virus del papiloma humano, detección y vacunas dra. marcela lizano soberón
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Virus del Papiloma Humano, Detección y Vacunas
Dra. Marcela Lizano Soberón
Enfermedad de transmisión Enfermedad de transmisión sexualsexual
Genoma del VPH 99% en Ca-CUGenoma del VPH 99% en Ca-CU
Infección Infección PERSISTENTEPERSISTENTE con con VPH como causa necesaria VPH como causa necesaria para el desarrollo de CaCUpara el desarrollo de CaCU
Zur Hausen, 1977; Zur Hausen, 1977; Bosch, 2002; de Villiers, 2004. Bosch, 2002; de Villiers, 2004.
Presencia regular y persistencia del respectivo DNA viral en biopsias tumorales y líneas celulares derivadas de dichos tumores.
Demostración de promoción de crecimiento por genes virales específicos, en cultivos celulares o modelos animales disponibles.
Demostración de que el fenotipo maligno depende de la expresión contínua de oncogenes virales.
Evidencias epidemiológicas de la infección viral como factor de riesgo para el desarrollo del cáncer.
Criterios para determinar papel viral en la carcinogénesis (zur Hausen 2001)
Cáncer Cáncer Cérvico Cérvico UterinoUterino
HPVHPV SISTEMA INMUNOLOGICO
ALTERACION DE LARESPUESTA INMUNE
LOCAL
DESNUTRICION
FACTORES GENETICOS
FACTORES HORMONALES
VIDA SEXUAL
OTROS
TABAQUISMO
STRESS
VPH de alto riesgo en el 99% de los cánceres de cérvix .
15-43% prevalencia de VPH en mujeres con citololgía normal.
~70% de la mujeres estarán infectadas por VPH en algún momento de su vida. La mayor parte de estas infecciones serán transitorias.
Koutsky et al. N Engl J Med 2002, 347:1645
Epidemiología del VPH
Orozco-Colín 2010. Int J Infect Dis. 14:1082.Kasan et al. 2011. Eur J Obster Gynecol Reprod Biol. Jul 14.
Walboomers JM et al. 1999. J Pathol. 189:12.
Normal
Infección VPH
persistencia NIC 2+ invasion
Tipo de VPH/ variantes intratipo Carga Viral Predisposición genética Respuesta inmune
El virus del papiloma humano y el cáncer cérvico-uterino
Integración
Menos del 2%de los individuos infectados
Lowy & Schiller. J Clin Invest. 116:1167, 2006
Incidencia de infecciones por HPV, precáncer y cáncer
J. Doorbar et al. / Vaccine 30S (2012) F55– F70
Relación evolutiva entre VPHsRelación evolutiva entre VPHs
Doorbar J et al. / Vaccine 30S (2012) F55– F70
Papilomavirus Alpha y asociacióncon enfermedad
Genoma del VPH
Oncogenes
Replicación
Replicación y transcripción
Proteínas de la cápside
Región Larga de control
Efecto de Integración del DNA viral al genoma hospedero X
X
Ciclo de vida de VPH en el epitelio cervical
Woodman CBJ et al.,Nat Rev 2007; 7:11.
Patogénesis del cáncer de cérvixzur Hausen
Información relevante de VPH y CaCU
La infección por VPH es muy común
El CaCU siempre es causado por el VPH
Tener VPH no significa que la mujer desarrollará CaCU.
Más del 90% de las infecciones detectadas se eliminan en los siguientes 2 años.
La infección con VPH de alto riesgo que persiste por más de 4 años aumenta el riesgo al cáncer por 100x
Los VPH se detectan prácticamente en todos los casos de CaCU y en una proporción de sus lesiones precursoras.
La infección por VPH es la CAUSA NECESARIA del cáncer de cérvix, pero NO SUFICIENTE.
Una vacuna totalmente eficaz contra VPH16 y 18 eliminaría cerca del 70% de los cánceres de cérvix.
La estrategia completa para eliminar el cáncer involucra la detección temprana, el tratamiento
y la prevención
PrevenciónPrimaria VacunaciónIntento prometedor para reducir incidencia y mortalidad de CaCU
SecundariaDetección oportuna del cáncerEl primer factor en el pronóstico es la detección en etapastempranas de la enfermedad:
- Pap- Colposcopía- Detección de ADN de VPH de alto riesgo
Tratamiento oportuno de lesiones premalignas
Diagnóstico molecular de VPH
Los modelos de cultivo in vitro son poco eficaces y costosos. Los anticuerpos carecen de valor diagnóstico.
