análisis de los polimorfismos de ltc4s, alox5 y … · a mi madre no elegimos la familia en la que...

UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

TESIS DOCTORAL

ANÁLISIS DE LOS POLIMORFISMOS DE LTC4S, ALOX5 Y ALOX5AP EN POBLACIÓN ASMÁTICA DE GRAN

CANARIA

JOSÉ ÁNGEL CUMPLIDO BONNY

SERVICIO DE ALERGOLOGÍA HOSPITAL UNIVERSITARIO DE GRAN CANARIA

DOCTOR NEGRÍN

2015

A mi madre No elegimos la familia en la que nacemos y crecemos. Que buena suerte he tenido.

A mi mujer

Su alegría ante la vida es un estímulo constante.

AGRADECIMIENTOS

A mi Directora de tesis, Doctora Teresa Carrillo, por su inestimable ayuda,

apoyo y asesoramiento. Su sutil y educado apremio ha sido fundamental en la recta final.

Su constancia y capacidad de trabajo, un ejemplo a seguir.

A mi Director de tesis, Carlos Blanco, por su disponibilidad y ayuda constantes a

pesar de la distancia.

A María José Torres y su equipo en la unidad de investigación, gracias por el

minucioso trabajo realizado en la extracción y análisis del ADN.

A Estefanía Herrera y Luis Alberto Henríquez, por aclarar pacientemente mis

dudas sobre genética y estadística.

A mis compañeros del servicio de alergia: auxiliares, administrativos, médicos y

enfermeras. Todos son parte de esta Tesis, sin su colaboración no habría sido posible.

INDICE

Pág.

Lista de abreviaturas.......................................................................I

1. INTRODUCCION………………………………………………………….…...…1

1.1. Epidemiología……………….…………………………………………...2

1.2. Historia natural…….…………………………………………….……..6

1.3. Conceptos: Gravedad, control y exacerbaciones. ……..……6

1.3.1. Gravedad……………………………………………………………………….…..7

1.3.2. Control del asma..……………………………………………………….…….7

1.3.3. Exacerbaciones………………………………………………………………....8

1.4. Estudios de asociación genética y asma………………………..9

1.4.1. Características…………………………………………………………………..10

1.4.2. Estudios de asociación de gen candidato………………..……..11

1.4.3. Estudios de todo el genoma…………………………………………...12

1.4.3.1. Estudios de ligamiento de todo el genoma..……………..12

1.4.3.2. Estudios de asociación de todo el genoma (GWAS).…13

1.4.4. Estudios de resecuenciación……………………………………………..14

1.5. Genes asociados con asma……………...…………………………15

1.5.1. Dipeptidil peptidasa X (DDP10)……………………………………....16

1.5.2. Disintegrina A y metaloproteinasa 33 (ADAM33)………….…17

1.5.3. Receptor acoplado a proteína G (GPRA)……………………….….17

1.5.4. Protocadherina 1 (PCDH1)…………………………………………………17

1.5.5. Gen de filagrina………………………………………………………………….18

1.5.6. Gen de ORMDL3 (Tipo orosomucoide 3)…………………………..18

1.5.7. Gen del receptor adrenérgico β-2…………………………………..…18

1.5.8. Gen del receptor de interleucina 4 (IL4R)………………….…….19

1.5.9. Genes asociados con asma mediante GWAS………………….…19

1.6. Leucotrienos…………….……………………………………………….21

1.6.1. Leucotrienos y su implicación en el asma…………………………25

1.7. Patología respiratoria exacerbada por aspirina

(AERD: Aspirin exacerbated respiratory disease)…….26

1.8. Genes de la vía de síntesis de leucotrienos.

Vía de la 5-Lipoxigenasa (5-LO)…………………………..29

1.8.1. Asociación genética y asma…………………………………….……..…32

1.8.1.1. ALOX5………………………………………………………………………..….32

1.8.1.2. ALOX5AP…………………………………………………………………….…33

1.8.1.3. LTC4S………………………………………………………………………..….34

2. HIPOTESIS DE TRABAJO…………………………………………………..…36

3. OBJETIVO………………………………………………………………………….37

3.1. Objetivo primario………………………………………………………37

3.2. Objetivo secundario…………………………………………….…….37

4. MATERIAL Y METODOS……………………………………………….………38

4.1. Estudio de casos y controles. Diseño……………………………38

4.2. Datos Clínicos y analíticos…………………..……………………..39

4.2.1. Asma……………………………………………………………………………..……39

4.2.2. Atopia……………………………………………………………………………...…41

4.2.3. Pruebas de función respiratoria……………………………..………..42

4.2.4. Tolerancia a AINEs……………………………………………………………43

4.2.5. Resumen……………………………………………………………………………43

4.3. Determinaciones genéticas……………………………………..…44

4.3.1. Extracción del ADN genómico……………………………………….…44

4.3.2. Tipaje del polimorfismo LTC4S -444 A/C…………………………44

4.3.3. Tipaje de los polimorfismos ALOX5 -176/-147 y

ALOX5AP -169/-146……………………………………….………………………...45

4.3.4. Confirmación de secuencias …………………………………………….46

4.4. Análisis estadístico………………………………….……………….47

5. RESULTADOS………………………………………………………………..….48

5.1. Datos poblacionales……………………………………………….…48

5.2. Polimorfismos de la vía de la 5-LO…………………….……..…56

5.2.1. Análisis de genotipos…………………………………………………….....57

5.2.1.1. LTC4S……………………………………………………………………..…...58

5.2.1.2. ALOX5…………………………………………………………………….….…61

5.2.1.3. ALOX5AP………………………………………………………………………64

5.2.1.4. Análisis conjunto de los polimorfismos………….…….…….68

5.3. Intolerancia a AINEs – gravedad del asma……………..……69

6. DISCUSION……………………………………………………………….……..71

7. CONCLUSIONES…………………………………………………………..…….91

8. BIBLIOGRAFIA…………………………………………………….…….92

9. ANEXO I………………………………………………………………..…117

9.1. Publicaciones con aportación de los datos presentados

I

Abreviaturas

AAS Acido acetil salicílico.

Ad Modelo de herencia Aditivo.

ADAM33 Disintegrina A y metaloproteinasa 33.

AERD Patología respiratoria exacerbada por aspirina.

AG Asma persistente grave.

AINEs Antiinflamatorios no esteroideos.

ALOX5 Gen de la 5-LO.

ALOX5AP Gen de la proteína activadora de la 5-LO (FLAP).

ANG Asma no persistente grave.

Anti-LT Anti Leucotrienos.

BLT1 Receptor uno del leucotrieno B.

BLT2 Receptor dos del leucotrieno B.

CNVs Variaciones en el número de copias en el genoma.

C Citosina.

Co Modelo de herencia Codominante.

COX-1 Cicloxigenasa-1.

CysLT Cisteinil-leucotrienos C4, D4, E4.

CysLTR1-R2 Receptor de cisteinil leucotrienos 1 y 2 respectivamente.

DDP10 Dipeptidil peptidasa X.

Do Modelo de herencia Dominante.

Dpt Dermatophagoides pteronyssinus.

EPOC Enfermedad pulmonar obstructiva crónica.

ERS European Respiratory Society.

FeNO Oxido nítrico exhalado.

II

ESCASE Estudio del Control del Asma en España.

FEV1 Volumen de aire que se expulsa durante el primer segundo

de la espiración forzada.

FLAP Proteína activadora de la 5-lipoxigenasa.

FVC Capacidad Vital forzada.

G Guanina.

GAD Genetic Association Datebase.

GEMA Guía española para el manejo del asma.

GINA Global Iniciative for Asthma.

GPRA Receptor acoplado a proteína G.

GWAS Estudios de asociación de todo el genoma.

LT Leucotrienos.

LTA4 Leucotrieno A4.

LTA4H Leucotrieno A4 hidrolasa

LTB4 Leucotrieno B4.

LTB4R1-R2 Receptor del leucotrieno B4 1 y 2 respectivamente.

LTC4 Leucotrieno C4.

LTC4S Leucotrieno C4 sintasa.

LTD4 Leucotrieno D4.

LTE4 Leucotrieno E4.

MAF Frecuencia del alelo menor.

NHLBI Instituto Nacional del Corazón, Pulmón y la Sangre de

EEUU.

OMS La Organización Mundial de la Salud.

PCDH1 Protocadherina 1.

PGE2 Prostaglandina E2.

III

RFLP Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción.

(Restriction Fragment Length Polymorphism).

PGD2 Prostaglandina D2.

Re Modelo de herencia Recesivo.

RGE Reflujo gastroesofágico.

SNS Sistema Nacional de Salud.

SNP Polimorfismo de un solo nucleótido (Single Nucleotide

Polymorphism).

TSLP Estroma tímico linfoproliferativo.

5-LO 5-lipoxigenasa.

VNTR Polimorfismos en el número de repetición en tandem

(Variable Number Tandem Repetition).

Tesis Doctoral

José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas

1

1. INTRODUCCION

El asma es un problema de salud mundial que afecta en la actualidad

a alrededor de 300 millones de personas de cualquier edad, sexo, grupo

étnico y país. Se caracteriza esta afección por una considerable

heterogeneidad, que viene determinada por interacciones genéticas y

ambientales, mecanismos fisiopatológicos, exposiciones ambientales,

comorbilidades, edad, gravedad de la enfermedad de base, accesibilidad a

los servicios sanitarios y cuidados recibidos, factores psicológicos, respuesta

al tratamiento y características de la enfermedad, incluidas las

exacerbaciones y la muerte, así como la cronicidad (1).

Las primeras referencias históricas sobre el asma aparecen en el

antiguo Egipto, en concreto en el Papiro de Georg, donde se describen

recetas para el tratamiento de esta afección. El término asma deriva del

griego “aazein” que significa jadear, exhalar con la boca abierta, respirar

fuerte. Hipócrates en el “Corpus Hippocraticum” utiliza ya la palabra "asma"

como término médico. Más tarde, Maimónides, médico del Sultán Saladino

en su "Tratado del Asma" describe de forma minuciosa los síntomas típicos

del asma. Ya en el siglo XVII Ramazzini, conocido como el padre de la

medicina laboral, describe un vínculo entre el asma y el polvo orgánico y

también reconoce al asma inducida por ejercicio.

A pesar de que Salter en 1859 realizó una descripción del asma como

una enfermedad que cursaba con obstrucción reversible al flujo aéreo,

todavía en la primera mitad del siglo XX se consideraba que se trataba de

una enfermedad psicosomática (2). A partir de los años 60 del pasado siglo

se describió el asma como una enfermedad obstructiva de la vía aérea que

cursaba con hiperrespuesta bronquial. Por fin en 1995 el Instituto Nacional

del Corazón, Pulmón y la Sangre de EEUU (NHLBI) definió al asma como

“una enfermedad inflamatoria crónica de las vías respiratorias en la que

intervenían muchos tipos de células, especialmente mastocitos, eosinófilos y

linfocitos B”.

Tesis Doctoral


2

Más recientemente, la “Guía española para el manejo del asma”

(GEMA 2009) (3) ha definido al asma como un síndrome que incluye

diversos fenotipos clínicos que comparten manifestaciones clínicas similares,

pero de etiologías probablemente diferentes. Ello condiciona la propuesta de

una definición precisa, y así, las habitualmente utilizadas son meramente

descriptivas de sus características clínicas y fisiopatológicas. Desde un

punto de vista pragmático se podría definir como una enfermedad

inflamatoria respiratoria crónica, en cuya patogenia intervienen diversas

células y mediadores de la inflamación, condicionada en parte por factores

genéticos y que cursa con una obstrucción variable del flujo aéreo, total o

parcialmente reversible, ya sea por la acción de medicamentos o

espontáneamente.

1.1 Epidemiología

El asma es una de las enfermedades respiratorias crónicas más

frecuentes en la edad adulta y, sin ningún género de duda, la más frecuente

en la infancia.

La prevalencia está aumentando en muchos países, pero aún no se

dispone de datos suficientes para determinar las causas probables de este

incremento. Se desconoce la prevalencia real del asma a nivel mundial,

posiblemente por la falta de especificidad de los síntomas relacionados con

la enfermedad y por no existir una definición universalmente aceptada

desde el punto de vista epidemiológico.

Como ya se ha mencionado, se estima que padecen asma más de

300 millones de personas en el mundo, con una amplia variación geográfica

y siendo más frecuente en mujeres y en niños. La cifra varía entre países,

siendo mayor en países industrializados.

Tesis Doctoral


3

En Europa, la prevalencia de asma en niños de países mediterráneos

es del 8 al 13,5%, excepto en Grecia que es del 3,7%. En España, la

prevalencia del asma en niños y niñas de 6-7 años es del 10,7% y del

8,7%, y de 13-14 años, del 9,3% y del 9,2% respectivamente (4). En

población adulta española se acepta que alrededor del 5% padece asma (5).

En cuanto a la tasa de mortalidad por asma por 100.000 adultos en

Europa, va del 0,54 de Holanda al 8,7 de Portugal. En España, para todas

las edades, en 1960 era de 9,36 y, en 2005, de 2,22. En el grupo de edad

de 5 a 34 años, los valores de la tasa de mortalidad para ambos sexos

oscilan entre 0,1 y 0,4 con una gran variabilidad en su evolución a lo largo

de los años (6).

Otro dato que pone de relieve la importancia del asma desde el punto

de vista de la salud pública es que en Europa el 38% de los niños y el 16%

de los adultos han perdido días de colegio o de trabajo, respectivamente,

dato que es superior en nuestro país. A nivel mundial, el asma es, tras la

enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), la causa de mayor

número de días de absentismo laboral por enfermedad respiratoria. La

Organización Mundial de la Salud (OMS) ha estimado que anualmente se

pierden 15 millones de años de vida ajustados por incapacidad por asma

(6).

Numerosos estudios han demostrado que el asma es una enfermedad

infra-diagnosticada e infra-tratada. En España se ha estimado que un 52%

de los casos no han sido diagnosticados y un 26% de los que presentan

síntomas frecuentes, no siguen ningún tipo de tratamiento regular (7).

Existe una clara relación entre asma y alergia, de hecho, la presencia

de atopia aumenta la probabilidad de asma entre 10 y 20 veces. No

obstante, muchos asmáticos no son atópicos y no todos los atópicos

desarrollan asma (solo un 25-30% de los niños sensibilizados padecen

asma), por lo que cabe pensar que deben existir otros factores

Tesis Doctoral


4

concomitantes, no identificados, que modulen la evolución de este subgrupo

(2).

Según datos de la OMS, durante el 2005 se produjeron 255.000

muertes por asma en todo el mundo. Los principales factores que

contribuyen a la morbilidad y mortalidad por esta enfermedad son el

diagnóstico insuficiente y el tratamiento inadecuado. En nuestro país entre

1980 y 1996 se produjo una reducción en la tasa estandarizada de

mortalidad por asma para todas las edades, pasando en los hombres de

37,8 muertes por millón a 10,1 mientras que para las mujeres la tasa pasó

de 19,5 a 13,2. Analizando los datos disponibles en población más joven,

curiosamente no se ha producido esta reducción (8).

La prevalencia del asma y la creciente morbimortalidad asociada,

generan un notable consumo de recursos sanitarios y representan una

importante carga económica para la sociedad. Tanto la elevada prevalencia

como el progresivo incremento en la incidencia de asma en los países

desarrollados han convertido a esta enfermedad en un grave problema no

solo sanitario, sino también económico. Así, se estima que cerca del 2% del

gasto sanitario total de los países desarrollados, está ocasionado por la

asistencia y tratamiento del asma. Además, se prevé que el impacto del

asma aumentará en los próximos años, como consecuencia del aumento de

la esperanza de vida de la población, el incremento de la prevalencia y la

aparición de nuevos medicamentos.

En cuanto a datos económicos, según el estudio AsmaCost, realizado

en 2007, el coste económico del paciente adulto asmático en España

ascendía en ese momento a 1.726 y a 1.533 euros, desde la perspectiva de

la sociedad y del Sistema Nacional de Salud (SNS), respectivamente. El

coste era superior en los pacientes mayores de 65 años (2.069 euros) y en

aquellos con asma de mayor gravedad (959, 1.598, 1.553 y 2.635 euros

para asma intermitente, persistente leve, moderada y grave,

respectivamente) (9). El coste medio anual por niño asmático en España en

Tesis Doctoral


5

2008 era de 1.490 euros, y oscilaba entre 403 euros para el asma más leve

y 5.380 euros para la forma más grave (10).

Se estima que alrededor del 70% del coste total del asma es

consecuencia de su mal control y manejo; por otra parte, los costes

indirectos y una parte de los directos, como gastos de hospitalización,

visitas a Urgencias o muerte, son los mayores responsables del consumo de

recursos económicos debido al asma (11). En el Estudio del Control del

Asma en España (ESCASE) se evaluó el control del asma en nuestro país

según las recomendaciones de la “Global Iniciative for Asthma” (GINA)

(12), los resultados fueron ciertamente desalentadores: más de las dos

terceras partes de los pacientes estudiados tenían un mal control del asma

(13). Estos datos, en su conjunto, sugieren que realizar un diagnóstico

preciso de asma, unido a un incremento de la utilización de fármacos

antiinflamatorios preventivos, a la mejora de la educación del paciente

asmático y al seguimiento estrecho de las recomendaciones de las

sociedades científicas, puede redundar en un mejor control de la

enfermedad y en una reducción de los costes asociados.

Se acepta que alrededor del 5% de los pacientes asmáticos padecen

asma grave no controlada y que estos consumen más del 50% de los

recursos sanitarios dedicados a esta enfermedad. Por otra parte, se ha

estimado que sólo en el 55% de los afectados con sospecha inicial de asma

grave no controlada se confirma el diagnóstico, una vez descartados otro

tipo de problemas (3). En este sentido, en el ya citado estudio AsmaCost se

encontró que el coste del paciente asmático era sustancialmente menor si el

diagnóstico se basaba en la presencia de hiperrespuesta bronquial en

comparación a cuando se hacía sólo a partir de la clínica, lo que refuerza la

importancia de realizar un diagnóstico certero del asma (9).

Tesis Doctoral


6

1.2. Historia natural

En cuanto a la historia natural de esta enfermedad, el asma, por lo

general comienza en los primeros años de la vida. En casi el 50% de los

casos, el pico de inicio se sitúa antes de los 10 años. Casi la tercera parte

de los niños menores de 3 años presenta en alguna ocasión sibilancias,

generalmente en el curso de una infección viral, y muchos de ellos tendrán

al menos una recurrencia. No obstante, no todos los niños con síntomas de

asma los mantienen en la vida adulta. Se ha investigado exhaustivamente

sobre los factores determinantes de la evolución de esta enfermedad.

Los datos disponibles en la actualidad sobre la historia natural del

asma proceden de estudios longitudinales de cohortes y de base

poblacional; a pesar de sus limitaciones, estos estudios llevados a cabo en

distintos países han aportado datos muy interesantes sobre la génesis y

progresión del asma y sobre los posibles factores de riesgo implicados. En

buena medida, los resultados de estos trabajos nos orientan a que el patrón

de asma durante la infancia nos va a ayudar a predecir, con una elevada

probabilidad, lo que va a ocurrir en la vida adulta. Así, los niños con asma

episódica evolucionarán por lo general a la curación completa y solo un

pequeño porcentaje presentará síntomas intermitentes o persistentes leves

sin repercusiones funcionales. Por el contrario, la mayoría de niños con

asma persistente tendrán reducida su función pulmonar y continuarán

presentando síntomas en la vida adulta (2).

1.3. Conceptos de gravedad, control del asma y

exacerbaciones

Los conceptos de gravedad y control de asma son importantes para

evaluar al paciente asmático y su respuesta al tratamiento, así como para

los servicios de salud, registros y estudios de investigación. Por desgracia,

Tesis Doctoral


7

con frecuencia, la terminología aplicada no está estandarizada y los

términos se confunden e intercambian. Es sumamente importante

diferenciar el asma grave del asma no controlada.

1.3.1. Gravedad: la gravedad es una característica intrínseca de la

enfermedad de base y, en cambio, el control, una valoración que se

establece una vez que se ha instaurado el tratamiento, siendo la principal

meta de éste (1, 12). Debe ser un objetivo prioritario intentar conseguir

tanto el control de los síntomas diarios como el del riesgo futuro, sobre todo

en la aparición de exacerbaciones. En la presentación inicial de la

enfermedad, si el paciente no está recibiendo tratamiento de

mantenimiento, se debe valorar la gravedad en función de la presencia de

síntomas diurnos y nocturnos, del uso de medicación de rescate, de la

limitación de la actividad, de la función pulmonar y del número de

exacerbaciones, para después clasificarla en asma intermitente, persistente

leve, persistente moderada o persistente grave, e instaurar el tratamiento

farmacológico adecuado según la gravedad (3, 12). Una vez que el paciente

está siendo tratado, la gravedad depende del escalón terapéutico que

precise para lograr el control de la enfermedad (12).

1.3.2. Control del asma: Se entiende que el asma está controlada

cuando tanto la sintomatología diurna como la nocturna desaparece o es

escasa, el número de exacerbaciones, las visitas a urgencias y los ingresos

hospitalarios son mínimos o nulos, la función pulmonar es normal o próxima

a la normalidad, no es necesario el uso de medicación de rescate y no

existen limitaciones para la actividad diaria, incluido el ejercicio físico (12).

Un mal control del asma se asocia a peor calidad de vida, limitación

de las actividades diarias, pérdida de horas de trabajo o de asistencia a la

escuela, mayor gasto sanitario y mayor riesgo de presentar exacerbaciones

que requieran asistencia en los servicios de urgencias e ingresos

hospitalarios. El periodo mínimo para evaluar el control es de 1 a 4 semanas

en los adultos y de al menos 4 semanas en el caso de los niños, antes de

Tesis Doctoral


8

que el paciente acuda a consulta (14). Aunque se han desarrollado varios

cuestionarios para evaluar el control del asma, ninguno evalúa de forma

adecuada las exacerbaciones que, como acabamos de mencionar, son de

gran importancia para definir el control de la enfermedad (15).

1.3.3. Exacerbaciones: Son episodios caracterizados por un

aumento progresivo de la disnea, tos, sibilancias y opresión torácica, o una

combinación de estos síntomas, y que varían, tanto en el inicio como en la

resolución, de minutos a semanas. Las exacerbaciones son, sin ninguna

duda, la variable más utilizada en la investigación de la eficacia de los

tratamientos del asma. Controlar la enfermedad de base y las

exacerbaciones probablemente se consiga incidiendo en distintos factores

(15). Diferenciamos tres tipos de exacerbaciones:

Las exacerbaciones graves son aquellas que requieren tratamiento

urgente para evitar la hospitalización e incluso la muerte del paciente. Suele

ser un indicador de mal control del asma y deben incluir al menos uno de

los siguientes criterios: uso de corticoides sistémicos o un incremento de la

dosis de corticoides orales al menos 3 días consecutivos, hospitalización o

visita a Urgencias por asma con requerimiento de corticoides sistémicos.

Aunque las exacerbaciones graves son más frecuentes en el asma grave y,

por tanto, aumentan su mortalidad, también se presentan, en una

proporción mayor a la esperada en el asma leve (16).

Las exacerbaciones moderadas son aquellas que precisan un cambio

temporal en el tratamiento para evitar su evolución a una exacerbación

grave. Se deben cumplir, durante 2 o más días, uno o más de los siguientes

criterios: deterioro de los síntomas, empeoramiento de la de la función

pulmonar y aumento del uso de la medicación de rescate (14). Las visitas a

Urgencias que no precisen corticoides sistémicos se clasificarán como

exacerbaciones moderadas.

Tesis Doctoral


9

Las exacerbaciones leves son aquellas que ceden con tratamiento de

rescate, no precisan asistencia en servicios de urgencias, no conllevan un

deterioro persistente de los síntomas ni de la función pulmonar y no alteran

significativamente la calidad de vida del paciente. Requieren, solamente, un

ajuste en el tratamiento de base si son frecuentes.

Los principales desencadenantes de las exacerbaciones son las

infecciones virales (en especial por rinovirus), la exposición a

aeroalérgenos, a algunos contaminantes medioambientales, a sustancias e

irritantes presentes en el medio laboral y a fármacos como los analgésicos

antiinflamatorios no esteroideos (AINEs).

1.4. Estudios de asociación genética y asma

La comprensión de los principios básicos de los estudios de asociación

genética es sumamente importante, ya que sus resultados afectan por igual

a todos, tanto a pacientes como a profesionales de la medicina y/o de la

investigación. Aunque existe el convencimiento general entre profesionales

de que aún es pronto para obtener conclusiones fiables, ya existen

compañías que ofrecen test de susceptibilidad genética para un amplio

rango de enfermedades comunes, incluida el asma.

El polimorfismo genético hace referencia a la existencia en una

población de múltiples alelos de un gen. Es decir, un polimorfismo es una

variación en la secuencia de un lugar determinado del ADN entre los

individuos de una población.

Aquellos polimorfismos que afectan a la secuencia codificante o

reguladora y que producen cambios importantes en la estructura de la

proteína o en el mecanismo de regulación de la expresión, pueden

traducirse en diferentes fenotipos (por ejemplo, el color de los ojos).

Tesis Doctoral


10

Un polimorfismo puede consistir en la sustitución de una simple base

nitrogenada (por ejemplo, la sustitución de una A (adenina) por una C

(citosina) o puede ser más complicado (por ejemplo, la repetición de una

secuencia determinada de ADN, donde un porcentaje de individuos tenga un

determinado número de copias de una determinada secuencia).

Existen diferentes tipos de polimorfismos:

• Polimorfismos de un solo nucleótido (SNP, del inglés: Single

Nucleotide Polymorphism).

• Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP, del

inglés: Restriction Fragment Length Polymorphism).

• Polimorfismos en el número de repeticiones en tandem (VNTR, del

inglés: Variable Number Tandem Repetition).

1.4.1. Características

Los métodos utilizados para descubrir nuevos genes asociados a

asma han evolucionado con el tiempo, a medida que las técnicas de

genotipado han mejorado en rentabilidad y han abaratado los costes. En la

actualidad, se ha empezado a utilizar técnicas capaces de secuenciar la

totalidad del genoma (Next Generation: NextGen) (17). El descubrimiento

de genes está cada vez menos limitado a las técnicas de secuenciación,

siendo el principal impedimento para su desarrollo total el gran

requerimiento bioinformático que precisan, así como la interpretación y

análisis de la enormidad de datos que se obtienen.

Existen diferentes tipos de estudios cuya finalidad es localizar genes,

o variables genéticas, asociados estadísticamente a unas características

predeterminadas:

Tesis Doctoral


11

1.4.2. Estudios de asociación de gen candidato

El método más utilizado es el estudio de casos y controles, en el que

se busca una determinada marca (generalmente polimorfismos de un solo

nucleótido o SNPs), un alelo o un haplotipo, en casos (individuos con el

fenotipo) comparado con los controles (individuos sin el fenotipo: “super

controles”, o individuos de la población general de los que se desconoce el

fenotipo: “controles poblacionales”).

Tal y como indica el nombre, los genes son seleccionados para este

estudio en función de lo que previamente conocemos sobre ellos, ya sea su

función (gen candidato por función), su localización cromosómica (tras

estudios de ligamiento de todo el genoma), o por su proximidad a una

asociación conocida (gen candidato posicional).

La variante a analizar en este estudio se puede seleccionar

basándonos en su función (por ejemplo: sustitución de un aminoácido que

se sabe influye en la función de la proteína o un SNP en la región promotora

que se sabe afecta a la transcripción), o en estudios de asociación previos

con la misma enfermedad o enfermedades relacionadas.

Estas estrategias requieren un conocimiento previo sobre la

estructura del haplotipo del gen, así como cierta habilidad para seleccionar

los SNPs que engloben todos los haplotipos. Estos SNPs seleccionados no

deben estar en desequilibrio de ligamiento entre sí, por el contrario, sí

deben estarlo con aquellos SNPs que no se genotiparán en el estudio (tag

SNPs) (18, 19). De esta manera, se reduce considerablemente el número

de SNPs seleccionados por cada gen. Este número varía entre 10 y algunos

cientos, dependiendo del tamaño del gen, la estructura del haplotipo y los

criterios para determinar desequilibrio de ligamiento.

Dado que en los estudios de gen candidato la selección de genes se

basa en una hipótesis previa, las asociaciones descubiertas con este método

Tesis Doctoral


12

son sencillas de interpretar, siendo esta una de las principales ventajas de

este tipo de estudio.

La mayoría de los estudios genéticos realizados hasta la fecha en

asma han sido de asociación de gen candidato, y los genes se han

seleccionado debido al conocimiento previo de su función o por su posible

implicación en la patogénesis del asma (20, 21). Por este motivo, la

principal limitación de estos estudios es que están circunscritos a lo que

sabemos, o creemos que sabemos, sobre la enfermedad en cuestión, su

patogénesis y la función de los genes. Los estudios de asociación de gen

candidato no pueden, por si mismos, descubrir nuevos genes implicados en

la enfermedad ni novedades en su patogenia.

1.4.3. Estudios de todo el genoma

A diferencia de los estudios de gen candidato, en este caso no es

necesaria una hipótesis previa ni conocimientos explícitos sobre la

patogenia de la enfermedad o fenotipo a estudiar. De hecho, los estudios de

aproximación de todo el genoma son conocidos como “estudios sin

hipótesis” o “estudios generadores de hipótesis”. Su ventaja es, por lo

tanto, que son capaces de descubrir nuevos genes y nuevas vías en la

fisiopatogenia de la enfermedad. El inconveniente, por el contrario, es la

gran carga estadística resultante del alto número de pruebas que se hacen

simultáneamente y que requieren un tamaño muestral muy elevado para

lograr resultados estadísticamente significativos. Además, la relación entre

las variantes encontradas y la enfermedad no siempre es tan evidente (22).

1.4.3.1. Estudios de ligamiento de todo el genoma: Para llevar a cabo este

tipo de estudio de aproximación genética se necesitan familias en las

que existan al menos dos miembros con la enfermedad (fenotipo), casi

siempre pares de gemelos. El estudio de ligamiento se basa en la

premisa de que el locus con el fenotipo se hereda junto con la

enfermedad en las familias, de modo que la región del gen que confiere

Tesis Doctoral


13

susceptibilidad estará presente entre los afectados con más frecuencia

de lo esperado por el azar.

La principal ventaja de los estudios de ligamiento es que mostrarán

genes que contienen variantes poco frecuentes que confieren un riesgo

elevado de padecer la enfermedad. Su principal inconveniente es que

identifica regiones cromosómicas muy amplias, capaces de albergar

cientos de genes (baja resolución) y que tiene una limitada capacidad

para detectar variantes que confieran un riesgo modesto de padecer la

enfermedad.

1.4.3.2. Estudios de asociación de todo el genoma (GWAS): La ventaja

fundamental de los GWAS es su excelente resolución y su capacidad

para detectar variantes con una implicación modesta sobre la

enfermedad. En este caso no es necesario el estudio de familias (23), es

más, la muestra debe ser homogénea en cuanto a raza y etnia se refiere

y las familias deben ser excluidas. Normalmente un GWAS busca

asociación entre un millón o más de SNPs. Los niveles de significación

estadística exigidos para considerar las asociaciones son muy rigurosos

(habitualmente con P < 10-7) y por este motivo las muestras deben ser

muy extensas. Esta es una de sus principales limitaciones y, por ello,

para solventarlo, se ha llevado a cabo un gran número de meta-análisis

en trabajos de cooperación nacional e internacional. Recientemente se

han publicado los resultados de dos meta-análisis de GWAS en asma:

• El consorcio GABRIEL (24) (Estudio multidisciplinar para identificar

las causas genéticas y ambientales del asma en la comunidad

europea): se han incluido 10365 casos y 16110 controles de

población europea caucásica extraídos de 23 estudios

independientes y el genotipado de 582892 SNPs.

• El consorcio EVE (25) (Estudio de colaboración entre

investigadores norteamericanos para identificar genes con

Tesis Doctoral


14

predisposición al asma entre poblaciones de distintas etnias): se

han incluido tres grupos poblaciones bien definidos y obtenidos de

nueve investigaciones:

• Europeos-americanos: 1486 casos, 1539 controles y 620 tríos

caso-padres.

• Afroamericanos y Caribeños-africanos: 1154 casos, 1054

controles y 413 tríos caso-padres.

• Latinos: 606 casos, 792 controles y 413 tríos caso-padres.

La principal limitación de los GWAS es que detectan solo variantes

comunes, ya que las plataformas de genotipado incluyen habitualmente

variantes comunes, y tienen una potencia muy baja para detectar

asociaciones de SNPs con frecuencias alélicas menores del 1%; así la

frecuencia del alelo menor (MAF) en la población, se clasifica en variante

común o variante rara según sea su frecuencia mayor o igual al 1% o

menor del 1%, respectivamente. Esto sugiere que las asociaciones

genéticas detectadas de este modo son solo una pequeña proporción de

la heredabilidad de la enfermedad (“missing heritability”) (26-28). Las

variantes alélicas poco frecuentes, las que no detectan los GWAS, tienen

un efecto mucho mayor sobre la expresión de la enfermedad que las

variantes frecuentes, desafiando de este modo la hipótesis de

“enfermedad común-variantes comunes”, básica al desarrollar estudios

GWAS.

1.4.4. Estudios de resecuenciación

El desarrollo de técnicas de alto rendimiento para la secuenciación

masiva en paralelo del genoma (NexGen), están permitiendo llevar a cabo

estudios de asociación que consiguen identificar, no solo variables comunes,

sino también las menos frecuentes, así como variables estructurales, tales

como variaciones en el número de copias (CNVs) y delecciones (indels), que

no detectaban los GWAS ni otros estudios centrados en la variabilidad de

Tesis Doctoral


15

SPNs. Estos estudios se fundamentan en el convencimiento de que

variaciones genéticas poco frecuentes tienen un efecto importante sobre la

enfermedad, y son capaces de explicar una proporción significativa del

riesgo genético en enfermedades comunes como el asma (29, 30).

Las limitaciones para seleccionar un método u otro han variado

mucho con el paso de los años. Las mejoras tecnológicas y el abaratamiento

de precios han permitido a los investigadores ampliar considerablemente el

abanico de posibilidades de elección. La decisión final estará condicionada

inicialmente por factores extrínsecos a la patología, principalmente recursos

económicos y el tamaño de la muestra. Salvando este impedimento, la

mejor elección dependerá del verdadero mapa genético que predispone al

asma, lo cual, por desgracia, no se conoce en la actualidad.

