virus del papiloma humano, detección y vacunas dra. marcela lizano soberón

Virus del Papiloma Humano, Detección y Vacunas

Dra. Marcela Lizano Soberón

Enfermedad de transmisión Enfermedad de transmisión sexualsexual

Genoma del VPH 99% en Ca-CUGenoma del VPH 99% en Ca-CU

Infección Infección PERSISTENTEPERSISTENTE con con VPH como causa necesaria VPH como causa necesaria para el desarrollo de CaCUpara el desarrollo de CaCU

Zur Hausen, 1977; Zur Hausen, 1977; Bosch, 2002; de Villiers, 2004. Bosch, 2002; de Villiers, 2004.

Presencia regular y persistencia del respectivo DNA viral en biopsias tumorales y líneas celulares derivadas de dichos tumores.

Demostración de promoción de crecimiento por genes virales específicos, en cultivos celulares o modelos animales disponibles.

Demostración de que el fenotipo maligno depende de la expresión contínua de oncogenes virales.

Evidencias epidemiológicas de la infección viral como factor de riesgo para el desarrollo del cáncer.

Criterios para determinar papel viral en la carcinogénesis (zur Hausen 2001)

Cáncer Cáncer Cérvico Cérvico UterinoUterino

HPVHPV SISTEMA INMUNOLOGICO

ALTERACION DE LARESPUESTA INMUNE

LOCAL

DESNUTRICION

FACTORES GENETICOS

FACTORES HORMONALES

VIDA SEXUAL

OTROS

TABAQUISMO

STRESS

VPH de alto riesgo en el 99% de los cánceres de cérvix .

15-43% prevalencia de VPH en mujeres con citololgía normal.

~70% de la mujeres estarán infectadas por VPH en algún momento de su vida. La mayor parte de estas infecciones serán transitorias.

Koutsky et al. N Engl J Med 2002, 347:1645

Epidemiología del VPH

Orozco-Colín 2010. Int J Infect Dis. 14:1082.Kasan et al. 2011. Eur J Obster Gynecol Reprod Biol. Jul 14.

Walboomers JM et al. 1999. J Pathol. 189:12.

Normal

Infección VPH

persistencia NIC 2+ invasion

Tipo de VPH/ variantes intratipo Carga Viral Predisposición genética Respuesta inmune

El virus del papiloma humano y el cáncer cérvico-uterino

Integración

Menos del 2%de los individuos infectados

Lowy & Schiller. J Clin Invest. 116:1167, 2006

Incidencia de infecciones por HPV, precáncer y cáncer

J. Doorbar et al. / Vaccine 30S (2012) F55– F70

Relación evolutiva entre VPHsRelación evolutiva entre VPHs

Doorbar J et al. / Vaccine 30S (2012) F55– F70

Papilomavirus Alpha y asociacióncon enfermedad

Genoma del VPH

Oncogenes

Replicación

Replicación y transcripción

Proteínas de la cápside

Región Larga de control

Efecto de Integración del DNA viral al genoma hospedero X

X

Ciclo de vida de VPH en el epitelio cervical

Woodman CBJ et al.,Nat Rev 2007; 7:11.

Patogénesis del cáncer de cérvixzur Hausen

Información relevante de VPH y CaCU

La infección por VPH es muy común

El CaCU siempre es causado por el VPH

Tener VPH no significa que la mujer desarrollará CaCU.

Más del 90% de las infecciones detectadas se eliminan en los siguientes 2 años.

La infección con VPH de alto riesgo que persiste por más de 4 años aumenta el riesgo al cáncer por 100x

Los VPH se detectan prácticamente en todos los casos de CaCU y en una proporción de sus lesiones precursoras.

La infección por VPH es la CAUSA NECESARIA del cáncer de cérvix, pero NO SUFICIENTE.

Una vacuna totalmente eficaz contra VPH16 y 18 eliminaría cerca del 70% de los cánceres de cérvix.

La estrategia completa para eliminar el cáncer involucra la detección temprana, el tratamiento

y la prevención

PrevenciónPrimaria VacunaciónIntento prometedor para reducir incidencia y mortalidad de CaCU

SecundariaDetección oportuna del cáncerEl primer factor en el pronóstico es la detección en etapastempranas de la enfermedad:

- Pap- Colposcopía- Detección de ADN de VPH de alto riesgo

Tratamiento oportuno de lesiones premalignas

Diagnóstico molecular de VPH

Los modelos de cultivo in vitro son poco eficaces y costosos. Los anticuerpos carecen de valor diagnóstico.

