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I
UNIVERSIDAD DE SANTANDER FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
MAESTRÍA EN INVESTIGACIÓN EN ENFERMEDADES INFECCIOSAS
Detección de agentes virales diarreagénicos en niños menores de cinco años en
Bucaramanga y su área metropolitana
Nayibe Tatiana Sanchez Alvarez
Proyecto de Maestría presentado al
Programa de Maestría en Investigación
en Enfermedades Infecciosas de la
Facultad de Ciencias de la Salud de la
Universidad, como parte de los requisitos
para la obtención del título de Magíster en
Investigación en Enfermedades
Infecciosas.
BUCARAMANGA
II
Nayibe Tatiana Sanchez Alvarez
Detección de agentes virales diarreagénicos en niños menores de cinco años en
Bucaramanga y su área metropolitana
Tutora: Dra. M.Sc. Ana Elvira Farfán García
Co-Tutor: Dr. MD, PhD. Oscar G. Gómez-Duarte.
BUCARAMANGA
2016
III
IV
______________________________________
Tutora
Dra. M.Sc. Ana Elvira Farfán García
V
______________________________________
Co-Tutor
Dr. MD, PhD. Oscar G. Gómez-Duarte
VI
Solo podemos ver poco del futuro, pero lo
suficiente para darnos cuente que hay mucho por
hacer.
Alan Turing.
VII
Dedicatoria….
Esta tesis la dedico con todo mi amor y cariño a mi familia Esperanza
Alvarez, Cristian Sánchez y mi novio Haiver Navarro, por sus sacrificios y
esfuerzos, me brindaron el apoyo incondicional, creyeron en mis
capacidades para hacer este sueño realidad.
Gracias a todos.
VIII
AGRADECIMENTOS
De ante mano quisiera dar mis sinceros agradecimientos a Dios por permitirme iniciar y
finalizar esta etapa de mi vida, a mis padres que desde que inicie mi carrera investigativa
han dado lo mejor de ellos para servirme de apoyo.
A mis tutores la Dra. Ana Elvira Farfán García y al Dr. Oscar Gómez Duarte, que creyeron
en mis capacidades y habilidades, brindándome todo el soporte e inspiración durante el
proceso. A ellos que crearon en mí una semilla de seriedad, responsabilidad, y amor por
la ciencia.
Mis más gratos agradecimientos al programa de Maestría en Investigación en
Enfermedades infecciosas de la Universidad de Santander UDES y a la directora, la Dra.
Liliana Torcoroma García, por su acompañamiento incondicional durante este proceso.
A la Universidad de Santander y la Universidad de Vanderbilt por permitirme hacer parte
de ella en la culminación con éxito de mis pasantías las que me hicieron crecer personal y
profesionalmente.
A Colciencias y a la UDES, por financiar mí propuesta de joven investigador, dirigida por
la Dra. Ana Elvira Farfán García.
IX
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Países con la mayor morbimortalidad de diarrea a nivel mundial. Reporte de
diarrea 2012, OMS. ............................................................................................................ 1
Figura 2. Evolución de las tasas de mortalidad por EDA en Colombia durante 1998 a 2014,
en niños < 5 años. ............................................................................................................... 2
Figura 3. Tasas de mortalidad por EDA en menores de cinco años por 100.000 menores
de cinco años, según departamentos. Colombia, 2010....................................................... 3
Figura 4. Estructura del virus Norwalk, Norovirus. ........................................................... 6
Figura 5. Replicación viral de norovirus.. .......................................................................... 8
Figura 6. Organización genómica de rotavirus. ............................................................... 11
Figura 7. Ciclo de replicación de rotavirus.. .................................................................... 12
Figura 8. Organización genómica de sapovirus.. ............................................................. 14
Figura 9. Organización genómica de Astrovirus.............................................................. 16
Figura 10. Ciclo de replicación viral de astrovirus.. ........................................................ 17
Figura 11. Organización genómica de adenovirus.. ......................................................... 18
Figura 12. Unión del virión de adenovirus con su receptor en la célula, para la entrada
celular.. ............................................................................................................................. 19
Figura 13 Metodología de clonación................................................................................ 33
Figura 14. Análisis filogenético de la secuencia de nucleótidos de norovirus GI.. ......... 60
Figura 15. Análisis filogenético de la secuencia de nucleótidos de norovirus GII. ......... 61
Figura 16. Análisis filogenético de la secuencia de nucleótidos de rotavirus.VP4.......... 63
Figura 17. Análisis filogenético de la secuencia de nucleótidos de rotavirus VP7.......... 64
X
Lista de Gráficos
Gráfica 1. Identificación de norovirus GI/GII, rotavirus, sapovirus, astrovirus y
adenovirus, durante los meses .......................................................................................... 45
Gráfico 2. Identificación de norovirus GI / GII, rotavirus, sapovirus, astrovirus y
adenovirus, durante los meses en los tres rangos de edad................................................ 52
Gráfico 3. Identificación de norovirus GI/GII, rotavirus, sapovirus, astrovirus y
adenovirus, durante los meses en el sexo femenino y masculino. ................................... 55
Gráfico 4. Infección única e identificación de norovirus GI/GII, rotavirus, sapovirus,
astrovirus y adenovirus en el sexo femenino y masculino. .............................................. 57
Gráfico 5. Coinfección e identificación de norovirus GI/GII, rotavirus, sapovirus,
astrovirus y adenovirus en el sexo femenino y masculino. .............................................. 58
Grafico 6. Identificación de norovirus GI/GII, rotavirus, sapovirus, astrovirus y
adenovirus en presencia de diarrea, disentería, vómito, fiebre, dolor abdominal en el sexo
femenino y masculino. ..................................................................................................... 68
Grafico 7. Identificación de norovirus GI/GII, rotavirus, sapovirus, astrovirus y
adenovirus en presencia de diarrea, disentería, vomito, fiebre, dolor abdominal en los tres
rangos de edad. ................................................................................................................. 69
XI
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Clasificación de NoV en 7 genotipos, basados en la secuencia de aminoácidos de
la proteína de la cápside VP1. ............................................................................................ 6
Tabla 2. Reactivos para la PCR múltiple por RT-qPCR para detección de
sapovirus/astrovirus, norovirus GI/GII y qPCR para adenovirus. ................................... 27
Tabla 3. Primers y condiciones amplificación de la PCR múltiple por RT-qPCR para la
detección del ARN y ADN viral (Protocolo del CDC Atlanta, Chhabra Preeti (2013). .. 28
Tabla 4. Componentes de reacción de transcriptasa reversa Norovirus (NovGI, NovGII).
.......................................................................................................................................... 30
Tabla 5. Condiciones del ciclado para la PCR transcriptasa reversa ............................... 30
Tabla 6. Primers usados para la identificación de la región C del gen de la cápside viral,
según protocolo establecido por Kojima et al., 2002. ...................................................... 31
Tabla 7. PCR Master mix ................................................................................................. 31
Tabla 8. Condiciones del ciclado PCR convencional ...................................................... 32
Tabla 9. Condiciones para la ligación de ADN en vectores PGEM ................................ 33
Tabla 10 Genes de la región C de la cápside de referencia de norovirus GI y GII. ......... 35
Tabla 11. Oligonucleótidos primers para la identificación de los genes VP4 y VP7, según
protocolo establecido por Aly et al., 2015. ...................................................................... 37
Tabla 12. Condiciones del ciclado VP4 ........................................................................... 38
Tabla 13. Condiciones del ciclado VP7 ........................................................................... 38
Tabla 14. Genes VP4 / VP7 referencia de rotavirus. ....................................................... 38
Tabla 15. Datos sociodemográficos y factores de riesgo para EDA en la población de
estudio .............................................................................................................................. 40
Tabla 16. Proporción de infecciones por virus entéricos mediante ensayos moleculares y
ELISA en casos y controles. ............................................................................................ 43
Tabla 17. Proporción de coinfecciones por virus entéricos. ........................................... 55
Tabla 18. Proporción de coinfecciones por virus entéricos según rangos de edad .......... 56
Tabla 19 Clasificación de rotavirus detectados según programa RotaC 2.0, de acuerdo a
cada una de las secuencias de las proteínas VP4 y VP7 .................................................. 65
Tabla 20 Tabla resúmen de los genotipos identificados mediante la base de datos del
RotaC 2.0 ........................................................................................................................... 65
Tabla 21 Resumen de los genotipos de la proteína VP4 mediante la base de datos GenBank
.......................................................................................................................................... 66
Tabla 22 Resumen de los genotipos de la proteína VP7 mediante la base de datos GenBank
.......................................................................................................................................... 66
Tabla 23. Distribución de virus identificados por sexo en casos y controles .................. 67
Tabla 24 Distribución de virus identificados por grupos de edad en casos y controles ... 67
Tabla 25 Proporción de diarrea, diarrea sanguinolenta (disentería), vómito y dolor
abdominal en casos de EDA con infección por virus diarreagénicos ............................. 70
XII
LISTA DE ABREVIATURAS
aa: aminoácidos
Ad40: adenovirus tipo 40
Ad41: adenovirus tipo 41
ADN: Ácido desoxirribonucleico
AL: aglutinación en látex
ARN: Ácido ribonucleico
BHQ: quencher Blackhole
Cp: punto de corte
Ct: Cycle Threshold
DEPC: Dietilpirocarbonato
dsRNA: RNA de doble cadena
EDA: Enfermedad Diarreica Aguda
EIA: inmunoanálisis enzimático
ELISA: Inmunoensayo Enzimático (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)
ER: retículo endoplásmico
FAM: 6-carboxyfluoreceina
G: genogrupos
G: Gamma
HAstV: Astrovirus humanos
HBGA: antígenos de grupo histosanguíneo
Hsc70: Proteinas de choque termico
XIII
IC: inmunocromatografía
K2: parámetros de kimura
LB: medio Luria Bertani
LAMP: Amplificación isotérmica mediada por bucles
LIBB: Laboratorio de Investigaciones Biomédicas y Biotecnológicas
ME: microscopía electrónica
NASBA: amplificación basada en secuencias de ácido nucleico
NIH: National Institute of Health
NoVGI: Norovirus GI
NoVGII: Norovirus GII
ORF: marcos de lectura abiertos
Pb: Pares de bases
PCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa
RT: Transcriptasa Reversa
RoV: Rotavirus
RoVA: Rotavirus grupo A
RT-PCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa transcriptasa reversa
RT-qPCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa transcriptasa reversa en tiempo real
SaV: Sapovirus
T92: Tamura de los 3 parametros
UDES: Universidad de Santander
XIV
TABLA DE CONTENIDO
INTRODUCCIÓN ....................................................................................................... 1