Si el principal riesgo genético de padecer asma son muchas variantes

comunes con un efecto modesto sobre la enfermedad, los GWAS y los

meta-análisis de GWAS se perfilan como la mejor opción. Considerando la

hipótesis contraria, la resecuenciación o los estudios de ligamiento de todo

el genoma serían los más recomendables. En todo caso, es posible que el

riesgo genético de padecer asma sea una combinación de ambas, por lo que

una combinación de estudios de aproximación parece ser lo más adecuado,

al menos hasta que nuestros conocimientos sean más certeros.

1.5. Genes asociados con asma

Se han realizado más de veinte estudios de ligamiento para asma y

fenotipos relacionados, identificándose al menos diez regiones

cromosómicas con genes potencialmente relacionados con el asma.

Utilizando estudios de clonación posicional sobre estas regiones, se han

identificado seis nuevos genes asociados al asma. Tres de ellos ejercen su

actividad sobre la mucosa, afectando directamente al epitelio bronquial.

Tesis Doctoral


16

Otros afectan directamente a la arquitectura pulmonar o interactúan con

citocinas inflamatorias.

Los estudios de asociación determinan la relación existente entre

fenotipos específicos o características de una enfermedad y la presencia de

alteraciones alélicas de una determinada marca de ADN. Se han descritos

millones de polimorfismos (principalmente de sustitución, inserción o

delección) en los 20.000 - 25.000 genes que, entre los tres billones de

pares de bases, componen el ADN humano. La “base de datos de la

asociación genética” (GAD, de sus siglas en inglés: Genetic Association

Datebase), contiene información sobre más de 500 publicaciones de

asociación genética con asma (40).

La revisión de estos estudios identificó 25 genes cuya asociación con

asma o fenotipos relacionados ha sido replicada en seis o más poblaciones,

así como, otros 54 genes replicados en entre dos y cinco poblaciones

diferentes. Se desconoce la función de muchas de las variantes genéticas

identificadas en estudios de ligamiento y asociación, a pesar de haberse

examinado también variantes genéticas con efectos bioquímicos conocidos

in vitro.

Algunas de las regiones más representativas o de los genes más

replicados (y, en algunos casos, variantes funcionales de los mismos) son:

1.5.1 Dipeptidil peptidasa X (DDP10): Esta región está localizada en el

cromosoma 2q14 próxima al gen de la IL-1. Cuatro estudios de

ligamiento de todo el genoma y dos estudios en ratón han encontrado

asociación con asma anteriormente. Además, en dos grupos de

familias con asma, de origen alemán y británico, se ha encontrado

una asociación significativa entre SNPs en DDP10 y asma (31).

Tesis Doctoral


17

1.5.2 Disintegrina A y metaloproteinasa 33 (ADAM33): Un GWAS

realizado en un amplio grupo de familias inglesas determinó

evidencias de ligamiento con el cromosoma 20p13. Mediante estudios

de clonación posicional y genotipado de 135 SNPs en 23 genes, se

identificó un gen asociado significativamente a asma. Este gen

codifica el dominio 33 de una disintregrina y metaloproteinasa A. El

ADAM33, fue el primer gen identificado por clonación posicional y

asociado con el desarrollo de asma y de hiperreactividad bronquial

(32). Se ha especulado que el gen ADAM33, expresado en las células

musculares lisas de la vía respiratoria y en fibroblastos de pulmón,

codifica la síntesis de una proteína importante para la fusión,

adhesión y señalización celular, así como para la proteólisis. Por otra

parte, se ha sugerido que ADAM33 desempeña, también, un papel en

la remodelación de la vía aérea (33, 34).

1.5.3 Receptor acoplado a proteína G (GPRA): Los primeros estudios

publicados de ligamiento de todo el genoma apuntaban a que el

cromosoma 7p era muy relevante. Estos hallazgos se replicaron en

estudios que incluían familias canadienses y finlandesas y se

confirmaron con posterioridad en familias de procedencia australiana

(35-37). Estudios de clonación posicional con 103 tríos (caso-padres)

procedentes de Finlandia han identificado un gen que codifica una

proteína G acoplada a un receptor que confiere susceptibilidad para

asma y se ha replicado en familias de origen canadiense (38).

1.5.4 Protocadherina 1 (PCDH1): Tanto el asma como la

hiperreactividad bronquial se han asociado a SNPs en el cromosoma

5q31-q33. Mediante estudios de ligamiento y secuenciación, se ha

identificado al gen de la protocadherina 1, PCDH1, que codifica a una

proteína de adhesión expresada en macrófagos alveolares y en

células epiteliales de la vía aérea. En siete de ocho estudios

poblaciones, las variantes en PCDH1 se han asociado con

hiperreactividad bronquial (39).

Tesis Doctoral


18

1.5.5 Gen de filagrina: La filagrina es una proteína llave que facilita la

diferenciación final de la epidermis y la formación de la barrera

defensiva de la piel. Dos variantes nulas de pérdida de función en el

gen de la filagrina (R501X y 2282del4) predisponen a dermatitis

atópica y se asocian con los niveles de IgE total (41, 42). Estas

variaciones también se asocian significativamente con asma en

pacientes con dermatitis atópica en algunos estudios (41), aunque en

otros parecen no influir con la susceptibilidad a padecer asma ni con

la gravedad de la misma (42).

1.5.6 Gen de ORMDL3 (Tipo orosomucoide 3): Este gen codifica a una

proteína transmembránica asociada al retículo endoplasmático y se

localiza en el cromosoma 17q. El primer GWAS identificó marcas en

este loci asociadas con asma de comienzo en la infancia en población

europea (43). Estos resultados se han replicado en poblaciones

españolas, europeas (24, 44-51) y asiáticas (50-52).

1.5.7 Gen del receptor adrenérgico ββββ-2: El gen que codifica al receptor

adrenérgico β-2 está situado en el cromosoma 5q31 (53). Codifica

una proteína con siete dominios transmembrana que pertenece a la

familia de receptores acoplados a la proteína G. Se expresa en

distintas células en el pulmón, tales como musculares lisas,

epiteliales, vasculares, y células inflamatorias, como mastocitos,

eosinófilos y linfocitos. Algunos SNPs de este gen se han asociado con

hiperreactividad bronquial y con la respuesta a broncodilatadores. Es

el caso, por ejemplo, de los individuos homocigotos Gly 16, los cuales

tienen una respuesta menor a broncodilatadores y, al mismo tiempo,

desarrollan más rápidamente taquifilaxia a esta medicación en

comparación con aquellos que presentan el fenotipo salvaje, es decir,

homocigotos Arg 16 (54, 55). La relevancia clínica de los distintos

SNPs identificados en este gen, sin embargo, no está totalmente

esclarecida a día de hoy. Se han asociado SNPs de este gen con la

Tesis Doctoral


19

presencia de asma nocturna y con variaciones en los niveles

plasmáticos de IgE, pero no con un mayor riesgo de padecer asma

(54, 56-58). Son necesarios más estudios para aclarar el papel de la

disfunción del receptor, tanto en el desarrollo como en la evolución

del asma y por el momento, parece que tampoco es fiable utilizar

estos SNPs como predictivos de la respuesta a broncodilatadores.

1.5.8 Gen del receptor de interleucina 4 (IL4R): En un estudio de

casos controles, se encontró una asociación entre una variante

polimórfica en el receptor de la IL-4 (-589C/T) y la presencia de

atopia, definida ésta como elevación de IgE total o de IgE específica

(59). En estudios in vitro realizados con células mononucleares de

sangre periférica, se ha encontrado que los individuos heterocigotos

para esta mutación tienen el doble de CD23 (receptor de baja

afinidad para la IgE) en respuesta a la IL-4, mientras que los

individuos homocigotos para la mutación tienen el triple. Estos

resultados se han reproducido en otras poblaciones y en estudios de

asociación en familias (60-66).

1.5.9 Genes asociados con asma mediante GWAS

Como ya se ha comentado en otros estudios genéticos, la principal

limitación de los estudios de gen candidato es que la selección de dicho gen

se basa, con frecuencia, en unos conocimientos limitados y cada

polimorfismo en cada gen candidato contribuye modestamente en la

heredabilidad de enfermedades complejas como el asma (67). Datos del

HapMap Project (www.hapmap.org), junto con procedimientos más exactos

para seleccionar marcas en el genoma, muchas de ellas en desequilibrio de

ligamiento con otras, lo suficientemente numerosas y dispersas como para

identificar la mayoría de variantes cromosómicas, han permitido que los

estudios de asociación de todo el genoma (GWAS) reemplacen a los

estudios de gen candidato en la búsqueda de genes responsables de

patologías complejas como el asma.

Tesis Doctoral


20

Aproximadamente una docena de GWAS han publicado asociación con

asma o fenotipos relacionados. Estos estudios se han llevado a cabo

principalmente en poblaciones europeas, con escasa reproductividad en

grupos étnicos diferentes (43, 68-71). Los trabajos más representativos

son:

1. El primer GWAS (43) determinó una asociación reproducible entre

asma de aparición en la infancia y marcas cerca del gen ORMDL3 en

el cromosoma 17q21.

2. El segundo GWAS realizado demostró asociación entre una variante

en el promotor del gen de la quitinasa 3-L1 (CHI3L1), que codifica

YKL-40, con asma, hiperreactividad bronquial y disminución de la

función respiratoria. (58-63). La variante del gen CH13L1 tiene una

importante asociación con los niveles séricos de YKL-40, sugiriendo

que éste puede ser un biomarcador para asma (68).

3. Mediante GWAS, también se ha objetivado asociación entre niveles

séricos de IgE total y variantes funcionales del gen de la cadena α del

receptor de alta afinidad de la IgE (FcER1α) (69).

4. En un GWAS con 10336 individuos con diagnóstico médico de asma y

16110 individuos no afectados, se encontraron las siguientes

asociaciones (24):

o Cromosoma 2, implicando a los receptores de la IL-1 y la IL-

18.

o Cromosoma 6, implicando a HLA-DQ.

o Cromosoma 9 , implicando a IL-33.

o Cromosoma 22, implicando a la unidad β del receptor de la IL-

2.

Tesis Doctoral


21

o Variantes en la localización de ORMDL3 en el cromosoma

17q21 se relacionaron específicamente con asma de aparición

en la infancia.

o Localizaciones fuertemente relacionadas con los niveles de IgE

total no se asociaron con asma.

5. En un metaanálisis de GWAS en población americana de diversidad

étnica, se reprodujeron cuatro asociaciones con localizaciones

cromosómicas en 17q21, cerca de IL1RL1, estroma tímico

linfoproliferativo (TSLP) e IL33. A diferencia de lo que sucede en

otras publicaciones, estas asociaciones han resultado

estadísticamente significativas con asma en grupos de tres etnias

diferentes. También han identificado, por primera vez, una asociación

con asma específica para etnia afroamericana. Se trata de una nueva

localización que codifica a una proteína inducible por interferón

(PYHIN1), que se asocia específicamente con individuos de

descendencia africana (25).

Los GWAS, sin embargo, no han demostrado asociaciones significativas

con variantes cromosómicas vinculadas a la vía de los leucotrienos.

1.6. Leucotrienos

Los leucotrienos (“Leuco” por leucocitos y “trienos” de tres dobles

enlaces conjugados) son una familia de ácidos grasos derivados del

metabolismos del ácido araquidónico por la vía de la 5-lipoxigenasa. Los

cisteinil-leucotrienos C4, D4, E4 (CysLT) son responsables de la actividad

biológica de los productos que antiguamente se denominaban “sustancias

de reacción lenta de la anafilaxia”. Fueron descubiertos en 1979 por el

bioquímico de origen sueco Bengt Samuelsson, Premio Nobel de Fisiología o

Medicina en 1982, por su trabajo sobre las prostaglandinas. La eficacia de

los antagonistas del receptor del CysLT de tipo 1 (CysLT1) en el asma valida

la importancia de los CysLT y del CysLT1 en esta enfermedad (72).

Tesis Doctoral


22

La síntesis de leucotrienos a partir del sustrato ácido araquidónico se

inicia por la acción de la 5-lipoxigenasa (5-LO) en colaboración con la

proteína activadora de la 5-lipoxigenasa (FLAP) (73). Aunque la FLAP no

tiene actividad enzimática (Figura 1), aumenta la capacidad de la 5-LO para

interactuar con su sustrato. El leucotrieno A4 (LTA4) se convierte, por

efecto de la hidrolasa del LTA4, en leucotrieno B4 (LTB4), o también se

puede conjugar con glutatión, reducido por acción de la sintasa del

leucotrieno C4 (LTC4), para producir LTC4. Proteínas transportadoras

específicas desplazan al LTB4 y al LTC4 al exterior de la célula. El LTC4

liberado se convierte en leucotrieno D4 (LTD4), que pasa a ser leucotrieno

E4 (LTE4) por hidrólisis secuencial de sus aminoácidos. La capacidad de

generar grandes cantidades de leucotrienos a partir del ácido araquidónico

es prácticamente exclusiva de los leucocitos; no obstante, las cantidades de

LTB4 y de cisteinil-leucotrienos que producen los distintos tipos de

leucocitos depende de las enzimas distales hidrolasa del LTA4 y sintasa del

LTC4, respectivamente.

En general, solo los leucocitos tienen suficiente 5-LO y FLAP para

sintetizar cantidades apreciables de leucotrienos a partir de ácido

araquidónico, si bien hay que tener presente que las células que expresan

enzimas metabolizadoras del LTA4 distal pueden captar LTA4 derivado de

los leucocitos y metabolizarlo en leucotrienos bioactivos, proceso que se

denomina “biosíntesis transcelular”. La colaboración entre neutrófilos y

células endoteliales es un ejemplo de este fenómeno.

La síntesis de leucotrienos se encuentra regulada por la cantidad de

ácido araquidónico libre que la fosfolipasa A2 (PLA2) libera de los

fosfolípidos de la membrana celular (74, 75), el nivel de cada una de las

proteínas de la vía 5-LO, la actividad catalítica por molécula enzimática

(p.ej., modulada por la fosforilación mediada por proteincinasas) (76) y la

disponibilidad de moléculas pequeñas (p.ej., ATP, óxido nítrico e

intermediarios del oxigeno reactivo) (77), que modulan a su vez la actividad

de la 5-LO.

Tesis Doctoral


23

Figura 1: Síntesis de leucotrienos, prostaglandinas y tromboxanos.

Otra variante que influye en la síntesis de leucotrienos es la

localización intracelular de la 5-LO. El desplazamiento de la 5-LO desde el

nucleoplasma a la membrana nuclear interna conlleva la síntesis máxima de

LTB4 (78).

Los déficits hereditarios de enzimas en la vía de síntesis de los

leucotrienos son poco frecuentes (79), pero se han descrito variantes

alélicas de las regiones codificante y promotora de los genes que codifican

la 5-LO (80), la FLAP (81), la hidrolasa del LTA4 (82) y la sintasa del LTC4

Tesis Doctoral


24

(83). Por otra parte, la transcripción de dichos genes se puede regular

mediante citocinas (84, 85), tales como el factor transformador de

crecimiento β (TFG-β), distintas leptinas, endotelinas, vitamina D3,

endotoxinas (86) y corticoides. Por ejemplo, la expresión de la sintasa de

LTC4 se regula al alza por acción de la IL-4 (85) y a la baja por endotoxinas

(86).

Las principales características de los diferentes metabolitos de la vía

de la 5-LO, así como de los receptores implicados en su actividad biológica,

se resumen en la “Tabla 1”.

Tabla 1. Leucotrienos: Receptores, enzimas y mediadores

BLT1 Receptor uno del leucotrieno B. Es un receptor acoplado a proteína G

con gran afinidad por el LTB4.

BLT2 Receptor dos del leucotrieno B. Es un receptor acoplado a proteína G

con gran afinidad por el LTB4.

CysLT1 Receptor uno de los cisteinil-leucotrienos (CysLT). Es un receptor

acoplado a proteína G que reconoce a los cisteinil-leucotrienos por

orden de afinidad (en primer lugar al LTD4, seguido del LTC4 y por

último al LTE4). Es la diana de fármacos antileucotrienos como el

montelukast, el zafirlukast y el pranlukast.

Su activación produce dilatación de vasos sanguíneos con incremento

de la permeabilidad vascular, hipersecreción mucosa, contracción de

la musculatura lisa bronquial, aumento de la migración

transendotelial de células hematopoyéticas CD34+ y eosinófilos y

aumento de la producción mastocitaria de IgE dependiente de IL-5 y

TNF.

CysLT2 Receptor dos de los CysLT. Es un receptor acoplado a proteína G que

reconoce a los CysLT por orden descendente de afinidad (en primer

lugar al LTC4 y al LTD4 seguido del LTE4). Produce activación de

células endoteliales.

Tesis Doctoral


25

Tabla 1. (continuación) Leucotrienos: Receptores, enzimas y mediadores

5-LO 5-lipoxigenasa. Enzima que inicia la síntesis de leucotrienos a partir

del ácido araquidónico.

FLAP Proteína activadora de la 5-LO. Aunque no tiene actividad enzimática,

aumenta la capacidad de la 5-LO para interactuar con su sustrato.

LTA4 Leucotrieno A4. Producto inestable de la acción de la 5-LO sobre el

sustrato ácido arquidónico y precursor del LTB4 y de los CysLT.

Hidrolasa

de LTA4

Enzima que hidroliza LTA4 para formar LTB4.

LTB4 Leucotrieno B4. Producto de la acción de la LTA4 hidrolasa sobre el

LTA4. Potente quimiotáctico y activador de los leucocitos.

Sintasa de

LTC4

Enzima que conjuga el glutatión con el LTA4 para formar LTC4.

CysLT Cisteinil-leucotrienos. Incluye el LTC4, LTD4 y el LTE4. En todos ellos

el aminoácido cisteína está conjugado a la base lipídica.

LTC4 Leucotrieno C4. Producto de la acción de la sintasa de LTC4 sobre

LTA4. Precursor de los restantes CysLT.

LTD4 Leucotrieno D4. Metabolito del LTC4. Es el más potente de los CysLT

en cuanto a la contracción del músculo liso de las vías respiratorias

por ligación al receptor CysLT1.

LTE4 Leucotrieno E4. Metabolito del LTD4 y producto final de todos los

CysLT. Se puede medir en orina.

1.6.1. Leucotrienos y su implicación en el asma

El paradigma actual de la patogenia del asma otorga gran

importancia a la interacción entre los genes y el ambiente. Según este

modelo, existen factores lesivos para el epitelio (tabaco, virus, sustancias

químicas…) y de susceptibilidad local de la vía aérea, que ponen en marcha

mecanismos de lesión–reparación, que tienden a perpetuarse en la unidad

trófica mesénquimo–epitelial. La exposición a aeroalérgenos y la atopia

inducen una respuesta Th2 con gran capacidad para favorecer y amplificar

Tesis Doctoral


26

las alteraciones inflamatorias y de remodelación de la vía aérea,

predisponiendo al fenotipo asmático. Esta hipótesis global explicaría como la

atopia puede darse sin asma y como el asma puede ocurrir en presencia o

ausencia de atopia (asma extrínseco e intrínseco, respectivamente), en

función de la intensidad de la agresión y de diferencias en la susceptibilidad

individual (87, 88). Los leucotrienos, junto a otros mediadores que

contribuyen al fenotipo asmático, provocan broncoconstricción al actuar

directamente sobre el músculo liso bronquial, e indirectamente al contribuir

a la hipersecreción mucosa, la vasodilatación, el aumento de permeabilidad

vascular y la actividad quimiotáctica para otras células y factores

inflamatorios, que contribuyen en la fisiopatogenia del asma.

La sobreproducción de leucotrienos en el asma se ha demostrado por

aumento de niveles de LTE4 en orina (89) y de CysLT y LTB4 en esputo

inducido de asmáticos comparado con población control. Este incremento es

mayor cuanto más grave es el asma (90) y aumenta tras exposiciones

bronquiales con aeroalérgenos. Por otro lado, los fármacos antileucotrienos

se han mostrado eficaces en el tratamiento del asma (91).

La implicación de los leucotrienos en la patogenia del asma es

relevante en todos los casos, independientemente de su asociación con

atopia. Sin embargo, la alteración en el metabolismo del ácido araquidónico,

ya sea por mediación de la vía de la 5-LO o de la cicloxigenasa-1 (COX-1)

(ver a continuación), es particularmente relevante en la “patología

respiratoria exacerbada por aspirina”, frecuentemente denominada “asma

inducido por acido acetil salicílico (AAS)”

1.7. Patología respiratoria exacerbada por aspirina

(AERD: Aspirin exacerbated respiratoty disease)

La AERD se define por la combinación de las tres características

clínicas siguientes:

Tesis Doctoral


27

1. Asma.

2. Rinosinusitis crónica con poliposis nasal.

3. Reacción adversa al AAS y otros inhibidores de la COX-1.

Los pacientes que presentan solo empeoramiento del asma inducido

por AAS u otros analgésicos del grupo de los antiinflamatorios no

esteroideos (AINEs), se incluyen también bajo esta denominación. El

término de AERD destaca la implicación de la vía aérea superior e inferior

en esta patología y la intolerancia a AINES como un desencadenante

importante, pero no imprescindible. La rigurosa evitación de AINEs, sin

embargo, no implica una mejoría en la rinitis y/o en el asma (92, 93).

El primer caso de sensibilización a AAS fue descrito en 1902, solo unos

años después de haber sido introducida esta medicación en el uso clínico.

En 1968, Samter y Beers describen la triada de síntomas característicos,

que en pocos años ya se conocería como “Triada de Samter” o “Triada AAS”

(94).

La AERD se diagnostica normalmente en la edad adulta, ya que la

afectación en niños y adolescentes es considerablemente menor. La

mayoría de los pacientes comienzan padeciendo rinitis persistente en la

tercera década de la vida. Los síntomas se intensifican de forma progresiva

presentando con frecuencia anosmia y poliposis. A medida que avanza la

inflamación de las vías respiratorias superiores, de forma característica, se

afectan las vías aéreas inferiores. En algún punto de esta progresión

aparece la intolerancia a AINES. El asma y la rinosinusitis de estos

pacientes empeoran con el tiempo, incluso realizando una rigurosa evitación

de AINEs (95).

La fisiopatología de AERD no está del todo aclarada. Existe una

sobreproducción de productos proinflamatorios derivados del metabolismo

del ácido araquidónico, en particular de leucotrienos. La inhibición de la

Tesis Doctoral


28

COX-1 por parte de los AINES implica una menor producción de

prostaglandina E2 (PGE2), reduciéndose por lo tanto el efecto inhibidor que

ésta ejerce sobre la 5-LO de la vía del ácido araquidónico y aumentando la

producción de leucotrienos. En consecuencia, resulta en un desequilibrio

entre mediadores proinflamatorios y antiinflamatorios, a favor de los

primeros.

Como ya se ha mencionado, el ácido araquidónico se libera desde los

fosfolípidos de membrana y es metabolizado por diferentes vías, para

generar distintos mediadores lipídicos, tanto proinflamatorios como

antiinflamatorios. El metabolismo del ácido araquidónico mediado por la 5-

LO genera leucotrienos. Los CysLT (LTC4, LTD4, LTE4), son potentes

proinflamatorios e inducen broncoconstricción, secreción mucosa y edema

de la vía aérea. Además, son potentes quimiotácticos para eosinófilos,

aumentando su número en la vía aérea. El LTB4 es también proinflamatorio

y quimiotáctico para neutrófilos y monocitos (96-98).

El metabolismo de ácido araquidónico mediado por la vía de la COX,

también llamada prostaglandín sintetasa, genera prostaglandinas y

tromboxanos (Figura 1). La prostaglandina D2 (PGD2) es producida

fundamentalmente por mastocitos y tiene un efecto broncoconstrictor; sus

niveles basales son más altos en pacientes con AERD y se elevan tras

exposición a AAS (99). A su vez, la PGE2 es broncodilatadora y tiene un

potente efecto antiinflamatorio, debido, en gran parte, al afecto inhibidor

que ejerce sobre la producción de leucotrienos, disminuyendo la actividad

de la 5-LO.

En conclusión, en los pacientes con AERD se ha demostrado

concentraciones elevadas de moléculas proinflamatorias y disminuidas de

moléculas antiinflamatorias, tanto en situación basal como tras exposición a

AINEs (100, 101). Algunas de las alteraciones más significativas que se han

identificado en estos pacientes son las siguientes:

Tesis Doctoral


29

1. Existe un número mayor de mastocitos y eosinófilos activados en el

tracto respiratorio de pacientes con AERD. Ambas células tienen la

capacidad de producir grandes cantidades de LTC4 (102-104).

2. La sintasa del LTC4, responsable de la producción de LTC4 a partir de

LTA4 (proceso que tiene lugar en el citoplasma de eosinófilos,

basófilos, mastocitos y macrófagos), está sobreexpresada en

eosinófilos y otros leucocitos de la vía aérea superior e inferior de

pacientes con AERD (103-105).

3. Los leucocitos de la mucosa nasal en pacientes con AERD expresan

mayor cantidad de receptores de leucotrienos (106) y, al mismo

tiempo, una isoforma del receptor para PGE (EP-2) está descendida

(107).

4. Los niveles de lipoxina A1, mediador antiinflamatorio derivado de la

vía de la 5-LO, están bajos en pacientes con AERD (108).

5. Los niveles de PGE2 en tejido polipoideo y de vías respiratorias

inferiores de los pacientes con AERD están disminuidos en situación

basal y descienden más tras provocación con AAS. Como ya se ha

mencionado, la PGE2 es un importante inhibidor de la síntesis de

leucotrienos (109, 110).

6. La inhalación de PGE2 previene la reacción tras la inhalación de acetil

salicilato de lisina, así como el aumento de CysLT (111).

7. Los fármacos antileucotrienos, tanto los antagonistas de receptores

(montelukast) como los inhibidores de la síntesis (zileutón), bloquean

o atenúan la broncoconstricción tras exposición a AAS (97, 112, 113).

1.8. Genes de la vía de síntesis de leucotrienos. Vía de

la 5-Lipoxigenasa (5-LO)

Algunos de los genes que codifican las proteínas más importantes

involucradas en la formación de leucotrienos y sus receptores se describen

en la Tabla 2:

Tesis Doctoral


30

Tabla 2: Característica moleculares de los genes que codifican la vía de la

5-LO y sus receptores.

Genes Localización

genética.

Longitud del

gen (kb)

Número

de exones

Número de

residuos

proteicos

ALOX5 10q11.2 82 14 673

ALOX5AP 13q12 31 5 162

LTC4S 5q35 2.5 5 150

LTA4H 12q22 35 19 610

CYSLTR1 Xq13-q21 54.9 3 337

CYSLTR2 13q14 2.8 1 346

LTB4R1 14q11.2-q12 5 3 352

LTB4R2 14q11.2-q12 2.8 1 389

ALOX5: 5-Lipoxigenasa; ALOX5AP: Proteína activadora de la 5-Lipoxigenasa (FLAP); LTC4S:

Sintasa del leucotrieno C4; LTA4H: Hidrolasa del leucotrieno A4; CYSLTR1-R2: Receptor de

cisteinil leucotrienos 1 y 2 respectivamente; LTB4R1-R2: Receptor del leucotrieno B4 1 y 2

respectivamente.

El gen de la 5-LO (ALOX5) se localiza en el locus 10q11.2, tiene una

longitud de 82kb y codifica un polipéptido de 673 aminoácidos y 85 kDa

(114, 115). La señal de inicio de transcripción se localiza a 65 pares de

bases del codón de inicio ATG y no hay secuencias TATA ó CAAT en el

promotor. La actividad del gen se regula a nivel transcripcional,

manteniendo unos niveles basales constantes de ARNm que aumentan

rápidamente con la activación celular (116, 117). La transcripción de ALOX5

depende, en parte, de una región promotora rica en Guanina (G) y Citosina

(C), que contiene variantes genéticas de inserción–delección. La forma más

común contiene cinco motivos de unión en tandem a proteínas con dedo de

zinc (Sp1/Erg-1) (las proteínas con dedo de zinc se unen a series de

repeticiones en tandem). Se han descrito mutaciones caracterizadas por la

adición o delección de estos motivos (-GGGCGC-) (118-121). Otro nivel de

regulación es la translocalización (dependiente de calcio) de la 5-LO del

citoplasma a la membrana nuclear, para acercarla a su sustrato e

Tesis Doctoral


31

incrementar su actividad (78, 122). La FLAP es fundamental para la

actividad de 5-LO. Está compuesta por 162 aminoácidos, tiene un peso

molecular de 18 kDa y está codificada por el gen ALOX5AP. Dicho gen, a su

vez, está formado por cinco exones y cuatro intrones de mayor longitud,

localizados en el cromosoma 13q12. Análisis con DNAc han revelado que

esta proteína se encuentra altamente conservada en mamíferos (123).

Tanto la 5-LO como la FLAP actúan sobre el ácido araquidónico, que

es liberado de los fosfolípidos de membrana por la acción de la fosfolipasa

A2 (PLA2). La PLA2 contiene 749 aminoácidos y tiene un peso molecular de

85 kDa. Está codificada por un gen localizado en el cromosoma 1q25

(PLA2G4), cuya estructura genómica no está esclarecida todavía (124). Las

dos enzimas responsables de formar CysLT y LTB4 a partir de LTA4 son,

como ya se ha descrito con anterioridad, la sintasa del LTC4 y la hidrolasa

del LTA4, respectivamente. La sintasa del LTC4 tiene un peso molecular de

18 kDa y está formada por 150 aminoácidos. Está codificada por el gen de

la sintasa del LTC4, localizado en el cromosoma 5q35, y contiene 2.5 kb con

cinco exones. Presenta dos sitios de fosforilación potenciales de la proteína

C kinasa y un sitio de N-glicosilación. El 31% de los aminoácidos son

idénticos a los de FLAP y esta homología es especialmente relevante en la

región N-terminal. La estructura secundaria presenta 3 dominios

hidrofóbicos y 2 loop hidrofílicos. La sintasa del LTC4 de ratón también

contiene 150 aminoácidos y el 88% de la secuencia es similar a la del

humano; las diferencias entre la sintasa del LTC4 humana y la del ratón se

sitúan en 18 aminoácidos, de los cuales 9 se localizan en la región carboxi-

terminal de la proteína del ratón (125). En estudios de promotores se ha

identificado tres sitios posibles de inicio de la transcripción, localizados a -

96, -69 y -66 respecto de ATG. También se ha identificado algunas

secuencias de reconocimiento para factores de transcripción, tales como

Sp1, AP-1, AP-2 y GATA-1 (126).

La hidrolasa del LTA4 tiene 69 kDa de peso molecular, el gen que

codifica su síntesis está localizado en el cromosoma 12q22, compuesto por

Tesis Doctoral


32

35 kb y contiene 19 exones. Se ha descrito múltiples secuencias de

reconocimiento para factores de transcripción y un sitio posible de inicio de

la transcripción a -151 de ATG (127).

1.8.1 Asociación genética y asma

1.8.1.1. ALOX5: El 5ÚTR del gen ALOX5 (5ÚTR y 3ÚTR: son dos partes

no traducidas de cada gen que se encuentran colindando el

“marco de lectura”) ha sido bien caracterizado. Mediante

resecuenciación de mutaciones en muestras de ADN de pacientes

asmáticos, en la región 176-146 bp corriente arriba de ATG

(región rica en GC), se observan adiciones de uno o delecciones

de uno o dos sitios de unión del factor de transcripción “dedos de

zinc” (Sp1/Egr-1), resultando en una menor capacidad de unión

de éste y una menor trascripción del gen (80, 128). La mutación

de las repeticiones en tandem del sitio de unión de Sp1 en la

región promotora ha sido objeto de varios estudios. Se ha

asociado con hiperreactividad bronquial, pero no con asma, en

algunas publicaciones (129, 130), y se ha propuesto como

marcador de gravedad en otras (121). Así mismo, otros autores

no han encontrado ninguna relación con asma ni fenotipos

relacionados (131). Se resumen estos hallazgos en la Tabla 3.

Tesis Doctoral


33

Tabla 3: Gen ALOX5

Polimorfismo Localización Población Asociación Referencia

Japonesa No AERD Kawagishi y cols.

(129)

Coreana No asma

Sí AERD

Sí

hiperreactividad

bronquial

Kim y cols.(130)

UK

caucásica

No asma

No atopia

Sayers y cols. (131)

Repeticiones

de Sp1

P

Turca Sí gravedad

asma

Sí asma inducido

por ejercicio

Kalayci y cols. (121)

1.8.1.2. ALOX5AP: Se ha identificado dos polimorfismos en su región

promotora, un cambio Guanina por Adenina (A) en -336 y una

repetición de A en posición -169 hasta -146, dando lugar a los

alelos 19A y 23A. En una cohorte de 341 familias caucásicas con

asma, no se encontró asociación con asma analizando la región

promotora y la transcripción basal del gen (131). En una

publicación japonesa, sin embargo, se objetivó una asociación,

estadísticamente significativa, entre asmáticos y una mayor

frecuencia del alelo 21A comparado con controles (p=0.035)

(132)

En la actualidad, el gen ALOX5AP ha sido completamente

secuenciado y se han identificado múltiples SNPs, algunos de ellos

asociados a asma y fenotipos de atopia, lo que sugiere que

algunas marcas del gen son predictivas de susceptibilidad de la

enfermedad (81, 133) (Ver Tabla 4).

Tesis Doctoral


34

Tabla 4: Gen ALOX5AP


18A-21A

repeticiones

Japonesa Sí asma.

Koshino y cols.

(132)

23A-19A

repeticiones

Coreana No AERD

Kim y cols. (130)

-336 G>A, 23A-

19A

repeticiones

P

UK

caucásica

No asma

No atopia


SNPs:

G>A (SG13S25,

SG13S89)

T>A(SG13S114)

C>A (SG13S32)

A>G (SG13S41)

5´UTR

UK

caucásica

Sí asma y

fenotipos

relacionados con

atopia

Hollowat y cols.

(133)

1.8.1.3. Gen de la sintasa de LTC4 (LTC4S): Este gen codifica a la

principal enzima implicada en la síntesis de los CysLT y, por este

motivo, ha sido objeto de muchos estudios de asociación

genética. Destaca el SNP localizado en -444 corriente arriba de

ATG (-444 A>C, rs730012), que se ha asociado con asma,

intolerancia a AINEs y/o gravedad del asma en aproximadamente

la mitad de los estudios realizados (83, 129, 134, 135). Estudios

de SNPs diferentes de la región promotora (-1072 G>A) no han

encontrado asociación (136). Estos datos se resumen en la Tabla

5.

Tesis Doctoral


35

Tabla 5: Gen de la sintasa del LTC4


-1072 G>A UK

caucásica

No asma

No atopia


Japonesa Sí AERD

Kawagishi y cols.