La detección de DNA de VPH aporta una excelente sensibilidad que debe ser valorada cuidadosamente debido a la ubicuidad del virus.
Las mujeres infectadas con VPH-AR se encuentran en mayor riesgo de desarrollar CaCU que las infectadas con tipos de VPH de bajo riesgo.
Manejo menos agresivo en mujeres VPH neg con anormalidades citológicas leves o equívocas, dado que es poco factible que progresen.
Mayor sensibilidad de detección Mayor sensibilidad de detección de de
LIE de alto gradoLIE de alto grado
76.2%76.2%
89.2%89.2%96.9%96.9%
0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%
100%
Pap Prueba VPH Pap + VPH
Sensibilidad
Manos, M.M., et al., Identifying Women With Cervical Neoplasia. JAMA, May 5, 1999
Participantes: 995mujeres con ASCUS
Sensibilidad de distintas técnicas de detección de VPH
Sonda directa
Señal amplificada
PCR en tiempo real
Hibridación in situ
Southern blot
Toma de muestra para la detección de VPH
La toma de muestra se obtiene de la región exo-
endocervical con cepillos especiales.
Se transporta al laboratorio en medio líquido (la
muestra puede ser viable dos semanas a temperatura
ambiente aunque es conveniente refrigerarla).
Puede utilizarse el mismo medio empleado en la
citología líquida.
Los estudios de toma por el propio paciente han
demostrado su eficacia.
HC2
Límite de detección: 4000–5000 HPV copies
Denature
nucleic acids
Hybridize target DNA with RNA probe
Capture RNA:DNA hybrids onto microtiter plate
Chemiluminescent signal amplification
RNA:DNA complex antibodies
Reagent reversal modification
La prueba de captura híbrida utiliza dos mezclas de sondas de RNA para diferenciar entre tipos de VPH oncogenicos y de bajo riesgo
Bajo riesgo6, 11, 42, 43, 44
Alto riesgo16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68
Tipos de VPH identificados en HC2
PCRLa amplificación de la secuencia blanco es exponencial
PCR / PRIMERS CONSENSO SOBRE EL GEN L1
65 pb
150 pb
450 pb
5’ 3’
MY11/09
GP5/6+
L1C1/2
Secuenciación de Productos de PCR
Blast
65 pb SPF1/2
Métodos de genotipificación por PCR
No todos los sistemas de tipificación brindan los mismos resultados...
- La estandarización es crítica
Cada sistema de primers bien validado sufre de problemas de sensibilidad para algunos tipos virales.
MY09/11: 26, 35, 45, 52, 55, 59, 68, 73, 83 PGMY09/11: 31, 52 GP5+/6+: 53, 61 SPF10: 42, 56, 59
Note: Research array depicted. The commercial array will have differences in probe composition and configuration from research prototype
Reference line
High beta-globin
Low beta-globin
Detección de infecciones
múltiples LBA (Roche)
E6 Nested Multiplex PCR
Sotlar K. et al. J.Clin.Microbiol. 2004. 42:3176-84.
PRIMERS PRIMERS GENERALESGENERALES E6-E7E6-E7
(602-666 pb)(602-666 pb)
COCKTAIL COCKTAIL 1116,18,31,516,18,31,59,459,45(151-457 (151-457 pb)pb)
COCKTAIL 4COCKTAIL 468,39,51,6668,39,51,66(172-333pb)(172-333pb)
COCKTAIL 3COCKTAIL 335,42,43,4435,42,43,44(163-358 pb)(163-358 pb)
COCKTAIL 2COCKTAIL 233,6/11,58,52,5633,6/11,58,52,56(181-398 pb)(181-398 pb)
PRIMERS ESPECÍFICOSPRIMERS ESPECÍFICOS
16
31
4518
161845
Recomendaciones para el manejo del paciente con criterio de positividad a
VPH
Massad LS et al. J Low Genit Tract Dis. 2013 17:S1-S27.Guías clínicas ASCCP 2006
Detección de VPH en mujeres > 30 años
Tamizaje con VPH y PAP
Si cualquiera de las pruebas es positiva, seguir la estrategia normal del flujograma de ascus y continuar con el tamizaje anual.
Si ambas pruebas son negativas, extender el intervalo de tamizaje hasta 3 años.
Massad LS et al. J Low Genit Tract Dis. 2013 17:S1-S27.Guías clínicas ASCCP 2006.
Prueba de DNA de VPH: Se requiere genotipificar?