1. MARCO TEÓRICO ............................................................................................. 1
1.1 Enfermedad Diarreica Aguda ...................................................................... 1
1.2 Carga de la Enfermedad Diarreica Aguda (EDA) a nivel global ................ 1
1.3 Epidemiología de EDA en Colombia .......................................................... 2
1.4 Agentes causantes de EDA .......................................................................... 5
1.4.1 Norovirus - NoV ........................................................................................ 5
1.4.1.1 Historia ................................................................................................... 5
1.4.1.2 Biología y taxonomía ............................................................................. 5
1.4.1.3 Replicación viral o ciclo biológico ................................................... 7
1.4.1.4 Epidemiología .................................................................................. 8
1.4.1.5 Formas de transmisión ...................................................................... 9
1.4.1.6 Aspectos clínicos y complicaciones ....................................................... 9
1.4.2 Rotavirus .................................................................................................. 10
1.4.2.1 Historia ................................................................................................. 10
1.4.2.2 Biología y taxonomía .......................................................................... 10
1.4.2.3 Replicación viral o ciclo biológico ...................................................... 11
1.4.2.4 Epidemiología ...................................................................................... 12
1.4.2.5 Formas de transmisión ......................................................................... 13
1.4.2.6 Aspectos clínicos y complicaciones ..................................................... 13
1.4.3 Sapovirus ................................................................................................. 13
1.4.3.1 Historia ................................................................................................. 13
1.4.3.2 Biología y taxonomía ........................................................................... 13
1.4.3.3 Replicación viral o ciclo biológico ...................................................... 14
1.4.3.4 Epidemiología ...................................................................................... 14
1.4.3.5 Formas de transmisión .................................................................... 15
1.4.3.6 Aspectos clínicos y complicaciones ............................................... 15
1.4.4. Astrovirus ............................................................................................... 15
1.4.4.1 Historia ................................................................................................. 15
1.4.4.2 Biología y taxonomía ........................................................................... 15
1.4.4.3 Replicación viral o ciclo biológico ...................................................... 16
1.4.4.4 Epidemiología ...................................................................................... 17
1.4.4.5 Formas de transmisión ......................................................................... 17
1.4.4.6. Aspectos clínicos y complicaciones .................................................... 18
1.4.5 Adenovirus entéricos ............................................................................... 18
1.4.5.1 Historia ................................................................................................. 18
1.4.5.2 Biología y taxonomía ........................................................................... 18
1.4.5.3 Replicación viral o ciclo biológico ...................................................... 19
1.4.5.4 Epidemiología ...................................................................................... 19
1.4.5.5 Formas de transmisión ......................................................................... 20
1.4.5.6 Aspectos clínicos y complicaciones ..................................................... 20
XV
1.5 Diagnóstico de agentes virales diarreagénicos. .............................................. 20
1.5.1 Técnicas directas: microscopía electrónica, Detección de antígenos por
inmunoensayos y aglutinación. ........................................................................ 20
1.5.2 Detección del genoma viral ..................................................................... 20
1.5.2.1. Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) ..................................... 21
1.5.2.3 Reacción en Cadena de la Polimerasa transcriptasa inversa (RT-PCR)21
1.5.2.4 Reacción en Cadena de la Polimerasa transcriptasa reversa en tiempo real (RT-
qPCR) ............................................................................................................... 22
1.5.2.5 Otras técnicas ....................................................................................... 22
2. OBJETIVOS ....................................................................................................... 24
2.1 OBJETIVO GENERAL ............................................................................ 24
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................... 24
3. MATERIALES Y MÉTODOS .............................................................................. 25
3.1 Tipo de estudio .......................................................................................... 25
3.2 Área geográfica ......................................................................................... 25
3.3 Universo .................................................................................................... 25
3.4 Población ................................................................................................... 25
3.5 Muestra ...................................................................................................... 25
3.6 Material biológico ..................................................................................... 25
3.7 Procedimientos .......................................................................................... 26
3.7.1 Extracción de ARN viral ......................................................................... 26
3.7.2 Extracción de ADN viral ......................................................................... 26
3.7.3 Reacción en Cadena de la Polimerasa Transcripción Reversa en Tiempo Real
(RT-qPCR) múltiple ......................................................................................... 27
3.7.4 Interpretación de resultados de RT-qPCR ............................................... 29
3.7.5 Secuenciación de cADN de Norovirus .................................................... 29
3.7.5.1 Protocolo de Transcripción Reversa (RT) del ARN de Norovirus GI/GII
30
3.7.5.2 Purificación del producto de PCR .................................................. 31
3.7.5.3 Polymerase Chain Reaction (PCR) convencional de la región C .. 31
3.7.5.4 Análisis de secuenciación y construcción del árbol filogenético ... 32
3.7.5.5 Protocolo de clonación ................................................................... 32
3.7.5.5.1 Purificación del producto de PCR. ............................................. 33
3.7.5.5.2 Ligación en el vector p-GEM ..................................................... 33
3.7.5.5.3 Transformación. .......................................................................... 34
3.7.6 Extracción del plásmido .......................................................................... 34
3.7.7. Árbol filogenético norovirus .............................................................. 35
3.7.8 Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) para la identificación de
Rotavirus .......................................................................................................... 36
3.7.8.1 PCR para la identificación y posterior secuenciación de rotavirus ...... 37
3.8 ASPECTOS ÉTICOS ................................................................................ 39
3.9 ANÁLISIS DE DATOS ............................................................................ 39
4. RESULTADOS .................................................................................................. 40
4.1. Datos sociodemográficos y factores de riesgo .............................................. 40
4.2. Estudio viral .................................................................................................. 42
XVI
4.2.1. Proporción de agentes virales ................................................................ 42
4.2.2. Detección viral en meses del año entre casos y controles ...................... 43
4.2.3 Detección viral entre casos y controles por rangos de edad y durante los meses
de estudio ......................................................................................................... 46
4.2.4 Detección viral en meses del año por sexo entre casos y controles ........ 52
4.2.5 Coinfecciones virales en casos y controles .............................................. 55
4.3 Filogenia de aislados de norovirus GI y norovirus GII ............................. 58
4.4. Filogenia de aislados de rotavirus ................................................................. 62
4.4.1 Comparación del análisis filogenético de las proteína VP4/VP7 de rotavirus
65
4.5 Factores demográficos implicados en EDA de etiología viral ....................... 66
5. DISCUSIÓN ....................................................................................................... 71
6. CONCLUSIONES ................................................................................................. 77
7. REFERENCIAS ..................................................................................................... 79
8. ANEXOS .............................................................................................................. 100
XVII
RESUMEN
Introducción: La enfermedad diarreica aguda (EDA), presenta mayor prevalencia en
niños menores de cinco años. Puede estar causada por bacterias, parásitos y/o
principalmente virus. El diagnóstico de infecciones virales gastrointestinales es limitado
por los altos costos en técnicas moleculares y el desconocimiento del personal de salud
sobre su importancia clínica. Los estudios reportados de estas infecciones en Colombia
son escasos. Objetivo: Identificar la frecuencia de agentes virales asociados a EDA y
caracterizar a nivel filogenético los dos agentes virales más frecuentes. Materiales y
métodos: A partir del material biológico colectado de un estudio previo de casos y
controles de 405 niños con EDA y 405 controles, se realizó un estudio analítico. Las
muestras de heces se procesaron por métodos moleculares para la detección de adenovirus,
norovirus, sapovirus, astrovirus y rotavirus. Adicionalmente, ELISA directo fue usada
para la detección de antígenos de rotavirus. El análisis filogenético fue realizado para
norovirus y rotavirus mediante la amplificación de genes blanco de los fragmentos de la
región C de la cápside y las proteínas VP4 y VP7, respectivamente. Resultados: Entre las
810 muestras se detectó positividad para virus en 30,1 %, 45,4 % en casos y 14,8 % en
controles. El virus más prevalente fue norovirus GII 10,9 %, seguido de rotavirus y
sapovirus con 5,1 % cada uno. Adenovirus, astrovirus y norovirus GI se detectaron en
porcentajes que variaron entre 1,7 y 3,8 %. La mayor frecuencia de virus se observó en
los rangos de edad de 12 a 23 meses y de 24 a 59 meses. Norovirus GII fue el más
prevalente en los casos con síntomas de diarrea y vómito en 93 y 88,8 % respectivamente.