La detección de DNA de VPH aporta una excelente sensibilidad que debe ser valorada cuidadosamente debido a la ubicuidad del virus.

Las mujeres infectadas con VPH-AR se encuentran en mayor riesgo de desarrollar CaCU que las infectadas con tipos de VPH de bajo riesgo.

Manejo menos agresivo en mujeres VPH neg con anormalidades citológicas leves o equívocas, dado que es poco factible que progresen.

Mayor sensibilidad de detección Mayor sensibilidad de detección de de

LIE de alto gradoLIE de alto grado

76.2%76.2%

89.2%89.2%96.9%96.9%

0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%

100%

Pap Prueba VPH Pap + VPH

Sensibilidad

Manos, M.M., et al., Identifying Women With Cervical Neoplasia. JAMA, May 5, 1999

Participantes: 995mujeres con ASCUS

Sensibilidad de distintas técnicas de detección de VPH

Sonda directa

Señal amplificada

PCR en tiempo real

Hibridación in situ

Southern blot

Toma de muestra para la detección de VPH

La toma de muestra se obtiene de la región exo-

endocervical con cepillos especiales.

Se transporta al laboratorio en medio líquido (la

muestra puede ser viable dos semanas a temperatura

ambiente aunque es conveniente refrigerarla).

Puede utilizarse el mismo medio empleado en la

citología líquida.

Los estudios de toma por el propio paciente han

demostrado su eficacia.

HC2

Límite de detección: 4000–5000 HPV copies

Denature

nucleic acids

Hybridize target DNA with RNA probe

Capture RNA:DNA hybrids onto microtiter plate

Chemiluminescent signal amplification

RNA:DNA complex antibodies

Reagent reversal modification

La prueba de captura híbrida utiliza dos mezclas de sondas de RNA para diferenciar entre tipos de VPH oncogenicos y de bajo riesgo

Bajo riesgo6, 11, 42, 43, 44

Alto riesgo16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68

Tipos de VPH identificados en HC2

PCRLa amplificación de la secuencia blanco es exponencial

PCR / PRIMERS CONSENSO SOBRE EL GEN L1

65 pb

150 pb

450 pb

5’ 3’

MY11/09

GP5/6+

L1C1/2

Secuenciación de Productos de PCR

Blast

65 pb SPF1/2

Métodos de genotipificación por PCR

No todos los sistemas de tipificación brindan los mismos resultados...

- La estandarización es crítica

Cada sistema de primers bien validado sufre de problemas de sensibilidad para algunos tipos virales.

MY09/11: 26, 35, 45, 52, 55, 59, 68, 73, 83 PGMY09/11: 31, 52 GP5+/6+: 53, 61 SPF10: 42, 56, 59

Note: Research array depicted. The commercial array will have differences in probe composition and configuration from research prototype

Reference line

High beta-globin

Low beta-globin

Detección de infecciones

múltiples LBA (Roche)

E6 Nested Multiplex PCR

Sotlar K. et al. J.Clin.Microbiol. 2004. 42:3176-84.

PRIMERS PRIMERS GENERALESGENERALES E6-E7E6-E7

(602-666 pb)(602-666 pb)

COCKTAIL COCKTAIL 1116,18,31,516,18,31,59,459,45(151-457 (151-457 pb)pb)

COCKTAIL 4COCKTAIL 468,39,51,6668,39,51,66(172-333pb)(172-333pb)

COCKTAIL 3COCKTAIL 335,42,43,4435,42,43,44(163-358 pb)(163-358 pb)

COCKTAIL 2COCKTAIL 233,6/11,58,52,5633,6/11,58,52,56(181-398 pb)(181-398 pb)

PRIMERS ESPECÍFICOSPRIMERS ESPECÍFICOS

16

31

4518

161845

Recomendaciones para el manejo del paciente con criterio de positividad a

VPH

Massad LS et al. J Low Genit Tract Dis. 2013 17:S1-S27.Guías clínicas ASCCP 2006

Detección de VPH en mujeres > 30 años

Tamizaje con VPH y PAP

Si cualquiera de las pruebas es positiva, seguir la estrategia normal del flujograma de ascus y continuar con el tamizaje anual.

Si ambas pruebas son negativas, extender el intervalo de tamizaje hasta 3 años.

Massad LS et al. J Low Genit Tract Dis. 2013 17:S1-S27.Guías clínicas ASCCP 2006.

Prueba de DNA de VPH: Se requiere genotipificar?