Tipificación de VPH
• Tipo: > 10% diferencias en genoma
• Subtipo: Diferencias del 10 a 2 %
• Variante:
< 2 % en secuencias codificantes (E6,E7,L1)
< 5% en secuencias no codificantes (LCR)
• 160 tipos de VPH se han clasificado de acuerdo a su nicho ecológico, potencial oncogénico y posición filogenética
Burk RD, et al. Virology 2013;445:232–43.
Usos potenciales
Investigación
Prueba de curación
Definir persistencia para manejo de citología normal en mujeres VPH positivas
Vigilancia en poblaciones vacunadas
Investigación
La ausencia de tipificación en estudios epidemiológicos asume igualdad en el espectro de genotipos de VPH:
Ya demostrado que hay diferencias en potencial oncogénico.
Entre los tipos oncogénicos – existen diferentes riesgos de progresión o persistencia?
. . . . . .. . . .. . . .. . .
Carrillo García A, et al. Gynecol Oncol 2014; 134-534-539.
Carrillo García A, et al. Gynecol Oncol 2014; 134-534-539.
ASOCIACION ENTRE TIPO DE MUESTRA (CA+LIEAG VS LIEBG) Y COMBINACION DE VPH ENTRE TODAS LAS
MUESTRAS POSITIVAS
Carrillo García A, et al. Gynecol Oncol 2014; 134-534-539.
Prueba de curación
Confirmación de que la lesión asociada a la infección por VPH ha sido erradicada por terapia excisional, vacuna profiláctica, quimioterapia (enfermedad residual).
Vigilancia en poblaciones vacunadas
Genotipificación en programas de tamizaje seleccionados pre- y post- vacunación.
Monitoreo del decremento temporal anticipado en la prevalencia de VPH16/18
Monitoreo en el incremento potencial de otros genotipos virales.
Evaluación de la protección cruzada potencial de la vacuna.
Expresión de VPH en la progresión neoplásica
Detección de mRNA de VPH
El VPH que se está transcribiendo (producción de mRNA viral) asegura que la infección es activa.
En particular, la expresión abundante de mRNA de E6 y E7 habla de una infección con alto riesgo de transformación.
Vs la detección de DNA, tiene un mayor valor predictivo positivo.
Comparación entre diferentes métodos comerciales de detección de VPH
CH2 No No No DNA No
LBA Sí No No DNA Si
PreTect HPV-proofer Sí Sí Sí mRNA Sí
Muestra infec.activa
Evita seg.innecesario
DetectaDNA/mRNA
Genotip.VPH
Detecta persistencia
Método Paciente Principio
Debido a la sensibilidad de las pruebas moleculares la detección de DNA de VPH no necesariamente va acompañado del desarrollo de un proceso tumoral, por lo que otros pruebas podrían requerirse:
1) Citología
2) Genotipificación
3) Expresión de mRNA de VPH
4) Integración de DNA viral
5) Estatus de p16 y otros marcadores celulares
6) Carga viral de VPH
Vacunas vs. VPH
Los Papilomavirus codifican 2 proteinas estructurales
Dos proteinas estructurales:
L1: Cada partícula tiene 360 copias.
L2: Cada partícula tiene 12 copias.
La proteina L1 se autoensambla de forma tridimensional formando “viriones” vacíos denominados “virus-like particles (VLPs)”
Doug Lowy (NCI, USA)
L1
L1
L2L2
Vector de Expresión o baculovirus
VLPs
Expresión y ensamblaje de L1 y L2 en células de levadura o de insecto
Vacunas profilácticas vs VPH
(Virus-Like particles)
Pr L1
L2
VLPs (Virus Like Particles)VLPs (Virus Like Particles)
Partículas virales VLP
No contienen DNA viral
Inducen anticuerpos neutralizantes contra tipos específicos.
Tienen efecto protector en conejos y perros, cuando se administran previamente al reto con papilomavirus de conejo y oral canino.
Breitburd et al. 1995 J Virol 69:3959.Suzich et al. 1995 PNAS 92:11553.
(VLPs) específicas para diferentes tipos de VPH
J. Clin. Invest. 2004; 114 (4):450–462
Vacunación con HPV-L1-VLPs
Inducción de anticuerpos
neutralizantes
VPH de alto riesgo
Purificación
Auto-ensamblaje
de VLPs
Proteína L1
Transferencia génica y expresión en modelo de
levadura
DNA que codifica VPH-L1
Desarrollo de vacuna contra VPHDesarrollo de vacuna contra VPHMás de 25 años...Más de 25 años...