Los genotipos de norovirus más frecuentes fueron GI.2 y GII.4 y los genotipos más
frecuentes de rotavirus fueron G12P8 y G9P8. Conclusiones: Se logró la identificación
de 6 virus en muestras de materia fecal de niños menores de cinco años. El agente viral
más frecuentemente aislado fue norovirus y el subtipo más importante fue norovirus GII.
Se demostró la importancia de los virus en la epidemiología de EDA y la alta diversidad
genética de los genotipos de norovirus y rotavirus en una población pediátrica de
Bucaramanga y su área metropolitana, Colombia.
XVIII
ABSTRACT
Introduction: acute diarrheal disease (ADD), the highest prevalence in children under
five. It can be caused by bacteria, parasites and / or viruses mainly. The diagnosis of
gastrointestinal viral infections is limited by the high costs of molecular techniques and
the lack of health personnel about its clinical importance. Reported studies of these
infections in Colombia are scarce. Objective: To identify the frequency of viral agents
associated EDA phylogenetic level and characterize the two most common viral agents.
Materials and Methods: From biological material collected from a previous case-control
study of 405 children with EDA and 405 controls, an analytical study. Stool samples were
processed by molecular methods for the detection of adenovirus, norovirus, sapovirus,
astrovirus and rotavirus. Additionally, direct ELISA was used for the detection of
rotavirus antigen. Phylogenetic analysis was performed to norovirus and rotavirus by
amplifying target gene fragment C region capsid proteins VP4 and VP7 and respectively.
Results: Among the 810 samples positive for the virus was detected in 30,1%, 45,4% in
cases and 14,8% in controls. The most prevalent virus norovirus GII was 10,9%, followed
by rotavirus and sapovirus with 5,1% each. Adenovirus, astrovirus and norovirus GI were
detected in percentages ranging from 1,7 to 3,8%. The highest frequency of virus was
observed in the age ranges of 12 to 23 months and 24-59 months. GII Norovirus was the
most prevalent in cases with symptoms of diarrhea and vomiting in 93 and 88,8%
respectively. The most common norovirus genotypes were GI.2 and GII.4 and the most
common rotavirus genotypes were G12P8 and G9P8. Conclusions: 6 virus identification
was achieved in stool samples of children under five years. The most frequently isolated
viral agent was norovirus and most important subtype was norovirus GII. The importance
of virus in the epidemiology of EDA and high genetic diversity of genotypes of norovirus
and rotavirus in a pediatric population of Bucaramanga and its metropolitan area,
Colombia was demonstrated.
Introducción
1
INTRODUCCIÓN
La enfermedad diarreica aguda (EDA) es considerada un problema en salud pública
que afecta a todos los grupos de edad. Se ha convertido en la principal causa de
consulta en países en vías de desarrollo, observándose una alta prevalencia en niños
menores de 5 años (Kosek et al., 2003; Kotloff et al., 2013; Ahmed et al., 2014; Walker
et al., 2012; Lim et al., 2016).
Las enfermedades gastrointestinales infecciosas son causadas por bacterias entre el 20
al 30% y más del 75 % son de etiología viral (Sidoti et al., 2015; Webb & Starr 2005;
Clark et al., 2004). Los patógenos virales más asociados a EDA en niños menores de
2 años son rotavirus con una prevalencia entre 30 y 50 %, adenovirus del 5 al 20 %.
En menores de 5 años se identifica con una frecuencia entre 10 y 38% y 1 a 4%,
norovirus y astrovirus, respectivamente (Liu et al., 2011; Clark et al., 2004).
Sin embargo, otros virus menos identificados como aichivirus, parechovirus,
enterovirus y bocavirus humano han sido considerados agentes productores de diarrea
en humanos (Chhabra et al., 2013; Khamrin et al., 2011; Sidoti et al., 2015; Stanway
et al., 2000; Pang et al., 2005; Reuter et al., 2009; Chow et al., 2010).
Desde 1972, cuando fue identificado el primer agente causal de gastroenteritis
(Kapikian et al., 1972), diferentes técnicas de identificación como microscopía
electrónica (ME), cultivo celular, aglutinación en látex (AL), inmunoanálisis
enzimático (EIA) y técnicas moleculares, se han implementado para la identificación
de los agentes virales causantes de EDA. El cultivo celular, aunque es la técnica
estándar de oro para la identificación viral, presenta una gran desventaja por ser
dispendiosa, costosa y no todos los laboratorios cuentan con infraestructura y recursos
necesarios para su realización (Logan et al., 2006; Kapikian et al., 1972).
Las técnicas moleculares son muy sensibles y requieren de 101 a 103 partículas
virales/gramo de materia fecal (Bellido et al., 2007; Logan et al., 2006; Svraka et al.,
2010; Bon et al., 1999; Chikhi et al., 2002; Yan et al., 2004), por lo que son empleadas
con fines diagnósticos por los laboratorios altamente especializados o de investigación.
Sin embargo, no han sido empleadas con frecuencia en todos los laboratorios por las
mismas limitaciones que presenta la técnica estándar de oro.
La EDA en Colombia, contínua siendo una enfermedad común que ocupa los primeros
lugares de morbimortalidad en niños menores de cinco años (Manrique et al., 2006).
La tasa de mortalidad por EDA es de 22,6 casos por 1.000.000 habitantes menores de
cinco años (Boletín epidemiológico, semana 37, SIVIGILA, 2015).
En Colombia son muy escasos los estudios que se han llevado a cabo para la
identificación de virus diarreagénicos, los principales están enfocados en la detección
de rotavirus como agente viral causante de EDA, destacándose que este agente es
inmunoprevenible, a diferencia de los otros patógenos implicados en esta enfermedad
(Urbina et al., 2003, 2004; Urbina et al., 2008; Fernández el at., 2015; Cáceres et al.,
2006; Solano et al., 2012).
Introducción
2
El diagnóstico viral de EDA en la región de Santander, ha sido limitado, debido a los
altos costos de las técnicas usadas, al desconocimiento por parte del equipo de salud
de los diversos virus que causan diarrea, a la inadecuada recolección y manejo de las
muestras para el diagnóstico. Entre otras, estas son causas que no permiten determinar
con exactitud la prevalencia de estos virus en la región (Gutiérrez et al., 2005). De otro
lado, el diagnóstico se enfoca en agentes etiológicos de tipo parasitario y bacteriano,
sin tener en cuenta el análisis viral (Beersma, 2012; Sidoti et al., 2015).
En Santander, existen pocos informes epidemiológicos sobre EDA y escasos estudios
completos reportados que muestren la prevalencia de los agentes etiológicos
(bacterianos, parasitarios o virales), al igual que los factores de riesgo en la población
más vulnerable (niños menores de 5 años) (Yepes et al., 2009). La información
disponible corresponde a lo notificado por el SIVIGILA.
Teniendo en cuenta los antecedentes de esta enfermedad en la población menor de
cinco años, se planteó este estudio con el objetivo de identificar mediante técnicas de
biología molecular e inmunológicas agentes virales diarreagénicos (norovirus GI/GII,
sapovirus, astrovirus, adenovirus y rotavirus) en dos grupos (niños con EDA (casos) y
sin EDA (controles)) de niños menores de cinco años de Bucaramanga y su área
metropolitana.
Marco Teórico
1
1. MARCO TEÓRICO
1.1 Enfermedad Diarreica Aguda
La Organización Mundial de la Salud (OMS) define la diarrea como la presencia de 3 o
más episodios de heces blandas o líquidas en 24 horas (OMS, 2015; CDC, 2015). Se
considera una alteración de la motilidad intestinal caracterizada por un aumento en el
contenido de agua, volumen o frecuencia de las heces (Chow et al., 2010). Las principales
manifestaciones clínicas de esta enfermedad son diarrea aguda, moderada o severa con o
sin vómitos, acompañada de dolor abdominal, dolor de cabeza, fiebre y escalofríos
(Hernández et al., 2011), pudiendo llegar a deshidratación y finalmente en casos extremos
a la muerte (OMS).
1.2 Carga de la Enfermedad Diarreica Aguda (EDA) a
nivel global
A nivel mundial, la EDA es considerada la segunda causa de muerte en niños menores de
cinco años. Se atribuye que una de cada diez muertes en este grupo de edad es por esta
enfermedad, dando como resultado aproximadamente 800.000 muertes al año en países en
desarrollo, la mayoría ocurridos en África subsahariana y el sur de Asia (Kotloff et al.,
2013; Ahmed et al., 2014), contrario a los países industrializados, en donde el número de
muertes por esta enfermedad es de aproximadamente 300 por año (Chow et al., 2010).
Adicionalmente, cada año se presentan 1700 millones de casos (OMS, 2016) (Figura 1).
Figura 1. Países con la mayor morbimortalidad de diarrea a nivel mundial. Reporte de diarrea 2012, OMS.
Color azul, Afganistán, Angola, China, República Democrática del Congo, Etiopía, India, Mali, Pakistán,
Nigeria, y Sudán.
Fuente: Who.int. (2016). WHO | Ending preventable deaths from pneumonia and diarrhoea by 2025. [online]
Available at: http://www.who.int/maternal_child_adolescent/news_events/news/2013/gappd_launch/en/
[Accessed 3 Oct. 2016].
Marco Teórico
2
1.3 Epidemiología de EDA en Colombia
En Colombia, la EDA ocupa los primeros lugares de morbimortalidad en niños menores de
cinco años (Manrique et al., 2006). Aunque es una enfermedad prevenible y a pesar que
desde los últimos 20 años las muertes por esta causa han disminuido, aún sigue cobrando
vidas dentro de la población infantil. Las tasas de mortalidad entre los años 1998 y 2014
han disminuido pasando de 33,8 a 3,11 muertes por 100.000 niños menores de cinco años
(Castillo et al., 2014; Así vamos en Salud, 2016) (Figura 2).