Tipificación de VPH

• Tipo: > 10% diferencias en genoma

• Subtipo: Diferencias del 10 a 2 %

• Variante:

< 2 % en secuencias codificantes (E6,E7,L1)

< 5% en secuencias no codificantes (LCR)

• 160 tipos de VPH se han clasificado de acuerdo a su nicho ecológico, potencial oncogénico y posición filogenética

Burk RD, et al. Virology 2013;445:232–43.

Usos potenciales

Investigación

Prueba de curación

Definir persistencia para manejo de citología normal en mujeres VPH positivas

Vigilancia en poblaciones vacunadas

Investigación

La ausencia de tipificación en estudios epidemiológicos asume igualdad en el espectro de genotipos de VPH:

Ya demostrado que hay diferencias en potencial oncogénico.

Entre los tipos oncogénicos – existen diferentes riesgos de progresión o persistencia?

. . . . . .. . . .. . . .. . .

Carrillo García A, et al. Gynecol Oncol 2014; 134-534-539.

Carrillo García A, et al. Gynecol Oncol 2014; 134-534-539.

ASOCIACION ENTRE TIPO DE MUESTRA (CA+LIEAG VS LIEBG) Y COMBINACION DE VPH ENTRE TODAS LAS

MUESTRAS POSITIVAS

Carrillo García A, et al. Gynecol Oncol 2014; 134-534-539.

Prueba de curación

Confirmación de que la lesión asociada a la infección por VPH ha sido erradicada por terapia excisional, vacuna profiláctica, quimioterapia (enfermedad residual).

Vigilancia en poblaciones vacunadas

Genotipificación en programas de tamizaje seleccionados pre- y post- vacunación.

Monitoreo del decremento temporal anticipado en la prevalencia de VPH16/18

Monitoreo en el incremento potencial de otros genotipos virales.

Evaluación de la protección cruzada potencial de la vacuna.

Expresión de VPH en la progresión neoplásica

Detección de mRNA de VPH

El VPH que se está transcribiendo (producción de mRNA viral) asegura que la infección es activa.

En particular, la expresión abundante de mRNA de E6 y E7 habla de una infección con alto riesgo de transformación.

Vs la detección de DNA, tiene un mayor valor predictivo positivo.

Comparación entre diferentes métodos comerciales de detección de VPH

CH2 No No No DNA No

LBA Sí No No DNA Si

PreTect HPV-proofer Sí Sí Sí mRNA Sí

Muestra infec.activa

Evita seg.innecesario

DetectaDNA/mRNA

Genotip.VPH

Detecta persistencia

Método Paciente Principio

Debido a la sensibilidad de las pruebas moleculares la detección de DNA de VPH no necesariamente va acompañado del desarrollo de un proceso tumoral, por lo que otros pruebas podrían requerirse:

1) Citología

2) Genotipificación

3) Expresión de mRNA de VPH

4) Integración de DNA viral

5) Estatus de p16 y otros marcadores celulares

6) Carga viral de VPH

Vacunas vs. VPH

Los Papilomavirus codifican 2 proteinas estructurales

Dos proteinas estructurales:

L1: Cada partícula tiene 360 copias.

L2: Cada partícula tiene 12 copias.

La proteina L1 se autoensambla de forma tridimensional formando “viriones” vacíos denominados “virus-like particles (VLPs)”

Doug Lowy (NCI, USA)

L1

L1

L2L2

Vector de Expresión o baculovirus

VLPs

Expresión y ensamblaje de L1 y L2 en células de levadura o de insecto

Vacunas profilácticas vs VPH

(Virus-Like particles)

Pr L1

L2

VLPs (Virus Like Particles)VLPs (Virus Like Particles)

Partículas virales VLP

No contienen DNA viral

Inducen anticuerpos neutralizantes contra tipos específicos.

Tienen efecto protector en conejos y perros, cuando se administran previamente al reto con papilomavirus de conejo y oral canino.

Breitburd et al. 1995 J Virol 69:3959.Suzich et al. 1995 PNAS 92:11553.

(VLPs) específicas para diferentes tipos de VPH

J. Clin. Invest. 2004; 114 (4):450–462

Vacunación con HPV-L1-VLPs

Inducción de anticuerpos

neutralizantes

VPH de alto riesgo

Purificación

Auto-ensamblaje

de VLPs

Proteína L1

Transferencia génica y expresión en modelo de

levadura

DNA que codifica VPH-L1

Desarrollo de vacuna contra VPHDesarrollo de vacuna contra VPHMás de 25 años...Más de 25 años...