(129)

Australiana

caucásica

Sí asma

Kedda y cols. (134)

UK

caucásica

Sí gravedad

asma

Sampson y cols.

(135)

-444 A>C

(rs730012)

P

Polaca Sí AERD Sanak y cols. (83)

Tesis Doctoral


36

2. HIPÓTESIS DE TRABAJO

El asma es una enfermedad multifactorial en la que influyen tanto

factores ambientales como genéticos. En los últimos años se han

identificado numerosos genes relacionados con el asma. Los estudios de

polimorfismos en dichos genes han intentado determinar su influencia en el

desarrollo de esta entidad.

Siendo el asma una enfermedad con un marcado componente

inflamatorio, muchos de los genes identificados son genes que codifican

citocinas, moléculas esenciales en el desarrollo de la respuesta inflamatoria.

Nuestra principal hipótesis de trabajo es que ciertas variantes génicas

que afectan a la vía de la síntesis de los leucotrienos podrían estar

relacionadas con el asma y con su gravedad.

Tesis Doctoral


37

3. OBJETIVO

3.1. Objetivo primario

• Analizar el efecto de los polimorfismos LTCS -444 A/C, ALOX5 -176/-

147 y ALOX5AP -69/-146 en la susceptibilidad a padecer asma, y de

que ésta sea más grave, en la población de Gran Canaria.

• Reproducir en nuestra población estudios que señalan a estos

polimorfismos como factores de riesgo de esta enfermedad.

3.2. Objetivo secundario

• Identificar, si es posible, marcadores en el genoma que sean capaces

de permitir la caracterización de los pacientes analizados para, en un

futuro, predecir el riesgo de desarrollar asma e, incluso, mejorar la

calidad del manejo de dichos pacientes.

• Analizar la asociación entre los polimorfismos LTCS -444 A/C, ALOX5

-176/-147 y ALOX5AP -69/-146 y la intolerancia a AINEs, en nuestra

población.

• Analizar la asociación entre atopia e intolerancia a AINEs con el riesgo

a padecer asma de mayor gravedad.

• Evaluar la movilidad entre los distintos escalones de gravedad en el

asma (clasificación según los criterios clínicos de la GEMA) (3),

durante un periodo de un año, en los pacientes asmáticos incluidos

en el estudio y clasificados desde la primera consulta.

Tesis Doctoral


38

4. MATERIAL Y METODOS 4.1. Estudio de casos y controles. Diseño.

Se analizaron un total de 193 pacientes no emparentados,

seleccionados entre los que acudían a consultas externas del Servicio de

Alergología del Hospital Universitario de Gran Canaria Dr. Negrín (centro de

referencia para el área norte de la isla de Gran Canaria). Todos los

pacientes se incluyeron en un periodo de cinco meses. Una vez reclutados,

fueron atendidos en visitas trimestrales durante un periodo de un año. El

estudio fue presentado, revisado y aceptado por el Comité Ético del

Hospital. Todos los participantes, tanto del grupo de asmáticos como del

grupo control, fueron debidamente informados de las características del

estudio y firmaron un consentimiento informado antes de ser incluidos en

él.

Los principales datos de filiación de todos los participantes se

emplearon en la identificación inicial, pero no se utilizaron en el análisis

ulterior, que se realizó respetando el anonimato del paciente. Se registró la

edad, el sexo y la fecha de nacimiento, así como la fecha de cada una de las

consultas a las que asistieron.

Los 193 individuos se reclutaron en un periodo de cinco meses y se

incluyó tanto a los pacientes que acudían a primera visita como a visita de

revisión o sucesiva. Todos los sujetos incluidos eran mayores de 18 años,

caucásicos y no emparentados entre sí. La muestra se compuso de 111

pacientes asmáticos y 82 no asmáticos (grupo control).

Los sujetos del grupo control (n=82) se incluyeron una vez aceptaron

participar en el estudio y siempre que cumplieran los siguientes requisitos:

no padecer asma, no ser atópicos y no tener historia de intolerancia a

AINEs.

A todos los pacientes del grupo de asmáticos (n=111) se les hizo una

evaluación y seguimiento en consulta, cada tres meses durante un periodo

Tesis Doctoral


39

de un año, atendidos siempre por el mismo Facultativo Especialista en

Alergología (Tabla 6).

Tabla 6: Diseño del estudio

1ª VISITA mes 0

2ª VISITA mes 3

3ª VISITA mes 6

4ª VISITA mes 9

5ª VISITA mes 12

Extracción de sangre

para análisis genético

Extracción de sangre

para análisis genético

Revisión

Pruebas de función respiratoria

Ajuste de tratamiento

Clasificación de la gravedad del asma (GEMA)

Se evaluaron una serie de variables que se detallan a continuación.

4.2. Datos clínicos y analíticos

4.2.1. Asma: Los pacientes asmáticos se seleccionaron de entre aquellos

que acudían por primera vez a consultas, y también entre los que

acudían a revisión, con diagnóstico previo de asma o clínica

sugestiva (tos, sibilancias, opresión torácica y/o disnea). En todos

los casos, se verificó la presencia de obstrucción reversible al flujo

aéreo, mediante al menos uno de los siguientes criterios:

• Diferencia mayor o igual al 20% en mediciones del flujo

espiratorio pico (PEF), medido durante al menos dos semanas,

tres mediciones diarias.

Tesis Doctoral


40

• Incremento mayor o igual al 12% del volumen espiratorio forzado

en un segundo (FEV1), con un volumen mínimo de 200 ml, tras la

inhalación de un agonista β2.

• Incremento mayor o igual al 20% del FEV1 tras la administración

de tratamiento con corticoides inhalados, con o sin

broncodilatadores, durante un mes consecutivo.

• Test de metacolina positivo: Descenso de al menos un 20% en el

FEV1, tras la inhalación de dosis crecientes de metacolina.

Se clasificó a los pacientes, según los criterios de gravedad de

la guía GEMA (3), en asma persistente grave, cuando cumplían las

características clínicas expuestas en la Tabla 7. Como es lógico, la

mayoría de los pacientes incluidos ya recibían tratamiento para el

asma y estaban bien controlados. En estos casos, se estableció la

clasificación de gravedad según el escalón terapéutico en que se

encontraban para mantener el control de la enfermedad (137). Se

consideró asma persistente grave cuando se encuadraban en el

escalón terapéutico 5: glucocorticoides inhalados a dosis altas

(budesonida inhalada o equivalente a dosis mayor a 800 µg/día)

asociados a agonista β2 de acción prolongada. Se consideró que se

alcanzaba el control del asma cuando las manifestaciones clínicas

del asma estaban ausentes, o se habían reducido al máximo por las

intervenciones terapéuticas, y se cumplían todos los objetivos del

tratamiento.

Los pacientes asmáticos que no cumplían ninguno de los criterios de

gravedad expuestos, se clasificaron como “asmáticos no graves”.

Tesis Doctoral


41

Tabla 7: Criterios clínicos para Asma Persistente Grave

Síntomas diurnos Síntomas continuos. Varias veces al día

Utilización medicación de rescate

(agonistas β2 de acción corta)

Varias veces al día

Síntomas nocturnos Muchos

Limitación de la actividad Mucha

Función pulmonar (FEV1) % teórico. ≤ 60

Exacerbaciones Dos o más al año

Como ya se ha mencionado, todos los pacientes del grupo de

asmáticos fueron revisados por el mismo facultativo en cinco

ocasiones a lo largo de un año (consultas trimestrales: ver Tabla 6).

Así mismo, en caso de exacerbación de su enfermedad, se les

atendía sin cita previa. En cada una de las visitas programadas

trimestralmente, se evaluaba el control de la enfermedad y se

ajustaban el tratamiento y la clasificación, según criterios de la

GEMA 2009 (3), ya expuestos.

En la quinta y última visita, se clasificó definitivamente a los

pacientes en dos grupos, según los criterios GEMA de gravedad, en

asmáticos con asma persistente grave y cualquier otro escalón de

gravedad:

• Asma persistente grave: n=62

• Asma no grave (intermitente o persistente leve-

moderada): n=49

4.2.2. Atopia: Se consideraron atópicos a aquellos pacientes que

mostraron una o más positividades en las pruebas cutáneas en prick

a aeroalérgenos habituales, realizadas en consulta, y/o la presencia

Tesis Doctoral


42

de IgE específica positiva a algún alérgeno.

Las pruebas cutáneas en prick se realizaron utilizando una

batería estándar con los aeroalérgenos más comunes en nuestro

medio (ALK-Abelló, Hørsholm, Denmark), y que incluyó:

Dermatophagoides pteronyssinus (Dpt), Dermatophagoides farinae,

Euroglyphus Maynei, Blomia Tropicalis, Acarus Siro, Tyrophagus

putrescentiae, Lepidoglyphus destructor, Aspergillus fumigatus,

Cladosporium herbarum, Alternaria alternata, Penicillium notatum,

Olea europaea, Lolium perenne, Artemisia vulgaris, látex, mezcla de

plumas, y derivados dérmicos de gato, perro, caballo, cucaracha y

conejo. Se consideraron positivos todos los alérgenos con un

diámetro mayor de la pápula ≥ de 3 mm respecto al control neativo,

transcurridos 15 minutos desde la punción.

Los niveles de IgE total e IgE específica frente a Dpt, se

midieron con el analizador Immulite 2000 (DPC, Los Angeles,

California, USA), a partir suero obtenido de la extracción de sangre

periférica. El punto de corte para la positividad se estableció en

niveles ≥ 0.35 Ku/L para la IgE específica y ≥ 100 Ku/L para la IgE

total.

4.2.3. Prueba de función respiratoria: Se consideró los valores de FEV1

y capacidad vital forzada (FVC) de la espirometría realizada en la

última visita programada. Se utilizó siempre la mejor de tres

maniobras (con un máximo de 8 maniobras). El espirómetro

utilizado a lo largo de todo el periodo de estudio fue un “FlowScreen

spirometer” (Viasys Healthcare, Conshohocken, Pennsylvania, USA).

Se realizaron las calibraciones reglamentarias diarias de este

aparato.

Tesis Doctoral


43

4.2.4. Tolerancia a AINEs: El diagnóstico de Intolerancia a AINEs se

estableció mediante criterios clínicos y de exposición oral

controlada.

En aquellos casos en los que el paciente hubiera presentado

reacción adversa con dos o más AINEs diferentes, el diagnóstico se

consideraba definitivo sin necesidad del test de exposición oral.

En los pacientes con asma grave, o asma no grave pero mal

controlada, no se realizó test de exposición oral en ningún caso.

El diagnóstico no se consideraba definitivo si no se les había

realizado un test de exposición oral controlada con anterioridad, o

no habían tenido reacción adversa con dos o más AINEs.

4.2.5. Resumen: Se recopilaron los siguientes datos de las historias

clínicas:

• Edad.

• Sexo.

• Raza y orígenes.

• Edad de inicio y duración del asma.

• Atopia.

o Pruebas cutáneas en prick frente a batería de

aeroalérgenos.

o Determinación de IgE total.

o Determinación de IgE específica frente a Dpt.

• Función respiratoria: FEV1, FVC.

• Tolerancia AINEs.

• Clasificación según gravedad.

• Tratamiento habitual.

Tesis Doctoral


44

4.3. Determinaciones genéticas

Todas las determinaciones genéticas se llevaron a cabo en la Unidad

de Investigación del Hospital Universitario de Gran Canaria Dr. Negrín.

4.3.1. Extracción de ADN genómico

De cada individuo participante en el estudio se obtuvieron dos

muestras de sangre venosa periférica, que fue procesada según el método

del fenol-cloroformo. Brevemente, el protocolo consiste en aislar y lisar las

células blancas para, a continuación, extraer el ADN mediante una serie de

lavados con fenol/cloroformo y alcohol isoamílico. Con posterioridad, se

precipita el ADN con cloruro sódico e isopropanol y se lava con etanol 70%.

El precipitado obtenido se seca completamente en un concentrador-

evaporador, en vacío y con calor, y se resuspende, una vez seco, en una

solución de Tris y EDTA. Los ADN así obtenidos se midieron por

espectrofotometría para determinar su concentración, ajustándose

posteriormente la misma a 100 ng/µl.

4.3.2. Tipaje del SNP LTC4S -444 A/C

Este SNP se determinó mediante una amplificación génica por la

técnica de la reacción en cadena de la polimerasa, seguida de la digestión

del fragmento amplificado con una enzima de restricción específica de

secuencia (PCR-RFLP).

Para la amplificación se utilizaron los siguientes cebadores:

LTC4Sa 5’-TCCATTCTGAAGCCAAAGGC-3’

LTC4Sb 5’-GTCACAGCAGCCAGTAGAGC-3’

Las reacciones se llevaron a cabo con 100 ng de ADN genómico,

desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs) a una concentración de 2 mM cada uno,

MgCl2 1,5 mM, dimetil-sulfóxido (DMSO) al 10%, 5 pmol de cada cebador y

0,5 U de polimerasa Taq (Ecogen, Barcelona, España), en un volumen total

Tesis Doctoral


45

de 25 µL. La PCR se realizó en un termociclador GeneAmp PCR System

9700 (Applied Biosystems, Foster City, California, EEUU), en las siguientes

condiciones: desnaturalización a 94ºC durante 5 minutos; 30 ciclos de

desnaturalización a 94ºC durante 30 segundos, alineamiento a 59ºC

durante 30 segundos y elongación a 72ºC durante 1 minuto; extensión final

a 72ºC durante 10 minutos.

La existencia de producto amplificado se comprobó mediante

electroforesis en un gel de agarosa al 2% y tinción con bromuro de etidio. El

producto de la PCR, un fragmento de 563 pb de longitud fue digerido con la

enzima de restricción MspI, siguiendo las instrucciones del fabricante

(Bioron GmbH, Ludwigshafen, Alemania). Los fragmentos resultantes de la

digestión fueron visualizados mediante electroforesis en gel de agarosa al

3% y tinción con bromuro de etidio. Los patrones de bandas obtenidos

fueron los esperados: 446 y 117 pb para el alelo A; 446, 85 y 32 pb para el

alelo C.

4.3.3. Tipaje de los polimorfismos ALOX5 -176/-147 y ALOX5AP -

169/-146

Estos polimorfismos se estudiaron simultáneamente mediante una

PCR múltiple y posterior análisis del tamaño de los fragmentos obtenidos.

Los cebadores específicos utilizados fueron los siguientes:

ALOX5a 5’-AGGACCAGACACCTCGCTGAGGAGAGAC-3’

ALOX5b 5’-GAGCAGCGAGCGCCGGGAGCCTCGGC-3’

ALOX5APa 5’-GGGAAGTTTCCCATGAACA-3’

ALOX5APb 5’-ACCATTCTCGACCACGCTGAT-3’

Los cebadores ALOX5a y ALOX5APa estaban marcados con los

fluoróforos 6-FAM y HEX, respectivamente (Applied Biosystems).

Tesis Doctoral


46

La amplificación se realizó en un volumen de 15 µL que contenía 50

ng de DNA genómico, dNTPs 2 mM cada uno, MgCl2 1,5 mM, 4 pmol de

cada cebador y 0,5 U de polimerasa Taq (Ecogen). Las condiciones de la

PCR, llevada a cabo en un termociclador GeneAmp PCR System 9700

(Applied Biosystems), fueron las siguientes: desnaturalización a 94ºC

durante 5 minutos; 28 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 30

segundos, alineamiento a 58ºC durante 40 segundos y elongación a 72ºC

durante 40 segundos; extensión final a 72ºC durante 10 minutos.

El tamaño de los distintos fragmentos obtenidos de la PCR fue

determinado mediante electroforesis capilar en un secuenciador ABI PRISM

310 (Applied Biosystems) y posterior análisis con el programa GeneScan

v3.1.2. Para el análisis del polimorfismo ALOX5 -176/-147 se produjeron

fragmentos de 255 pb (deleción de 12 pb), 261 pb (deleción de 6 pb), 267

(tipo salvaje) y 273 pb (adición de 6 pb). Para el polimorfismo ALOX5AP -

169/-146 se obtuvieron fragmentos de 357 y 361 pb, que se corresponden

con 19 y 23 repeticiones de adenosina, respectivamente.

4.3.4. Confirmación de secuencias

Algunas muestras con genotipos homocigotos para los polimorfismos

ALOX5 -176/-147 y ALOX5AP -169/-146 fueron secuenciadas, con el fin de

comprobar que los distintos alelos habían sido identificados correctamente.

Para ello se utilizó el kit BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems) y los

mismos cebadores de la PCR. Las muestras fueron sometidas a

electroforesis capilar en un secuenciador ABI PRISM 310 (Applied

Biosystems) y los resultados analizados con el programa DNA Sequencing

Analyser 3.4.1.

4.4. Análisis estadístico

Las desviaciones de la distribución normal se evaluaron mediante la

prueba de Kolmogorov-Smirnov. Las diferencias entre variables

Tesis Doctoral


47

cuantitativas se estudiaron con la prueba de Mann-Whitney. El equilibrio de

Hardy-Weinberg se evaluó mediante la prueba de chi-cuadrado.

El efecto de las distintas variantes genéticas en la susceptibilidad a la

enfermedad se determinó como odds ratio (OR), con sus correspondientes

intervalos de confianza del 95% (IC 95%). Un valor de p menor o igual a

0,05 fue considerado significativo. Todos los análisis se llevaron a cabo con

el programa SPSS v13.

Tesis Doctoral


48

5. RESULTADOS

5.1. Datos de la población

Las características generales y clínicas de los individuos participantes

en el estudio se muestran en las Tablas 8, 9 y 10.

Tabla 8. Características demográficas de los individuos participantes en el

estudio.

Asma

persistente

grave

(n=62)

Asma

no grave

(n=49)

Controles

(n=82)

P Prueba

Sexo (H/M) 10/52 10/39 26/56 0,076 χ2

Edad (mediana

(rango))

44 (18-79) 35 (18-72) 30 (18-65) * M-W

Edad de comienzo

(mediana (rango))

16 (0-53) 13 (0-62) 0,169 M-W

Años de evolución

(mediana (rango))

23 (3-63) 20 (4-45) 0,077 M-W

Antecedentes

familiares (n (%))

40 (64,5) 26 (53,1) 0,548 χ2

*Asma grave/Controles, P=0,000; Asma no grave/Controles, P=0,007; Asma grave/Asma no

grave, P=0,002.

Los pacientes del estudio fueron mayoritariamente mujeres (82%),

aunque la proporción de ambos sexos fue equivalente en los tres grupos. La

edad media difirió significativamente, siendo mayor en el grupo de

asmáticos graves que en el de asmáticos no graves y mayor en cualquier

grupo de asmáticos comparado con los controles.

La edad de comienzo del asma, así como los años de evolución de la

enfermedad, son ligeramente mayores en los asmáticos graves, sin que

existan diferencias significativas.

Tesis Doctoral


49

Los antecedentes familiares, entendidos como tener diagnóstico de

asma en padres y/o abuelos, entre los pacientes asmáticos incluidos en el

estudio, fueron similares.

Tabla 9. Características específicas de alergia y reflujo gastroesofágico

(RGE) de los individuos participantes en el estudio.

Asma

persistente

grave

(n=62)

Asma

no grave

(n=49)

P Prueba

Pruebas alérgica positivas frente

a aeroalérgenos (n (%))

43 (69,4) 46 (93,9) 0,001 χ2

IgE total en Ku/L (mediana

(rango))

159 (0-2000) 196 (0-

2000)

0,785 M-W

IgE Dpt> 0,35 ku/L (n (%)) 35/56 (56,5) 36/44 (73,5) 0,035 χ2

Intolerancia AINES (n (%)) 6 (9,7) 7 (14,3) 0,556 χ2

Rinitis (n (%)) 61 (98,4) 49 (100) 1,000 χ2

RGE (n (%)) 25 (40,3) 28 (57,1) 0,088 χ2

El porcentaje de sujetos con pruebas cutáneas en prick positivas

frente a uno o más de los aeroalérgenos más habituales en nuestro medio,

fue significativamente más elevado en el grupo de asma no grave,

comparado con el grupo de asma grave. Destaca que, la presencia de

pruebas alérgicas en prick test positivas entre los pacientes con asma no

grave fue del 94%, frente a un 69% en los asmáticos graves. En relación

directa con estos hallazgos, la IgE específica frente a Dpt (alérgeno más

prevalente de nuestro área) estaba elevada con más frecuencia en los

pacientes con asma no grave. Sin embargo, no se detectaron diferencias

significativas con respecto a los niveles de IgE total.

La intolerancia a AINEs, la presencia de rinitis y/o de RGE tampoco

mostraron diferencias estadísticamente significativas entre ambos grupos.

Tesis Doctoral


50

Tabla 10. Características de función respiratoria y tratamiento de los

individuos participantes en el estudio.

Asma persistente

grave

(n=62)

Asma

no grave

(n=49)

P Prueba

% FVC (media (± DE)) 70 (34-89) 85 (54-130) 0,000 M-W

% FEV1 (media (±

DE))

70 (32-93) 88 (44-117) 0,000 M-W

β2 corta (n (%)) 48 (77,4) 27 (55,1) 0,015 χ2

β2 larga (n (%)) 62 (100) 34 (69,4) 0,000 χ2

Anti-LT (n (%)) 53 (85,5) 10 (20,4) 0,000 χ2

Xantina (n (%)) 6 (9,7) 0 (0) 0,033 χ2

Anticolinérgicos (n

(%))

13 (21,0) 0 (0) 0,000 χ2

CS inhalados (n (%)) 62 (100) 36 (73,5) 0,000 χ2

Los parámetros de función respiratoria (FEV1 y FVC) estaban

significativamente descendidos en los pacientes con asma persistente grave

(Tabla 10). Del mismo modo, la medicación necesaria fue muy superior en

el grupo de asma persistente grave.

Estas diferencias observadas entre los distintos grupos de gravedad

del asma, tanto en los parámetros de función respiratoria como en los

requerimientos de fármacos y las posologías prescritas, son las esperadas,

puesto que la inclusión de los pacientes en las diferentes escalas de

gravedad del asma, dependía directamente de estas características.

Estratificando a los pacientes por sexo, las diferencias que se

aprecian entre los grupos de asmáticos, son superponibles a las expuestas

para el total de la población: las mujeres con asma grave son mayores que

las pacientes con asma no grave, y hay una prevalencia de atopia

significativamente mayor en el grupo de pacientes con asma no grave

(Tabla 11).

Tesis Doctoral


51

Tabla 11. Características de las mujeres incluidas en el estudio.

MUJERES

Asma

grave

(n=52)

Asma no

grave

(n=39)

P Prueba

Edad (mediana (rango)) 44,5 (20-

79)

36,0 (18-72) 0,005 M-W

Mayores de 50 años (n (%)) 22 (42,3) 10 (10,3) 0,001 χ2

Edad de comienzo (mediana

(rango))

16 (0-53) 14 (0-62) 0,245 M-W

Años de evolución (mediana

(rango))

23 (5-54) 20 (5-45) 0,107 M-W

Atopia (n (%)) 34 (65,4) 37 (94,9) 0,001 χ2


β2 corta (n (%)) 43 (82,7) 24 (61,6) 0,022 χ2

Anti-LT (n (%)) 43 (82,7) 6 (15,4) 0,000 χ2

Entre los varones, se encuentra relaciones no significativas en la

mayoría de las variables, probablemente debido al bajo número de

pacientes, hombres, incluidos (Tabla 12).

Comparando el total de pacientes agrupados por sexo, no se obtuvo

diferencias respecto a la gravedad del asma, la edad, ni la presencia de

atopia (Tabla 13). Por lo tanto, existía homogeneidad entre ambos sexos.

Destaca que el número de mujeres incluidas en el estudio es

considerablemente mayor al de varones (cuatro veces superior),

característica común con otros trabajos similares.

Tesis Doctoral


52

Tabla 12. Características de los varones incluidos en el estudio.

VARONES

Asma

grave

(n=10)

Asma no

grave

(n=10)

P Prueba

Edad (mediana (rango)) 38,5 (18-

66)

32,5 (18-54) 0,089 M-W



(rango))

16 (2-40) 7 (0-40) 0,425 M-W


(rango))

24,5 (3-63) 23 (4-40) 0,545 M-W

Atopia (n (%)) 9 (90,0) 9 (90,0) 0,763 χ2

Intolerancia AINES (n (%)) 0 (0) 2 (20,0) 0,237 χ2

β2 corta (n (%)) 5 (50,0) 3 (30,0) 0,325 χ2

Anti-LT (n (%)) 10 (100) 4 (40,0) 0,005 χ2

Tabla 13. Comparación del total de pacientes, agrupados por sexo.

Hombres

(n=20)

Mujeres

(n=91)

P Prueba

Edad (mediana (rango)) 35 (18-66) 42 (18-79) 0,277 M-W

Asma persistente grave 10 (50%) 52 (57%) 0,564 χ2

Asma no grave 10 (50%) 39 (43%) 0,532 χ2


Edad de comienzo (mediana (rango)) 10,5 (0-40) 15 (0-62) 0,291 M-W

Años de evolución (mediana (rango)) 24,5 (3-63) 22,5 (5-54) 0,985 M-W

Atopia (n (%)) 18 (90,0) 71 (78,0) 0,185 χ2

Rinitis (n (%)) 20 (100) 90 (98,9) 0,820 χ2


Anti-LT (n (%)) 14 (70,0) 49 (53,8) 0,142 χ2

Tesis Doctoral


53

En la Tabla 14 se muestran los resultados obtenidos al comparar

todos los pacientes asmáticos con pruebas cutáneas en prick positivas y/o

IgE específica frente a Dpt elevada (asma extrínseco), frente a aquellos con

ambas pruebas negativas (asma intrínseco), es decir, se compara a los

pacientes considerando la variable “atopia”.

Se observaron diferencias significativas en las pruebas cutáneas a

aeroalergenos y en la IgE específica, según lo esperado en base al criterio

de selección. La IgE total también estaba significativamente más elevada en

el grupo de pacientes con asma extrínseco.

Se encontraron diferencias significativas en la edad media de la

enfermedad siendo, como cabía esperar, mayor en pacientes con asma

intrínseca; así, la edad de comienzo del asma prácticamente se duplicaba

en los pacientes con asma intrínseca. Entre los mayores de 50 años, se

encontró una mayor presencia de mujeres que tuvieran asma intrínseca

frente a los varones y, de hecho, un total del 60% de todas las asmas

intrínsecas eran mujeres con más de 50 años de edad. Por otro lado, en

nuestro estudio, ningún varón con más de 50 años había sido diagnosticado

de asma intrínseca. No había diferencias respecto a los años de evolución, a

pesar de que el asma intrínseca era más frecuente en mayores,

probablemente debido a que esta enfermedad comienza en etapas más

tardías de la vida, comparado con el asma extrínseco

Tesis Doctoral


54

Tabla 14. Comparación de los pacientes con asma intrínseca y asma

extrínseca.

Asma

intrínseca

(n=22)

Asma

extrínseca

(n=89)

P Prueba

Sexo (H/M) 2/20 18/71 0,354 χ2

Edad (mediana (rango)) 55,0 (27-79) 36,0 (18-72) 0,000 M-W

Asma persistente grave(n (%)) 19 (86) 43 (48) 0,000 χ2

Asma no grave (n (%)) 3 (14) 46 (52) 0,000 χ2

Hombres mayores de 50 años (n

(%))

0 (0) 4 (4,5) 0,000 χ2

Mujeres mayores de 50 años (n

(%))

13 (60) 13 (14,6) 0,000 χ2


(rango))

25 (2-53) 13 (0-62) 0,002 M-W


(rango))

25 (7-54) 23 (3-63) 0,424 M-W

Ku/L IgE total (mediana (rango)) 51 (0-202) 108 (0-2000) 0,000 M-W

IgE Dpt> 0,35 kU/L (n (%)) 0 (0) 71 (79,8) 0,000 χ2

β2 corta (n (%)) 17 (77,3) 58 (65,2) 0,320 χ2

β2 larga (n (%)) 21 (95,5) 75 (84,3) 0,152 χ2

Anti-LT (n (%)) 18 (81,8) 45 (50,6) 0,007 χ2

Xantina (n (%)) 5 (22,7) 1 (1,1) 0,001 χ2

Anticolinérgicos (n (%)) 5 (22,7) 8 (9,0) 0,130 χ2

CS inhalados (n (%)) 22 (100) 76 (85,4) 0,068 χ2

En el estudio, había un número mayor de asmas intrínsecas en

tratamiento con anti-LT y teofilinas, en comparación con los otros grupos.

Ello es consecuencia de la mayor demanda de medicación entre los asmas

más graves, y reafirma la vinculación directa entre asma intrínseca y

gravedad del asma.

Un 86% del total de pacientes con asma intrínseco padecían asma

persistente grave. Expuesto a la inversa: solo 3 de los 22 pacientes con

Tesis Doctoral


55

asma intrínseco (14%) no tienen asma persistente grave, frente a un 52%

de los pacientes con asma extrínseco. El perfil de pacientes más

característico en el grupo de asma intrínseco y persistente grave era: mujer

mayor de 50 años, que debutó con asma en la edad adulta y lo padecía

desde hacía aproximadamente 25 años.

Se ha asociado con frecuencia la intolerancia a AINEs con el asma

intrínseca y con la gravedad del asma. Sin embargo, la distribución de la

intolerancia a AINEs entre los pacientes asmáticos de nuestra población era

perfectamente homogénea.

No se encontró relación entre la presencia de intolerancia a AINEs y

la atopia (asma extrínseca-asma intrínseca) (Tabla 15). Tampoco se obtuvo

asociación entre intolerancia a AINEs y la gravedad del asma (Tabla 16).

Tabla 15. Relación entre atopia e intolerancia a AINEs.

Asma

intrínseca

(n=22)

Asma

extrínseca

(n=89)

P Prueba

Intolerancia AINES (n

(%))

2 (9,1) 11 (12,4) 1,000 χ2

Tabla 16. Relación entre la gravedad del asma y la intolerancia a AINEs.

Asma persistente

grave

(n=62)

Asma

no grave

(n=49)

P Prueba


Tesis Doctoral


56

5.2. Polimorfismos de la vía de la 5-LO

El análisis del equilibrio de Hardy-Weimberg se cumplía en nuestra

población para los tres polimorfismos estudiados (P=0,508, 0,330 y 0,144

para LTC4S −444 A/C, ALOX5 −176/−147 y ALOX5AP −169/−146,

respectivamente).

Las frecuencias alélicas se muestran en la Tabla 17.

Tabla 17. Frecuencias alélicas.

Polimorfismo Alelo Asma grave Asma no grave Controles

A 0.75 0.80 0.75 LTC4S -444A/C

C 0.25 0.20 0.25

6* 0.02 0.03 0.01

5 0.78 0.69 0.71

4 0.18 0.23 0.26 ALOX5 -147/-176

3 0.02 0.05 0.02

361† 0.84 0.80 0.81 ALOX5AP -169/-

146 357 0.16 0.20 0.19 *Número de sitios de unión para Sp1/Egr1. †pb.

Los genotipos encontrados en nuestra población se detallan en la

Tabla 18.

Tesis Doctoral


57

Tabla 18. Frecuencia de genotipos.

Polimorfismo Genotipo Asma grave Asma no grave Controles

AA 0.56 0.63 0.55

AC 0.39 0.33 0.40 LTC4S -444A/C

CC 0.5 0.4 0.5

5/5 0.68 0.51 0.55

5/- 0.21 0.37 0.32 ALOX5 -147/-176

-/- 0.11 0.12 0.13

361/361 0.77 0.63 0.68

361/357 0.15 0.33 0.26 ALOX5AP -169/-146

357/357 0.8 0.4 0.6

5.2.1. Análisis de genotipos

La posible asociación de los genotipos con la enfermedad, se estudió

utilizando cuatro tipos de modelos de herencia (codominante, dominante,

recesivo y aditivo). Se analizaron, comparando con controles, el total de los

pacientes con asma en su conjunto y, separadamente, los controles con los

dos grupos de gravedad de asma. Estos análisis miden el riesgo de padecer

asma según los distintos polimorfismos y modelos de herencia.

Se analizan también estas las diferencias genéticas bajo los distintos

modelos de herencia en los dos grupos de asmáticos, comparándolos entre

si, para valorar el riesgo de padecer asma de mayor gravedad, cuando ya

se tiene el diagnóstico de asma (Tablas 19-30).

Las tablas de riesgo para los distintos polimorfismos y modelos de

herencia se exponen a continuación con el orden siguiente:

Polimorfismos del LTC4S -444A/C:

• Tabla 19: Controles – Asma persistente grave.

• Tabla 20: Controles – Asma no grave.

• Tabla 21: Total asmáticos - Controles.

Tesis Doctoral


58

• Tabla 22: Asma no grave – asma persistente grave.

Polimorfismos del ALOX5 −176/−147:



• Tabla 25: Total asmáticos - Controles


Polimorfismo ALOX5AP −169/−146:



• Tabla 29: Total asmáticos - Controles


Efecto interacción de los polimorfismos LTC4S –444 A/C, ALOX5 –

176/–147, y ALOX5AP –169/–146:

• Tabla 31

5.2.1.1. LTC4S

Al comparar los SNPs del LTC4S -444A/C entre controles y pacientes

con asma persistente grave (Tabla 19), bajo los cuatro modelos de herencia

posibles, no se encontró ningún SNP que incrementara el riesgo de padecer

asma persistente grave. Tampoco se encontró ningún SNP con efecto

protector frente al desarrollo de asma persistente grave.

Al comparar los SNPs del LTC4S -444A/C entre controles y pacientes

con asma no persistente grave (Tabla 20), no se encontró ningún SNP que

incrementara el riesgo de padecer asma bajo ninguno de los cuatro modelos

de herencia; así mismo, no se encontró ningún SNP con efecto protector

frente al desarrollo de asma.

Tesis Doctoral


59

Tabla 19: Análisis de riesgo del SNP LTC4S −444 A/C en función del modelo

de herencia: controles con asma persistente grave.

LTC4S: Controles / Asma persistente grave

Modeloa Genotipo Controles Asma p. grave OR (IC 95%)

n % n %

Co AA 45 54,9 34 55,7 1

AC 33 40,2 24 39,3 0,96 (0,48-1,92)

CC 4 4,9 3 4,9 0,99 (0,21-4,73)

Re AA-AC 78 95,1 58 95,1 1

CC 4 4,9 3 4,9 1,01 (0,22-4,68)

Do AA 45 54,9 34 55,7 1

AC-CC 37 45,1 27 44,3 0,97 (0,50-1,88)

Ad 0.97 (0,56-1,71) aModelos de herencia: Codominante (Co), Recesivo (Re), Dominante (Do), Aditivo

(Ad)

Tabla 20: Análisis de riesgo del SNP LTC4S −444 A/C en función del modelo

de herencia: controles con asma no persistente grave.