Figura 2. Evolución de las tasas de mortalidad por EDA en Colombia durante 1998 a 2014, en niños < 5
años.
Fuente: https://www.asivamosensalud.org/inidicadores/estado-de-salud/grafica.ver/12
Un reporte generado en el año 2010 de las tasas de mortalidad en niños menores de 5 años
por EDA en Colombia, muestra que los departamentos con las tasas más altas en el país
son Vaupés con 43,7% seguido de Guainía con 10,4%. Casanare y San Andrés Islas en este
año no habían reportado casos de mortalidad por EDA en menores de cinco años. Sin
embargo, es importante anotar que durante el presente año la principal entidad territorial
que ha notificado el mayor número de casos de EDA en niños menores de cinco años ha
sido la Guajira con un 14,4% (Sivigila, 2016). En Santander, se observa una tasa de
mortalidad por EDA de menos de 13.00 por 100.000 menores (Figura 3).
33,8
21,8 22,9
16,7
20,1 20,4
16,3
13,311,5 11,7
8,27,3
5,23,7 3,5 3,4 3,1
0
5
10
15
20
25
30
35
40
1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014
Tasa
de
Mort
ali
da
d d
e E
DA
< 5
añ
os
Año
Marco Teórico
3
Figura 3. Tasas de mortalidad por EDA en menores de cinco años por 100.000 menores de cinco años,
según departamentos. Colombia, 2010. Fuente: Ministerio de salud y protección social dirección de
epidemiología y demografía grupo ASIS, 2013.
Los pocos estudios realizados en nuestro país se han centrado en la identificación de
algunos agentes virales en especial rotavirus tipo A como agente causal de EDA en niños
menores de 5 años. La cronología de algunos estudios enfocados en la identificación de
agentes virales en Colombia han sido reportados desde 1982 con la identificación de
rotavirus en 48% de los niños con EDA grave y 36% con EDA moderada en muestras
seleccionadas de 75 niños de la ciudad de Medellín (Trujillo el at., 1985).
En las ciudades de Cartagena y Sincelejo, durante marzo de 1998 a julio del 2000, rotavirus
tipo A fue identificado en 36,6% como el principal agente causante de EDA, 44,2% en
Cartagena y 28,3% en Sincelejo, seguido de Salmonella 9,0%, Shigella 8,0%, E. coli 6,0%
entre otros agentes bacterianos y parasitarios (Urbina et al., 2003).
En un trabajo realizado en el 2004 se genotipificó rotavirus en 67,9% de las muestras
positivas. Los resultados de la secuenciación de la proteína VP7, mostró el genotipo G1
como el más prevalente con 57,9%, seguido de G3 (21,1%), G9 (15,8%) y G2 (5,3%). Los
genotipos P basados en la proteína VP4 fueron, P[4], P[6], P[8] en 49,1%, 36,4% y 14,5%,
respectivamente. Las combinaciones más comunes entre G y P fueron G3P[4] (8,8%) y
G9P[6] (7,0%), seguido de G1P[4] y G1P[8] (con 5,3% cada uno). Este estudio evidenció
una marcada diversidad en las cepas recolectadas (Urbina et al., 2004).
En Bogotá, con el fin de establecer la relación entre las infecciones causadas por rotavirus
y la deshidratación por diarrea en niños menores de cinco años, se llevó a cabo un estudio
durante el período de abril del año 2000 a febrero del 2001. Se observó asociación
Marco Teórico
4
estadísticamente significativa entre la diarrea, la deshidratación y la presencia de rotavirus.
43% de las 290 muestras de materia fecal fueron positivas para este agente (Cáceres et al.,
2005).
En la misma época, entre los años 1996 y 2002 con el objetivo de determinar el
comportamiento de astrovirus como agente causal de diarrea en las ciudades de Bogotá,
Facatativá, Cartagena y Quibdó en niños menores de cinco años, se determinó baja
prevalencia de este virus (2,8%). Las muestras positivas genotipificadas no evidenciaron
ningún cambio evolutivo en su genoma, comparado con cepas de otros países, lo que
sugiere que han sido cepas conservadas en los últimos tiempos (Gutiérrez et al., 2005).
En el año 2004, se determinó la prevalencia y los tipos de agentes infecciosos causantes de
EDA en niños menores de cinco años que consultaron a la IPS de Tunja, Boyacá,
considerándose como agente causal rotavirus con 48,1% comparado con agentes
bacterianos y parasitarios (Manrique et al., 2006).
En tres regiones Colombianas (región Andina, Costa Atlántica y el Oeste del Pacífico) entre
los años 1984 a 2006, se realizó una revisión sistemática de 23 estudios con el fin de
determinar la frecuencia de virus como causa de EDA. Rotavirus fue identificado con
mayor frecuencia (35,2%), Calicivirus en 10,4% solo fue identificado en la ciudad de
Facatativá durante 1999 al 2000 y en Quibdó entre del año 2000 al 2003. Adenovirus y
astrovirus se identificaron en 2,7% y 1,35%, respectivamente, en Bogotá, Facatativá,
Cartagena y Quibdó (Urbina et al., 2008).
En la ciudad de Bucaramanga, en los meses de septiembre a octubre del 2006 se determinó
la prevalencia de los agentes patógenos comunes asociados con EDA en niños menores de
cinco años, que eran atendidos en los servicios de urgencias de instituciones de salud,
evidenciándose rotavirus en 44 % con respecto a los otros agentes, lo cual indica que es
fundamental su identificación en esta región (Yepes et al., 2009).
En el año 2015 se determinó la prevalencia de rotavirus y norovirus en dos regiones de
Colombia. En el Chocó se identificó 8% de norovirus y 6 % de rotavirus, menor que en
Cundinamarca con 9,7 % para el último y 9 % para el primero. Estos datos sugieren
diferencias en la distribución de norovirus, lo cual podría ser explicado por patrones de
estacionalidad, población vulnerable y a las diferentes técnicas de identificación empleadas
(Fernández et al., 2015).
Actualmente y según reporte del SIVIGILA, en el boletín epidemiológico de la semana 37
del año 2016, han ingresado 98 casos probables de muerte por EDA en menores de cinco
años, 55 han sido confirmados y 43 se encuentran en estudio para su clasificación final y
definición de la causa de muerte (Sivigila, Instituto Nacional de Salud Colombia).
El número de casos de muertes en Colombia varía desde 1 en el departamento de Sucre
hasta 14 en la Guajira, siendo esta la región con el máximo de casos reportados. La
incidencia más alta de EDA se registró en el sexo femenino con 56,1% y en menores de un
año con 56,1% (Sivigila, 2016).
Marco Teórico
5
1.4 Agentes causantes de EDA
La frecuencia de los agentes etiológicos de la EDA varían de acuerdo al país, región o
comunidad, cambios climáticos, rangos de edad, tipo y sensibilidad de las técnicas
empleadas para su diagnóstico (Manrique et al., 2006). Los parásitos Giardia lamblia,
Cryptosporidium y Entamoeba histolytica son los que presentan aproximadamente el 10%
de relevancia en los casos de gastroenteritis (Chow et al., 2010; Elliott, 2007; Kotloff et al.,
2013; Panchalingam et al., 2012). La diarrea causada por bacterias varía entre 10 al 20%,
los agentes bacterianos más comunes son Salmonella spp, Shigella spp, patotipos de E.
coli, Campylobacter, Yersinia spp (Caracciolo et al., 2007).
Los virus son responsables de aproximadamente el 75% de los cuadros diarreicos en niños
menores de cinco años (Khamrin et al., 2011; Andreasi et al., 2008; Jakab et al., 2005;
Sidoti et al., 2015; Webb & Starr 2005; Elliot, 2007). Existen más de 20 tipos de virus que
causan diarrea acuosa en humanos (Andreasi et al., 2008; Wilhelmi et al., 2003). Los
grupos virales más importantes incluyen virus ARN: rotavirus del grupo A, norovirus,
astrovirus y sapovirus y un virus ADN: adenovirus entérico tipo 40/41 (Chhabra et al.,
2013; Gallimore et al., 2004; Bon et al., 1999; Chikhi-Brachet et al., 2002; Clark and
McKendrick, 2004; Heatley et al., 1988).
1.4.1Norovirus - NoV
1.4.1.1 Historia
En 1929, Zahorsky describió por primera vez la "hemis hiperémesis" o "enfermedad de
vómitos de invierno", como una enfermedad caracterizada por la aparición de vómitos y
diarrea, que por lo general alcanzaba su punto máximo durante los meses más fríos (Patel
et al., 2009).
En 1972, se descubrieron partículas virales de aproximadamente 27 nm de diámetro
llamadas norovirus, mediante el uso de la microscopía inmunoelectrónica (IEM) en un
filtrado de heces de un brote de gastroenteritis infecciosa aguda no bacteriana en Norwalk,
Ohio, Estados Unidos. De forma natural y experimental, se demostró que el agente tenía la
capacidad para inducir enfermedad en voluntarios humanos (Kapikian et al., 1972).
Posteriormente, en 1990 el genoma de NoV fue clonado y caracterizado. Se identificó su
ácido ribonucleico (ARN) monocatenario de sentido positivo de aproximadamente 7,6 kb
(Kapikian et al., 1972).