1997

Estudios fase I - monovalente

1980s Sospecha Correlación VPH – CACU

2002 Estudios fase III - tetravalente

1990s

Estudios Pre-clínicos: VLP induce respuesta de Ig neutralizante

Estudios fase II – monovalente y tetravalente

2006 Registro

Annu Rev Med 2004;55:319-31N Engl J Med 2002 ;347(21):1703-1705

Agencia Internacional de Investigación en Cáncer declara a VPH tipos 16 y 18 como carcinógenosVPH involucrado en transformación celular maligna

Primeros intentos DNA desnudo - vaccinia virus - proteínas de fusiónAutoensamblaje de proteinas de cápside L1 y L2

2001

2002

1991 Partículas similares a virus (VLP) ensambladas en levadura y células de insecto

1995

500 µg /50 µg225 µgDosis de adyuvante

20/2020/40/40/20Concentraciones por dosis en µg

AS04Hidróxido de aluminio + 3-desacil-monofosforil

lípido A (MPL, Corixa/GSK)

AAHS Sulfato hidroxifosfato de

aluminio amorfo

(Merck & Co., Inc.)

Adyuvante

Sustrato de células de insecto

LevaduraProceso de ensamblado/ reensamblado registrado

comercialmente para mayor estabilidad

Tecnología para producir PPV de L1

Tipos de VPH

CervarixCervarix®®22GARDASILGARDASIL®®11

500 µg /50 µg225 µgDosis de adyuvante

20/2020/40/40/20Concentraciones por dosis en µg

AS04Hidróxido de aluminio + 3-desacil-monofosforil

lípido A (MPL, Corixa/GSK)

AAHS Sulfato hidroxifosfato de

aluminio amorfo

(Merck & Co., Inc.)

Adyuvante

Sustrato de células de insecto

LevaduraProceso de ensamblado/ reensamblado registrado

comercialmente para mayor estabilidad

Tecnología para producir PPV de L1

Tipos de VPH

CervarixCervarix®®22GARDASILGARDASIL®®11

Composición de las vacunas contra el VPHComposición de las vacunas contra el VPH

1. Villa LL, Costa RLR, Petta CA y cols. Lancet Oncol. 2005;6:671–678. 2. Harper DM, Franco EL, Wheeler C y cols. Lancet. 2004;364:1757–1765.

6 11 16 18 16 186 11 16 18 16 18

PPV = partículas parecidas a virus

Eficacia de la Vacuna Cuadrivalente VPH 6,11,16 y 18 FUTURE II – Resultados

N Engl J Med 2007;356:1915-27Análisis Punto Final Vacuna VPH Placebo Eficacia

(95% IC)

# de Mujeres

# de Casos

(Tasa**)

# de Mujeres

# de Casos (Tasa

PP NIC 2/3, AIS* y Cáncer Relacionado a VPH-16 y 18

5,305 1

(<0.1)

5,260 42

(0.3)

98 %

IT NIC 2/3, AIS* y Cáncer Relacionado a VPH-16 y 18

6,087 83

(0.5)

6,080 148

(0.8)

44 %

IT NIC 2/3, AIS* y Cáncer Relacionado a cualquier tipo de VPH

6,087 219

(1.3)

6,080 266

1.5

17%

Transudación o exudación de anticuerpos séricos al sitio de la

infección por VPH

Schwarz TF, Oberdan L. Gynecol Oncol. 2008; 110:S1-S8

Harper D. Prophylactic HPV vaccines: Current knowledge of impact on gynecologic premalignancies. Discovery Medicine July 2010.

Títulos de anticuerpos anti-VPH18 inducidos por las

vacunas

Las pruebas clínicas muestran que la protección continúa. Se desconoce cuales son los niveles mínimos de anticuerpos anti-VPH 16 y 18 para proteger contra la enf. clínica

Desarrollo de NICs I AIS relacionados conHP6,11,16,18 en población vacunada (Gardasil)

Joura EA, et al.Vaccine 2008, 26:6844

Posible generacion de Celulas B de memoria

Modelo de estimación del impacto clínico de la vacuna profiláctica HPV-16/18

Goldie S et al. 2003 Int J Cancer 106:893.

Inci

den

cia

de

Ca

de

cérv

ix

I nci

den

cia

de

Ca

de

cérv

ix

Po

r 10

0,00

0 m

uj e

res

Po

r 10

0,00

0 m

uj e

res

20

40

60

80

100

120

0

14 18 22 26 30 34 38 42 46 50

54 666258

EDAD (AÑOS)EDAD (AÑOS)

VVAACCUUNNAACCIIOONN

Sin Sin VacunaciónVacunación

50% 50%

75% 75%

98% 98%

Tipos de VPH: 16, 18, 31, 33 ,45, 52,58 6, 11