LTC4S: Controles / Asma no grave

Modeloa Genotipo Controles Asma no grave OR (IC 95%)

n % n %

Co AA 45 54,9 31 63,3 1

AC 33 40,2 16 32,7 0,70 (0,33-1,49)

CC 4 4,9 2 4,1 0,73 (0,12-4,21)

Re AA-AC 78 95,1 47 95,9 1

CC 4 4,9 2 4,1 0,83 (0,15-4,70)

Do AA 45 54,9 31 63,3 1

AC-CC 37 45,1 18 36,7 0,71 (0,34-1,46)

Ad 0,76 (0,41-1,41) aModelos de herencia: Codominante (Co), Recesivo (Re), Dominante (Do), Aditivo

(Ad)

Tesis Doctoral


60

Al comparar los SNPs del LTC4S -444A/C entre controles y el total de

pacientes con asma, sin diferenciarlos según gravedad, se reprodujeron los

resultados de los dos supuestos anteriores, en los que se analizaban por

separado a los pacientes con asma persistente grave y no grave con los

controles. No se encontró ningún SNP que aumentara o disminuyera el

riesgo de padecer asma bajo ninguno de los cuatro modelos de herencia

(Tabla 21).

Tabla 21: Análisis de riesgo del SNP LTC4S−444 A/C en función del modelo

de herencia: controles con total de pacientes asmáticos.

LTC4S: Total asmáticos / Controles

Modeloa Genotipo Total asmáticos Controles OR (IC 95%)

n % n %

Co AA 65 59,1 45 54,9 1

AC 40 36,4 33 40,2 0,84 (0,46-1,52)

CC 5 4,5 4 4,9 0,86 (0,22-3,40)

Re AA-AC 105 95,5 78 95,1 1

CC 5 4,5 4 4,9 1,08 (0,28-4,14)

Do AA 65 59,1 45 54,9 1

AC-CC 45 40,9 37 45,1 0,84 (0,47-1,50)


(Ad)

Al comparar los SNPs del LTC4S -444A/C entre los distintos grupos de

gravedad del asma (pacientes con asma persistente grave con los pacientes

asmáticos no graves), no se encontró ningún SNP que incrementara el

riesgo de padecer asma más grave entre los pacientes asmáticos, bajo

ninguno de los cuatro modelos de herencia. Tampoco se encontró ningún

SNP protector frente al riesgo de padecer asma de mayor gravedad (Tabla

22).

Tesis Doctoral


61

Tabla 22: Análisis de riesgo del SNP LTC4S−444 A/C en función del modelo

de herencia: pacientes con asma no persistente grave comparado con asma

persistente grave.

LTC4S: Asma no grave / Asma persistente grave

Modeloa Genotipo Asma no grave Asma p grave OR (IC 95%)

n % n %

Co AA 31 63,3 34 55,7 1

AC 16 32,7 24 39,3 1,37 (0,62-3,04)

CC 2 4,1 3 4,9 1,37 (0,21-8,73)

Re AA-AC 47 95,9 58 95,1 1

CC 2 4,1 3 4,9 1,22 (0,19-7,58)

Do AA 31 63,3 34 55,7 1

AC-CC 18 36,7 27 44,3 1,37 (0,63-2,95)


(Ad)

5.2.1.2. ALOX5

Se analizaron los polimorfismos de adicción o delección de

repeticiones en tándem “GGGCGC” en la región promotora de ALOX5,

motivos de reconocimiento para Sp1/Erg-1. Se consideró como normal la

variante más común de cinco repeticiones en tándem (“5”) y como

mutación (“Mut”) cualquier número de repeticiones diferente de cinco.

Al comparar el grupo control con los pacientes con asma persistente

grave (Tabla 23) bajo los cuatro modelos de herencia posibles, no se

identificó ningún polimorfismo que aumentara el riesgo de padecer asma

persistente grave. Tampoco se encontró ninguna mutación protectora para

el desarrollo de asma persistente grave.

Utilizando el modelo de herencia codominante, parecía existir cierta

relación (sin significación estadística) entre el genotipo heterocigoto y un

Tesis Doctoral


62

menor riesgo de padecer asma persistente grave. Este hallazgo no se

reproduce en los otros modelos de herencia.

Tabla 23. Análisis de riesgo del polimorfismo ALOX5 −176/−147 en función

del modelo de herencia: controles con asma persistente grave.

ALOX5: Controles / Asma persistente grave


n % n %

Co 55 45 54,9 42 67,7 1

5- 26 31,7 13 21,0 0,54 (0,24-1,18)

Mut 11 13,4 7 11,3 0,68 (0,24-1,92)

Re 55/5- 71 86,6 55 88,7 1

Mut 11 13,4 7 11,3 0,82 (0,30-2,56)

Do 55 45 54,9 42 67,7 1

5-/Mut 37 45,1 20 32,3 0,58 (0,29-1,52)


(Ad)

Al comparar el número de repeticiones en tándem en la región

promotora de ALOX5 entre el grupo control y los pacientes con asma no

persistente grave (Tabla 24), no se halló ninguna mutación que

incrementara el riesgo de padecer asma, bajo ninguno de los cuatro

modelos de herencia. Así mismo, no se encontró ningún polimorfismo

protector frente al asma, bajo ninguno de los cuatro modelos de herencia.


promotora de ALOX5 entre controles y el total de pacientes asmáticos, sin

hacer distinciones según la gravedad de la enfermedad, no se encontró

ningún polimorfismo que aumentara el riesgo de padecer asma, bajo

ninguno de los cuatro modelos de herencia. Así mismo, no se halló ningún

polimorfismo protector frente al asma, bajo ninguno de los cuatro modelos

de herencia (Tabla 25).

Tesis Doctoral


63


del modelo de herencia: controles con asma no grave.

ALOX5: Controles / Asma no grave


n % n %

Co 55 45 54,9 25 51,0 1

5- 26 31,7 18 36,7 1,25 (0,57-2,70)

Mut 11 13,4 6 12,2 0,98 (0,32-2,97)

Re 55/5- 71 86,6 43 87,8 1

Mut 11 13,4 6 12,2 0,90 (0,31-2,61)

Do 55 45 54,9 25 51,0 1

5-/Mut 37 45,1 24 49,0 1,17 (0,57-2,37)


(Ad)


del modelo de herencia: asmáticos totales con controles.

ALOX5: Total asmáticos / Controles


n % n %

Co 55 67 60,4 45 54,9 1

5- 31 27,9 26 31,7 0,80 (0,42-1,52)

Mut 13 11,7 11 13,4 0,79 (0,33-1,99)

Re 55/5- 98 88,3 71 86,6 1

Mut 13 11,7 11 13,4 0,86 (0,36-2,02)

Do 55 67 60,4 45 54,9 1

5-/Mut 44 39,6 37 45,1 0,80 (0,49-1,42)


(Ad)

Tesis Doctoral


64


promotora de ALOX5 entre los distintos grupos de gravedad del asma

(pacientes con asma persistente grave con los pacientes asmáticos no

graves), no se identificó ningún polimorfismo que aumentara el riesgo de

padecer asma más grave entre los pacientes asmáticos en ninguno de los

cuatro modelos de herencia. Así mismo, no se halló ningún polimorfismo

con efecto protector frente al riesgo de padecer asma de mayor gravedad

(Tabla 26).


del modelo de herencia: asma no grave comparado con asma persistente

grave.

ALOX5: Asma no grave / Asma persistente grave

Modeloa Genotipo Asma no grave Asma grave OR (IC 95%)

n % n %

Co 55 25 51,0 42 67,7 1

5- 18 36,7 13 21,0 0,43 (0,18-1,02)

Mut 6 12,2 7 11,3 0,69 (0,21-2,30)

Re 55/5- 43 87,8 55 88,7 1

Mut 6 12,2 7 11,3 0,91 (0,29-2,91)

Do 55 25 51,0 42 67,7 1

5-/Mut 24 49,0 20 32,3 0,50 (0,23-1,07)


(Ad)

5.2.1.3. ALOX5AP

Se analizó el polimorfismo de la región promotora de ALOX5AP -169/-

146. Se realizó PCR múltiple y posterior análisis de los fragmentos

resultantes, obteniendo fragmentos de 357 y 361 pb, que se correspondían

con 19 y 23 repeticiones de adenosina, respectivamente. Veintitrés

Tesis Doctoral


65

repeticiones (361 pb) era el polimorfismo más frecuente, y se consideró

como mutación los fragmentos de 357 pb con diecinueve repeticiones de

adenosina.

Comparando a los sujetos del grupo control con los pacientes

con asma persistente grave (Tabla 27), bajo los cuatro modelos de herencia

posibles, no se encontró ningún polimorfismo que aumentara el riesgo de

padecer asma persistente grave. Tampoco se halló ningún polimorfismo que

fuera protector frente al desarrollo de asma persistente grave.

Tabla 27. Análisis de riesgo del polimorfismo ALOX5AP −169/−146 en

función del modelo de herencia: controles con asma persistente grave.

ALOX5AP: Controles / Asma persistente grave


n % n %

Co 361-361 55 67,9 47 77,0 1

361-357 21 25,9 9 14,8 0,50 (0,21-1,20)

357-357 5 6,2 5 8,2 1,17 (0,32-4,29)

Re Por. 361 76 93,8 56 91,8 1

357-357 5 6,2 5 8,2 1,36 (0,37-4,91)

Do 361-361 55 67,9 47 77,0 1

Por. 357 26 32,1 14 23,0 0,63 (0,29-1,34)

Ad 0,82 (0,47-1,43)

aModelos de herencia: Codominante (Co), Recesivo (Re), Dominante (Do), Aditivo

(Ad)

Al comparar el grupo control con los pacientes con asma no grave

(Tabla 28), bajo los cuatro modelos de herencia posibles, no se identificó

ningún polimorfismo que incrementara el riesgo de padecer asma no grave

ni tampoco polimorfismos con acción protectora frente al asma no

persistente grave.

Tesis Doctoral


66


función del modelo de herencia: controles con asma no grave.

ALOX5AP: Controles / Asma no grave


n % n %

Co 361-361 55 67,9 31 63,3 1

361-357 21 25,9 16 32,7 1,35 (0,62-2,97)

357-357 5 6,2 2 4,1 0,71 (0,13-3,88)

Re Por. 361 76 93,8 47 95,9 1

357-357 5 6,2 2 4,1 0,65 (0,12-3,47)

Do 361-361 55 67,9 31 63,3 1

Por. 357 26 32,1 18 36,7 1,23 (0,58-2,59)

Ad 1,08 (0,59-1,96)

aModelos de herencia: Codominante (Co), Recesivo (Re), Dominante (Do), Aditivo

(Ad)

Al comparar el número de repeticiones de adenosina en la región

promotora de ALOX5AP entre controles y el total de pacientes asmáticos,

sin distinciones según la gravedad de la enfermedad, tampoco se encontró

ningún polimorfismo que aumentara el riesgo de padecer asma, bajo

ninguno de los cuatro modelos de herencia. Así mismo, no se encontró

ningún polimorfismo que protegiera frente al desarrollo de asma, bajo

ninguno de los cuatro modelos de herencia (Tabla 29).

Tesis Doctoral


67


función del modelo de herencia: total de asmáticos con controles.

ALOX5AP: Total asmáticos / Controles


n % n %

Co 361-361 78 70,9 55 67,9 1

361-357 25 22,7 21 25,9 0,84 (0,43-1,65)

357-357 7 6,4 5 6,2 0,99 (0,30-3,27)

Re Por. 361 103 93,6 76 93,8 1

357-357 7 6,4 5 6,2 1,03 (0,32-3,39)

Do 361-361 78 70,9 55 67,9 1

Por. 357 32 29,1 26 32,1 0,87 (0,47-1,62)


(Ad)

Al comparar el número de repeticiones de adenosina en la región

promotora de ALOX5AP, entre los distintos grupos de gravedad del asma

(pacientes con asma persistente grave con los pacientes asmáticos no

graves), no se encontró ningún polimorfismo que incrementara el riesgo de

padecer asma más grave entre los pacientes asmáticos, en ninguno de los

cuatro modelos de herencia.

El único resultado estadísticamente significativo que se encontró fue

un menor OR para el genotipo heterocigoto 361/357 del polimorfismo

ALOX5AP -169/-146, con respecto al homocigoto 361/361, comparando

asma no persistente grave con los que si la tenían. Este polimorfismo

“protector para asma persistente grave” se apreció sólo en el modelo de

herencia codominante y no se reprodujo en homocigotos 357/357, ni

tampoco bajo la hipótesis de que el alelo 357 se heredara con carácter

dominante o recesivo (Tabla 30).

Tesis Doctoral


68


función del modelo de herencia: asma no grave con asma persistente grave.

ALOX5AP: Asma no grave / Asma persistente grave

Modeloa Genotipo Asma no grave Asma p grave OR (IC 95%)

n % n %

Co 361-361 31 63,3 47 77,0 1

361-357 16 32,7 9 14,8 0,37 (0,15-0,94)

357-357 2 4,1 5 8,2 1,65 (0,30-9,04)

Re Por. 361 47 95,9 56 91,8 1

357-357 2 4,1 5 8,2 1,22 (0,19-7,58)

Do 361-361 31 63,3 47 77,0 1

Por. 357 18 36,7 14 23,0 0,51 (0,22-1,18)


(Ad)

5.2.1.4. Análisis conjunto de los polimorfismos

Se realizó también una prueba que tenía como objetivo detectar un

posible efecto de interacción entre los tres genes, es decir, una asociación

de la enfermedad con la presencia de alelos de riesgo de cualquiera de los

polimorfismos estudiados (Tabla 31).

Consideramos como alelos de riesgo los siguientes:

• El alelo C del polimorfismo LTC4S −444 A/C.

• El alelo que determinaba un número de sitios de unión Sp1/Egr1

distinto de 5 en ALOX5 −176/−147.

• El alelo de 357 pb (19 repeticiones de adenosina) del ALOX5AP

−169/−146.

Con el fin de aumentar el poder estadístico, los alelos de riesgo se

organizaron en categorías según la cantidad de cada uno que presentaba

Tesis Doctoral


69

cada individuo (ninguno, uno, dos, o más de dos), considerando los tres

polimorfismos en conjunto.

No se observó ninguna asociación con la enfermedad, ni siquiera en

aquellos pacientes que presentaban más de dos polimorfismos

considerados, según bibliografía, de riesgo para asma.

Tabla 31. Efecto interacción de los polimorfismos LTC4S –444 A/C, ALOX5

–176/–147, y ALOX5AP –169/–146.

Nº de alelos de riesgo AG

ANG

Controles

Total

0 17 (28.3%) 10 (20.4%) 19 (23.5%) 46 (24.2%)

1 23 (38.3%) 17 (34.7%) 23 (28.4%) 63 (33.2%)

2 13 (21.7%) 15 (30.6%) 29 (35.8%) 57 (30.0%)

Más de 2 7 (11.7%) 7 (14.3%) 10 (12.3%) 24 (12.6%)

Total 60 (100%) 49 (100%) 81 (100%) 190 (100%)

AG: Asma persistente grave; ANG: Asma no persistente grave.

5.3. Intolerancia a AINEs- gravedad del asma

Al analizar la asociación de la intolerancia a AINEs con la gravedad

del asma, y la de los distintos polimorfismos con la gravedad del asma,

separados según tuvieran o no intolerancia a AINEs, no se apreció relación

en ninguno de los supuestos. El número de pacientes con intolerancia a

AINEs era, sin embargo, muy reducido.

a) Al analizar la asociación de la intolerancia a AINEs con la gravedad

del asma, no se encontró asociación entre la gravedad del asma y la

intolerancia a AINEs: test χ2; p=0,556 (Tabla 32).

Tesis Doctoral


70

b) El estudio de la asociación entre los distintos polimorfismos y la

gravedad del asma, considerando solo los pacientes asmáticos con

buena tolerancia a AINEs (n=98):

p= 0,474 para los SNPs de LTC4S.

p= 0,066 para los polimorfismos de ALOX5. Existía asociación

no estadísticamente significativa.

p= 0,087 para los polimorfismos de ALOX5AP.

c) El análisis de la asociación entre los distintos polimorfismos y la

gravedad del asma, considerando solo los pacientes asmáticos con

intolerancia a AINEs (n=13):

p= 0,592 para los SNPs de LTC4S.

p= 0,632 para los polimorfismos de ALOX5.

p= 0,529 para los polimorfismos de ALOX5AP.

Tabla 32. Asociación de la intolerancia a AINEs con la

gravedad del asma.

AG ANG Total

No 56 42 98 AINEs Si 6 7 13

62 49 111

AG: Asma persistente grave, ANG: Asma no persistente grave.

Tesis Doctoral


71

6. DISCUSION

Desde una perspectiva conservadora, se ha estimado que el asma

afecta a más de 300 millones de personas en el mundo. Teniendo en cuenta

la previsión de crecimiento poblacional y el mayor grado de urbanización, se

calcula que, en unos diez años, esta cifra se vea incrementada en otros 100

millones de personas (138). El número total de exacerbaciones que

requieren asistencia urgente, así como el gasto sanitario derivado del asma,

han aumentado en paralelo, reflejando un incremento importante en el

número de casos de asma persistente grave (139). Se ha estimado, así

mismo, que alrededor de 255.000 personas mueren cada año como

resultado de complicaciones del asma (140).

En los comienzos del siglo XXI, la carga sanitaria que genera el asma

es de suficiente magnitud como para que muchos gobiernos reconozcan la

prioridad de elaborar estrategias para la prevención y control de esta

enfermedad. La identificación de marcadores genéticos con capacidad de

determinar qué pacientes tienen un mayor riesgo de padecer la

enfermedad, o de que ésta sea más grave, supondría un importante avance

en materia de prevención. De hecho, las principales aportaciones de los

estudios genéticos sobre asma se pueden resumir en cuatro puntos (141):

1) Conocimiento más profundo de la patogenia, permitiendo la

caracterización de nuevos genes y vías capaces de conducir a nuevas

dianas terapéuticas.

2) Identificación de los factores ambientales susceptibles de

interaccionar con la base genética individual y, al mismo tiempo,

confirmar el papel etiológico de los factores ambientales. Ello permite

la prevención de la enfermedad mediante la actuación sobre el medio

ambiente.

Tesis Doctoral


72

3) Tipificación de individuos susceptibles de padecer formas graves de

asma. Gracias a la detección precoz se puede diseñar e implementar

terapias preventivas en los sujetos de riesgo.

4) Diseño de tratamientos específicos de los pacientes:

a. Subclasificación de la enfermedad sobre las bases genéticas y

diseño de tratamientos basados en dicha clasificación.

b. Identificación de sujetos con riesgo de enfermedad grave y

diseño de tratamientos preventivos.

c. Determinación de la probabilidad de que un paciente responda

a un tratamiento concreto.

El asma es una enfermedad crónica caracterizada por inflamación de

la mucosa de la vía respiratoria y broncoconstricción, que cursa de forma

característica con disnea, sibilancias, opresión torácica y/o tos. Los motivos

por los que solo determinados individuos padecen asma no están aclarados,

sin embargo, existe consenso en que el asma es el resultado de una

combinación de factores genéticos y ambientales. Así, se han identificado

un gran número de variaciones genéticas en estudios de asociación y

GWAS. Algunas de estas variantes genéticas se han propuesto como

marcadores de la enfermedad, mientras que con otras no se ha encontrado

ninguna asociación.

La aportación de los estudios de asociación genética en el asma es

fundamental para dilucidar dudas y ampliar conocimientos sobre esta

enfermedad. Los trabajos cuyos resultados no establecen ninguna

asociación aportan, a pesar de ello, información de relevancia comparable a

aquellos que sí la presentan. La trascendencia de estos trabajos es aún

mayor cuando se analizan conjuntamente los resultados de varios proyectos

de investigación. El elevado coste de los estudios de polimorfismos implica,

frecuentemente, la inclusión de un número de pacientes menor del deseado

para obtener resultados estadísticamente significativos. El análisis

combinado de los resultados de diferentes estudios de asociación genética,

realizados en poblaciones similares o dispares étnicamente, se perfila como

Tesis Doctoral


73

la mejor alternativa para alcanzar conclusiones fiables; sin embargo, dadas

las dificultades asociadas al diagnóstico de asma, y la ausencia de síntomas

o signos patognomónicos en esta enfermedad, son los fenotipos

relacionados con el asma los objetivos habitualmente analizados en las

distintas publicaciones, y éstos varían entre autores. Los criterios utilizados

para el diagnóstico de asma son, con frecuencia, dispares y, en algunas

ocasiones, se reducen a datos obtenidos de un cuestionario y a una escala

visual de puntuación de síntomas. En nuestro trabajo, por el contrario, los

pacientes incluidos en el mismo, se han evaluado en cinco ocasiones a lo

largo de un año, antes de clasificarlos según la gravedad del asma y, en

todos los casos, el tratamiento se ajustó al mínimo necesario para mantener

controlada la enfermedad. La hiperreactividad bronquial, entendida como

broncodilatación o broncoconstricción positiva, estaba presente en todos los

pacientes que fueron catalogados como asmáticos. De ello se infiere que, a

diferencia de lo que sucede en numerosos estudios publicados, la población

incluida estaba correctamente diagnosticada y seleccionada.

Los cisteinil leucotrienos, entre otros muchos mediadores, han sido

implicados en la fisiopatología del asma. Son importantes en la respuesta

inflamatoria, inducen broncoconstricción, edema e hipersecreción de la

mucosa bronquial, así como migración eosinofílica. La vía de síntesis de los

leucotrienos está bien caracterizada, siendo sus tres enzimas principales la

5-LO, la FLAP y la LTC4S con sus correspondientes genes: ALOX5, ALOX5AP

y gen de LTC4S. Estas enzimas y sus metabolitos han sido objeto de un

gran número de estudios. Su implicación en el fenotipo asmático, en la

gravedad del asma y, en especial, en los asmáticos intolerantes a AINEs, ha

quedado ampliamente demostrada. Así mismo, los fármacos

antileucotrienos han demostrado ser eficaces en el tratamiento del asma en

una amplia serie de pacientes. Se ha sugerido, en base a los resultados de

algunos estudios, que la respuesta terapéutica a los antileucotrienos, los

fenotipos de asma y su gravedad, pueden estar relacionados con el

genotipo de las principales enzimas implicadas en la producción de

leucotrienos. Sin embargo, estos datos no han sido corroborados en todos

Tesis Doctoral


74

los estudios. Un mismo polimorfismo se ha considerado de protección o de

riesgo frente un mismo fenotipo por distintos autores, en estudios sobre

poblaciones de etnias similares o diferentes. Por este motivo, el efecto que

tienen los distintos genotipos de las regiones promotoras de ALOX5,

ALOX5AP y LTC4S, sobre los fenotipos asmáticos no está, a día de hoy,

suficientemente aclarado.

En este trabajo, se ha analizado la implicación que diferentes

polimorfismos en las regiones promotoras de dichos genes, tienen sobre la

prevalencia de asma y sobre la gravedad de la misma, en la población

asmática de Gran Canaria. Cabe destacar, como ya se ha mencionado en

los criterios de inclusión, que los pacientes asmáticos se seleccionaron y

catalogaron de forma rigurosa, tras controlar su evolución durante un

periodo de un año, mediante visitas trimestrales, realizadas siempre por el

mismo facultativo. Se efectuaron un total de 711 visitas durante este

periodo, incluyendo las cinco visitas programada por cada paciente asmático

y las no programadas. La población de asmáticos se separó en dos grupos,

según los criterios de la gravedad de la GEMA: pacientes con asma

persistente grave y pacientes sin asma persistente grave. Dada la

importante relación existente entre la vía de síntesis de los leucotrienos y la

intolerancia a AINEs, se analizó esta última variable tanto conjuntamente

con el asma como por separado, a pesar del reducido número de pacientes

con estas características en nuestra muestra. No es esta asociación, sin

embargo, uno de los objetivos para los que se diseñó el estudio que nos

ocupa.

Los 111 pacientes asmáticos estudiados eran, en su mayoría,

mujeres con una edad media de 40 años. Los controles no asmáticos se

ajustaron, así mismo, a estas variables. La mayor presencia de mujeres es

común a otras publicaciones en las que se incluye pacientes asmáticos.

Analizando los datos obtenidos a partir de la historia clínica, destaca la

intensa asociación existente entre la atopia y la clasificación del asma en

función de la gravedad. De los 22 pacientes con diagnóstico de asma

Tesis Doctoral


75

intrínseco (no atópica), un 86% (n=19) tenían asma persistente grave,

frente a solo un 48% en el grupo de pacientes asmáticos atópicos con asma

persistente grave. Al analizar estos datos desde otra perspectiva, la atopia

está presente en un 69,4% de los pacientes con asma persistente grave y

en un 93,9% de los pacientes con asma no grave. Existe, en nuestra

población, una relación negativa entre presencia de atopia y gravedad del

asma; y una relación positiva, aun mayor, entre no ser atópico y padecer

asma de mayor gravedad. Curiosamente, en el último Congreso de la

European Respiratory Society (ERS), celebrado en la ciudad alemana de

Munich en septiembre de 2014, se ha presentado los resultados de un

estudio multicéntrico y multipaís sobre epidemiología del asma grave en

Europa, en el que se han reclutado entre 2010 y 2014 un total de 216

pacientes con asma grave, de los cuales, casi el 95% eran atópicos, hecho

que suscitó una enorme controversia durante la discusión. En nuestro

estudio, la edad de comienzo del asma intrínseco era significativamente

mayor que la del asma extrínseco, como se ha descrito en la mayoría de

series. No existen, sin embargo, diferencias significativas entre ambas, en

lo referente a años de evolución del asma. Ello se puede explicar porque el

asma extrínseco debuta en etapas más tempranas de la vida, mientras que

la edad media de los pacientes con asma intrínseco es ligeramente mayor.

El objetivo principal al realizar el estudio de casos-controles fue

conocer en qué medida determinados polimorfismos afectaban, en nuestra

población, al riesgo de padecer asma y al riesgo de que ésta fuera más

grave. Las variantes polimórficas se compararon de forma individual y

conjuntamente en cada uno de los tres grupos. Los hallazgos obtenidos se

discuten a continuación.

Analizando los resultados por separado en cada polimorfismo,

destacó:

ALOX5: La enzima 5-LO es codificada por el gen ALOX5, localizado en el

cromosoma 10q11.12. La actividad de la 5-LO se ha asociado con algunos

Tesis Doctoral


76

procesos inflamatorios, tales como asma, arterioesclerosis e hipertensión

pulmonar (142). Estudios iniciales realizados por Hoshiko y cols. en 1990

(143), y posteriormente corroborados por In K y cols. en 1997 (80),

identificaron variantes en series de seis nucleótidos repetidos en tándem en

la región promotora principal del gen ALOX5. Este polimorfismo de la región

promotora, incluiría entre tres y seis repeticiones en tándem de la secuencia

de nucleótidos “5´-GGGCGC-3”, localizada a 212-88 bp corriente arriba de

ATG. Esta región de transcripción, rica en G-C, contiene patrones de

reconocimiento para las enzimas Sp1/Erg-1 (proteínas que contienen un

motivo en dedos de zinc, mediante el cual se unen directamente al ADN y

favorecen la transcripción), cruciales para el inicio de la transcripción. Cinco

repeticiones son el alelo más frecuente en poblaciones caucásicas y

afroamericanas, reconocida como la variante mayor o “salvaje”. Las

mutaciones en el número de sitios de unión de Sp1 se asociaron con una

actividad disminuida del gen en cultivos tisulares. In K y cols., mediante

ensayos in vitro que implicaban cambios en el recorrido electroforético,

dependiente de la unión de factores de transcripción al DNA (EMSA, por sus

siglas en ingles Electrophoretic Mobility shift assay (144, 145)), determinan

que, en todas las mutaciones, existía unión de los factores de transcripción

al DNA. Esta unión era considerablemente más fuerte en el alelo salvaje,

concluyendo que los alelos mutados tienen una menor afinidad o un número

menor de sitios de unión viables para Sp1 / Egr-1.

A pesar de que en estos primeros estudios (80, 143), las variantes

alélicas de la región promotora de ALOX5 se asociaban, in vitro, con una

menor actividad en la transcripción, otros autores han encontrado

resultados opuestos. Estudios de expresión genética en leucocitos de

individuos sanos homocigotos para las variantes “no 5 repeticiones” (146),

presentaban mayor expresión de 5-LO, FLAP y LTA4H, comparando con

homocigotos para el alelo salvaje (cinco repeticiones), sugiriendo que las

variantes “no 5 repeticiones” se asocian con una mayor producción de

leucotrienos.

Tesis Doctoral


77

Aunque las variantes alélicas de la región promotora de ALOX5 se

asocian a alteraciones en la actividad transcripcional en estudios in vitro, no

queda claro cómo influyen estas variantes en el fenotipo de asma. Mougey y

cols. (147), analizaron un total de 270 niños de entre 6 y 17 años, con

asma mal controlada a pesar de un correcto tratamiento de base. Se definió

asma mal controlada como: puntuación del cuestionario de control de asma

ACQ > 1.25, dos o más visitas no programadas a su médico por asma o uso

de ciclos de esteroides orales en doce meses, despertares nocturnos

secundarios al asma al menos uno en semana o necesidad de

broncodilatadores de rescate al menos una vez en semana durante un mes.

Los pacientes se dividieron según genotipo en dos grupos: pacientes con al

menos un alelo salvaje, cinco repeticiones del patrón de reconocimiento de

Sp1: (X/5 + 5/5) =230 pacientes, 84%; y pacientes con cualquier otra

combinación (X/X)=40 pacientes, 16%. Se analizaron valores de FEV1%,

datos de control de síntomas, niveles de FeNO y valores de LTE4 en orina

(LTE4u). Encontraron una mayor alteración de la función respiratoria y

niveles más elevados de CysLT en los pacientes portadores de dos copias de

la variante “no 5-repeticiones” X/X (homocigotos para la variante menor).

Sólo se observó esta asociación en los individuos portadores de dos

variantes menores, lo que sugería que los fenotipos LTE4u y FEV1% se

expresaban con carácter recesivo. Los pacientes homocigotos para la

variante menor también presentaron puntuaciones más altas en ACQ,

sugiriendo mayor sintomatología de asma. Este grupo tenía prescrito con

más frecuencia tratamiento con antileucotrienos. Estos resultados sugieren

que estas variantes alélicas sobre la región promotora de ALOX5, con un

número variable de repeticiones en tándem de motivos de unión para el

factor de transcripción Sp1, tienen influencia positiva sobre la actividad de

ALOX5 y, secundariamente, sobre la producción de leucotrienos. En esta

misma línea, Lima y cols. (148) encontraron que los asmáticos portadores

de la variante “no 5 repeticiones” y tratados con un inhibidor del receptor

de leucotrienos (montelukast), tenían un riesgo un 73% menor de tener

una o más crisis, comparando con pacientes homocigotos para el alelo

Tesis Doctoral


78

salvaje, debido a que las variantes alélicas tienen mayor expresión de 5-LO

y más altos niveles de CysLT.

Entre pacientes asmáticos con intolerancia a AINES, aquellos con

variantes menores presentaron mayor grado de obstrucción bronquial,

comparado con homocigotos para la variante común (130). Así mismo,

Kalayci y cols. (121), encontraron que pacientes homocigotos para la

variante menor tenían una mayor probabilidad de tener asma persistente

grave y mayor HRB asociada al ejercicio, comparado con pacientes con

genotipo homocigoto para la variante mayor.

Los resultados de nuestro estudio coinciden en que el alelo 5-

repeticiones es el más frecuente en población caucásica: 70% en controles,

74% en pacientes asmáticos (78% en asma persistente grave y 69% en los

asmáticos no persistente grave). Destaca, no obstante, que es en el grupo

de pacientes con asma persistente grave en donde más frecuentemente se

localiza el alelo común, comparando con el grupo control y pacientes

asmáticos no grave (78%, 70% y 69% respectivamente), sugiriendo, a

priori, un efecto favorable a padecer asma y a que ésta sea más grave

cuando se tiene el alelo común, lo que podría indicar una mayor actividad

del gen. El genotipo homocigoto para la variante común está presente en un

55% de los pacientes controles, frente a un 67,7% de los pacientes con

asma persistente grave (un 60% en todos los pacientes asmáticos). El

genotipo homocigoto para cualquiera de las variantes menores es de un

13,4% en controles, frente a un 11,3% en asma grave y un 11,7% en el

total de asmáticos.

En nuestro estudio, el análisis de riesgo de los distintos polimorfismos

de la región promotora de ALOX5, considerando los cuatro modelos posibles

de herencia (codominante, dominante, recesivo y aditivo), comparando

entre controles y los distintos grupos de asmáticos por separado y los

asmáticos totales, no se aprecia ninguna relación destacable. Al realizar el

análisis de riesgo, comparando los asmáticos entre sí, resulta igualmente no

Tesis Doctoral


79

significativo. Dicho de otra manera, ninguna combinación de alelos,

independientemente del modelo de herencia, parece ejercer un efecto

protector o de riesgo sobre la posibilidad de padecer asma, ni sobre la

gravedad de la misma, en nuestra población.

En nuestro trabajo, tampoco hemos encontrado asociación

significativa entre los polimorfismos de ALOX5 y la gravedad del asma,

analizando a los pacientes asmáticos con tolerancia a AINEs (n=98), si bien,

existía una tendencia a la significación entre ambas variables (p=0,066). No

encontramos, tampoco, asociación (p=0,632) entre los polimorfismos y la

gravedad del asma en los pacientes con intolerancia a AINEs (n=13).

Comparando con el alelo más común (5-repeticiones, variante

mayor), las variantes “no 5-repeticiones” (variantes menores) se han

asociado con una respuesta variable a antileucotrienos, tanto a los

inhibidores de leucotrienos como a los antagonistas del receptor,

respaldando el hecho de que las variantes genéticas interfieren, en mayor o

menor medida, sobre la producción final de leucotrienos. Drazen y Telleria

(149, 150), por separado, fueron los primeros en encontrar una asociación

entre las variaciones en las repeticiones en tándem de la región promotora

de ALOX5, con la expresión de 5-LO y la respuesta a fármacos

antileucotrienos. Encontraron que la adición o delección de motivos de

unión de Sp1/Erg-1 (variantes menores), resultaba en una menor actividad

del gen y en una menor respuesta a estos fármacos, en pacientes

homocigóticos para el alelo “no 5-repeticiones”. Este resultado era el

esperado, considerando que las variaciones del alelo conllevan una menor

expresión de la 5-LO. En teoría, cuanta mayor implicación tengan los

leucotrienos en la patogenia del asma, mayor será la respuesta a los

fármacos antileucotrienos.