1.4.1.2 Biología y taxonomía
El genoma de NoV está organizado en tres marcos de lectura abiertos (ORF). El ORF1 en
el extremo 5´ codifica para una poliproteína no estructural grande de 1738 aminoácidos
(aa) con un peso molecular de 193,5 (193.5K). Esta poliproteína se escinde en motivos
cortos identificados como 2C (helicasa), 3A, 3B o VPg, 3C (Cisteína proteasa), 3D (ARN-
polimerasa dependiente de ARN) y p48. Estas proteínas están implicadas en la replicación
viral.
Marco Teórico
6
El segundo marco de lectura, ORF2, codifica una proteína de 530 aa (56,6k) denominada
proteína mayor de la cápside (VP1). Esta proteína forma dos dominios el P (Protruding,
por hacer parte de la porción más externa, a su vez, presentan dos subdominios el P1 y el
P2), blancos para la genotipificación y S (Shell, ubicado en la porción interna de la cápside)
(Figura 4).
Figura 4. Estructura del virus Norwalk, Norovirus. A. estructura de la cápside icosahédrica. El color amarillo
muestra el dominio P2, el rojo el dominio P1 y el azul el domino de la corteza. B. Genoma con los 3 ORF y
cada una de las proteínas que codifican. Modificada de Glass et al., 2009.
La mayoría de las interacciones celulares y las características de reconocimiento
inmunológico se dan en el subdominio P2, el cual es principalmente reconocido por los
antígenos del grupo histosanguíneo (HBGA, del inglés histo-blood group antigens),
considerado como un receptor y factor de susceptibilidad del huésped para la infección. A
su vez, cada virus tiene su receptor celular para el proceso de infección.
De acuerdo a la información de las secuencias del gen POL en el ORF1 o el gen VP1 del
ORF2 (Vinjé at al., 2003), NoV se divide en siete genogrupos (G), de los cuales GI, GII y
GIV afectan a humanos. Dentro de estos genogrupos, existen diversos genotipos (Tabla 1)
(Vinjé et al., 2015).
Tabla 1. Clasificación de NoV en 7 genotipos, basados en la secuencia de aminoácidos de la proteína de la
cápside VP1.
Genogrupo Genotipo
Región C Área geográfica Fuente Referencias
GI GI.1–GI.9
Taiwan, Grecee,
China, Australia,
Japan:Miyagi, Italia,
áfrica del sur,
España, Finlandia,
Brasil, Singapur
Materia fecal de
humano, Aguas
residuales, ríos.
Comidas.
Wu et al., 2016;
Siafakas 2016; Lim et
al., 2016; Kazamaet al.,
2016, Pavoni et al.,
2014, Mans et al.,
2016, Fernandez-
Marco Teórico
7
Jiménez et al., 2016,
Huu et al., 2016,
Teixeira et al., 2015,
Neo et al., 2016,
GII GII.1–GII.22
Korea del sur,
Ethiopia, Cameroon,
China, Brazil,
Mexico, Russia,
Paraguay,USA,
Vietnam
Materia fecal de
Humano – Porcino,
aguas residuales.
Koo et al., 2016, Sisay
et al., 2016; Li et al.,
2016; de Andrade
Et al., 2014; Ajami
Et al., 2016;
Zhirakovskaia
Et al., 2015, Galeano et
al., 2013, Park et al.,
2016; Tra My
Et al., 2014.
GIII GIII.1–GIII.3 Irán, Egipto Materia fecal de
bovino
Pourasgari et al., 2015;
Mohamed et al., 2016;
GIV GIV.1–GIV.2 Brasil, Corea del sur,
USA, Costa Rica
Materia fecal de
humano,
Felino/Canino,
aguas residuales.
Teixeira et al., 2016;
Han et al., 2013;
Kitajima et al., 2016.
Pichardo et al., 2014.
GV GV.1–GV.2 USA Murinos Zhang et al., 2015;
GVI GVI.1–GVI.2 Japón, Italia Canino Takano et al., 2015;
Martella et al., 2012.
GVII GVII.1 Uruguay Aguas residuales Lizasoain et al., 2015.
La clasificación en genogrupos se realiza por secuenciación del producto obtenido
mediante RT-PCR de la secuencia genómica presente en el ORF1 y ORF2 (Vinje et al.,
2003).
1.4.1.3 Replicación viral o ciclo biológico
La infección depende de la presencia de HBGA. Los receptores HBGA son una familia
compleja de glucanos presentes en la superficie de células sanguíneas, en los epitelios
intestinales, respiratorios, secreciones biológicas, como la saliva y la leche, que actúan
como receptores para el virus en los hospedadores susceptibles (Ribes et al., 2010).
Adicionalmente, existen diferentes enzimas como la fucosiltransferasa 2 (FUT2, enzima
secretora), FUT3 (enzima Lewis) y las enzimas A y B implicadas en la síntesis de HBGAs.
Así, mutaciones en los genes que codifican estas enzimas pueden alterar la expresión de
HBGAs en la superficie de la mucosa que conllevan a la resistencia natural a la infección.
Principalmente la deficiencia de la enzima FUT2, hace que las personas que estén en
contacto con NoVGI.1, NoVGII.3 y la mayoría de NoVs GII.4 no se infecten (Lindesmith
et al., 2003; Donaldson et al., 2010)
NoV se une a los receptores celulares a través de un dominio específico de la proteína de
la cápside (región P2). Esa unión conlleva a la penetración del genoma al interior celular,
ya sea por la liberación directa desde la superficie o por la endocitosis de la partícula viral
y su posterior salida al citoplasma. Puesto que el genoma de NoV es un ARN de cadena
sencilla y de polaridad positiva, una vez que se localiza en el citoplasma celular puede
actuar como ARN mensajero y sintetizar las proteínas virales utilizando la maquinaria
traduccional celular (Ribes et al., 2010; Vinje et al., 2015) (Figura 5).
Marco Teórico
8
Figura 5. Replicación viral de norovirus. 1. Unión al factor de fijación. 2. Unión de la partícula viral al
receptor celular. 3. Entrada de la partícula viral. 4. Eliminación o pérdida de la cápside. 5. Traducción. 6.
Procesamiento de la poliproteína. 7. Formación de complejos de replicación. 8. Replicación del ARN. 9.
Ensamblaje del virión. 10. Salida de la partícula viral. Modificado de Thorne et al., 2014.
La incapacidad para cultivarse in vitro ha bloqueado la caracterización del ciclo de vida de
este agente viral (Thorne et al., 2014). Sin embargo, en el presente año se reportó un cultivo
de enterocitos infectados con NoV, en el que se necesita la bilis como factor para la
replicación del virus. La inadecuada expresión del antígeno del grupo histosanguíneo en
las células intestinales restringe la replicación del virus, pero aún así se requieren más
estudios que aborden esta temática (Ettayebi et al., 2016).
1.4.1.4 Epidemiología
NoVs han sido reconocidos como una de las más importantes causas de gastroenteritis
aguda no bacteriana en todos los grupos de edad a nivel mundial (Gómez et al., 2012; Patel
et al., 2009). Es el responsable del 90 % de las gastroenteritis virales y por lo menos del
50% de todos los brotes de gastroenteritis a nivel mundial en recintos cerrados como
ancianatos, cruceros, guarderías, entre otros. Sin embargo, la prevalencia de este agente es
raramente registrada en los países en vías de desarrollo (Hall et al., 2011; Widdowson,
2005). Se conoce que NoVs son la causa de 900.000 episodios de gastroenteritis, 64.000
hospitalizaciones y 128.000 muertes cada año en niños menores de cinco años en los países
en vías desarrollo (Patel et al., 2008; Monteiro et al., 2013).
Marco Teórico
9
En estos países se ha implementado la búsqueda de tasas de reinfección, prevalencia y
susceptibilidad genética a NoV mediante la implementación de técnicas de identificación
más sensibles, con el objetivo de aportar información del impacto de estos agentes en la
clínica. NoV ha sido el responsable de 11,2% de los episodios de EDA en niños de la India,
de los cuales 2,6% fueron NoVGI y 8,1% NoVGII (Menon et al., 2016). En Lima, Perú, se
identificó NoV en 17,4% de 224 muestras diarreicas en niños menores de 24 meses de edad
y entre estas muestras positivas, el 92 % fueron norovirus GII (Rivera et al., 2011). Por su
parte, en Brasil en el año 2009 se identificaron NoVs de niños sintomáticos y asintomáticos
en 17% y 13%, respectivamente (Barreira et al., 2010).
Adicionalmente NoV se ha reportado en el 58 % de los brotes alimentarios, en los países
desarrollados en donde se ha introducido la vacuna de rotavirus, reemplanzado la causa de
gastroenteritis viral (Payne et al., 2013).
1.4.1.5 Formas de transmisión
El virus puede estar presente en las heces y el vómito de las personas infectadas, siendo así
de fácil y rápida propagación, a través gotitas, fómites, el contacto de persona a persona,
contaminación de alimentos y aguas residuales con partículas virales provenientes de
materia fecal.
Los principales factores de NoVs que impactan en la salud pública incluyen: (I) Las bajas
dosis infecciosas (18 a 1000 partículas víricas), (II) aparición de la enfermedad en hasta del
30% de las personas expuestas, aumentando el riesgo potencial de diseminación
secundaria, (III) soportan una amplia gama de temperaturas (congelación a -60°C) y
persistencia en superficies del medio ambiente, aguas recreativas, de bebida y en una
variedad de alimentos, incluyendo ostras, frutas y verduras que son regadas con aguas
residuales y que se consumen crudas, (IV) La diversidad de cepas de NoVs y (V) la falta
de inmunidad a largo plazo (6-14 semanas). Una persona sintomática infectarse de nuevo
con la misma cepa después de 2 o 3 años (Glass et al., 2009; Constantini, 2010).