1997
Estudios fase I - monovalente
1980s Sospecha Correlación VPH – CACU
2002 Estudios fase III - tetravalente
1990s
Estudios Pre-clínicos: VLP induce respuesta de Ig neutralizante
Estudios fase II – monovalente y tetravalente
2006 Registro
Annu Rev Med 2004;55:319-31N Engl J Med 2002 ;347(21):1703-1705
Agencia Internacional de Investigación en Cáncer declara a VPH tipos 16 y 18 como carcinógenosVPH involucrado en transformación celular maligna
Primeros intentos DNA desnudo - vaccinia virus - proteínas de fusiónAutoensamblaje de proteinas de cápside L1 y L2
2001
2002
1991 Partículas similares a virus (VLP) ensambladas en levadura y células de insecto
1995
500 µg /50 µg225 µgDosis de adyuvante
20/2020/40/40/20Concentraciones por dosis en µg
AS04Hidróxido de aluminio + 3-desacil-monofosforil
lípido A (MPL, Corixa/GSK)
AAHS Sulfato hidroxifosfato de
aluminio amorfo
(Merck & Co., Inc.)
Adyuvante
Sustrato de células de insecto
LevaduraProceso de ensamblado/ reensamblado registrado
comercialmente para mayor estabilidad
Tecnología para producir PPV de L1
Tipos de VPH
CervarixCervarix®®22GARDASILGARDASIL®®11
500 µg /50 µg225 µgDosis de adyuvante
20/2020/40/40/20Concentraciones por dosis en µg
AS04Hidróxido de aluminio + 3-desacil-monofosforil
lípido A (MPL, Corixa/GSK)
AAHS Sulfato hidroxifosfato de
aluminio amorfo
(Merck & Co., Inc.)
Adyuvante
Sustrato de células de insecto
LevaduraProceso de ensamblado/ reensamblado registrado
comercialmente para mayor estabilidad
Tecnología para producir PPV de L1
Tipos de VPH
CervarixCervarix®®22GARDASILGARDASIL®®11
Composición de las vacunas contra el VPHComposición de las vacunas contra el VPH
1. Villa LL, Costa RLR, Petta CA y cols. Lancet Oncol. 2005;6:671–678. 2. Harper DM, Franco EL, Wheeler C y cols. Lancet. 2004;364:1757–1765.
6 11 16 18 16 186 11 16 18 16 18
PPV = partículas parecidas a virus
Eficacia de la Vacuna Cuadrivalente VPH 6,11,16 y 18 FUTURE II – Resultados
N Engl J Med 2007;356:1915-27Análisis Punto Final Vacuna VPH Placebo Eficacia
(95% IC)
# de Mujeres
# de Casos
(Tasa**)
# de Mujeres
# de Casos (Tasa
PP NIC 2/3, AIS* y Cáncer Relacionado a VPH-16 y 18
5,305 1
(<0.1)
5,260 42
(0.3)
98 %
IT NIC 2/3, AIS* y Cáncer Relacionado a VPH-16 y 18
6,087 83
(0.5)
6,080 148
(0.8)
44 %
IT NIC 2/3, AIS* y Cáncer Relacionado a cualquier tipo de VPH
6,087 219
(1.3)
6,080 266
1.5
17%
Transudación o exudación de anticuerpos séricos al sitio de la
infección por VPH
Schwarz TF, Oberdan L. Gynecol Oncol. 2008; 110:S1-S8
Harper D. Prophylactic HPV vaccines: Current knowledge of impact on gynecologic premalignancies. Discovery Medicine July 2010.
Títulos de anticuerpos anti-VPH18 inducidos por las
vacunas
Las pruebas clínicas muestran que la protección continúa. Se desconoce cuales son los niveles mínimos de anticuerpos anti-VPH 16 y 18 para proteger contra la enf. clínica
Desarrollo de NICs I AIS relacionados conHP6,11,16,18 en población vacunada (Gardasil)
Joura EA, et al.Vaccine 2008, 26:6844
Posible generacion de Celulas B de memoria
Modelo de estimación del impacto clínico de la vacuna profiláctica HPV-16/18
Goldie S et al. 2003 Int J Cancer 106:893.
Inci
den
cia
de
Ca
de
cérv
ix
I nci
den
cia
de
Ca
de
cérv
ix
Po
r 10
0,00
0 m
uj e
res
Po
r 10
0,00
0 m
uj e
res
20
40
60
80
100
120
0
14 18 22 26 30 34 38 42 46 50
54 666258
EDAD (AÑOS)EDAD (AÑOS)
VVAACCUUNNAACCIIOONN
Sin Sin VacunaciónVacunación
50% 50%
75% 75%
98% 98%
Tipos de VPH: 16, 18, 31, 33 ,45, 52,58 6, 11