En otros estudios farmacogenéticos realizados con montelukast en

sujetos sanos, los resultados fueron justo los contrarios: individuos

Tesis Doctoral


80

homocigotos para las variantes “no 5 repeticiones” (130), presentaban

mayor expresión de 5-LO y LTA4H al compararlos con homocigotos para el

alelo más común, sugiriendo que las variantes menores se asocian con una

mayor producción de leucotrienos.

En nuestra población, un porcentaje significativamente mayor de

pacientes con asma persistente grave recibía tratamiento con montelukast

(85%), comparado con el grupo de asmáticos no persistente graves (20%).

El montelukast es un fármaco inhibidor del receptor de leucotrienos CysLT1

(en España no está comercializado el fármaco inhibidor de la enzima 5-LO).

Estas diferencias son implícitas a los criterios de gravedad y se justifican en

la necesidad de administrar más medicación al primer grupo para alcanzar

el control del asma. Dichas diferencias encontradas son también

extrapolables a otros fármacos reservados a escalones terapéuticos

asociados con el asma de mayor gravedad, como son los broncodilatadores

de larga duración, los corticoides inhalados a altas dosis, las teofilinas y los

anticolinérgicos.

Otros autores han concluido que existe suficiente evidencia para

afirmar que las variantes menores en la región promotora de ALOX5 pueden

influir negativamente sobre el asma. En nuestro estudio, no se encontró que

existiera un riesgo relativo mayor de padecer asma o de que la enfermedad

fuera más grave como consecuencia de los distintos polimorfismos de la

región promotora de ALOX5, cualquiera que fuera el modelo de herencia.

Así mismo, tampoco encontramos relación entre el citado polimorfismo y la

tolerancia o intolerancia a AINEs, independientemente del fenotipo de

gravedad del asma al que estuviera asociada.

ALOX5AP: El gen ALOX5AP se localiza en el cromosoma 13q12, contiene

cinco pequeños exones de longitudes entre 71-478 pares de bases, y cuatro

intrones de mayor longitud (151, 152). Aunque se ha identificado dos SNPs

Tesis Doctoral


81

en intrones al clonarse el gen, no se ha determinado, sin embargo, la

frecuencia de estos polimorfismos ni su implicación en el asma (151).

Sayers y cols. (131) identificaron dos polimorfismos en la región promotora

del gen ALOX5AP: un SNP consistente en una sustitución de guanina por

adenina en la posición 336 (-336 G>A), siendo este grupo el primero en

describirlo, y otro polimorfismo consistente en repeticiones de longitud

variable de adenina (A). Este segundo polimorfismo había sido descrito

previamente, con ligeras diferencias en la longitud de las repeticiones de A,

por Koshino y cols. (132), quienes encontraron asociación con asma en

población japonesa, tras analizar la región promotora de ALOX5AP en 71

pacientes asmáticos y 71 controles no asmáticos. Estos autores concluyeron

que el alelo con repeticiones de 21 pares de bases de un solo nucleótido, A,

en la región promotora de ALOX5AP, estaba presente más frecuentemente

en pacientes asmáticos (52/71=73,2%; pacientes sanos: 39/71=54,9%),

comparado con el alelo de 18 repeticiones de A. Mientras que Koshino y

cols. identificaron fragmentos de poli A con longitudes de 18A y 21A y

asociaron el polimorfismo de 21 repeticiones (21/21) con asma en población

japonesa. Sayers, Kim y cols. (130, 131), por separado, identificaron

polimorfismos de 19 y 23 repeticiones de A, y no encontraron asociación

con asma en poblaciones caucásica y coreana, respectivamente. Estos

hallazgos sugieren que podría existir una diferencia étnica en la distribución

genotípica de ALOX5AP. Además, Sayers y cols. (131) encontraron una

frecuencia del alelo común (23A) del 89% en pacientes con asma (n=183),

frente a un 88% en los controles no asmáticos de población británica. A su

vez, Kim y cols. (130), en un estudio realizado con población coreana,

evidencian una prevalencia del 84% en asmáticos (n=107), y del 78,9% en

los controles, no encontrando diferencias significativas en la frecuencia

alélica de pacientes intolerantes a AINES, comparado con los tolerantes. No

hallaron, tampoco, diferencias significativas en la frecuencia de genotipos,

analizándolos bajo los supuestos de herencia dominante, co-dominante y

recesiva, entre pacientes con intolerancia a AINES, comparados con

controles no asmáticos, ni comparados con pacientes asmáticos tolerantes a

AINES.

Tesis Doctoral


82

En nuestra población, el alelo 361 pb (23 repeticiones de A), estaba

presente en el 84% de los pacientes con asma persistente grave, en un

80% en asmáticos no graves y en un 81% de controles, siendo el alelo más

frecuente, en concordancia con los hallazgos descritos por otros autores

(130, 131). Al comparar los controles con la totalidad de nuestra muestra

de pacientes asmáticos, y con los grupos de asmáticos por separado según

criterios de gravedad, no se apreció riesgo relativo mayor de padecer asma

en ninguno de los cuatro modelos de herencia: codominate, dominante,

recesiva y aditiva.

Se encontró un riesgo relativo menor de padecer asma persistente

grave, con modelo de herencia codominante, en el genotipo heterocigoto

(OR=0,37. 95% IC=0,15-0,94). Sin embargo, este resultado no se

reprodujo en los modelos de herencia dominante o recesiva en los pacientes

homocigotos. Tampoco se reprodujo al comparar, en este mismo modelo de

herencia, a los pacientes con asma persistente grave con el grupo control.

Por lo tanto, dado que esta asociación sólo se obtuvo en el modelo

codominante, es muy probable que este resultado corresponda a un error

de tipo I ya que se compararon 16 pacientes frente a 9, es decir, un

número muy reducido. Aclarado este punto, podemos concluir que no

encontramos relación entre el polimorfismo consistente en repeticiones

variables de A en la región promotora de ALOX5AP y la presencia de asma o

la gravedad de la misma. Kedda y cols. (153), en un estudio en población

caucásica que incluía 584 pacientes asmáticos, divididos en categorías

según gravedad del asma, y 457 controles no asmáticos, así como otros

autores (130, 131), tampoco han demostrado ninguna asociación entre las

repeticiones de A y el riesgo de padecer asma, ni entre este polimorfismo y

la gravedad de la misma.

Al analizar por separado la tolerancia / intolerancia a AINEs, no

encontramos relación significativa entre los diferentes alelos y genotipos,

comparando pacientes asmáticos con buena tolerancia a AINEs (p=0,087).

Tesis Doctoral


83

Tampoco existía asociación entre los polimorfismos de la región promotora

de ALOX5AP y la gravedad del asma (p=0,529), analizando solo a los

pacientes con intolerancia a AINEs (n=13).

LTC4S: La tercera enzima en la biosíntesis de cisteinil leucotrienos es la

LTC4S. Se trata, como ya se ha comentado, de una glutatión transferasa

clave en la síntesis de cisteinil leucotrienos, al convertir LTA4 a LTC4. El gen

que codifica la LTC4S se localiza en el brazo largo del cromosoma 5 (5q35),

una región asociada con asma en estudios de ligamiento y próxima a la

zona 5q31-33, que incluye varios genes candidatos de asma (154). El gen

de la LTC4S incluye unos 2.5 kilobases, contiene 5 pequeños exones y

algunos supuestos motivos de ligamiento o zonas de regulación, en la

región 5´ no transcrita.

Sanak y cols. (83) describieron por primera vez en 1997 una

transversión de A por Citosina (C), 444 pares de bases corriente arriba del

lugar de inicio de la transcripción del gen de la LTC4S (A -444 C):

encontraron una asociación entre el alelo C-444 y la existencia de asma

exacerbado por AINEs (AERD), con un riesgo relativo de 3.89 (95% CI 1.57

– 8.98), aunque añadían la posibilidad de que existiera desequilibrio de

ligamiento con otros genes. Con posterioridad, se ha visto que existe un

aumento en la expresión del RNAm de LTC4S en eosinófilos de sangre

periférica, en pacientes asmáticos con el alelo C en posición -444,

comparado con controles asmáticos y no asmáticos sin este polimorfismo,

además, este aumento de expresión era aún mayor en los pacientes con

asma inducida por aspirina (AERD) (103, 155). Los trabajos iniciales de

Sampson y cols. (135) mostraron, así mismo, asociación entre la presencia

de asma persistente grave y el polimorfismo C-444, sugiriendo que la

predisposición genética a la mayor producción de Cys-LT puede ser un

factor de riesgo de padecer asma grave, independiente de la tolerancia a

AINEs.

Tesis Doctoral


84

Estos hallazgos iniciales confirieron un papel relevante al SNP A-444

C del gen de la LTC4S en la gravedad del asma y del AERD. Conviene

señalar, sin embargo, que estos estudios se realizaron en población europea

exclusivamente, con un número escaso de individuos, y que los criterios

utilizados para definir la gravedad del asma eran, en general, poco

rigurosos. Sus resultados son, por lo tanto, cuestionables. Con la intensión

de corregir estas limitaciones, Kedda y cols. (134) realizaron con

posterioridad un estudio incluyendo 604 pacientes asmáticos y 458

controles no asmáticos, todos caucásicos australianos. Los pacientes

asmáticos se dividieron según gravedad en asma persistente leve,

moderada y grave, en base a un sistema de puntuación, que incluyó los

siguientes criterios: función pulmonar, uso de corticoides orales en los

últimos 12 meses y dosis diaria de corticoides inhalados, demanda semanal

de broncodilatadores de rescate, síntomas diurnos, despertares por asma,

asistencia a servicios de urgencias y hospitalizaciones. Encontraron una

asociación leve, no significativa, entre el SNP A-444 C y la existencia de

asma, pero no entre la presencia del alelo C y la gravedad del asma o la

intolerancia a AINEs, al contrario que Sampson y cols. (135). Los resultados

de este estudio coinciden con el realizado por Brauer y cols. (156) en

población danesa, en el que no objetivaron relación entre la gravedad del

asma y los SNPs en la región promotora del gen de LTC4S. En población

japonesa, Kawasagishi y cols. (129) tampoco encontraron diferencias

significativas entre los alelos del gen, al comparar datos de función

respiratoria y dosis de corticoides inhalados en 160 pacientes asmáticos, 60

de ellos con intolerancia a AINEs. En la misma línea, en un estudio realizado

en población infantil de origen coreano, en el que se incluyó a 445 niños con

asma y 146 niños no asmáticos y no atópicos, concluyeron que existía

relación entre el alelo C (genotipos CC, AC) y una menor respuesta

bronquial a metacolina, comparado con homocigotos para A, asociando este

SNP con una menor respuesta bronquial en niños con asma (157). Puesto

que el SNP -444 A/C no ha demostrado tener ningún efecto funcional sobre

la transcripción del gen, se ha sugerido que este SNP podría estar en

Tesis Doctoral


85

desequilibrio de ligamiento con otro con actividad funcional, no relacionada

con la región promotora de LTC4S (136, 157).

En nuestro estudio, un 25% del grupo control presentaba el alelo C

frente a un 23% de la población de asmáticos. Al analizarlo por separado,

encontramos que el 30% de pacientes con asma persistente grave lo

presentaban, frente al 20% de los pacientes con asma no persistente grave.

En cuanto al genotipo homocigoto para A, lo presentaban el 55% de los

controles, el 55.7% de los asma persistente grave y el 63% de los

asmáticos no persistente grave, siendo estos datos superponibles a los de

las publicaciones anteriormente mencionadas. Al analizar el riesgo relativo

de padecer asma o de que esta fuera más grave, considerando los cuatro

modelos de herencia posibles, no se encontró un riesgo relativo mayor en

ninguno de los supuestos. En pacientes asmáticos con buena tolerancia a

AINEs no se apreció, tampoco, asociación significativa de la gravedad del

asma con la presencia del SNP en C-444 (p=0,474). Así mismo, no

encontramos relación (p=0,592) entre los SNPs y la gravedad del asma, en

pacientes con intolerancia a AINEs (n=13), en contraste con los hallazgos

de Sanak y cols. (83), quienes, tras identificar por primera vez la

transversión A por C en la posición -444, describieron una relación

significativa entre este SNP y la intolerancia a AINES en asmáticos. Kedda y

cols. (134), al igual que nosotros, no encontraron evidencias de asociación

entre el SNP C-444 y la presencia de asma en pacientes con intolerancia a

AINEs.

En otros estudios realizados en población española, se ha publicado

resultados similares. García y cols. (158) no detectaron ninguna asociación

entre el alelo C-444 y la presencia de asma, la gravedad de la misma ni la

intolerancia a AINEs, en un estudio en el que incluyeron 123 pacientes

asmáticos y 103 controles no asmáticos.

Los resultados discutidos en los párrafos anteriores se han incluido en

un meta-análisis publicado en 2012 (159), en el que se han analizado

Tesis Doctoral


86

conjuntamente con los datos de otras 12 publicaciones, sumando un total

de 3042 pacientes asmáticos y 1902 controles. Se concluyó que ser

portador del alelo C (CC + AC) no implica un riesgo más elevado de padecer

asma, comparado con homocigotos AA, cuando se incluía a todos los

pacientes. Esta falta de asociación no se modificaba al analizar por separado

distintos grupos, divididos en función de la edad, y el resultado sólo variaba

al estratificarlos por etnias. Se encontró asociación significativa entre el

riesgo de padecer asma en población caucásica y el SNP C (OR = 1.21, 95%

IC = 1.02-1.44, p= 0.03), pero no en poblaciones asiáticas ni afro-

americana. Se ha objetivado, también, asociación con el riesgo de padecer

asma con tolerancia a AINEs (OR = 1.36, 95% IC = 1.12 -1.65, p= 0.002),

lo que sugiere que el SNP -444 A/C podría ser un marcador de asma en

población caucásica.

A pesar de que existen algunas publicaciones y meta-análisis que han

asociado con el asma algunos de los polimorfismos estudiados, la mayoría

han concluido, al igual que nosotros, que no existía asociación significativa.

Es muy probable que el reducido tamaño muestral sea un factor decisivo en

estos resultados. Los estudios de asociación de todo el genoma (GWAS)

publicados hasta la fecha no han encontrado tampoco ningún polimorfismo,

en las principales enzimas de la vía de síntesis de leucotrienos, que tenga

asociación con asma. Un meta-análisis de GWAS recientemente publicado

(25), ha identificado, por primera vez, cuatro loci asociados a asma en tres

grupos étnicos diferentes: loci en 17q21 y próximo a los genes de IL1RL1,

TSLP e IL33. Ha concluido que estos resultados sugieren que algunos loci de

susceptibilidad para asma son constantes, incluso cuando existen

diferencias ancestrales, siempre que se investigue sobre series de pacientes

suficientemente numerosas, y que existen asociaciones genéticas

específicas de etnias, que contribuyen a la compleja arquitectura genómica

del asma.

En nuestro estudio, con el fin de detectar un posible efecto sinérgico

entre los tres genes sobre el asma, es decir, una asociación aditiva entre la

Tesis Doctoral


87

presencia de alelos considerados de riesgo, en cualquiera de los

polimorfismos estudiados, con la enfermedad, realizamos un análisis

adicional. Se consideraron de riesgo los siguientes alelos: el alelo C del SNP

LTC4S−444 A/C, el alelo que determina un número de sitios de unión para

Sp1/Egr1 distinto de 5 en ALOX5 −176/−147 y el alelo de 357 pb del

ALOX5AP −169/−146. La presencia de alelos de riesgo se organizó en

categorías según el número de ellos que poseía un individuo (ninguno, uno,

dos, o más de dos), considerando los tres polimorfismos en conjunto. No se

observó efecto epistático alguno, ni asociación con la enfermedad en

ninguna combinación.

Cabe destacar que, en nuestro estudio tampoco, encontramos

relación entre la gravedad del asma y una mayor respuesta terapéutica a

fármacos antileucotrienos. El número de pacientes con asma persistente

grave que recibía tratamiento con antileucotrienos, era significativamente

mayor que el grupo de pacientes con asma no persistente grave, al igual

que sucede con los otros fármacos empleados para controlar la enfermedad.

Precisamente, una característica del asma grave es la mayor demanda de

medicación, ya sea debido a una menor respuesta a la misma o a la

necesidad de dosis más elevadas, debido a alteraciones fisiopatológicas y/o

estructurales de base más evolucionadas. Una respuesta significativamente

mayor a los fármacos antileucotrienos en los pacientes con los

polimorfismos estudiados implicaría, posiblemente, una mejoría clínica

suficiente como para reducir el escalón de gravedad del asma en el que se

encuentran y descatalogar a algunos pacientes del grupo de “asma

persistente grave”, con lo que el número de pacientes en tratamiento con

antileucotrienos y portadores de los polimorfismos aumentaría entre los

pacientes asmáticos no graves. En nuestra población, el uso de

antileucotrienos en cada grupo era comparable con el resto de fármacos.

Esto no excluye la posibilidad de que estos polimorfismos sean capaces de

identificar a aquellos pacientes asmáticos para los que los fármacos que

actúan sobre la vía de los leucotrienos pudieran tener un efecto terapéutico

Tesis Doctoral


88

mayor y una mayor contribución sobre las alteraciones fisiopatológicas del

asma.

Conviene señalar que, para poder emitir conclusiones definitivas, son

necesarios estudios de cohortes con un número más elevado de

participantes, de mayor diversidad étnica y con pacientes correctamente

categorizados, tanto conceptualmente en asmáticos o no asmáticos, como

en su clasificación según criterios de gravedad. Características tales como

tolerancia o intolerancia a AINEs, en estos pacientes, son relevantes, puesto

que la fisiopatología de la intolerancia a AINES involucra directamente a la

vía de la ciclooxigenasa y a la vía de síntesis de los leucotrienos. Nuestro

estudio sugiere que los polimorfismos descritos en las regiones promotoras

de los genes ALOX5, ALOX5AP y LTC4S, no constituyen un riesgo genético

para padecer asma, ni para determinar la gravedad de la misma, en nuestra

población. Tampoco encontramos diferencias significativas entre aquellos

pacientes con intolerancia a AINES y los que los toleraban, comparando

entre si los grupos de pacientes asmáticos graves, los no graves y los

controles no asmáticos.

Una de las principales fortalezas de nuestro trabajo son los rigurosos

criterios que se han aplicado, tanto para la inclusión de los pacientes

asmáticos, como para la clasificación de estos según la gravedad. Ningún

estudio publicado hasta la fecha basa los criterios de gravedad en

seguimientos previos, con visitas trimestrales durante un año. En cada

visita se reevaluaba la clasificación según la gravedad, tras la recogida de

datos clínicos detallados y de función respiratoria. La mayoría de los

pacientes llevaba años acudiendo regularmente a consultas y habían sido

diagnosticados de asma varios años antes de ser incluidos en el estudio.

Excepto dos pacientes, el resto permaneció en la misma categoría de

gravedad a lo largo de todo el estudio. En esos dos casos en que se

modificó el escalón de gravedad, los cambios fueron los siguientes: uno

bajó a asma persistente moderada desde asma persistente grave y el otro

Tesis Doctoral


89

fue justo al revés, es decir, pasó de asma persistente moderada a asma

persistente grave.

Todos los pacientes reclutados en este estudio procedían de Canarias

y eran de raza caucásica, al igual que sus padres. No se incluyeron

pacientes de los que se desconociera la procedencia de los padres. Dada las

características endogámicas propias de la insularidad y la influencia

sudamericana presente en Canarias, esperábamos obtener datos más

dispares respecto a aquellos obtenidos en población caucásica anglosajona

(133, 136), australiana (153) o incluso española, de pacientes reclutados en

la Península Ibérica (158). A pesar nuestras diferencias y de la evidente

limitación de nuestro trabajo en cuanto al tamaño muestral, nuestros datos

son concordantes con los obtenidos en estas publicaciones.

El asma es una enfermedad crónica muy compleja. Los distintos

fenotipos existentes, los diferentes criterios de inclusión utilizados en las

distintas publicaciones, la influencia del ambiente en la expresión genética,

su carácter poligénico, así como la interacción entre genes y de estos con el

medio, hacen que resulte complicado obtener un mapa genético con los

datos disponibles hasta ahora. La vía de la 5-LO desempeña un papel

fundamental en la patogenia del asma, las propiedades proinflamatorias de

sus metabolitos están perfectamente contrastadas. Sin embargo, no queda

completamente aclarado hasta qué punto los polimorfismos estudiados en

los genes de las tres principales enzimas implicadas en la producción de

Cys-LT afectan al fenotipo asmático. Parece plausible que su influencia no

sea tan importante como inicialmente se preveía. Una posible explicación es

el limitado efecto que cada polimorfismo por separado aporta a la

enfermedad y que existan mecanismos de control genéticos que minimicen

el impacto de estos polimorfismos sobre la enfermedad (interacción gen-

gen).

Nuestros resultados no han demostrado ninguna asociación

significativa con asma ni con la gravedad del asma, tanto analizando los

Tesis Doctoral


90

polimorfismos por separado como conjuntamente. El reducido tamaño de la

muestra es posiblemente un factor clave en la falta de significación

estadística. En este sentido, el escaso número de pacientes con intolerancia

a AINEs entre la población de asmáticos incluidos, sesga los resultados en

los estudios de asociación con los polimorfismos, siendo estos, al igual que

con el resto de fenotipos estudiados, no significativos.

Tesis Doctoral


91

7. CONCLUSIONES

• Nuestro estudio no encuentra asociación entre los polimorfismos

estudiados en la región promotora de LTC4S, ALOX5 y ALOX5AP, con

el riesgo de padecer asma.

• Tampoco se identifica asociación alguna entre los polimorfismos

estudiados en la región promotora de LTC4S, ALOX5 y ALOX5AP, con

el riesgo de padecer asma más grave.

• El análisis de combinaciones genéticas, buscando un posible efecto

aditivo o epistático de los polimorfismos mencionados, tampoco

resulta significativo en su asociación con asma y/o gravedad.

• Existe, en nuestra población, una relación negativa entre presencia

de atopia y gravedad del asma; y una relación positiva, aun mayor,

entre no ser atópico y padecer asma de mayor gravedad. El asma

intrínseca es significativamente más frecuente entre nuestros

pacientes con diagnóstico de asma persistente grave.

• La Intolerancia a AINEs no se asocia con ninguno de los

polimorfismos estudiados, ni con la gravedad del asma, en nuestra

población.

• La movilidad de nuestros pacientes entre los distintos escalones de

gravedad en el asma, durante el año de estudio con visitas

trimestrales, es menor del 2%.

Tesis Doctoral


92

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sequential addition of atopic asthma cases according to age at diagnosis.

J ALLERGY CLIN IMMUNOL

VOLUME 129, NUMBER 2

LETTERS TO THE EDITOR 573

IL-1 receptor–associated kinase 3 gene (IRAK3)variants associate with asthma in a replicationstudy in the Spanish population

To the Editor:Asthma is a chronic inflammatory disease associated with

genetic and environmental factors. Although the 12q13-24chromosome region had previously shown linkage to asthma,the IL-1 receptor–associated kinase 3 gene (IRAK3) has recentlyemerged as a susceptibility candidate for asthma as a result ofpositional cloning of persistent asthma with age of onset lessthan 13 years in Italian samples.1 IRAK3 encodes a proteinthat negatively regulates Toll-like receptor signaling pathwaysinvolved in innate host defense and in the control of adaptive im-mune responses. However, single nucleotide polymorphisms(SNPs) near IRAK3 have not reached the stringent significancethresholds in any of the genome-wide association studies(GWASs) performed in asthmatic patients.2 Here we aimed toreplicate the association of IRAK3 genetic variants with suscep-tibility to asthma in a case-control study with unrelated Spanishsubjects.For this purpose, DNA samples from 607 patients aged 5 years

or older with physician-diagnosed asthma and fulfilling theGlobal Initiative for Asthma guidelines (www.ginasthma.com)were collected from respiratorymedicine and allergy departmentsas part of the Genetics of Asthma (GOA) study in the Spanishpopulation. Samples from 1271 nonasthmatic patients without apersonal or familial history of allergic or pulmonary diseaseswere obtained from the Spanish National DNA Biobank (www.bancoadn.org), and these were used as control samples. Furthersample details can be found in the Methods section and TableE1 in this article’s Online Repository at www.jacionline.org.

Fifteen tagging SNPs (tSNPs) were selected and genotyped,as described elsewhere,3 to comprehensively survey commongene variation. All of them passed our quality control filtersand were considered for the analyses (see the Methods sectionand Table E2 in this article’s Online Repository at www.jacionline.org). Additionally, 83 European ancestry informativemarkers (EuroAIMs; see Table E3 in this article’s Online Re-pository at www.jacionline.org) were genotyped and used forprincipal component analysis with EIGENSOFT to derive thescores for the first principal component (PC1).4 Association ofindividual tSNPs was tested with the Cochran-Armitage trendtest, and then a logistic regression analysis was used to calculateodds ratios (ORs) with 95% CIs and to adjust for populationstratification by using the PC1 scores. Additionally, 15 untypedSNPs of the gene were imputed and tested for association. Hap-lotype associations were also tested to replicate previous find-ings.1 A false discovery rate (FDR) threshold of 5% wasestablished to limit the expected proportion of false-positive re-sults incurred in the study when a particular subject’s SNP testresult was considered significant. Further method details are de-scribed in the Methods section in this article’s OnlineRepository.For asthma, only 1 SNP (rs1168774) was nominally associated

but was not considered significant in the context of the multipletests performed (P 5 .038, FDR 5 42%, see Table E4 in this ar-ticle’s Online Repository at www.jacionline.org). However, 4tSNPs showed nominal association with atopic asthma (seeTable E4 for unadjusted results), 3 of them remaining significantafter adjusting for population stratification: rs1732877 (OR, 1.24;

95% CI, 1.04-1.46; P 5 .014), rs1624395 (OR, 1.22; 95% CI,1.03-1.45; P 5 .019), and rs1370128 (OR, 1.22; 95% CI, 1.03-1.44; P5 .019). Testing of untyped variants revealed 8 additionalSNPswith nominal association with atopic asthma (.014 <_P value<_ .048, see Table E4). All 11 SNPs were considered significantlyassociated with atopic asthma (FDR 5 2%) and showedmoderate-to-strong linkage disequilibrium (LD; 0.48 <_ r2 <_1.0). Three of them replicated previous findings (rs1624395,rs1370128, and rs2293657).1

A previous study suggested that association of IRAK3 withasthma varied with the age of onset.1 Analyzing the tSNPs repli-cating previous findings (rs1370128 and rs1624395), we ob-served that the effects were largest for 22 years of age atdiagnosis (Fig 1) both for rs1370128 (OR, 1.46; 95% CI, 1.14-1.87; P 5 .001; permuted P 5 .021) and rs1624395 (OR, 1.40;95% CI, 1.09-1.79; P 5 .007; permuted P 5 .043). Thereafter,considering only those atopic asthma cases diagnosed at 22 yearsof age or less, we observed nominal associations for 8 tSNPs, allshowing larger effects than when considering all atopic asthmacases (see Table E4). After adjusting for population stratification,all these associations remained significant: rs2701653 (OR, 1.51;95% CI, 1.04-2.19; P 5 .030), rs78503618 (OR, 1.57; 95% CI,1.15-2.16; P 5 .005), rs1732877 (OR, 1.43; 95% CI, 1.11-1.85; P 5 .007), rs1624395 (OR, 1.37; 95% CI, 1.07-1.76; P 5.013), rs1370128 (OR, 1.44; 95% CI, 1.12-1.84; P 5 .004),rs1152912 (OR, 1.36; 95% CI, 1.06-1.76; P 5 .018),rs1152913 (OR, 1.48; 95% CI, 1.14-1.91; P 5 .003), andrs1152916 (OR, 1.44; 95% CI, 1.11-1.86; P5 .007). On the con-trary, none of the tSNPs was significantly associated with atopicasthma diagnosed at age greater than 22 years (.228 <_ P value <_.971, not shown), suggesting that associations found with atopicasthma were likely to be due to the cases with an age at diagnosisof 22 years or less.Testing of untyped variants revealed 8 additional SNPs nom-

inally associated with atopic asthma diagnosed at age 22 years orless (.001 <_ P value <_ .040, Fig 2 and see Table E4). All 16 SNPsnominally associated with atopic asthma diagnosed at age 22years or less were considered significant (FDR <_ 2%), and mostof them were in moderate-to-strong LD. The exception werers2701653 and rs78503618 from the 59 region, which showed

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FIG 2. Association P values (in log scale) of IRAK3 gene SNPs with atopic asthma diagnosed at age 22 years

or less and in a meta-analysis across Europeans. An LD plot of r2 values based on resequencing data is

shown for the 58 SNPs of IRAK3, as well as their relative position in the gene. Each diamond of the LD

plot represents the pairwise r2 correlation between SNPs.


FEBRUARY 2012

574 LETTERS TO THE EDITOR

weak LD in pairwise comparisons between them (r25 0.001) andwith the rest of the SNPs of the gene (0.001 <_ r2 <_ 0.319).However, only the inclusion of the SNP rs2701653 as a covariatein logistic regression left a significant association for the 2 SNPsthat replicated previous findings (P 5 .012 and P 5 .007 forrs1624395 and rs1370128, respectively), indicating the presenceof independent associations.Haplotype testing of a previously associated 3-SNP region

(rs11465955, rs1624395 and rs1370128)1 replicated the associa-tion of the protective CGC haplotype (.001 <_P <_.032, see Table E5in this article’s Online Repository at www.jacionline.org).However, the association of the TAT risk haplotype1 was not repli-cated (P >_ .068), although it showed a significant effect in logisticregression (OR, 1.39; 95%CI, 1.07-1.81; P5 .013). Nevertheless,the CAT haplotype was detected as a risk haplotype for all asthmaphenotypes (P <_ .023, 1.37 <_ OR <_ .1.75; see Table E5). A furtherexploration suggested that the 3 SNPs included in haplotypes hadalmost perfect LD (D9) with 2 other nearby SNPs (rs2289134 andrs1732877), revealing similar effects when extending the haplo-types to intron 2 of the IRAK3 gene (see Table E5).

Because our results suggested that atopic asthma cases diag-nosed at age 22 years or less accounted for the discoveredassociations, we explored whether these associations had direc-tionally consistent effects with previous findings by performing ameta-analysis with data from candidate-gene case-control asso-ciation studies of unrelated patients with childhood and early-onset asthma (see the Methods section in this article’s OnlineRepository for further details).1,5 This analysis included 3384samples (736 cases and 2648 control subjects) and compared 7,3, and 5 SNPs overlapping between our samples and Sardinian,Italian, and Japanese subjects, respectively. This joint analysisonly evidenced allele and effect-wise replication among Euro-peans (Fig 2 and see Table E6 in this article’s Online Repositoryat www.jacionline.org), with 1 SNP associated with suggestivesignificance at a genome-wide level (rs1370128; OR, 1.54; 95%CI, 1.31-1.82; P 5 2.9 3 1027). Congruent with these results, astudy of 39 candidate genes in non-Hispanic white nuclear fami-lies with asthma6 reported a nominal association for 2 IRAK3SNPs: rs1821777, which shows an r2 value of 1 with rs2289134associated into haplotypes of 5 SNPs in our study, and





LETTERS TO THE EDITOR 575

rs1152912, which is also associated in our study. However, alarge-scale asthma GWAS among Europeans reported a P valueof .07 for 1 IRAK3 SNP not tested in this study (rs17826057) ina meta-analysis combining cases with childhood-onset, later-on-set, severe, and occupational asthma, showing nonsignificant re-sults also when the analysis was restricted to asthma cases withonset at less than 16 years.7 Similarly, IRAK3 was not associatedwith childhood asthma among Japanese or Mexican nuclear fam-ilies in which most cases were atopic (90%).5,8 Although morestudies need to be accomplished, the nontransferability of theIRAK3 association with asthma between studies could be due todifferences in LD between populations, genetic and environmen-tal interactions, genetic heterogeneity, or the inadequate genecoverage of previous studies (see Table E7 in this article’s OnlineRepository at www.jacionline.org for gene coverage in Europeansin commercial arrays).8 Thus, despite the fact that SNPs from theIRAK3 gene are not among the GWAS hits for asthma to date,2 ourresults support the importance of this gene in patients with atopicasthma.In this study we performed the first independent replication of

IRAK3 association with asthma,1 examining extensively the mostcommon variation of the gene. Our results replicated the associa-tion of IRAK3 at the SNP and haplotype levels and evidenced thatother variants of the gene had independent effects in atopicasthma. These results were robust to population stratificationand to the differences in age and sex between cases and controlsubjects (not shown). Strikingly, the association of haplotypeswas not restricted to atopic asthma diagnosed at age 22 years orless but also was found among all asthma cases. However, theTAT risk haplotype was not replicated, which could be motivatedby our limited power to detect association on the basis of previousfindings1 (<60% for risks >_1.2 at a 2-sided P value of .05 and avariant frequency of 0.35 to 0.40) or the potential presence of pri-vate risk variants in Sardinians. Moreover, we could not distin-guish the causal variant because all but a few associated SNPswere in moderate-to-strong LD. Despite the fact that the testedtrait was not exactly the same as that analyzed among Italian sam-ples,1 because the persistency of asthma symptoms was not re-corded among GOA samples, the fact that we replicated thesame SNPs and the protective haplotype supports that these re-sults are unlikely to be spurious.In conclusion, our results confirm the importance of the IRAK3

gene in asthma pathogenesis in European populations, supportingthe hypothesis of shared risk factors among complex diseases3

and bolstering the relevance of the hygiene hypothesis in asthmadevelopment.9 Further research is needed to discern whether thisassociation is due to rare gene variants,10 to the biological func-tion of IRAK3, or to LDwith nearby genes, as well as its relevancein non-European populations.

We thank Carole Ober, Deborah Meyers, and the 4 reviewers who helped

improve the article and Tob�ıas Felipe for Fortran scripting.