1.4.1.6 Aspectos clínicos y complicaciones
Las infecciones causadas por NoV tienen un período de incubación de 10 a 51 horas. Los
síntomas incluyen vómitos en proyectil, seguido de calambres abdominales, fiebre, diarrea
acuosa y otros síntomas tales como dolor de cabeza, escalofríos y mialgias. La enfermedad
normalmente dura entre 2 a 3 días, pero puede prolongarse de 4 a 6 días. Las personas
infectadas que no tienen compromiso de su sistema inmune expulsan partículas virales
durante un máximo de 8 semanas y los pacientes inmunocomprometidos durante más de
un año (Bellido et al., 2007; Patel et al., 2009; Glass et al., 2009).
Marco Teórico
10
1.4.2 Rotavirus
1.4.2.1 Historia
La primera partícula viral de rotavirus (RoV) fue descubierta por primera vez en animales
en el año 1960 y 1973, mediante el uso de ME, Ruth Bishop, Geoffrey Davidson, Ian
Holmes y Brian Ruck identificaron el virus en células epiteliales maduras que recubren las
vellosidades del duodeno y en las heces de los niños con gastroenteritis aguda.
El virus fue identificado como reovirus similar a orbivirus, que presentaban gran parecido
a los virus ya implicados en la etiología de diarrea en ratones recién nacidos (Bishop et al.,
2009). Fue hasta el año 1974, cuando Thomas Henry lo denominó rotavirus basado en la
estructura de rueda (rota en latín) observada en el microscopio electrónico. En 1980, se
iniciaron los primeros estudios del desarrollo de las vacunas para rotavirus (Ciarlet et al.,
2009; Vesikari et al., 2010).
1.4.2.2 Biología y taxonomía
RoV pertenecen a la familia Reovidae. Son virus de aproximadamente 70 nm de diámetro,
icosahédricos, no envueltos. Su genoma es ARN de doble cadena (dsRNA) que está
rodeado de una cápside de tres capas. Este ARN presenta 11 segmentos, que codifican 6
proteínas estructurales, VP1 a VP4, VP6, VP7 y 6 proteínas no estructurales NSP1 a NSP6
(Aly et al., 2015).
La proteína VP6 es la más abundante y presenta los determinantes antigénicos específicos
de los grupos y es parte de la capa media de la cápside. La capa externa presenta dos
proteínas, VP4 y VP7. Estas actúan como antígenos neutralizantes, los cuales sirven como
blancos vacunales. Es importante anotar que estas dos proteínas definen el genotipo del
virus. La proteína VP7 es glicosilada, lo que permite la clasificación de los genotipos G y
la VP4 es una proteasa que determina el genotipo P. Por otra parte, la proteína NSP4,
permite la categorización en diferentes genotipos y actúa como una enterotoxina capaz de
desencadenar diarrea (Aly et al., 2015).
En este género hay siete serogrupos distintos del A al G, que se distinguen por poseer
diferentes proteínas VP6. Los grupos A, B y C son responsables de EDA en los seres
humanos, siendo el grupo A, el más identificado en niños menores de cinco años (Aly et
al., 2015; Bishop et al., 1973; Yan et al., 2004) (Figura 6).
Marco Teórico
11
Figura 6. Organización genómica de rotavirus. Modificado de Nan et al., 2014
En la actualidad se conocen aproximadamente 27 tipos G y 37 tipo P, los genotipos más
comunes son G1P[8], G2P[4], G3P[8] y G4P[8], siendo estos los responsables del 90 % de
casos de gastroenteritis humana del grupo A en el norte de América y Europa (Aly et al.,
2015).
1.4.2.3 Replicación viral o ciclo biológico
Las partículas virales que tienen tres capas en la cápside, primero se adhieren a los HBGAs
sobre la superficie de la célula del huésped, seguido por la interacción con otros receptores
celulares, como integrinas y las proteínas de choque térmico (Hsc70) (Gualtero et al.,
2007). El virus se internaliza mediante endocitosis mediada por receptores. Después de
esto, ocurre la eliminación de la capa exterior, provocada por el bajo nivel de calcio del
endosoma, lo que provoca la liberación de partículas de doble capa en el citoplasma. Estas
comienzan el proceso de transcripción de ARNm, dichos ARN son utilizados para traducir
las proteínas virales. Una vez que se han producido suficientes proteínas víricas, el genoma
de ARN se replica y se empaqueta en estructuras llamadas viroplasmas (Hu et al., 2012).
Los partículas de doble capa se unen a la proteína NSP4, que sirve como receptor en el
retículo endoplásmico (ER del inglés endoplasmic reticulum). Durante este proceso, las
partículas víricas se empiezan a ensamblar en el ER, ocurre la eliminación de la membrana
transitoria y empieza el montaje de las proteínas de la cápside externa VP4 y VP7,
resultando en la maduración de la partícula con las tres capas.
Finalmente, se libera la progenie de viriones mediante lisis celular. En las células epiteliales
polarizadas, las partículas son liberadas por un mecanismo de transporte vesicular (Hu et
al., 2012) (Figura 7).
Marco Teórico
12
Figura 7. Ciclo de replicación de rotavirus. Modificado de Hu et al., 2012.
1.4.2.4 Epidemiología
Las principales infecciones son causadas por rotavirus del grupo A, (RoVA), responsables
de más de 600.000 muertes anuales en todos los niños a nivel mundial. Sumado a esto,
causan entre el 25 al 35% de los casos de las hospitalizaciones por enfermedad
gastrointestinal (Azaran et al., 2016). Este agente viral es la principal causa de brotes, tanto
en los países desarrollados como en desarrollo (Wilhelmi et al., 2003; Rahman et al., 2007).
Comercialmente se conocen dos vacunas: una llamada Rotarix, monovalente derivada de
la cepa humana G1P[8] y la otra Rotateq, pentavalente recombinante de la cepa bovino
(WC3)-humano (Ali et al., 2016; McAtee et al., 2016). Rotarix, (RIX4414), es administrada
en dos dosis orales principalmente en el 2do y 4 do mes de edad (Yeung et al., 2016),
disponible en muchos países de Europa, América del Norte, América Latina, Asia y África
(Phua et al., 2009). En América Latina se ha encontrado una eficacia entre 80 al 83 %.
RotaTeq es combinada con cinco cepas atenuadas, que expresan la proteína de superficie
VP7 de los RoV de los tipos G1, G2, G3 y G4. El genotipo P[8] corresponde a la presencia
de la proteína VP4 del RoV (Ciarlet et al., 2009; Vesikari et al., 2010). El esquema de
administración son tres dosis por lo general al 2 do, 4 to y 6 to mes de edad (Yeung et al.,
2016).
Estas dos vacunas fueron aprobadas y recomendadas para la inmunización de rutina en la
Unión Europea en el año 2006. La eficacia de las vacunas ha oscilado entre el 80% al 98%
en los países industrializados y en América Latina, pero en países como Kenia, Malawi,
África, Bangladesh, Vietnam y Asia la eficacia, es de 51% al 64%, esto puede ser debido
a la alta incidencia de la enfermedad grave por rotavirus, una amplia diversidad de cepas
de rotavirus circulantes y una alta exposición a la infección natural por rotavirus en la
infancia temprana (Mrozek et al., 2016; Phua et al., 2009; Cunliffe et al., 2012). Estas
Marco Teórico
13
vacunas fueron diseñadas como estrategias de prevención y para disminuir severidad en las
infecciones por RoV.
1.4.2.5 Formas de transmisión
La principal forma de transmisión es fecal/oral de persona a persona. Este virus exhibe
bajas dosis infecciosas (menos de 10 partículas virales). El virus es expulsado en 1011
partículas por gramo de heces, antes del inicio de los síntomas y después de dos semanas
(Chen et al., 2012; Richardson et al., 1998). Las partículas virales pueden durar en
superficies secas durante 10 días y más de 4 horas en las manos de las personas, por lo que
la transmisión puede ser por fómites, agua y superficies ambientales (chen et al., 2012).
1.4.2.6 Aspectos clínicos y complicaciones
Los síntomas más evidentes son vómitos, fiebre y diarrea no sanguinolenta, generalmente
entre 10 a 20 deposiciones durante 3 a 8 días (OMS). La diarrea es producida por una
reducción de la superficie de absorción debido al daño celular por efectos enterotoxigénicos
de la proteína NPS4 (Bellido et al., 2007; Chen et al., 2012).
Dentro de la primera semana de la enfermedad se detecta IgM específica de RoV en las
heces y en el suero. Pasada la enfermedad se detecta IgG, indicativo de una infección
resuelta. Estos anticuerpos confieren protección para una próxima infección (Bellido et al.,
2007).
1.4.3 Sapovirus
1.4.3.1 Historia
Las partículas de sapovirus (SaV) fueron descubiertas por primera vez mediante
microscopía electrónica (ME) en muestras de heces diarreicas de humanos en el Reino
Unido en 1976 (Oka et al., 2015; Madeley et al., 1976). Un año después se identificó en un
brote de diarrea en un orfanato en Sapporo, Japón, en Octubre 1977, lugar que le atribuye
su nombre (Torner et al., 2016).
1.4.3.2 Biología y taxonomía
SaV pertenece a la familia Caliciviridae. Son virus de 30 a 38 nm de diámetro con
estructura icosahédrica (Oka et al., 2015) y ARN de cadena sencilla con polaridad positiva
(Yan et al., 2003) con un tamaño de 7.3 a 7,5 kb. Este virus tiene depresiones en forma de
copa en la superficie, lo cual es una morfología típica de los Calicivirus (Oka et al., 2015).