Mar�ıa Pino-Yanes, MSca,b

Inmaculada S�anchez-Mach�ın, MDc

Jos�e Cumplido, MDd

Javier Figueroa, MDe

Mar�ıa Jos�e Torres-Galv�an, PhDf

Ruperto Gonz�alez, MDc

Almudena Corrales, CLTa,b

Orlando Acosta-Fern�andez, MDg

Jos�e Carlos Garc�ıa-Robaina, MDc

Teresa Carrillo, MDd

Anselmo S�anchez-Palacios, MDe

Jes�us Villar, MD, PhDa,h,i

Mariano Hern�andez, PhDj

Carlos Flores, PhDa,b

From aCIBER de Enfermedades Respiratorias, Instituto de Salud Carlos III, Madrid,

Spain; bthe Research Unit, Hospital Universitario NS de Candelaria, Tenerife, Spain;cthe Allergy Unit, Hospital Universitario NS de Candelaria, Tenerife, Spain; dthe Al-

lergy Unit, Hospital Universitario Dr. Negrin, Las Palmas de Gran Canaria, Spain;ethe Allergy Unit, Hospital Universitario Insular de Gran Canaria, Spain; fthe Re-

search Unit, Hospital Universitario Dr. Negrin, Las Palmas de Gran Canaria, Spain;gthe Neumology Unit, Hospital Universitario de Canarias, Tenerife, Spain; hthe Mul-

tidisciplinary Organ Dysfunction Evaluation Research Network (MODERN), Re-

search Unit, Hospital Universitario Dr. Negrin, Las Palmas de Gran Canaria, Spain;ithe Keenan Research Center, St Michael’s Hospital, Toronto, Ontario, Canada; andjthe Genetics Laboratory, Instituto Universitario de Enfermedades Tropicales y Salud

P�ublica de Canarias, Universidad de La Laguna, Tenerife, Spain. E-mail: cflores@ull.

es.

Supported by grants from the Ministry of Science and Innovation of Spain (PI081383)

and FUNCIS (27/07) and by a specific agreement between Instituto de Salud Carlos

III and Gobierno de Canarias (EMER07/001) under the ENCYT 2015 framework.

Disclosure of potential conflict of interest: The authors declare that they have no relevant

conflicts of interest.

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The C11orf30-LRRC32 region is associatedwith total serum IgE levels in asthmaticpatients

To the Editor:Asthma is a chronic inflammatory respiratory disease charac-

terized by bronchial hyperresponsiveness, increased TH2 cyto-kine levels, and increased serum IgE levels. Atopic dermatitisor eczema is a chronic inflammatory skin disease characterizedby epidermal barrier dysfunction and IgE-mediated sensitization.The only published genome-wide association study (GWAS) ofatopic dermatitis identified rs7927894 on chromosome 11q13.5


mailto:[email protected]


METHODS

Ethics statementThis study was approved by the ethics committees at participating

hospitals, and written informed consent was obtained from all subjects.

Study subjectsThis study was conducted by using a case-control design of DNA samples

from unrelated subjects reporting at least 2 generations of Spanish descent.

Case samples that fulfilled the Global Initiative for Asthma guidelines for the

diagnosis and classification of asthma (www.ginasthma.com) were collected

from respiratory medicine and allergy departments as part of the GOA study

in the Spanish population. This sample included 607 patients with physician-

diagnosed asthmawith active specific medication for asthmatic symptoms and

age of 5 years or older. We recorded basic demographic data (age, sex, and

smoking habits), age at diagnosis of the disease, severity of the illness, family

history of allergic disease, allergic symptoms (rhinitis, atopic dermatitis, and

food and drug allergy), basal FEV1, and symptomatic treatment. Atopy was

confirmed by a positive skin prick test response (a wheal with a diameter 3

mm greater than that elicited by the saline control) to one of 7 common aller-

gens, including dust mite, epithelium, pollen, fungi, food, latex, and others, or

by specific serum IgE levels of greater than 0.35 IU/mL. Allergens evaluated

for specific IgE levels were dust mite (Dermatophagoides pteronyssinus,Der-

matophagoides farinae, Glycyphagus species, Blomia tropicalis, Acarus siro,

Tyrophagus putrescentiae, Lepidoglyphus destructor, and Euroglyphus may-

nei), epithelium (Felis domesticus, Canis familiaris, Equus caballus, and Or-

yctolagus cuniculus), pollen (Olea europaea, Salsola species, Lolium perenne,

Artemisia vulgaris, Parietaria species, Platanus species, Chenopodium spe-

cies, Plantago species,Rumex species, andCupressus species), fungi (Penicil-

lium notatum, Alternaria alternate, Aspergillus fumigatus, and Cladosporium

herbarum), food (cow’s milk, hen’s egg, peanut, soybean, wheat, fish, shrimp,

crabs, lobster, clams, oysters, mussels, banana, chestnut, and kiwi), latex, and

cockroache (Blattella germanica).

A total of 1271 DNA samples from subjects self-reporting at least 2

generations of ancestors born in Spain and without personal or familial history

of allergic or pulmonary diseases were used as control samples. These were

obtained from the Spanish National DNA Biobank (www.bancoadn.org), a

member of the Public Population Project in Genomics Consortium (www.

p3gobservatory.org). Briefly, samples were collected from branches of the Na-

tional Blood Service from unrelated subjects residing in Spain. After signing

an informed consent form, donors self-declared general health status, physical

activity, transportation and nutrition habits, employment and qualification, de-

mographics, tobacco smoke, alcohol consumption, genealogical information,

residence andmother tongue, and personal and familiar history of diseases, in-

cluding infectious, cancerous, blood and circulatory, endocrine, mental and

behavioral, respiratory (including asthma symptoms), immunologic (includ-

ing allergies), bone, congenital, skin and digestive, as well as eye and hearing,

disorders. No information from medical records was incorporated or revised,

and no medical testing was performed on donors.

Selection of tSNPstSNPs were selected by using TagIT 3.03E1 with published resequencing

data from 22.6 kb in 32 unrelated healthy Spanish subjects and forcing the in-

clusion of previously associated SNPsE2,E3 and all potential functional vari-

ants, as predicted by PupaSuiteE4 or previously established by us.E3 A final

set of 15 tSNPs was selected (Table E2) and tested for performance by using

an SNP-dropping-with-resampling method,E1 satisfying a haplotype r2 value

of 1.0 in the resequencing data.

Genotyping of tSNPsDNAwas extracted from blood (GFX kit; GE Healthcare, Little Chalfont,

United Kingdom) or saliva (Oragene DNA; DNA Genotek, Inc, Kanata,

Ontario, Canada) and used for whole-genome amplification with the Illustra

GenomiPhi V2 DNA Amplification Kit (GE Healthcare). Dilutions of this

product were quantified by using an SYBRGreen I–based DNA quantification

method (Molecular Probes, Eugene, Ore) and genotyped in 2 reactions

containing 7 and 8 tSNPs by means of the SNaPshot Multiplex kit (Applied

Biosystems, Foster City, Calif), as described elsewhere.E3 Electrophoresis was

performed on an ABI 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems), and gen-

otypes were automatically assigned by using GeneMapper v3.2 (Applied Bi-

osystems). Genotyping was blind to disease status. Approximately 6% of the

samples were genotyped in duplicate to monitor genotyping quality, yielding

an estimated overall discordance rate among duplicated samples of 0.07%

(95% CI, 0.02% to 0.19%). The genotyping completion rate was greater

than 97.7% across all 15 tSNPs (see Table E2).

Assessment of population stratificationNinety-three EuroAIMs were genotyped in case and control samples to

reduce the risk for false-positive results, allowing correcting for major popu-

lation stratification effects among European and Spanish populations.E5,E6

Genotyping of EuroAIMs was conducted by using the iPLEX Gold assay on

the MassARRAY system, and genotype calls were automatically generated

by using all data from the study simultaneously with TYPER 3.4 software

(Sequenom, San Diego, Calif) by the Spanish National Genotyping Center,

Santiago de Compostela Node (CeGen, www.cegen.org). Of 93 EuroAIMs,

83 markers were successfully genotyped and considered for the final analysis

(see Table E3). Our previous studies have demonstrated that a subset of as few

as 65 of theseEuroAIMs effectively controlled false-positive results in Spanish

case-control association studies.E6 On the basis of these markers, principal

component analysis was used to derive the scores for the PC1 as ancestry esti-

mates in cases and control subjects. This analysis was performedwith EIGEN-

SOFT,E7 as described elsewhere.E6

Statistical analysisClinical and demographic data were analyzed by using x2 and Mann-

WhitneyU tests with SPSS 15.0 software (SPSS, Inc, Chicago, Ill). Departures

from Hardy-Weinberg equilibrium were evaluated separately for cases and

control subjects by using an exact test.E8 Because none of the tSNPs deviated

significantly from Hardy-Weinberg equilibrium in the control group (thresh-

old for significance after considering the multiple comparisons performed

was a P value of .003), all tSNPs were retained for the association analyses.

Further details can be found in Table E2.

Individual tSNP associations were tested by using the Cochran-Armitage

trend test, assuming an additive model, and the empiric P value was obtained

by using 1000 permutations with a custom script for STATISTICA (StatSoft,

Inc, Tulsa, Okla).E9 Logistic regression analysis was used to calculate allelic

effects as ORswith 95%CIs, to adjust for population stratification by using the

PC1 scores as a covariate, and to test the independence of associations be-

tween SNPs. These analyses were performed with SPSS 15.0 software

(SPSS, Inc).

Because a previous study evidenced an increase of allelic effects among

cases with onset at less than 13 years, we explored whether the allelic effects

varied with the age at diagnosis to estimate the trait cutoff at which the allelic

effects were largest. For that, a previously described algorithm was used.E10

Briefly, individual SNP associations were computed as above but repeatedly

for each group of cases resulting from the sequential incorporation of atopic

asthmatic patients for every increase in 1 year in the age of diagnosis (starting

from the age of 11 years, for which the study accumulated>50 cases). The em-

piric P value, adjusted for the multiple tests done, was then obtained from the

comparison of the smallest nominal P value from all tests done with P values

calculated from permuting genotypes 1000 times among thewhole sample (by

reshuffling labels of cases and controls) as the proportion of permutation rep-

licates that yielded P values smaller than that observed in the actual dataset.

Untyped SNPswithmultilocus LD values of .7 or greaterE11 or with aminor

allele frequency (MAF) of 10%or greater were imputed from tSNPs and tested

for association by means of TUNA version 1.1E11 to limit the imputation er-

ror,E3 allowing us to analyze 15 additional SNPs of the gene. Haplotypes

from the resequencing data were estimated with PHASE 2.1E12 to be used

as a reference for the underlying LD across the gene. An FDR was assessed

with QVALUEE13 considering all 30 SNPs tested (15 tSNPs and 15 imputed


FEBRUARY 2012

575.e1 LETTERS TO THE EDITOR



http://www.p3gobservatory.org

http://www.p3gobservatory.org

http://www.cegen.org

SNPs) to judge the SNP associations in the context of the multiple compari-

sons performed. An omnibus test overall haplotype frequency distribution

was first obtained with WHAP to determine whether there were haplotype as-

sociations.E14 Then the statistical significance for the association of specific

haplotypes was assessed by using logistic regression with HAPSTAT,E15

and ORs and 95%CIs were obtained by using THESIAS,E16 with the latter us-

ing the most common haplotype as a reference.

Under the principle that if SNPs had consistent effects (ie, allele and effect

wise) among different studies, a joint analysis would improve the results

obtained from the studies by using a separate analysis, a meta-analysis of

association for the SNPs overlapping across our study and the previous

onesE2,E17 was performed. For this purpose, fixed and random effects meta-

analyses were examined with the R library rmeta version 2.16.E18 The patterns

of LD, as r2 and D9 values, were explored with Haploview 3.32.E19

Finally, an evaluation of the array coverage of SNPs from the IRAK3 gene

with MAFs of 5% or greater in the GWAS performed in samples of European

ancestry to date was assessed.E20-E26 For that, the information of SNPs con-

tained in the arrays was downloaded from the UCSC Genome Bioinformatics

Web page (http://genome.ucsc.edu) for the region delimited by our resequenc-

ing survey. Gene coverage was then assessed as the proportion of SNPs that

were captured by the array both directly and indirectly (with a multimarker

r2 >_ 0.8) with respect to the total number of SNPs with MAFs of 5% or greater

in Utah residents with ancestry from northern and western Europe from Hap-

Map release 28 and in our resequencing data.

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LETTERS TO THE EDITOR 575.e2

http://genome.ucsc.edu

TABLE E1. Relevant demographic and clinical features of samples

Variable Cases (n 5 607) Control subjects (n 5 1271) P value

Sex (% males) 23.3 (567) 59.1 (1270) <.001*

Age (y), mean, P25-P75 37, 25-44 (569) 40, 32-48 (1270) <.001�Smoking habits (% ever smokers) 27.3 (344) 48.1 (1122) <.001*

Clinical features

Serum IgE levels (IU/mL), mean, P25-P75 478.1, 89.3-394.5 (259) NA

Age at diagnosis (y), mean, P25-P75 28, 14-39 (570) NA

FEV1 (% predicted), mean, P25-P75 82, 68-95 (231) NA

Rhinitis (% positive) 74.2 (485) NA

Dermatitis (% positive) 20.2 (480) NA

SPT response (% positive) 76.6 (445) NA

Specific IgE (% positive) 51.2 (287) NA

Atopy (% positive) 76.7 (464) NA

Treatment

Inhaled corticoids (%) 85.6 (250) NA

Oral corticoids (%) 4.6 (305) NA

Long-acting b2-agonists (%) 53.0 (317) NA

Short-acting b2-agonists (%) 81.8 (231) NA

Body mass index (kg m22), mean, P25-P75 24.6, 21.1-27.5 (227) NA

Numbers in parentheses indicate the total number of subjects with available data.

NA, Not available; P25, percentile 25; P75, percentile 75.

*x2 Test.

�Mann-Whitney U test.


FEBRUARY 2012


TABLE E2. Information, CRs, and HWE P values for IRAK3 tSNPs

rs No. Position* SNP (effect) CR (%)

HWE P value

Control

subjects

Asthmatic

patients

Atopic asthmatic

patients

Diagnosed

at <_22 y

rs1732887 64867883 21464A>G 98.7 .004 .579 .779 .404

rs2701653 64868152 21195C>T 98.1 .312 .276 .570 .754

rs1732886 64870029 c.1331550A>G 98.1 .014 .912 .888 .579

rs78503618 64871319 c.13311841_1853delGGAAGTGGTCAGT 98.7 .278 .534 .368 .201

rs2289134 64884954 c.31611014T>C 98.3 .307 .654 .909 1.000

rs1732877 64885411 c.31611471T>C 97.7 .642 .616 .157 .515

rs11465955 64889666 c.381199C>T 98.2 .250 .721 .909 .907

rs1152888 64891495 c.439G>A (p.Val147lle) 98.0 .434 .139 .766 .289

rs1624395 64904483 c.65422287G>A 98.9 .593 1.000 .519 .513

rs1370128 64904905 c.65421865C>T 98.5 .522 .457 .164 .589

rs11176095 64919952 c.88824581T>C 98.7 .005 .168 .421 .034

rs1152912 64920175 c.88824358G>A 98.3 .280 .808 .245 .750

rs1152913 64920682 c.88823851T>A 98.2 .865 .060 .031 .139

rs1152916 64921571 c.88822962A>T 98.9 1.000 .056 .152 .072

rs10506481 64930378 *2157T>C 98.3 .114 .011 .218 .003

Nominally significant associations are shown in boldface.

CR, Completion rate; HWE, hardy-Weinberg equilibrium.

*According to National Center for Biotechnology Information build 36.3.




TABLE E3. Summary statistics for EuroAIMs successfully genotyped in this study

rs No. Alleles Chromosome Position* CR (%)

MAF HWE P values

Control subjects Asthmatic patients Control subjects Asthmatic patients

rs1157492 C/T 1 211627299 97.9 0.430 0.397 .908 .549

rs11807062 A/C 1 3176394 97.5 0.171 0.179 .070 .089

rs1416467 A/G 1 80470749 98.5 0.491 0.469 .910 .162

rs1890131 C/T 1 164329131 98.3 0.303 0.293 .893 .694

rs2236876 A/G 1 169749143 97.2 0.315 0.325 .427 .347

rs2419063 A/G 1 186988492 97.8 0.105 0.122 1.000 .702

rs495347 C/T 1 17909228 98.6 0.304 0.300 .592 .285

rs725974 G/T 1 167344909 96.7 0.187 0.215 1.000 .275

rs7552548 A/G 1 82775867 96.5 0.320 0.310 .030 .177

rs10496610 C/G 2 123757682 99.2 0.230 0.222 .749 1.000

rs1448314 A/G 2 223811705 98.1 0.087 0.089 .101 .307

rs1517407 A/G 2 63401982 98.2 0.474 0.469 .046 .323

rs3769005 C/G 2 136437098 98.2 0.482 0.523 .255 .805

rs4832640 C/T 2 19025771 97.1 0.255 0.272 .200 .214

rs6432110 A/T 2 10688616 98.1 0.431 0.458 .017 .620

rs6745653 C/T 2 97748515 98.8 0.116 0.124 .679 .709

rs1879558 C/T 3 155137053 98.7 0.188 0.176 .307 .122

rs2596834 C/T 3 10795067 95.4 0.495 0.470 .013 .561

rs4686497 A/G 3 190124209 98.3 0.168 0.205 .042 .209

rs822759 G/T 3 22948116 98.6 0.324 0.356 .846 .214

rs9290675 C/T 3 180489335 99.1 0.131 0.120 .135 .562

rs9861816 C/G 3 195649797 98.2 0.259 0.240 .235 .501

rs10516982 G/T 4 96963279 98.1 0.272 0.289 .566 .135

rs1373557 G/T 4 167601812 98.9 0.202 0.199 .332 .201

rs17443616 A/G 4 41063093 98.5 0.306 0.311 .640 .182

rs1873195 C/T 4 38713739 98.5 0.301 0.267 .788 .021

rs2014303 A/C 4 10262125 97.8 0.221 0.224 .869 .289

rs2251432 A/G 4 191063741 97.7 0.208 0.190 .195 .503

rs4555709 C/T 4 53867889 99.2 0.073 0.074 .035 .559

rs9328764 A/G 4 2143685 98.6 0.160 0.174 .599 .398

rs974020 C/T 4 117865302 98.6 0.296 0.270 .153 .470

rs16891982 C/G 5 33987450 99.3 0.201 0.253 .429 .452

rs33706 C/G 5 87540920 98.6 0.284 0.305 .036 .290

rs3822616 A/G 5 94828145 98.4 0.192 0.183 .143 .338

rs10484547 C/G 6 29560753 99.4 0.071 0.083 .828 .592

rs2187684 C/T 6 32872697 98.0 0.360 0.341 .902 .273

rs2804756 C/T 6 698586 99.1 0.086 0.079 .151 .253

rs756147 A/G 6 141672412 99.5 0.055 0.077 .009 .773

rs10486207 A/G 7 7884020 98.4 0.282 0.273 .184 .917

rs17864053 A/G 7 89801957 98.6 0.209 0.210 .229 .806

rs1922086 C/T 7 155515702 97.7 0.394 0.414 .006 .312

rs2097884 A/C 7 4125658 97.4 0.251 0.257 .172 .747

rs2219248 C/T 7 113965977 98.7 0.355 0.350 1.000 .059

rs2367191 A/G 7 141571268 98.3 0.413 0.405 .412 .671

rs2905347 A/G 7 22393559 96.4 0.435 0.449 .640 .677

rs10504924 C/T 8 94157437 97.7 0.092 0.123 .864 .704

rs920590 C/T 8 19695441 98.2 0.372 0.366 .114 .479

rs10512122 C/G 9 81715524 98.6 0.175 0.165 .170 .458

rs1408794 A/G 9 12641340 94.8 0.477 0.523 .011 .004

rs2086085 A/C 9 1680761 99.1 0.106 0.120 .455 .019

rs1045873 A/C 10 25177778 98.6 0.301 0.281 .105 .268

rs10508372 A/G 10 9012024 99.6 0.087 0.092 .723 .216

rs10509384 A/G 10 78693188 97.3 0.298 0.284 .276 .611

rs10509954 A/G 10 113658378 98.4 0.109 0.115 .143 .105

rs379773 C/G 10 109905342 95.4 0.353 0.354 .704 .470

rs7908825 C/G 10 75224547 97.4 0.324 0.312 1.000 .104

rs1560569 A/G 11 8896463 97.2 0.344 0.340 .344 .781

rs2847502 C/T 11 119623708 98.9 0.306 0.304 .206 .847

rs4938377 G/T 11 116801502 98.1 0.063 0.076 1.000 .141

rs923031 A/C 11 15777602 98.3 0.468 0.449 .138 .741

rs1003306 A/T 12 2624458 98.0 0.339 0.372 .447 .005

(Continued)


FEBRUARY 2012


TABLE E3. (Continued)

rs No. Alleles Chromosome Position* CR (%)

MAF HWE P values

Control subjects Asthmatic patients Control subjects Asthmatic patients

rs1582398 A/G 12 78624019 97.5 0.129 0.140 .377 .732

rs3809125 C/T 12 55130616 98.3 0.367 0.369 .112 .724

rs7965049 A/G 12 7537044 97.5 0.245 0.253 .357 .227

rs998401 A/G 12 53641500 98.0 0.074 0.074 .058 1.000

rs7997100 C/T 13 67988075 98.4 0.349 0.348 .010 .719

rs986642 C/G 13 56944263 98.8 0.239 0.268 .160 .009

rs10483853 A/G 14 72826052 98.7 0.234 0.257 .344 .236

rs10519269 A/C 15 77705433 96.5 0.106 0.130 .095 .586

rs1129038 C/T 15 26030454 98.4 0.331 0.341 .898 .927

rs7163907 C/T 15 73632152 98.9 0.303 0.328 .254 .164

rs1107820 C/T 17 41491195 97.4 0.274 0.242 1.000 .120

rs1476162 A/G 17 8031808 98.6 0.135 0.146 .544 1.000

rs2003092 A/G 17 59516509 97.7 0.274 0.314 1.000 .337

rs959260 C/T 17 70881017 98.3 0.218 0.215 .934 .716

rs2418844 A/G 18 26037261 97.8 0.489 0.503 .253 .806

rs4892082 A/C 18 69051672 97.5 0.123 0.131 1.000 .721

rs523776 C/T 18 7554299 98.4 0.242 0.220 1.000 .722

rs959763 G/T 18 56797826 98.0 0.363 0.386 .854 .796

rs103294 C/T 19 59489660 98.7 0.162 0.156 .835 .643

rs202546 C/T 20 1611539 97.3 0.429 0.438 .449 .675

rs477627 A/G 20 47613465 97.6 0.193 0.217 .647 .904

rs969539 A/G 22 24942341 97.2 0.374 0.362 .626 .211

CR, Completion rate; HWE, Hardy-Weinberg equilibrium.

*According to National Center for Biotechnology Information build 35.




TABLE E4. Association summary, including unadjusted effects and P values, of IRAK3 SNPs with asthma and atopic asthma

rs No. Position* SNPy (effect)

Risk

allele

Minor allele frequency OR (95% CI)z P value§

Control

subjects

Asthmatic

patients

Atopic

asthmatic

patients

Diagnosed

at <_22 y

Asthmatic

patients

Atopic

asthmatic

patients

Diagnosed

at <_22 y

Asthmatic

patients

Atopic

asthmatic

patients

Diagnosed

at <_22 y

rs1732888 64867853 21494T>C T 0.273 0.258 0.269 0.228 .344 .819 .098

rs1732887 64867883 21464A>G A 0.258 0.243 0.254 0.210 1.09 (0.93-1.27) 1.02 (0.85-1.23) 1.28 (0.96- 1.72) .309 .819 .082

rs2701653 64868152 21195C>T T 0.094 0.104 0.106 0.134 1.14 (0.91-1.42) 1.15 (0.88-1.51) 1.49 (1.03-2.14) .307 .355 .034

rs1732886 64870029 c.1331550A>G A 0.256 0.242 0.247 0.205 1.08 (0.92-1.25) 1.04 (0.87-1.27) 1.32 (0.98-1.75) .368 .610 .061

rs78503618 64871319 c.13311841_

1853delG

GAAGTGG

TCAGT

ins 0.267 0.269 0.231 0.192 .99 (0.85-1.16) 1.22 (1.00-1.49) 1.54 (1.12-2.13) .866 .057 .004

rs56156535 64872409 c.13312931T>C C 0.402 0.422 0.439 0.463 .181 .046 .040

rs1168774 64877754 c.13426004A>G G 0.429 0.458 0.472 0.483 .038 .014 .001

rs4762088 64877849 c.13425909G>C C 0.386 0.407 0.425 0.449 .167 .048 .039

rs17767286 64878509 c.13425249C>A A 0.379 0.394 0.411 0.433 .325 .111 .071

rs17767298 64879508 c.13424250A>G G 0.362 0.377 0.393 0.413 .316 .108 .072

rs1882200 64883968 c.316128C>T T 0.331 0.347 0.365 0.384 .343 .084 .105

rs2289134 64884954 c.31611014T>C C 0.334 0.347 0.365 0.385 1.06 (0.91-1.22) 1.14 (0.96-1.36) 1.24 (0.96-1.59) .410 .117 .095

rs1732877 64885411 c.31611471T>C C 0.417 0.445 0.470 0.488 1.13 (0.98-1.29) 1.24 (1.04-1.46) 1.46 (1.13-1.89) .113 .008 .003

rs11465955 64889666 c.381199C>T T 0.334 0.350 0.368 0.392 1.07 (0.93-1.24) 1.16 (0.97-1.37) 1.28 (0.99-1.64) .293 .082 .058

rs2293657 64891273 c.4372220A>T T 0.286 0.310 0.327 0.348 .067 .018 .010

rs1152888 64891495 c.439G>A (p.Val147lle) A 0.080 0.091 0.100 0.112 1.17 (0.92-1.49) 1.29 (0.97-1.72) 1.46 (0.98-2.17) .270 .085 .070

rs1821777 64892495 c.5881851C>T T 0.343 0.350 0.369 0.390 .677 .177 .088

rs55715236 64904334 c.65422436C>T T 0.329 0.338 0.359 0.383 .589 .158 .068

rs1623665 64904449 c.65422321G>T T 0.415 0.442 0.466 0.489 .124 .023 .005

rs1624395 64904483 c.65422287G>A A 0.392 0.419 0.442 0.475 1.12 (0.98-1.29) 1.23 (1.04-1.45) 1.40 (1.09-1.79) .101 .013 .007

rs1370127 64904584 c.65422186G>A A 0.392 0.419 0.442 0.475 .106 .022 .012

rs1370128 64904905 c.65421865C>T T 0.415 0.443 0.466 0.489 1.12 (0.98-1.29) 1.22 (1.04-1.44) 1.46 (1.14-1.87) .107 .011 .001

rs10716217 64908730 c.8871313delA delA 0.415 0.442 0.466 0.489 .125 .017 .001

rs1152908 64915771 c.88717354T>A A 0.399 0.423 0.444 0.484 .126 .015 .005

rs11176095 64919952 c.88824581T>C C 0.062 0.066 0.074 0.088 1.10 (0.84-1.44) 1.24 (0.90-1.70) 1.48 (0.96-2.28) .618 .235 .086

rs1152912 64920175 c.88824358G>A A 0.479 0.483 0.499 0.561 1.02 (0.88-1.17) 1.10 (0.93-1.30) 1.40 (1.09-1.81) .856 .273 .006

rs1152913 64920682 c.88823851T>A A 0.496 0.492 0.463 0.401 1.05 (0.92-1.20) 1.18 (1.00-1.39) 1.51 (1.17-1.94) .515 .057 .003

rs1152915 64920925 c.88823608A>C C 0.304 0.312 0.318 0.304 .605 .428 .986

rs1152916 64921571 c.88822962A>T A 0.443 0.425 0.402 0.353 1.08 (0.94-1.23) 1.18 (1.00-1.40) 1.46 (1.13-1.89) .310 .043 .002

rs10506481 64930378 *2157T>C T 0.123 0.120 0.124 0.104 1.03 (0.84-1.27) 1.00 (0.78-1.28) 1.20 (0.81-1.79) .767 .986 .362

tSNPs are underlined. Nominally significant associations are shown in boldface.

*According to National Center for Biotechnology Information (NCBI) build 36.3.

�According to the sequence with NCBI accession no. NC_000012.10.

�Calculated only for the genotyped SNPs.

§Obtained from 1000 permutations.

JALLERGYCLIN

IMMUNOL

FEBRUARY2012

575.e7

LETTERSTO

THEEDITOR

TABLE E5. Analysis of haplotypes of 3 or 5 SNPs

Frequencies P value OR (95% CI); P valuey

Haplotype*

Control

subjects

Asthmatic

patients

Atopic

asthmatic

patients

Diagnosed

at <_22 y

Asthmatic

patients

Atopic

asthmatic

patients

Diagnosed

at <_22 y Asthmatic patients

Atopic asthmatic

patients Diagnosed at <_22 y

CGC 0.582 0.545 0.525 0.481 .032 .006 .001 Reference Reference Reference

TAT .329 .340 .361 .383 .494 .113 .068 1.09 (0.94-1.27); .267 1.18 (0.98-1.41); .077 1.39 (1.07-1.81); .013

CAT 0.062 0.082 0.084 0.091 .029 .043 .066 1.37 (1.05-1.80); .020 1.46 (1.05-2.02); .023 1.75 (1.12-2.74); .015

CGT 0.022 0.022 0.027 0.036 .984 .957 .154 1.05 (0.65-1.68); .854 0.96 (0.52-1.80); .909 1.89 (0.94-3.83); .076

Omnibus .071 .035 .010

TTCGC 0.578 0.542 0.522 0.477 .077 .011 .003 Reference Reference Reference

CCTAT 0.327 0.336 0.358 0.376 .417 .118 .093 1.08 (0.93-1.26); .288 1.15 (0.97-1.39); .111 1.35 (1.03-1.77); .031

TCCAT 0.060 0.082 0.085 0.093 .016 .019 .035 1.37 (1.05-1.80); .022 1.43 (1.03-1.98); .032 2.01 (1.27-3.19); .003

TCCGT 0.021 0.021 0.022 0.035 .973 .941 .199 1.04 (0.64-1.70); .877 1.02 (0.55-1.88); .958 1.36 (0.62-3.00); .439

Omnibus .084 .035 .019

Nominally significant associations are shown in boldface. SNPs included in the haplotypes studied by Balaci et alE2 are underlined.

*Haplotypes are defined by 3 tSNPs (rs11465955, rs1624395, and rs1370128) or 5 SNPs SNPs (rs2289134, rs1732877, rs11465955, rs1624395, and rs1370128).

�P value from regression logistic model by using the most common haplotype as reference.

JALLERGYCLIN

IMMUNOL

VOLUME129,NUMBER2

LETTERSTO

THEEDITOR

575.e8

TABLE E6. Meta-analysis of IRAK3 SNPs in unrelated case-control samples

Rs no.

Risk

allele

Minor allele frequency Association tests

Spanish Sardinian Italian Japanese

Individual studies

OR (95% CI)*; P value

Meta-analysis

OR (95% CI)*; P value

Control

subjects

(n 5 1271)

Casesy(n5 139)

Control

subjects

(n 5 460)

Cases

(n 5 139)

Control

subjects

(n 5 278)

Cases

(n 5 67)

Control

subjects

(n 5 639)

Cases

(n 5 391) Spanishz Sardinian Italian Japanese§ Europeans All samples§

rs1732887 A 0.26 0.21 0.10 0.09 1.28 (0.96-1.72); .082 1.06 (0.78-1.43); .725 1.18 (0.95-1.46);

.1420

rs2701653 T 0.09 0.13 0.41 0.43 1.49 (1.03-2.14); .034 1.05 (0.87-1.25); .620 1.11 (0.95-1.31);

.1791

rs1732886 A 0.26 0.21 0.21 0.16 1.32 (0.98-1.75); .061 1.40 (0.98-2.00); .106 1.36 (1.08-1.72); .0105

rs1882200 T 0.33 0.38 0.34 0.46 1.25 (0.97-1.61); .105 1.65 (1.26-2.17); .001 1.42 (1.18-1.71); .0002

rs11465955 T 0.33 0.39 0.35 0.46 0.34 0.43 1.28 (0.99-1.64); .058 1.56 (1.18-2.04); .001 1.48 (1.01-2.18);

.029

1.42 (1.2-1.68); .0001

rs2293657 T 0.29 0.35 0.34 0.46 0.12 0.15 1.32 (1.01-1.71); .010 1.65 (1.26-2.17); .001 1.07 (0.82-1.39); .180 1.47 (1.22-1.77); .0001 1.31 (1.13-1.53);

.0004

rs1152888 A 0.08 0.11 0.40 0.40 1.46 (0.98-2.17); .07 0.96 (0.81-1.15); .839 1.03 (0.87-1.21);

.3719

rs1821777 T 0.34 0.39 0.36 0.46 1.22 (0.94-1.57); .088 1.54 (1.17-2.02); .001 1.36 (1.13-1.63); .0013

rs1624395 A 0.39 0.48 0.42 0.51 0.40 0.53 1.40 (1.09-1.79); .007 1.46 (1.11-1.91); .002 1.68 (1.15-2.46);

.004

1.47 (1.25-1.74);

5.7 3 1026

rs1370128 T 0.42 0.49 0.43 0.54 0.41 0.55 1.46 (1.14-1.87); .001 1.53 (1.16-2.00); .001 1.76 (1.21-2.58);

.002

1.54 (1.31-1.82);

2.9 3 1027

rs10716217 delA 0.42 0.49 0.54 0.55 1.50 (1.17-1.92); .001 1.04 (0.87-1.24); .685 1.17 (1.02-1.36);

.0295

*From an additive model.

�Atopic asthma diagnosed at 22 years or younger.

�From Table E4.

§Only childhood cases from the Japanese study were considered in this analysis.

JALLERGYCLIN

IMMUNOL

FEBRUARY2012

575.e9

LETTERSTO

THEEDITOR

TABLE E7. Coverage of SNPs from the IRAK3 gene with MAFs of

5% or greater on commercial arrays used in asthma GWASs in

samples of European ancestry*

Coverage (%)

SNP array HapMap CEU Resequencing

Affymetrix 500K 63 29

Affymetrix Genome-Wide Human

SNP Array 6.0

93 71

Illumina HumanHap300� 77 19

Illumina HumanHap550� 83 35

Illumina HumanHap650Y 83 42

Illumina 1M-Duo 97 65

CEU, Ancestry from northern and western Europe.

*Includes studies described in Moffatt et al, 2007E20; Himes et al, 2009E21; Sleiman

et al, 2009E22; Li et al, 2010E23; Moffatt et al, 2010E24; Ferreira et al, 2011E25; and

Torgerson et al, 2011.E26

�Including the Illumina HumanCNV370-Duo as it was built on the Illumina

HumanHap300 BeadChip (317,000 SNPs) with an additional 52,000 markers aimed at

detecting copy number variations.

�Including the Illumina Human610 because it is similar to the Illumina

HumanHap550 with the addition of 60,000 markers to target regions with copy

number variations.