Su genoma consta de 2 ORF. El ORF1 codifica para proteínas no estructurales (NS1 a NS7)
y proteínas VP1 de la cápside, el ORF2 codifica una proteína menor de la cápside llamada
VP2 (Svraka et al., 2010; Oka et al., 2015) (Figura 8).
Marco Teórico
14
Figura 8. Organización genómica de sapovirus. Modificado Oka et al., 2015.
Mediante los análisis de la secuencia completa de la cápside, se han clasificado en cinco
genogrupos (GI a GV). SaV GIII infecta la especie porcina y SaV GI, GII, GIV y GV
infectan a los humanos (Svraka et al., 2010).
Se han descrito 15 genotipos en los cuatro genogrupos relacionados en las infecciones en
humanos (GI.1 a GI.8, GII.1 a GII.5, GIV y GV) (Torner el at., 2016).
1.4.3.3 Replicación viral o ciclo biológico
El conocimiento detallado del ciclo de replicación de los calicivirus en humanos no se
conoce por falta de un modelo animal y de un sistema de cultivo de células infectadas (Bull
et al., 2011).
1.4.3.4 Epidemiología
SaV son responsable de gastroenteritis en todos los grupos de edad. Afecta tanto humanos
como animales. Están presentes en baja prevalencia de los casos de EDA en niños y se
relacionan principalmente a pacientes con complicaciones clínicas como
inmunosuprimidos o niños prematuros (Oka et al., 2015). La mortalidad por este agente es
rara.
Reportes realizados en diferentes estudios en Japón durante los años 1999 al 2013 muestran
tasas de detección entre 1,7 a 19,2%, cabe resaltar que las altas tasas de estos estudios
fueron por los largos periodos de estudio. Sin embargo, la prevalencia de casos esporádicos
en otros informes demuestran tasas que oscilan entre 1,7 a 5,1% (Thongprachum et al.,
2016).
En el norte de África, la República Tinecica, se investigó la incidencia y el papel clínico
de varios virus entéricos responsables de gastroenteritis infantil, durante el año 2003 al
Marco Teórico
15
2005, encontrándose a sapovirus relacionado en 1,0% de los casos (Sdiri et al., 2008).
Ouagadougou, Burkina Faso, desde el año 2011 al 2012, atribuyó la diarrea a sapovirus en
10,3% siendo este porcentaje bajo comparado con la identificación de otros agentes virales
como rotavirus, adenovirus y norovirus en 63,5%, 31,2%, y 18,2%, respectivamente
(Ouédraogo et al., 2016).
En Estados Unidos estudios recientes en los estados de Portland, Maryland y Virginia, han
demostrado la identificación de sapovirus en solo 2% como agente viral diarreagénico, bajo
porcentaje en comparación con los otros agentes (Grytdal et al., 2016).
Las infecciones relacionadas con este agente son menos reportadas, alcanzando tasas de
detección del 10 %. En general los síntomas son más leves comparados con los otros
agentes virales diarreagénicos (Bucardo et al., 2014).
1.4.3.5 Formas de transmisión
La transmisión es de persona a persona o puede propagarse a través de la vía fecal/oral y
alimentos o aguas contaminadas. La exposición a superficies contaminadas ha sido
implicada en algunos brotes (Torner et al., 2016; Repp et al., 2012).
1.4.3.6 Aspectos clínicos y complicaciones
El principal síntoma es la diarrea, acompañada o no de fiebres, vómitos y dolores
abdominales, a diferencia de norovirus cuyos síntomas principales son vómito y fiebre
(Svraka et al., 2010).
El período de incubación es de 12 a 48 horas. 4 días después de la exposición ocurre
excreción viral y puede persistir durante 3 semanas (Torner et al., 2016).
1.4.4. Astrovirus
1.4.4.1 Historia
Identificado por primera vez en 1975, por Appleton y Higgins, las partículas virales,
mediante ME en muestras de materia fecal de niños con diarrea aguda (Bosch, et al., 2014)
Su nombre fue asignado por sus características morfológicas parecidas a una estrella, de 5
a 6 puntas en su extremo (Koci et al., 2003; Wilhelmi et al., 2003; Krishna et al., 2006). En
1993 fue agrupado taxonómicamente en la familia Astroviridae (Bellido et al., 2007).
1.4.4.2 Biología y taxonomía
AsV son virus ARN monocatenario de sentido positivo, no envueltos, con un diámetro
entre 28 a 30 nm. Se encuentran en una amplia variedad de especies animales, incluida la
humana. Pertenecen a la familia Astroviridae, que se divide en dos géneros, el primero los
mamastrovirus, que incluyen los astrovirus humanos y animales, el segundo los
avastrovirus en el que pertenecen astrovirus aviares (Bellido, 2007; Ulloa et al., 2010).
Marco Teórico
16
El genoma está compuesto por 6771 nucleótidos agrupado en 3 ORF, ORF1a, ORF1b y
ORF2. El ORF1a y ORF1b codifican proteínas no estructurales, una serin proteasa 3C en
el ORF1a y una ARN polimerasa dependiente ARN putativo en ORF1b.
El ORF2, codifica una proteína precursora de la cápside (Jeong et al., 2012; Wilhelmi et
al., 2003), que se escinde en dos clases de dominios. El primer dominio contenido en los
residuos de los nucleótidos 1 al 415, siendo altamente conservados entre la familia
Astroviridae. Por el contrario, el segundo dominio, presente en los residuos del nucleótido
416 al extremo, son muy divergentes entre todos los genotipos conocidos y se ha informado
de que anticuerpos monoclonales neutralizantes se asignan a este segundo dominio
(Krishna et al., 2006) (Figura 9).
Figura 9. Organización genómica de Astrovirus. A. con los 2 ORF y las proteínas que codifica. B.
Proteínas estructurales del ORF2. Modificado de Krishna et al., 2006.
Una poliproteína de 87 kDa, da lugar a las proteínas estructurales de la cápside VP34,
VP29, VP26, siendo esta última la responsable de la clasificación de astrovirus en los
diferentes genotipos (Wilhelmi et al., 2003).
Los Astrovirus humanos (HAstV) han sido clasificados en 8 tipos antigénicos denominados
HAstV 1 a HAstV 8, de los cuales el tipo predominante reportado es el HAstV 1 (Gutierrez
et al., 2005). Adicionalmente, se han reportado 7 AsV diferentes identificados en muestras
de materia fecal de personas, estos han sido reconocidos como MLB Like divididos en
MLB1, MLB2, MLB3 y VA like clasificados en VA1/HMO-C, VA2/HMO-B, VA3/HMO-
A, HMO (del inglés human, mink and ovine-like), estas cepas son distintas genéticamente
a las cepas clásicas de astrovirus, de hecho están estrechamente relacionadas con las
encontradas en los visones que son mamíferos carnívoros que se asemejan a la manta y a
las otras cepas de astrovirus de las ovejas (Kapoor et al., 2009; Meyer et al., 2015;
Finkbeiner et al., 2009; Jiang et al., 2013).
1.4.4.3 Replicación viral o ciclo biológico
Los receptores celulares y las células diana para el reconocimiento viral son desconocidos,
aunque el sitio principal de la replicación parece ser el tracto gastrointestinal, se ha
encontrado virus presente en enfermedades diseminadas y encefalitis (Cordey et al., 2016).
Después de la entrada de AsV a las células del huésped, el ARN genómico no está
recubierto, por lo tanto se puede traducir en un precursor de poliproteína que es escindido
en las proteínas necesarias para la replicación del genoma del virus y ensamblaje de la
Marco Teórico
17
progenie viral. Este proceso se lleva a cabo en las membranas celulares. La finalización del
ciclo de vida del virus requiere la acción de las caspasas de las partículas de virus para salir
de la célula (Figura 10).
Figura 10. Ciclo de replicación viral de astrovirus. Modificado Méndez et al., 2001.
1.4.4.4 Epidemiología
En países en vías de desarrollo y climas sin estaciones definidas como el nuestro, existen
pocos reportes epidemiológicos (Ramírez et al., 2014). Este virus afecta principalmente a
niños menores de cinco años de edad, pero se ha encontrado relación con EDA en adultos,
ancianos y pacientes inmunocomprometidos (Ramirez et al., 2014; Jeong et al., 2012).
Se considera que el 10 % de los casos esporádicos de gastroenteritis no bacteriana, son
causadas por astrovirus (Holtz et al., 2011). Se encuentra entre 13 al 65 % de las
coinfecciones con otros agentes virales como rotavirus y calicivirus (Jeong et al., 2012;
Pang et al., 1999).
En regiones de Colombia, AsV ha sido determinado, mediante ELISA, con una prevalencia
global de 2,8% (Gutierrez et al., 2005). Adicionalmente, se han identificado en 4,1% de
171 muestras de materia fecal de niños menores de cinco años, mediante técnicas tanto
moleculares como inmunológicas (Ulloa et al., 2010), lo cual evidencia la circulación de
AsV en nuestro país.
1.4.4.5 Formas de transmisión
Los virus se transmiten principalmente por la vía fecal/oral, entre personas o agua y
alimentos contaminados (Ha et al., 2016; Monroe et al., 1993).