BRIEF COMMUNICATION

No association between genetic ancestry and susceptibilityto asthma or atopy in Canary Islanders

María Pino-Yanes & Almudena Corrales &

José Cumplido & Ruperto González &

María José Torres-Galván &

Orlando Acosta Fernández &

Inmaculada Sánchez-Machín & Javier Figueroa &

Anselmo Sánchez-Palacios & Jesús Villar &

Mariano Hernández & Teresa Carrillo & Carlos Flores

Received: 12 April 2012 /Accepted: 6 June 2012 /Published online: 19 June 2012# Springer-Verlag 2012

Abstract Asthma is a complex respiratory disease charac-terized by chronic inflammation of airways and frequentlyassociated with atopic symptoms. The population from theCanary Islands, which has resulted from a recent admixtureof North African and Iberian populations, shows the highestprevalence of asthma and atopic symptoms among the Span-ish populations. Although environmental particularitieswould account for the majority of such disparity, geneticancestry might play a role in increasing the susceptibility of

asthma or atopy, as have been demonstrated in other recent-ly African-admixed populations. Here, we aimed to explorewhether genetic ancestry was associated with asthma orrelated traits in the Canary Islanders. For that, a total of734 DNA samples from unrelated individuals of the GOAstudy, self-reporting at least two generations of ancestorsfrom the Canary Islands (391 asthmatics and 343 controls),were successfully genotyped for 83 ancestry informativemarkers (AIMs), which allowed to precisely distinguishing

Electronic supplementary material The online version of this article(doi:10.1007/s00251-012-0631-3) contains supplementary material,which is available to authorized users.

M. Pino-Yanes :A. Corrales : J. Villar : C. FloresCIBER de Enfermedades Respiratorias,Instituto de Salud Carlos III,Madrid, Spain

M. Pino-Yanes :A. Corrales : C. Flores (*)Research Unit, Hospital Universitario N.S. de Candelaria,Carretera del Rosario s/n,38010 Santa Cruz, Tenerife, Spaine-mail: [email protected]

J. Cumplido : T. CarrilloAllergy Unit, Hospital Universitario Dr. Negrin,Las Palmas de Gran Canaria, Spain

R. González : I. Sánchez-MachínAllergy Unit, Hospital del Tórax,Complejo Hospitalario Universitario NS Candelaria,Tenerife, Spain

M. J. Torres-GalvánResearch Unit, Hospital Universitario Dr. Negrin,Las Palmas de Gran Canaria, Spain

O. A. FernándezNeumology Unit, Hospital Universitario de Canarias,Tenerife, Spain

J. Figueroa :A. Sánchez-PalaciosAllergy Unit, Hospital Universitario Insular de Gran Canaria,Las Palmas de Gran Canaria, Spain

J. VillarMultidisciplinary Organ Dysfunction Evaluation ResearchNetwork (MODERN), Research Unit,Hospital Universitario Dr. Negrin,Las Palmas de Gran Canaria, Spain

J. VillarKeenan Research Center, St. Michael’s Hospital,Toronto, ON, Canada

M. HernándezGenetics Laboratory, Instituto Universitario de EnfermedadesTropicales y Salud Pública de Canarias,Universidad de La Laguna,Tenerife, Spain

Immunogenetics (2012) 64:705–711DOI 10.1007/s00251-012-0631-3

Author's personal copy

http://dx.doi.org/10.1007/s00251-012-0631-3

between North African and Iberian ancestries. No associa-tion was found between genetic ancestry and asthma orrelated traits after adjusting by demographic variables dif-fering among compared groups. Similarly, none of the indi-vidual AIMs was associated with asthma when results wereconsidered in the context of the multiple comparisons per-formed (0.005≤p value≤0.042; 0.221≤q value≤0.443). Ourresults suggest that if genetic ancestry were involved in thesusceptibility to asthma or related traits among CanaryIslanders, its effects would be modest. Larger studies, ex-amining more genetic variants, would be needed to exploresuch possibility.

Keywords Allergy . Genetic susceptibility . North Africa .

Admixture

Asthma is a complex respiratory disease characterized bychronic inflammation of airways and frequently associatedwith atopic symptoms (Ober 2005). Although environmen-tal factors are involved in its pathogenesis, familiar cluster-ing, twin studies, and genetic studies also support animportant genetic contribution to disease predisposition(Holberg et al. 1999; Ober and Hoffjan 2006; Bouzigon etal. 2010; Thomsen et al. 2010). The prevalence of asthmavaries widely around the world (1–18 %), and predictionsfor the coming years indicate that an increase is expected forWestern societies (Braman 2006; Pearce et al. 2007). InSpain, the prevalence of asthma symptoms has been esti-mated around 5–6 %, with considerable geographic varia-tion among regions (5–12 %) (The Spanish Group of theEuropean Asthma Study 1995). However, the highest prev-alence of asthma in adults from Spain has been found in theCanary Islands (17.2 %), based on the European Communi-ty Respiratory Health Survey (The Spanish Group of theEuropean Asthma Study 1995; Julia Serda et al. 2005). Inaddition, estimates of asthma prevalence in children aged 6–7 years are twofold higher in the Canary Islands (18.4 %) thanthe mean for the Spanish population (9.9 %) (Sanchez-Lermaet al. 2009). Similarly, the prevalence of atopy in the CanaryIslands is also elevated (40.6 %), compared to the mainlandSpanish populations (Julia-Serda et al. 2011).

The Canary Islands belong politically to Spain, in spite ofbeing located at about 1,000 km from the closest Europeanpoint in Iberian Peninsula and only 100 km off the North-west coast of Africa. These islands were inhabited by ab-original people related to the Berber populations at the timeof Spanish occupation in the fifteenth century, as pointed byhistorical, anthropological, archeological, and linguisticrecords (Navarro 1991). Genetic footprints of such North-west African influence (as a proxy for the aborigines) inCanary Islanders have been demonstrated in contemporaryinhabitants using classical (Flores et al. 2001) and autosomal

markers (Maca-Meyer et al. 2004; Fregel et al. 2005;Pino-Yanes et al. 2011), as well as with mitochondrial DNA(Rando et al. 1999) and the Y chromosome (Flores et al.2003). Recently, we have estimated North African admixturein Canary Islanders using almost a hundred ancestry informa-tive markers (AIMs), genetic loci showing large allele fre-quency differences between populations, selected fromdifferent regions of the autosomal genome (Pino-Yanes et al.2011). Intriguingly, our results suggested that North Africanancestry averaged 17±25 %, but showed a wide interindivid-ual variation ranging from 0 to 96%, which was interpreted asa trace of the violent way the islands were conquered andcolonized (Pino-Yanes et al. 2011).

Although the prevalence of asthma is generally low with-in countries from West Africa, individuals with West Afri-can ancestry have shown a higher prevalence of asthma andrelated traits when exposed to a Western style of livingcompared to European descent populations (NHLBI 2004).This has been explained as a consequence of gene–environ-ment interaction by which the admixed African populationwould carry risk alleles for asthma and related traits becausethese alleles would provide them an adaptation to a higherload of parasites in their original populations that are nolonger present in the new environment (Le Souef et al.2006). As a consequence, in a recent admixed population,it is expected that genomic segments originated from theancestral ethnic group with the higher risk will be enrichedwith risk alleles (Smith et al. 2004), which will be reflectedin a larger proportion of ancestry from the ancestral popu-lation in affected individuals compared to the unaffectedgroup. This hypothesis has been confirmed for AfricanAmerican and African Caribbean individuals, in which alarger African admixture has been associated with highersusceptibility for asthma and related traits and with lowerpulmonary function measures (Tsai et al. 2006; Vergara etal. 2009; Kumar et al. 2010, 2012; Flores et al. 2012).Similar to the West African populations, the prevalence ofasthma is generally low in the North African countries(NHLBI 2004), being estimated in 3–4 % for clinical diag-nosed asthma in Algeria, Morocco, and Tunisia (Nafti et al.2009). However, a trend for a markedly increase of preva-lence has been found in these populations over recent dec-ades due to the acquisition of a Western lifestyle andcontinued urban shifts (NHLBI 2004). In fact, for Morocco,the highest prevalence of asthma and asthma symptoms, aswell as of other allergic diseases, is found in Casablanca, thelargest city and the economic capital (Bouayad et al. 2006).This prevalence has been associated with an increase inurbanization and the acquisition of urban life style of living(Bouayad et al. 2006). In line with this data, the geneticexpression profile in peripheral blood leukocytes has beenfound to be profoundly changed by an urban living stylecompared to a rural living style in Northwest African

706 Immunogenetics (2012) 64:705–711


populations (Idaghdour et al. 2008). Therefore, a higher riskfor asthma and related traits would be expected in popula-tions with North African genetic ancestry with Westernliving style.

Although the Canary Islands have particular climaticconditions that could promote the emergence of atopicsymptoms, it has been suggested that the genetic back-ground might also contribute to the high prevalence ofatopic symptoms and asthma in this population (Julia Serdaet al. 2005). Here, we aimed to analyze if genetic ancestry,assessed from autosomal AIMs, was associated with asthmaor related traits in a case–control sample of CanaryIslanders.

This study was approved by the ethics committees atparticipating hospitals, and written informed consent wasobtained from all subjects. This study was conducted usinga case–control design of 734 DNA samples from unrelatedindividuals reporting at least two generations of ancestorsborn in the Canary Islands. See Table 1 for the character-istics of subjects included in the study. Samples utilizedconstituted a subset of the Genetics of Asthma Study inthe Spanish population, described elsewhere (Pino-Yanes etal. 2012). Briefly, cases were represented by 391 physician-diagnosed asthmatic patients aged >5 years and fulfilling theGlobal Initiative for Asthma guidelines for diagnosis andclassification of asthma (http://www.ginasthma.com). Thesesamples were collected from respiratory medicine and allergydepartments from hospitals belonging to the Spanish NationalHealth System. Only individuals, who reported having at leasttwo generations of ancestors born in the Canary Islands, wereincluded in this study. Demographical and clinical data

recorded included: age, sex, smoking habits, age at diagnosisof the disease, rhinitis, atopic dermatitis, basal forced expira-tory volume in 1 s (FEV1), serum total IgE levels, and thesymptomatic treatment. Atopy was confirmed by a positiveskin prick test (SPT, a wheal with a diameter 3 mmgreater than the saline control) and/or elevated specificserum IgE levels (>0.35 UI mL−1) to at least one ofseven common allergens. Particularly, allergens evaluat-ed for specific IgE were: dust mite (Dermatophagoidespteronyssinus, Dermatophagoides farinae, Glycyphagusspp, Blomia tropicalis, Acarus siro, Tyrophagus putres-centiae, Lepidoglyphus destructor, and Euroglyphusmaynei), epithelium (Felis domesticus, Canis familiaris,Equus caballus, and Oryctolagus cuniculus), pollen(Olea europaea, Salsola spp, Lolium perenne, Artemisiavulgaris, Parietaria spp, Platanus spp, Chenopodiumspp, Plantago spp, Rumex spp, and Cupressus spp),fungi (Penicillium notatum, Alternaria alternate, Asper-gillus fumigatus, and Cladosporium herbarum), food(Cow's milk, hen's egg, peanut, soybean, wheat, fish,shrimp, crabs, lobster, clams, oysters, mussels, banana, chest-nut, and kiwi), latex and cockroaches (Blattella germanica).

Controls consisted of 343 DNA samples from nonasth-matic unrelated adults, which were obtained from blood bankdonors who did not report a personal or familiar medicalhistory for allergic or pulmonary diseases and self-reportingat least two generations of ancestors born in the CanaryIslands. A total of 93 European AIMs (from now on referredas EuroAIMs), allowing to distinguish between North Africanand Iberian ancestries, were genotyped in cases and controlsusing iPLEX™ Gold assays on MassARRAY system by the

Table 1 Relevant demographicand clinical features of samples

In parentheses, total number ofsubjects with available data

NA not available, P25 percentile25, P75 percentile 75aχ2 testbMann–Whitney U test

Variable Cases (n0391) Controls (n0343) p Value

Gender (% of males) 37.4 (387) 62.6 (343) <0.001a

Age (years); mean, P25–P75 38, 22–48 (352) 36, 31–45 (343) 0.087b

Smoking habits (% of ever smokers) 20.8 (126) 79.2 (234) <0.001a

Clinical features

Serum IgE levels (kUI mL−1); mean, P25–P75 499.1, 89.3–425.5 (163) NA

Age at diagnosis (years); mean, P25–P75 24, 10–32 (356) NA

FEV1 (% predicted); mean, P25–P75 81, 67–95 (206) NA

Rhinitis (% positive) 44.9 (273) NA

Dermatitis (% positive) 4.0 (273) NA

SPT (% positive) 60.4 (240) NA

Specific IgE (% positive) 42.7 (225) NA

Atopy (% positive) 61.7 (256) NA

Treatment

Inhaled corticoids (%) 86.5 (222) NA

Oral corticoids (%) 2.9 (279) NA

Long-acting β2-agonists (%) 53.3 (291) NA

Short-acting β2-agonists (%) 81.5 (205) NA

Immunogenetics (2012) 64:705–711 707



Spanish National Genotyping Center, Santiago de Compos-tela Node (CeGen, http://www.cegen.org/) (Pino-Yanes et al.2011). Briefly, iPLEX™ assays were scanned by MALDI-TOF mass spectrometry, and individual SNP genotype callswere automatically generated using Sequenom Typer 3.4™software. Samples from the Coriell Institute for Medical Re-search (http://www.coriell.org) were included to test allelecalling reliability of this platform.

Departures from Hardy–Weinberg equilibrium (HWE)were evaluated separately in cases and controls using anexact test (Wigginton et al. 2005), by means of the SNPIn-fostats software (Pino-Yanes et al. 2011). Given its higherdiscriminatory power to detect differences among closelyrelated populations, such as North Africans and Iberians(Maca-Meyer et al. 2004), than alternative algorithms basedon the assignation of individuals to discrete populations(Heath et al. 2008; Li and Yu 2008; Price et al. 2008),principal component analysis (PCA) was utilized to deriveindividual ancestry estimates as scores of the first principalcomponent as the major axis covering the Iberian-NorthAfrican genetic differences (Pino-Yanes et al. 2011). Forthis purpose, data for the same set of EuroAIMs fromindividuals, self-declaring two generations of ancestorsfrom the Iberian Peninsula (n0889) and Morocco in NorthAfrica (n068), were jointly analyzed with the case–controlsample to serve as reference populations (Pino-Yanes et al.2011). EIGENSOFT was used to assess PCA and to test theassociation of ancestry estimates with asthma and atopic traitsbetween cases and controls by means of ANOVA statistics(Price et al. 2006). Then, in order to adjust this association,clinical and demographic variables were included as covari-ates along with ancestry estimates in regression models utiliz-ing SPSS 15.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). Given that geneticancestry estimates represented a mean value from the genome,we also explored the possibility of having local differences ingenetic ancestry that could be detected by using the individualEuroAIMs as proxies. For that, SNPassoc (Gonzalez et al.2007) was employed to test the association of individualEuroAIMs with asthma, adjusting for the genetic ancestryestimates by means of logistic regression models. Finally, inorder to limit the expected proportion of false positives in-curred in the study when a particular individual EuroAIMassociation test was called significant and to account for themultiple phenotypes tested for association with genetic ances-try, a false discovery rate was computed using QVALUE(Storey and Tibshirani 2003), and a threshold q value of0.05 was established to declare significance.

Eight SNPs gave poor-quality genotype data duringgenotyping (rs1032143, rs1073321, rs12502036,rs1364394, rs153595, rs1854226, rs2171209, andrs7108371) and were discarded from the study. In addition,two SNPs that deviated significantly from HWE, after con-sidering a multiple correction threshold of p<6x10-4 (0.05/85)

at least in one study sample (rs7277342 and rs2596501), werealso dropped from the analyses. Therefore, further analysesincluded the remaining 83 EuroAIMs, which had an averagecompletion rate of 98.0 % (P25–P75097.5–98.6 %), for a totalof 734 samples (mean sample completion rate098.0 %, P25–P75098.8–100.0%). As previous findings have showed a highcorrelation between individual ancestry estimates obtainedwith the full set of 93 EuroAIMs and with a reduced subsetof as few as 65 markers (Pino-Yanes et al. 2011), the finalnumber of EuroAIMs considered was still adequate for thepurpose of the study. See Table S1 in the Online Resource forfurther details.

The comparison of genetic ancestries between asthmaticor atopic asthma patients with the control group did notreveal significant differences. Similarly, no association wasfound between genetic ancestry and a positive result neitherfor atopy, SPT or rhinitis (Table 2), nor with serum levels oftotal IgE or with pulmonary function, measured by thepercentage of predicted FEV1 (Table 2). Genetic ancestrywas associated at nominal significance with a positive resultfor specific IgE among asthmatics (p00.004) (Table 2).Although this comparison was still significant after consider-ing all traits tested (q00.032), this result was considerednonsignificant after adjusting for age as a covariate (p00.056). We further explored the effect of age by subdividingthe sample according to age quartiles (Q): ≤23 years (Q1), 24–32 years (Q2), 33–44 years (Q3), and >44 years (Q4). Theresults were not significant in any of the age groups, and thedirectionality of effects was different between subsamples,particularly between the group of individuals with ≤23 yearsversus all the rest of analyzed groups (≥24 years) (Table S2 inthe Online Resource). In fact, genetic ancestry was signifi-cantly associated with a positive result for specific IgE amongasthmatics with ≥24 years (p value00.008 and beta0−29.82).This result may point to a modifier effect of age in the associ-ation of genetic ancestry with a positive result for specific IgEamong asthmatics. While several evidences suggest that demo-graphic and environmental factors influence total and specificIgE, and that specific IgE levels decrease with the increasing ofage (Omenaas et al. 1994; Borish et al. 2005), due to the limitedpower to detect association after sample was subdivided(<22 % on each subsample), future studies with larger samplesizes would be needed to determine if such effect is genuine.

Despite no evidence of association was found betweengenetic ancestry and asthma risk among Canary Islanders,we then determined whether any of the individual Euro-AIMs was associated with asthma. Adjusting the associationof each marker by ancestry differences between patients andcontrols, seven EuroAIMs were nominally associated(0.005≤p value≤0.042), although none of these associationswas considered significant in the context of the multiplecomparisons performed (0.221≤q value≤0.443) (Table S3in the Online Resource).

708 Immunogenetics (2012) 64:705–711


http://www.cegen.org/

http://www.coriell.org

In this study, we have explored for the first time whethergenetic ancestry in Canary Islanders was associated withasthma and related traits. Despite the high prevalence ofasthmatic and atopic symptoms estimated for this popula-tion compared to the rest of populations from Spain (JuliaSerda et al. 2005), no association was found between genet-ic ancestry and asthma or related traits in Canary Islanders.Similarly, none of the individual EuroAIMs showed associ-ations with asthma. These results are in agreement withprevious observations based on self-reported informationfrom grandparental place of birth, where subjects with twogenerations of ancestors born in the Canary Islands did notshow increased asthma risk when compared with subjectswith ancestors born elsewhere (Julia Serda et al. 2005).

Although the Canary Islands have particular climaticconditions, such as high humidity and stable warm temper-atures that provide ideal conditions for mites and molds,which favor the emergence of atopic and asthmatic symp-toms in the Canary Islands (Sanchez-Lerma et al. 2009),genetic factors are also be involved in this disease. Accord-ing to the hygiene hypothesis (Strachan 1989), we speculat-ed that genetic African ancestry in the Canary Islanderscould provide a higher risk for asthma and atopy becausethe African ancestral population would have adapted to apathogen-rich environment that no longer exists in the cur-rent urban society in the Canary Islands. In line with this, arecent study has shown that the pathogenic environment(mostly the exposure to helminthes) is the predominant driverof local adaptation, even stronger than climate (Fumagalli etal. 2011). In addition, allele frequencies in genes involved inimmunity response have been strongly correlated with patho-genic environment (Fumagalli et al. 2011). Remarkably, it hasbeen revealed that several genes associated at the genome-wide level with helminth diversity were also associated withsusceptibility for asthma and atopy (Fumagalli et al. 2010).Under this scenario, the helminth-driven selective pressure isexpected to favor individuals carrying alleles that allow a

strong Th2 response and, therefore, to promote the transmis-sion and spread of asthma-susceptibility variants (Fumagalli etal. 2010).

Previous studies have examined the association of genet-ic ancestry and asthma susceptibility in recently admixedpopulations, observing a difference of 5–6 % in Africanancestry between cases and controls in independent Africandescent populations from the USA and the Caribbean(Vergara et al. 2009; Flores et al. 2012). Our statistical powerwas adequate (≥80 %) to detect differences in North Africanadmixture between cases and controls with effects even lowerthan the previously observed (up to 3.2 % of differences inNorth African admixture, i.e., a standardized effect of ≥0.2)(Fig. 1). However, in the hypothetical case that the geneticancestry had a true association with susceptibility to asthma orrelated traits, the presence of smaller effects cannot be dis-carded. Similarly, it is likely that the use of a larger number ofmarkers will allow estimating further ancestries among

Table 2 Association betweengenetic ancestry and asthmaticand atopic phenotypes

aLogistic regression model in-cluding gender and smokinghabits as covariatesbLogistic regression model in-cluding the age as a covariatecLinear regression model includ-ing the age as a covariate

Clinical variable Association p value (q value) Beta

Unadjusted Adjusted

Cases versus controls

Asthma 0.379 (0.599) 0.667a (0.889) −3.21

Atopic asthma 0.501 (0.599) 0.861a (0.958) 1.53

Asthmatic patients

Atopy (positiveness) 0.408 (0.599) 0.473b (0.889) −5.96

SPT (positiveness) 0.363 (0.599) 0.344b (0.889) −7.99

Rhinitis (positiveness) 0.137 (0.548) 0.452b (0.889) 6.51

Specific IgE (positiveness) 0.004 (0.032) 0.056b (0.448) −18.66

Total IgE levels (log scale) 0.524 (0.599) 0.958c (0.958) −0.13

FEV1 (%) 0.609 (0.609) 0.576c (0.889) 43.95

Fig. 1 Statistical power to detect differences in the genetic ancestryproportions by standardized effects for the sample size utilized (391cases and 343 controls)

Immunogenetics (2012) 64:705–711 709


Canary Islanders. In this study, samples from different loca-tions in Morocco were used as a proxy for the aboriginalpopulation inhabiting the Canary Islands before the conquest.Although this is a reasonable assumption given the evidencefrom the historical records (Chejne 1974; Flores et al. 2001)and the numerous previous genetic studies (Rando et al. 1999;Flores et al. 2001, 2003, 2004; Alonso et al. 2005; Adams etal. 2008; Fregel et al. 2009), this obviously constitutes asimplification of the heterogeneous African influences thathave affected the Canary Islands populations. Therefore, it islikely that further sampling of North African regions and thetyping of additional markers might allow identifying othergenetic influences in Canary Islanders, which could clarify ifa true relationship between genetic ancestry and asthma existsin this population. In addition, another limitation of this studyis that the socioeconomic status of individuals was notrecorded, and therefore, its effects on asthma risk were notexplored. Given that the Spanish National Health Systemguarantees free healthcare access to the whole population,not only for treatment and rehabilitation but also for thepromotion of health and prevention of disease, a limited effecton asthma risk is expected.

In conclusion, no association was found between geneticancestry and asthma or related traits among Canary Islanders.Larger studies examining more genetic variants would beneeded to explore whether genetic ancestry has modest effectsin increasing asthma risk in the Canary Islanders.

Acknowledgments We thank David Comas and Jose M. Larruga forproviding Northwest African samples. This work was supported bygrants from the Health Institute “Carlos III” (FIS PI08/1383, FIS PI11/00623) and cofinanced by the European Regional Development Funds,“Away of making Europe” from the European Union, by a grant fromFundación Canaria de Investigación y Salud (FUNCIS 27/07), and by aspecific agreement between Instituto de Salud Carlos III and Gobiernode Canarias (EMER07/001).

Conflict of interest None.

References

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Assessing the Validity of Asthma Associations for EightCandidate Genes and Age at Diagnosis EffectsMarıa Pino-Yanes1,2¤, Almudena Corrales1,2, Jose Cumplido3, Paloma Poza4,

Inmaculada Sanchez-Machın4, Anselmo Sanchez-Palacios5, Javier Figueroa5,

Orlando Acosta-Fernandez6, Nisa Buset7, Jose Carlos Garcıa-Robaina8, Mariano Hernandez9,

Jesus Villar1,7,10, Teresa Carrillo3, Carlos Flores1,2,9*

1 Centro de Investigacion Biomedica en Red de Enfermedades Respiratorias (CIBERES), Instituto de Salud Carlos III, Madrid, Spain, 2 Research Unit, Hospital Universitario

Nuestra Senora de Candelaria, Santa Cruz de Tenerife, Spain, 3 Allergy Unit, Hospital Universitario Dr. Negrın, Las Palmas de Gran Canaria, Spain, 4 Allergy Management

Unit, Hospital del Torax (Ofra), Santa Cruz de Tenerife, Spain, 5 Allergy Unit, Hospital Universitario Insular de Gran Canaria, Las Palmas de Gran Canaria, Spain, 6 Neumology

Unit, Hospital Universitario de Canarias, San Cristobal de La Laguna, Spain, 7 Research Unit, Hospital Universitario Dr. Negrin, Las Palmas de Gran Canaria, Spain, 8 Allergy

Unit, Hospital Universitario Nuestra Senora de Candelaria, Santa Cruz de Tenerife, Spain, 9 Applied Genomics Group (G2A), Genetics Laboratory, Instituto Universitario de

Enfermedades Tropicales y Salud Publica de Canarias, Universidad de La Laguna, San Cristobal de La Laguna, Spain, 10 Keenan Research Center, St. Michael’ Hospital,

Toronto, Ontario, Canada

Abstract

Background: Before the advent of genome-wide association studies (GWAS), ADAM33, ADRB2, CD14, MS4A2 (alias FCER1B),IL13, IL4, IL4R, and TNF constituted the most replicated non-HLA candidate genes with asthma and related traits. However,except for the IL13-IL4 region, none of these genes have been found in close proximity of genome-wide significant hitsamong GWAS for asthma or related traits. Here we aimed to assess the reproducibility of these asthma associations and totest if associations were more evident considering the effect of age at diagnosis.

Methodology/Principal Findings: We systematically evaluated 286 common single nucleotide polymorphisms (SNPs) ofthese 8 genes in a sample of 1,865 unrelated Spanish individuals (606 asthmatics and 1,259 controls). We found that variantsat MS4A2, IL4R and ADAM33 genes demonstrated varying association effects with the age at diagnosis of asthma, with 10SNPs showing study-wise significance after the multiple comparison adjustment. In addition, in silico replication with GWASdata supported the association of IL4R.

Conclusions/Significance: Our results support the important role of MS4A2, IL4R and ADAM33 genes in asthma and/oratopy susceptibility. However, additional studies in larger samples sets are needed to firmly implicate these genes in asthmasusceptibility, and also to identify the causal variation underlying the associations found.

Citation: Pino-Yanes M, Corrales A, Cumplido J, Poza P, Sanchez-Machın I, et al. (2013) Assessing the Validity of Asthma Associations for Eight Candidate Genesand Age at Diagnosis Effects. PLoS ONE 8(9): e73157. doi:10.1371/journal.pone.0073157

Editor: Gualtiero I. Colombo, Centro Cardiologico Monzino IRCCS, Italy

Received February 13, 2013; Accepted July 18, 2013; Published September 9, 2013

Copyright: � 2013 Pino-Yanes et al. This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permitsunrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited.

Funding: Funded by grants from the Carlos III Health Institute (http://www.isciii.es) and cofounded by the European Regional Development Fund (FEDER) "A wayof making Europe": PI081383 and EMER07/001, and by a grant from Fundacion Canaria de Investigacion y Salud FUNCIS 27/07 (http://www.funcis.org) to CF. MPYwas funded by a postdoctoral fellowship from Fundacion Ramon Areces (http://www.fundacionareces.es). The funders had no role in study design, data collectionand analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.

Competing Interests: The authors have declared that no competing interests exist.

* E-mail: [email protected]

¤ Current address: Department of Medicine, University of California San Francisco, San Francisco, California, United States of America

Introduction

Asthma is a complex respiratory disease characterized by

chronic inflammation of the airways and frequently associated

with atopy, pulmonary obstruction and bronchial hyper-respon-

siveness against a diversity of stimulus [1]. Its prevalence varies

widely among different populations around the world (1–18%) [2].

Familiar clustering [3], twin studies [4], and genetic studies [5,6]

support an important genetic component of the disease, with an

estimated heritability of 60% [7].

Before the advent of genome-wide association studies (GWAS)

[8], almost a thousand candidate-gene association studies for

asthma and related traits were published [9]. Considering the gene

as the unit of replication and using a broad definition for asthma,

Ober & Hoffjan [5] elegantly summarized the accumulated

evidence for candidate-gene association studies from the literature

by assessing the consistency of findings [10]. This yielded a ranking

of candidate genes based on the number of positive associations

between any polymorphism and any asthma trait [5]. As a result,

eight non-HLA genes were put forward among the most replicated

(in .10 independent studies) and, therefore, these genes were

suggested as firm candidates for asthma susceptibility [5]. Four of

these genes were located in the linked region for asthma on

chromosome 5q: interleukin (IL) 4 (IL4), IL13, CD14 and the b2-

adrenergic receptor (ADRB2); one gene was located in the linked

region 6p21: the tumor necrosis factor (TNF); one was the first

PLOS ONE | www.plosone.org 1 September 2013 | Volume 8 | Issue 9 | e73157

positionally cloned asthma gene, ADAM metallopeptidase domain

33 (ADAM33); another was the gene encoding the a chain of the

IL-4 and IL-13 receptors (IL4R); and finally, the gene encoding the

IgE Fc receptor beta-subunit (MS4A2, alias FCER1B). However,

most of them were assessed in studies with limited sample sizes

averaging <200 individuals per group [5,11], and lacked of a

systematical analysis in candidate-gene studies by surveying more

than few variants (for example, by using tagging SNPs [tSNPs]).

To date, despite the fact that more than ten GWAS of asthma

have been published, none of these eight firm candidates have

been replicated at genome wide significance, nor have been found

in close proximity of GWAS hits, except for the IL13-IL4 region

[8,12–21].

Asthma is clinically recognized as an amalgam of several distinct

phenotypes [22,23], which blur the complex genetic architecture

underlying the disease susceptibility. Among these phenotypes, the

age-at-onset of asthma could differentiate asthmatic groups, so that

genetic variants might inconsistently associate with childhood and

later-onset disease [17,24,25]. Motivated by this evidence, here we

aimed to assess the reliability of asthma associations for the eight

most replicated non-HLA asthma candidate genes and to explore

whether effects of risk alleles varied with the disease age at

diagnosis.

Methods

Ethics statementThis study was approved by the External Scientific Committee

and Advisory Committee of Experts on ethical, economic,

environmental, legal and social affairs at the National Bank and

the Ethics Committee of Hospital Universitario NS de Candelaria

and Hospital Universitario Doctor Negrın. Written informed

consent was obtained from all subjects or appropriate surrogates

on the behalf of participants under the age of 18.

Study subjectsThis study was conducted using a case-control design of 1,878

DNA samples from unrelated individuals, all reporting at least two

generations of Spanish descent. Sample details have been

described elsewhere [24]. In brief, cases included 607 asthmatic

patients aged .5 years and diagnosed by physicians following the

Global Initiative for Asthma (GINA) guidelines for diagnosis and

classification of asthma severity (http://www.ginasthma.com).

These samples were collected and characterized for allergic and

asthmatic symptoms in Respiratory Medicine and Allergy

Departments, as part of the Genetics of Asthma study (GOA) in

the Spanish population. Among cases, atopy was defined by the

evidence of allergic sensitization to known allergens, reflected by

either a positive skin prick test [SPT] or the specific IgE to one or

more known allergens in the serum. For simplicity, those cases that

had asthma and also atopy will be referred as atopic asthmatics,

although we ignored whether or not allergen exposures lead to the

asthma symptoms of these patients. Further sample details can be

found in Text S1 and in Table S1.

Control group consisted of 1,271 DNA samples from adults self-

reporting no personal or familiar medical history of allergic or

pulmonary diseases recruited from the Spanish National DNA

Biobank. These were collected from branches of the National

Blood Service from unrelated individuals residing in Spain. After

signed informed consent, by means of personal interviews, each

donor was asked to declare general health status, physic activity,

commonly used transportation, nutrition habits, type of work and

qualification, demographics, tobacco smoke, alcohol consumption,

genealogical information, residence and mother tongue, and

personal and familial history of diseases. See http://www.

bancoadn.org for further information. In addition to the criteria

of the Spanish National DNA Biobank to define healthy controls,

we added three more criteria to select the controls for this study: 1)

Self-reported Spanish ancestry based on having at least two

generations of ancestors born in Spain; 2) Complete data on

personal and familiar history of disease recorded in the

questionnaire, smoking status, place of origin, and area of

residence; 3) Absence of self-reported personal or familiar history

of pulmonary or allergic disease. Further sample details can be

found in Text S1 and in Table S1.

Selection of tagging SNPsTagging SNPs (tSNPs) were selected by means of TagIT 3.03

[26], using available re-sequencing data from European samples

from different sources (Table 1 and Table S2). The IL13 and IL4

genes, which lie in close proximity, were considered as a single

region. Similarly, given the strong linkage disequilibrium (LD)

between LTA and TNF genes [27], common variants of the LTA

gene were also tagged and jointly analyzed with TNF. See Text S1

and Table S2 for further details.

Assessment of population stratificationTo reduce the risk for false positives due to major population

stratification effects, a total of 83 European ancestry informative

markers (termed EuroAIMs) were determined in case and control

samples. These EuroAIMs allowed to correct for major differences

in Spanish populations due to the North African genetic influences

observed in this population, with a mean value of 5–9% for

mainland populations and 16–20% for Canary Islanders [28]. A

principal component analysis (PCA) based on these genetic

markers was used to derive the ancestry estimates in cases and

controls as scores of the first principal component (PC1), by means

of EIGENSOFT [29]. A full list of EuroAIMs used and the

genotyping procedures have been detailed elsewhere [24,28].

GenotypingGenotyping was conducted using the iPLEXH Gold assay on

MassARRAYH system (Sequenom Inc., San Diego, CA) by the

Spanish National Genotyping Center, Santiago de Compostela

Node (CeGen, http://www.cegen.org). Briefly, iPLEXH assays

were scanned by MALDI-TOF mass spectrometry and individual

SNP genotype calls were automatically generated using Sequenom

TYPER 3.4H software (Sequenom Inc.). Samples from the Coriell

Institute for Medical Research (http://www.coriell.org) were

included on each SpectroCHIPH (Sequenom Inc.) to test allele

calling reliability samples of this platform. The SNPs that gave

poor quality data on this platform were finally determined at the

Hospital Universitario N. S. de Candelaria using either SNaP-

shotH Multiplex kit reactions (Applied Biosystems, Foster City,

CA) or KASPar SNP Genotyping System assays (KBiosciences,

Hertfordshire, UK). Genotyping was blind to the disease status

and <6% of the samples were genotyped in duplicate to monitor

genotyping quality. See Text S1 for further details.

Statistical analysisClinical and demographical data were analyzed by means of the

x2-test and the Mann-Whitney U-test using R version 2.15 [30].

Departures from Hardy-Weinberg equilibrium (HWE) were

evaluated separately for cases and controls using an exact test

[31], by means of a custom script for STATISTICA (StatSoft Inc.,

Tulsa, OK) [32]. However, as deviations in cases have been

considered a symptom of disease association [33–35], only those

Age at Diagnosis Effects in Asthma Candidate Genes


tSNPs deviating significantly from HWE in the control group were

filtered out from further analyses (threshold p-value = 7.0E-04

after considering the multiple comparisons performed). Individual

tSNP associations were tested under an additive model by means

of regression analysis with SNPassoc [36]. For that, PC1 scores

were included as a covariate in regression models to adjust

associations for population stratification, and allele effects were

estimated as odds ratios (ORs) with 95% confidence intervals (CIs).

Additionally, MaCH 1.0 [37] was used to impute untyped SNPs

with data from 380 European individuals deposited in The 1000

Genomes Project (1KGP), May 2011 version [38]. Association

testing was performed using Mach2dat [37] adjusting for the PC1

scores. This analysis was conducted using allele dosages for those

SNPs showing MAF$10% and Rsq.0.3, ensuring that all SNPs

considered for association testing were accurately imputed (with

.90% of SNPs having Rsq.0.8, and with a mean Rsq across all

imputed SNPs of 0.95 [IQR: 0.91–0.97]) (Table S3).

For each gene by separate, a conditional regression-based

analysis was used to point out the independent association signals

of each locus by including all SNPs associated at nominal

significance. We then tested if association tests of the SNPs that

represented nominal independent associations within each gene

improved considering age-at-onset-varying effects, by implement-

ing a sequential addition (SA) of cases [39]. For that, the age at

diagnosis was utilized as a proxy for the age-at-onset of the disease,

which was not recorded for most patients, and cases were grouped

in categories of quartiles of age (14 [n = 155], 26 [n = 291], 39

[n = 427], and 82 years [n = 606]). The age at diagnosis cutoff

obtained was next used to select a sub-sample of cases for which

associations were tested again, both for tSNPs and imputed SNPs.

LD patterns and regional association results were represented

using LocusZoom 1.1 based on LD data from hg18 deposited by

1KGP [40].

To judge the significance of SNP associations in the context of

the multiple comparisons performed, a false discovery rate (FDR)

was calculated using QVALUE [41]. A FDR threshold of 5% (p-

value #0.0012) was established to declare study-wise significance

to limit the expected proportion of false positives incurred in the

study when a particular individual SNP test was called significant.

This was assessed considering altogether the p-values from all

SNPs analyzed, both genotyped and imputed, the tests from the

SA of cases to obtain the age cutoff at which the allele effects were

largest, and all the comparisons performed (i.e. associations with

asthma, atopic asthma, and age-of-onset before the cutoffs).

Functional annotation of associated SNPs was carried out using

the software HaploReg [42].

Results

A total of 13 samples (1 case and 12 controls) were excluded

from the analyses because of genotype quality (completion rate

,90%). Out of the initial set of 82 tSNPs, 6 were found

monomorphic (rs5744440, rs35684381, rs597040, rs8124875,

rs614971 and rs17548816) by using both iPLEXH and an

alternative genotyping method (see the Supplementary methods

in Text S1). Only one tSNP (rs12361312 at MS4A2) deviated

significantly from HWE expectations in the control group and was

discarded from further analyses (Table S2). Therefore, a total of

75 tSNPs, which maintained an adequate coverage for all genes

(r2$0.85), and 211 imputed SNPs were considered for association

studies in 1,865 samples (606 cases and 1,259 controls) (Table S3).

The mean completion rate among the 75 tSNPs was 98.5% (P25–

P75 = 98.7–100.0%), and the estimated overall genotype dis-

cordance rate among duplicated samples was 0.30% (95% CI =

0.08%–1.09%).

Association testing revealed a total of 35 SNPs (16 tSNPs and 19

imputed) that were associated with either asthma or atopic asthma

at nominal significance, although these were not considered

significant in the context of the multiple comparisons (p-values

.0.0012) (Table S3). Based on the premise that incorporating the

age-at-onset in the analyses might increase the power to detect

association [24,25], we next used SA of asthma patients to estimate

the age at diagnosis cutoff maximizing allele effects. For that,

among the 35 SNPs that reached nominal significance, we first

excluded the redundant SNPs from each gene using conditional

logistic regressions for asthma or atopic asthma. We identified the

following SNPs as the ones showing independent nominal

associations: rs1800925 (21112 C/T) in IL13–IL4 (only for atopic

asthma), rs2071590 in LTA-TNF (only for asthma), rs569108

(Gly237Glu) in MS4A2, and rs1805015 (Ser478Pro) in IL4R (both

for asthma and atopic asthma) and rs2787095 in ADAM33 (only

for asthma) (data not shown). These 5 SNPs represented

independent associations for each gene and coincidentally, these

Table 1. Summary information used for the selection of tagging SNPs (tSNPs) on the candidate genes.

Gene Chr. (Mb) Size (kb)Coveredregion (kb) Data sources

SelectedtSNPs Monomorphic

FinaltSNPs

Finalhaplotyper2

IL13–IL4 5q31.1 (132.0) 12 29.0 SeattleSNPsa 10 0 10 1.00

CD14 5q31.1 (140.0) 2 7.0 InnateImmunityb

6 1 5 1.00

ADRB2 5q31 (148.2) 2 9.5 SeattleSNPsa 8 1 7 1.00

TNF-LTA 6p21.3 (31.5) 6 9.3 SeattleSNPsa 11 0 11 0.85

MS4A2 11q13 (59.9) 10 15.3 HapMap/ T1Dc 7 0 7 0.97

IL4R 16p12.1 (27.3) 51 56.0 SeattleSNPsa 21 0 21 0.92

ADAM33 20p13 (3.6) 14 15.2 EGPd 19 4 15 1.00

Total 97 141.3 82 6 76

aThe National Heart Lung and Blood Institute’s (NHLBI) Programs for Genomic Applications (http://pga.gs.washington.edu).bThe Inate Immunity NHLBI Program for PGA (https://regepi.bwh.harvard.edu/IIPGA2).cHapMap phase 2 (http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov) and data from 96 type 1 diabetes individuals [28].dThe NIEHS Environmental Genome Project (http://egp.gs.washington.edu).doi:10.1371/journal.pone.0073157.t001



5 SNPs had been associated with asthma or related traits in

previous studies, but in this study we extended their association to

a Southwestern European population with noticeable North

African influences.

SA did not show any age at diagnosis cutoff that significantly

maximized the association of rs1800925 (in IL13–IL4) with atopic

asthma (lowest p-perm = 0.063). In contrast, SA revealed allele

effects peaking at the same age at diagnosis, 39 years (number of

cases = 427), for SNPs from MS4A2 and IL4R: rs569108 in

MS4A2 (p-perm = 0.005), and rs1805015 in IL4R (p-perm = 0.001).

However, SA revealed allele effects peaking at a different age at

diagnosis for the SNPs from the other two genes: rs2071590 in

LTA-TNF showing a maximum at 26 years (p-perm = 0.002,

number of cases = 291), and rs2787095 in ADAM33 with a

maximum at 14 years (p-perm = 3.0E–04, number of cases =

155). The results obtained from the SA analyses using the quartiles

of the distribution of the age at diagnosis were equivalent to those

obtained using it as a continuous variable (data not shown).

Testing associations on the sub-sample of cases with the age at

diagnosis of asthma before the maxima determined by SA for each

gene revealed 18 additional SNPs reaching nominal significance

(Table S3). Five of these SNPs (0.013# p-value #0.050) were

located in IL4R gene and only one of them constituted a positive

finding in previous studies. After conditioning these new associ-

ations from IL4R to the SNP rs1805015, only one SNP showed

independent association (rs3024676, p-value = 0.021). The

remaining 13 were all SNPs from ADAM33 (3.8E-5# p-value

#0.039), and 6 of them have been associated in at least one

previous study (Table S3 and Figure 1). After adjusting the

association of these 13 SNPs in ADAM33 that emerged with the

age at diagnosis cutoff for the SNP rs2787095, 7 SNPs (rs2787093,

rs628965, rs628977, rs630712, rs598418, rs2853209, and

rs603112) resulted independently associated from this SNP

(0.012# p-value #0.048). Therefore, the advantages of taking

into account the age at diagnosis varying effects for replication

studies in asthma were clearly evidenced in ADAM33, a gene for

which SNP-level replications are scarce in the literature [5,43].

Otherwise, we would have missed .50% of SNPs of this gene that

showed association in previous studies. For the LTA-TNF and

MS4A2 genes, we only observed subtle increases of effect sizes for

the SNPs that were revealed in our previous analyses, but did not

evidence more SNPs reaching nominal significance (Table S3 and

Figure 1). After a global FDR assessment accounting for all

comparisons performed, only 10 SNPs in MS4A2, IL4R and

ADAM33 genes showed an FDR ,5%, which were considered

associated at study-wise significance (Table 2). Among these, 7

SNPs were identified to be functional, as they were either

predicted to cause missense changes in the protein encoded or

had empirically demonstrated regulatory roles as deduced from

ENCODE project experimental data [42] (Table S4).

In order to provide evidence for replication at these loci, we

accessed the GABRIEL data, the largest GWAS meta-analysis in

asthma performed in Europeans [17]. There, we were able to

allocate 11 out of the 51 SNPs that reached nominal significance

with asthma in our study (Table S5). Only the SNP rs1805012,

located in IL4R, demonstrated in silico replication in GABRIEL

(p = 5.7E-04), showing the same direction of effects as in our study.

Discussion

In this study, we have comprehensively analyzed the association

of 286 common variants of eight candidate genes with asthma and

atopic asthma in a case-control Spanish sample and found

associations for 10 SNPs in three of them (MS4A2, IL4R and

ADAM33) after considering all tests performed. We additionally

provided in silico replication for IL4R with GWAS data from the

GABRIEL study.

It is well known that the age-at-onset of asthma is associated

with different phenotypic characteristics [44], and it has recently

evidenced that age-varying genetic associations can cause non-

replication and, consequently, lead to missing important genetic

associations [45]. Therefore, here we re-evaluated the association

of these genes by restricting the analysis to case subjects with an

age at diagnosis of asthma before a cutoff that maximized allele

effects of replicated variants. This allowed us to verify that

association improved for certain genes, such as ADAM33, as

recently supported for other firm candidates [25,46,47], and also

to gain insight in the genetic complexity of asthma associations at

these candidate genes. Intriguingly, many of their effects peaked in

the range of age at diagnosis between 20 and 45 years,

coincidental with the age range with the maximum expression of

the disease [48,49]. It remains to be solved whether or not true

biological mechanisms underlie this and previous observations

[17,25,46]. Nevertheless, our results suggest that it will be worth

considering the disease age at diagnosis in further studies, as well

as in the research of improved asthma treatment and prevention.

To identify firm susceptibility genes and understand the

biological processes underlying the development of the disease,

replication in independent well-powered studies is essential,

regardless of whether the first evidence of association was provided

by a GWAS study or a candidate gene survey [50]. Besides,

replication efforts allow testing the generalizability of findings in

other populations, and discovering novel genetic loci contributing

to phenotypic trait variability [51]. Particularly, testing the

associations in populations of recent African ancestry will likely

improve the detection of new risk variants [52], as they may offer

the opportunity to refine the signal or to allocate the causal

variants [53]. Our study aligns with these considerations, as it was

performed in a population with sizeable North African genetic

influences [28,54], and with a sample size representing a

substantially larger population of cases (.97%) than the vast

majority of prior published case-control studies of these genes in

unrelated individuals, although still far from optimal to detect

weak effects.

Under a simplistic scenario assuming complete LD of associated

SNPs with causal variants, the analyzed sample size provided a

70% power to detect a minimum risk of 1.45 for a risk allele

frequency of 45% with a two-sided p = 0.0012 significance level for

the primary outcome (asthma), and ranged from 14.6% to 52.6%

for the analyses in subset of cases with atopic asthma and asthma

before the age at diagnosis cutoff (Table S6). We acknowledge that

risk effects of this range are in the upper bound of those expected

for common variants in complex traits [55], which may have

contributed to our failure to detect associations for some of the

genes tested. Alternatively, our failure to find associations may

possibly be attributed to: i) Our impossibility to test their

association with more relevant traits or patient sub-samples (e.g.

asthma drug responses [56,57], environmental exposures [58]); ii)

The use of controls self-reporting no personal or familiar history of

pulmonary or allergic disease, but without a disease confirmation

based on a clinical characterization (e.g. lung function measure-

ments, SPT or specific IgE testing); iii) The lack of a true

association with asthma susceptibility, as has been suggested for

particularly relevant variants by meta-analyses [56]. Whichever is

correct, a recently published study with on a similar sample size

showed positive and negative association results fully congruent

with ours [59]. In support of our results, we were able to replicate

in silico the association of a SNP in IL4R in the largest GWAS study



published to date that included more than 25,000 Europeans [17].

This SNP from IL4R, as well as few others from the same gene that

were found associated in our study (rs1801275, rs1805015, and

rs3024676), also demonstrated congruent effects and significant

association in a recent GWAS of total IgE levels [60]. This

evidence supports that, despite the enormous efforts to disentangle

asthma genes such as those entailed by the GABRIEL study [17]

or the EVE consortium [19], many more asthma susceptibility

genes awaits its discovery.

Some recent replication studies focusing on candidate genes

have utilized available arrays for genome wide genotyping [61–63]

where common variants of many key asthma candidate genes

could be insufficiently covered. In this respect, Michel et al. [59]

indicated that only 37% of the previously associated SNPs from 14

candidate genes were captured by the array utilized by the same

authors on the first GWAS for asthma and, surprisingly, not a

single SNP from key asthma genes such as ADAM33, IL4 and

CD14 was contained in their array [8]. Only after extending the

study by further genotyping (and by imputation) on the same

samples of their GWAS, these authors were able to consistently

replicate many of the biological candidates that were missing from

their GWAS [59]. We confirmed that the coverage of published

GWAS for asthma performed in European populations to date has

been insufficient for ADAM33 (,30%), even in a best-case scenario

using the HapMap phase 2 data as a reference for comparisons

(Table S7). If array comparisons were made against the 1KGP

sequencing data [38], the coverage would be even lower

(Table S7). Besides, it is worth noting that the estimated coverage

of these genes might be inflated, as these were implicitly derived

for HapMap CEU data and the same data was used to inform the

SNP contents of the array, and we have assumed that the 100% of

SNPs contained in the array were successfully genotyped. Effects

similar to those related to the age-of-onset of asthma, exceptionally

explored [17], could have also contributed to find no association

for the genes explored here in the published GWAS for asthma.

In conclusion, here we found the association of 10 common

variants in three biological candidate genes (MS4A2, IL4R and

ADAM33) that attained study-wise significance, and one of them

was also supported by in silico replication in GWAS data.

Therefore, we provided independent support for their role as risk

factors for the amalgam of asthma phenotypes. Moreover, our

results evidenced the genetic complexity at some of these

susceptibility loci and the importance of considering age-at-onset

effects. Given the low statistical power of the present study,

Figure 1. P-values of association by chromosome position with A) asthma #14years for ADAM33, B) asthma #39 years for MS4A2and, C) asthma #39 years for IL4R. P-values are expressed in –log10 scale. The SNP number shown on the plot denotes the result for themost significant SNP for each gene and the results for the remaining were color coded to reflect their LD with this SNP based on pairwise r2 valuesfrom the 1KGP. Estimated recombination rates (from 1KGP) were also plotted on the right axis to reflect the local LD structure.doi:10.1371/journal.pone.0073157.g001

Table 2. Association summary of the 10 SNPs that resulted significantly associated with asthma after adjustments for the multiplecomparisons.

Gene rs# Positiona ComparisonAllele1/Allele2

Frecuencycontrolsb

Frecuencycasesb OR (95% CI)b p-value

MS4A2 rs569108 59863104 Asthma diagnosed #39 A/G 0.961 0.985 2.45 (1.39–4.33) 2.7E-04c

IL4R rs1805015 27374180 Asthma diagnosed #39 T/C 0.809 0.864 1.45 (1.17–1.80) 2.1E-04c

ADAM33 rs2787093 3648462 Asthma diagnosed #14 T/C 0.890 0.822 0.56 (0.40–0.78) 4.9E-04

rs628965 3649713 Asthma diagnosed #14 G/A 0.619 0.523 0.65 (0.50–0.84) 1.0E-04c

rs628977 3649721 Asthma diagnosed #14 C/T 0.617 0.516 0.66 (0.51–0.85) 3.7E-04c

rs630712 3650066 Asthma diagnosed #14 A/C 0.892 0.826 0.57 (0.41–0.80) 1.0E-04

rs597980 3651165 Asthma diagnosed #14 A/G 0.440 0.326 0.60 (0.46–0.79) 1.2E-04c

rs598418 3651269 Asthma diagnosed #14 A/G 0.618 0.523 0.65 (0.50–0.84) 1.0E-04c

rs2853209 3651472 Asthma diagnosed #14 A/T 0.482 0.362 0.58 (0.45–0.75) 3.8E-05c

rs2787095 3655943 Asthma diagnosed #14 C/G 0.584 0.530 1.51 (1.19–1.91) 3.8E-04c

tSNPs are underlined.aAccording to NCBI build 36.3.bComputed for allele 1.cSNPs associated in previous studies.doi:10.1371/journal.pone.0073157.t002



particularly limited in the case subset analyses when considering

the age at diagnosis, further studies will be needed to identify

causal variants and to unravel if these genes are truly associated

with asthma, with atopy or with both.

Supporting Information

Table S1 Relevant demographic and clinical features ofGOA samples.

(DOC)

Table S2 Information, completion rates and Hardy-Weinberg equilibrium (HWE) p-values for the tSNPs.(DOC)

Table S3 Association summary of SNPs with asthma,atopic asthma and asthma with age at diagnosis beforethe cutoff demonstrating the largest effects.(DOC)

Table S4 Functional annotation of the 10 associatedSNPs.

(DOC)

Table S5 In silico replication of the associated SNPscontained in the GABRIEL study.(DOC)

Table S6 Sample sizes and statistical power for eachanalysis performed in a subset of cases.

(DOC)

Table S7 Coverage of candidate genes on commercialarrays used in asthma GWAS in samples of Europeanancestry.

(DOC)

Text S1 Supplementary methods.

(DOC)

Acknowledgments

The authors want to thank Tobıas Felipe for programming, and Marıa

Torres (CeGen, Santiago de Compostela Node) for her exceptional

technical support with iPLEXH Gold assays. In addition, we would like to

express our gratitude to the Juvenile Diabetes Research Foundation/

Wellcome Trust Diabetes and Inflammation Laboratory (JDRF/WT DIL,

Cambridge Institute for Medical Research) for granting the access to the

MS4A2 re-sequencing data, and acknowledge that those who carried out

the original analysis and collection of the data bear no responsibility for the

analysis or interpretations of this study.

Author Contributions

Conceived and designed the experiments: MPY CF. Performed the

experiments: MPY AC JC PP ISM ASP JF OAF NB JCGR JV TC.

Analyzed the data: MPY CF. Contributed reagents/materials/analysis

tools: CF MH JV. Wrote the paper: MPY MH CF.

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Letter to the Editor

HLA-DRB1*15:01 allele protects from asthmasusceptibility

To the Editor:

Asthma is a chronic inflammatory disease associated withgenetic and environmental factors. The HLA locus is the mostpolymorphic and gene-dense region of the human genome andhas been associated with a large number of infectious andautoimmune diseases.1 Before the advent of genome-wideassociation studies (GWAS), HLA-DRB1 and HLA-DQB1 geneswere independently associated with asthma and related traits inseveral candidate gene association studies.2 The importance ofthese genes in the pathogenesis of asthma has recently beencorroborated by both individual and meta-analyzed GWAS.3-5

In spite of the evidence, the interpretation of these associationscan be problematic because of the complex relationship betweenthe allele at single-nucleotide polymorphisms (SNPs) and thevariation at classical HLA alleles. Interestingly, classic allelesassociatewith stronger effects than individual SNPs and constitutethe most likely functional variants.6 Here, we aimed to test theassociation of SNPs from HLA-DRB1 and HLA-DQB1 withasthma in Spanish samples, and to uncover the classic allelesthat are involved in the susceptibility to the disease.

In the discovery stage, DNA samples from 574 physician-diagnosed asthmatic patients from the Genetics of Asthma (GOA)study in the Spanish population were compared with samples of1186 nonasthmatic subjects obtained from the Spanish NationalDNA Biobank (www.bancoadn.org).7 An independent sample of568 asthma cases and 787 controls was used for replication. Forfurther description of the study design, see Fig E1, OnlineRepository text, and Table E1 in this article’s Online Repositoryat www.jacionline.org.

A total of 22 SNPs capable of predicting classic alleles fromHLA-DRB1 and HLA-DQB1 in European populations weregenotyped in the discovery sample using a combination ofdifferent methods (see Table E2 in this article’s Online Repositoryat www.jacionline.org).8 Their performance on predictingHLA-DRB1 and HLA-DQB1 classic alleles was first assessed bygenotyping 313 DNA samples from healthy Spanish individualswith paired data for classic alleles at a 4-digit resolution(Luminex, Austin, Tex). To impute classic alleles, we used areference data set with more than 2500 samples of Europeanancestry with dense SNP data and classical HLA allele typing.6

We used a new probabilistic approach (HLP*IMP:02), whichdelivers increased accuracy on European samples, even underconditions of reduced SNP coverage.6 The imputed alleles forthe training sample were compared with the observed classicalleles at 2-digit and 4-digit resolution. Only those classic allelesthat attained 80% or more sensitivity, specificity, and positive andnegative predictive values and that were common in the trainingsample (frequency >_5%) were tested for association.

The association of SNPs with asthma in the discovery samplewas tested using logistic regression models and includedpreviously obtained ancestry scores as covariates to adjust forpopulation stratification.7 In this stage, we performed multipletesting adjustments for SNPs and classic alleles by means of105 permutations in which case-control labels were swappedwhile maintaining the haplotype structure.

Seventeen SNPs were successfully genotyped and passedquality control checks (see Online Repository text andTable E2). Four of them were associated with asthma inthe discovery sample after multiple comparison adjustments(1.24 <_ odds ratio [OR] <_ 1.94, 2.8 3 1027 <_ P <_ .002)(see Table E3 and Fig E2 in this article’s Online Repository atwww.jacionline.org) and 2 of them were nominally significantin replication samples (P <_ .008) (Table I). A meta-analysisconfirmed the consistency of the effects for the association ofrs3135388 and rs6457617 with asthma (P 5 7.8 3 1025 and3.0 3 1025, respectively) (Table I), and conditionalregression analysis in the overall sample revealed theirindependent association (P 5 1.3 3 1024 for rs3135388 andP 5 1.5 3 1024 for rs6457617), consistent with their weaklinkage disequilibrium (r2 5 0.06).

In silico analysis of expression quantitative trait loci (eQTLs)revealed the role of associated SNPs as eQTLs for HLA-DRB1and/or HLA-DRB5 in lymphoblastoid cells derived fromEuropean individuals (see Table E4 in this article’s OnlineRepository at www.jacionline.org). The SNP rs3135388 wasalso located on an enhancer histone mark site in B-lymphocytecells and a transcription factor binding site as demonstrated byempirical data from the Encyclopedia of DNA Elements(ENCODE) (http://www.genome.gov). In addition, our resultsfor rs6457617 constitute a replication of a GWAS hit for asthmain Japanese.3 Interestingly, the 2 associated SNPs showedconsistent effects with those reported for lipid traits (see TableE5 in this article’s Online Repository at www.jacionline.org).

Quality assessment of the imputation of the 76 classic allelesdetected in the training sample (see Table E6 in this article’sOnline Repository at www.jacionline.org) revealed that 14 ofthe 25 common alleles passed our quality criteria and werefollowed-up for association analysis using logistic regressionmodels. Three classic alleles were associated with asthma in thediscovery sample after multiple testing adjustments (see TableE7 in this article’s Online Repository at www.jacionline.org):HLA-DQB1*06, HLA-DRB1*15, and HLA-DRB1*15:01(.001 <_ P <_ 1.0 3 1025). However, only 2 of them replicated atnominal significance: HLA-DRB1*15 and HLA-DRB1*15:01(P 5 .001 and .008, respectively). A meta-analysis confirmeda consistent protective effect of HLA-DRB1*15:01 forasthma across all the samples (OR, 0.66; 95% CI, 0.53-0.81;P5 6.73 1025). Interestingly,HLA-DRB1*15:01 has previouslybeen associated with an increased risk for multiple sclerosis andnarcolepsy. This result is consistent with other susceptibilitygenes that have been shown to have opposite effects in asthmaand autoimmune diseases (Table E5).9,10 However, this study isthe first revealing such an effect for a classic HLA allele.

Because a previous study has found an association betweenSNPs from the HLA region and sensitization to specificallergens,11 we performed a post hoc analysis for sensitizationto the 3 most common specific allergens within the asthmacases (see Online Repository text), and identified SNPrs2395175 as associated with the presence of sensitization todust mites, pollens, and animal epithelia in the discoverysample (P <_ .004), with both harmful and protective associations,depending on the allergen (see Table E8 in this article’sOnline Repository at www.jacionline.org). However, only the

1






http://www.genome.gov





TABLE I. Summary of association testing of HLA-DQB1 and HLA-DRB1 SNPs and classic alleles with asthma susceptibility

rs#/gene Effect allele

Discovery sample (n 5 1760)

Replication sample

(n 5 1355) Meta-analysis (n 5 3115)

OR (95% CI) P value OR (95% CI) P value

Q test

P value* OR (95% CI)

FE

P value

RE

P value

rs2395175 A 1.94 (1.51-2.49) 2.8 3 1027� 0.99 (0.72-1.35) .931 .001 1.39 (0.72-2.70)� 6.6 3 1025 4.5 3 1026

rs3135388 A 0.66 (0.50-0.87) .002� 0.63 (0.41-0.97) .008� .976 0.66 (0.54-0.81)§ 7.8 3 1025� 9.4 3 1025

rs6457617 T 1.25 (1.08-1.44) .003� 1.26 (1.07-1.48) .005� .947 1.25 (1.13-1.39)§ 3.0 3 1025� 3.6 3 1025

rs7764856 A 1.24 (1.07-1.45) .005� 1.00 (0.84-1.19) .973 .063 1.13 (1.01-1.27)§ .029 .028

HLA-DQB1 *06 0.67 (0.56-0.80) 1.0 3 1025� 0.97 (0.91-1.02) .249k 1.3 3 1024 0.81 (0.57-1.16)� 4.5 3 1023 1.2 3 1024

HLA-DRB1 *15 0.64 (0.49-0.84) .001� 0.87 (0.80-0.95) .001�k .026 0.77 (0.57-1.03)� 1.2 3 1024 1.3 3 1024�HLA-DRB1 *15:01 0.65 (0.49-0.86) .002� 0.66 (0.49-0.90) .008� .918 0.66 (0.53-0.81)§ 6.7 3 1025� 8.0 3 1025

FE, Fixed-effects; RE, random-effects.

*Cochran’s Q test for heterogeneity.

�Significant P values in individual samples and those that revealed a consistent effect in the meta-analysis.

�Effect and interval derived from the RE model as suggested by the Q test.

§Effect and interval derived from the FE model as suggested by the Q test.

kClassical allele data were available only for a subset of 785 samples.

TABLE II. Summary of association testing of the SNP rs2395175 with allergic sensitization against dust mites, pollens, and animal

epithelia

Allergen

Discovery sample Replication sample Meta-analysis

Sample

size* OR (95% CI) P value

Sample

size* OR (95% CI) P value

Sample

size*

Q test

P valuey OR (95% CI)

FE

P value

RE

P value

Dust mites 253:173 2.69 (1.58-4.59) 2.7 3 1024� 437:110 1.18 (0.64-2.20) .597 690:283 .048 1.81 (0.81-4.06)§ .002 .002

Pollens 163:262 0.46 (0.27-0.79) .004� 224:344 1.06 (0.64-1.76) .830 387:606 .029 0.70 (0.31-1.57)§ .069 .042

Animal

epithelia

128:282 2.07 (1.28-3.35) .003� 219:349 1.94 (1.20-3.12) .007� 347:631 .842 2.00 (1.43-2.81)k 5.6 3 1025� 6.7 3 1025�

FE, Fixed-effects; RE, random-effects.

*Number of individuals with positive and negative sensitization (sensitized: nonsensitized).

�Cochran’s Q test for heterogeneity.

�Significant P values in individual samples and those that revealed a consistent effect in the meta-analysis.

§Effect and interval derived from the RE model as suggested by the Q test.

kEffect and interval derived from the FE model as suggested by the Q test.


nnn 2014

2 LETTER TO THE EDITOR

association with animal epithelia sensitization was replicated inindependent samples (P <_ .003), showing a large effectsize in the meta-analysis (OR, 2.00; 95% CI; 1.43-2.81; P 5 5.63 1025) (Table II). This SNP was also an eQTL for HLA-DRB1and/or HLA-DRB5 in lymphoblastoid cells (Table E4).

Our study has 2 main limitations. First, it had more than 80%statistical power for variants with an OR of more than 1.3, but notfor smaller effect sizes (see Fig E3 in this article’s OnlineRepository at www.jacionline.org). Second, association testingof the full spectrum of classic alleles at these 2 genes wasimpracticable, both because of sample size limitations andbecause of the imperfect predictive ability of the SNPs retainedfor classic allele imputation. Consequently, we analyzed only56% of common classic alleles in this population (see OnlineRepository text). It is possible that we missed other interestingassociations, as suggested by the fact that a weighted scoreincluding the 2 SNPs associated with asthma explained slightlyhigher phenotypic variance than did a model including the classicalleles (Nagelkerke’s R2 5 0.14 vs 0.10, respectively).

In summary, a deeper examination of HLA genes has revealed aclassic allele that shows pleiotropic effects for asthma and otherimmune-related diseases and likely constitutes a putative causalvariant. Analysis of SNPs also revealed shared genetic risk factorsbetween asthma and lipid levels. Finally, we provided evidencesupporting the role of HLA polymorphisms in specific allergicsensitization.

We thank Alexander Dilthey, Goncalo Abecasis, and Christian Fuchsberger

for their help with software tools, Servicio de Apoyo Inform�atico a la

Investigaci�on (ULL) for the HPC support, and Katherine K. Nishimura for

proofreading the manuscript.

Mar�ıa Pino-Yanes, PhDa,b,c

Almudena Corrales, CLTa,b

Marialbert Acosta-Herrera, MSca,b,d

Eva P�erez-Rodr�ıguez, MDe

Jos�e Cumplido, MDf

Paloma Campo, MD, PhDg

Amalia Barreto-Luis, BSa,b

Florentino S�anchez-Garc�ıa, MD, PhDh

Tob�ıas Felipe, PhDi

Inmaculada S�anchez-Mach�ın, MDj

In�es Quintela, MSck

Jos�e Carlos Garc�ıa-Robaina, MDe

Jes�us Villar, MD, PhDa,d

Miguel Blanca, MD, PhDg

Angel Carracedo, MD, PhDl,m

Teresa Carrillo, MDf

Carlos Flores, PhDa,b,n

From aCIBER de Enfermedades Respiratorias, Instituto de Salud Carlos III, Madrid,

Spain; bResearch Unit, Hospital Universitario N.S. de Candelaria, Tenerife, Spain;cthe Department of Medicine, University of California, San Francisco, Calif; dthe

Research Unit, Multidisciplinary Organ Dysfunction Evaluation Research Network

(MODERN), Hospital Universitario Dr Negrin, Gran Canaria, Spain; ethe Allergy

Unit, Hospital Universitario N.S. de Candelaria, Tenerife, Spain; fAllergy Unit,

Hospital Universitario Dr Negr�ın, Gran Canaria, Spain; gAllergy Service, Carlos


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VOLUME nnn, NUMBER nn

LETTER TO THE EDITOR 3

Haya Hospital, Malaga, Spain; hthe Immunology Unit, Hospital de Gran Canaria

Dr Negr�ın, Gran Canaria, Spain; iNorthWest Research Associates, Boulder, Colo;jthe Allergy Unit, Hospital del T�orax, Complejo Hospitalario Universitario NS

Candelaria, Tenerife, Spain; kGrupo de Medicina Xen�omica, CEGEN-ISCIII-

Universidade de Santiago de Compostela, Santiago de Compostela, Spain; lGrupo

de Medicina Xen�omica, Fundaci�on Galega de Medicina Xen�omica (SERGAS)-

CIBERER-Universidade de Santiago de Compostela, Santiago de Compostela, Spain;mCenter of Excellence in Genomic Medicine Research, King Abdulaziz University,

Jeddah, Saudi Arabia; and nApplied Genomics Group (G2A), Genetics Laboratory,

Instituto Universitario de Enfermedades Tropicales y Salud P�ublica de Canarias,

Universidad de La Laguna, Tenerife, Spain. E-mail: [email protected].

This work was supported by grants from the Health Institute ‘‘Carlos III’’ (grant no. FIS

PI08/1383 and grant no. FIS PI11/00623) and cofinanced by the European Regional

Development Funds, ‘‘Away of making Europe’’ from the European Union, and by a

specific agreement between Instituto de Salud Carlos III and Gobierno de Canarias

(grant no. EMER07/001). M. Pino-Yanes was supported by a postdoctoral fellowship

from Fundaci�on Ram�on Areces. M. Acosta-Herrera and A. Barreto-Luis were sup-

ported by fellowships from the Instituto de Salud Carlos III (grant no. FI11/00074

and grant no. FI12/00493, respectively).

Disclosure of potential conflict of interest: M. Pino-Yanes has received funding from the

Fundaci�on Ram�on Areces. A. Carracedo is employed at the University of Santiago,

which has received funding from the Ministry of Justice, the Ministry of Health,

and the European Union. The rest of the authors declare that they have no relevant

conflicts of interest.

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http://dx.doi.org/10.1016/j.jaci.2014.05.031

análisis de los polimorfismos de ltc4s, alox5 y … · a mi madre no elegimos la familia en la que...

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