Marco Teórico
18
1.4.4.6. Aspectos clínicos y complicaciones
La infección produce diarrea, sin cambios en la morfología intestinal (Behling et al., 2002;
Koci et al., 2003). La diarrea se caracteriza por ser de corta duración, de aproximadamente
3 días con un rango de 1 a 21 días. Durante las primeras 24 horas se presentan entre 1 a 10
deposiciones con una media de 4. Esta enfermedad es considerada de menor gravedad
comparada con la causada por otros agentes virales, solo entre 0 al 3% tienen progreso a
deshidratación (Jeong et al., 2012; Ramírez et al., 2014; Wilhelmi et al., 2003).
Los síntomas como el vómito, dolor de cabeza, dolor abdominal y la fiebre son menos
frecuentes que en otras infecciones (Hu et al., 2016). El virus es eliminado en heces durante
más de dos semanas, pero se puede prolongar dependiendo del compromiso inmunológico
de los pacientes (Ramírez et al., 2014).
1.4.5Adenovirus entéricos
1.4.5.1 Historia
Los adenovirus fueron aislaron por primera vez en 1953 en un cultivo de células adenoides
humanas (Hoeben et al., 2013). En 1960 y 1970, se logró realizar el cultivo celular, con el
fin de conocer la forma de replicación (Hoeben et al., 2013).
1.4.5.2 Biología y taxonomía
Los AdV pertenecen a la familia Adenoviridae, son virus ADN de doble cadena,
icosahédricos que presenta una cápside compuesta por 7 proteínas, hexón (II), base de
pentón (III), fibra (IV), IIIa, VI, VIII y IX, clasificados en 52 genotipos y agrupados en 7
especies desde A a la G (Crosby et al., 2014; Feeney et al., 2011; Logan et al., 2006). Las
principales proteínas de la cápside que constituyen la mayoría de la superficie del virión
son el hexon, la base de pentón y fibra, presentes en 720, 60 y 36 copias por virión (Crosby
et al., 2014).
Entre los genotipos más frecuentemente asociados con la producción de gastroenteritis son
el 40 y 41, que pertenecen al subgénero F. Adicionalmente, otros genotipos de los
subgéneros A (31, 12, 18) y C (1, 2, 5, 6) también han sido implicados en la etiología de la
diarrea aguda (Figura 11).
Figura 11. Organización genómica de adenovirus. Modificado de Crosby et al., 2014.
Marco Teórico
19
El hexón juega un papel estructural como una proteína de revestimiento, mientras que la
base del pentón y la fibra son responsables de las interacciones célula, virión que
constituyen el tropismo del virus (Glasgow at la. 2006).
1.4.5.3 Replicación viral o ciclo biológico
La replicación de AdV es un proceso muy eficiente. En 40 horas, una célula infectada tiene
la capacidad de producir aproximadamente un millón de copias de ADN viral (Hoeben et
al., 2013).
La entrada del virus en células implica dos pasos distintos, uno la unión a una molécula de
receptor primario en la superficie celular, seguido por la interacción con moléculas
responsables de la internalización del virión y dos la unión directa del dominio de la fibra
a su receptor celular primario, llamado (CAR) para la mayoría de los genotipos, incluyendo
Ad2 y Ad5.
Después de la unión al receptor, se efectúa la endocitosis mediada por el receptor del virión
de la base pentónica, aminoácidos Arginina-Glicina-Asparagina (RGD), motivos con las
integrinas celulares, incluyendo αvβ3, αvβ5, αvβ1, α3b1 y alfa5β1. Los virus entran a la
célula en vesículas revestidas de clatrina, la cual es transportada a los endosomas. En este
paso ocurre la acidificación que conlleva a la liberación del virus y permite la permanencia
en el citosol, para finalmente pasar, al núcleo donde la replicación viral se lleva a cabo
(Glasgow et al., 2006) (Figura 12).
Figura 12. Unión del virión de adenovirus con su receptor en la célula, para la entrada celular. Modificado
de Glasgow et al., 2006.
1.4.5.4 Epidemiología
La especie A, genotipos 12, 18, 31 y F genotipos 40 y 41, se han relacionado con las
infecciones gastrointestinales en niños menores de 2 años (Feeney et al., 2011; Logan et
al., 2006; Yan et al., 2003).
Se consideran entre 1,4 a 10% de las gastroenteritis a nivel mundial (Al thani et al., 2013),
Casi el 50% de los niños menores de cinco años han sido seropositivos para anticuerpos de
adenovirus tipo 40 (Ad40) y adenovirus tipo 41 (Ad41) en Asia, Europa y América del Sur
(Khoshdel et al., 2015).
Marco Teórico
20
1.4.5.5 Formas de transmisión
La principal vía de infección es vía fecal/oral. Esta infección se produce durante todo el
año y afecta principalmente a los niños menores de cuatro años (Khoshdel et al., 2015)
1.4.5.6 Aspectos clínicos y complicaciones
Los AdV son una de las causas principales de síndromes clínicos, incluyendo
gastroenteritis, enfermedad respiratoria, conjuntivitis, cistitis hemorrágica y exantema
(Sanaei et al., 2016).
Los adenovirus entéricos asociados con diarrea prolongada pueden contribuir a la
deshidratación y a la desnutrición infantil en los países en desarrollo (Chow et al., 2010).
Por lo general, después de un período de incubación de 8 a 10 días, se produce la diarrea
acompañada con fiebre, vómitos, dolores abdominales y deshidratación (Sanaei et al.,
2016; Chow et al., 2010).
1.5 Diagnóstico de agentes virales diarreagénicos.
1.5.1 Técnicas directas: microscopía electrónica,
Detección de antígenos por inmunoensayos y
aglutinación.
Una variedad de técnicas directas basadas en inmunoensayo enzimático (EIA) (Caul, 1996
a,b), aglutinación con partículas de látex (LA) (Lee et al., 2011), inmunocromatografía (IC)
y recientemente, inmunoensayo quimioluminiscente (CLIA) (Sidoti et al., 2015), han sido
utilizadas comúnmente por los laboratorios de entidades prestadoras de salud para el
diagnóstico común de virus entéricos causantes de EDA, dado que son fáciles de usar, son
altamente específicas y no se requiere una infraestructura especial de los laboratorios. No
obstante el límite de detección de estas técnicas es de 104 a 105 partículas virales por gramo
de materia fecal (Bellido et al., 2007) y comparadas con las técnicas moleculares carecen
de sensibilidad, debido a la gran diversidad de las cepas que presentan los virus (Pang et
al., 2005; Logan et al., 2006; Kim et al., 2012).
1.5.2 Detección del genoma viral
Desde 1972, cuando norovirus fue identificado mediante ME como el primer agente causal
de gastroenteritis (Kapikian et al., 1972), una variedad de técnicas para detectar agentes
virales en muestras de heces se han implementado. Las pruebas moleculares, han sido
usadas por su alta sensibilidad debido a que necesitan menor cantidad de partículas para su
detección entre 101 a 10 3 (Bellido et al., 2007; Sidoti et al., 2015).
Marco Teórico
21
1.5.2.1. Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), es una técnica para la amplificación directa
de un gen o fragmento de ADN e indirecta del ARN, partiendo del ADN complementario
(cADN), presentes en mezclas de muy diversas fuentes sin necesidad de una purificación
previa de la muestra (Luque et al., 2006).
Esta técnica genera múltiples copias de una secuencia específica de ADN, mediante una
desnaturalización, hibridación específica y finalmente una replicación usando la enzima
ADN polimerasa, con el propósito de ser analizados con fines diagnósticos, investigativos,
y epidemiológicos (Tamay de Dios et al., 2013).
La PCR presenta variantes usadas dependiendo de las características de cada virus, las
muestras, la calidad del genoma y la cantidad viral que la técnica requiera para su detección.
1.5.2.3 Reacción en Cadena de la Polimerasa transcriptasa
inversa (RT-PCR)
Variante de la PCR cuyo fin es la amplificación de ARN (especialmente ARN mensajero
(RNAm)) a través de la síntesis previa de su cADN in vitro, que después es amplificado
por PCR convencional. Es decir, no se obtienen copias de ARN de partida sino de ADNc,
este paso le confiere mayor estabilidad al ARN (Cotazar et al., 2004).
En la actualidad, la RT-PCR múltiple, ha sido empleada en la detección de varios agentes
virales diarreagénicos. Una de las ventajas que presenta este método es que permite la
detección rápida, sensible y específica de más de un patógeno (Kojima et al., 2002,
Khamrin et al., 2011; Panchalingam et al., 2012; Dung et al., 2013; Rooney et al., 2014).
La principal desventaja que esta técnica presenta es la disminución de su sensibilidad por
la presencia de algunos inhibidores en la materia fecal como las bilirrubinas, polisacáridos
complejos, sales biliares (Trujillo et al., 2006; Fuentes et al., 2009).
Diversos estudios han implementado esta técnica con diferentes fines informativos para la
investigación clínica, en particular en el contexto de infecciones mixtas. En un estudio
realizado en Tanzania, para la detección y cuantificación de agentes virales esta técnica
mostró entre el 88% al 100% de sensibilidad y especificidad respectivamente (Liu et al.,
2011).
Otros desarrollados en los países con altas tasas de mortalidad, Sudáfrica y Asia, han
implementado RT-PCR múltiple para la detección de NoV (GI yGII), AsV, y SaV
(Panchalingam et al., 2012). Al igual que en Estados Unidos durante los años 1999 al 2004,
en muestras de materia fecal de casos esporádicos de gastroenteritis en niños, la PCR en
tiempo real transcriptasa inversa (TaqMan) permitió la rápida detección y tipificación de
cepas pertenecientes a NoV (GI, GII), mediante el uso de sondas TaqMan específicas para
cada secuencia a identificar (Trujillo et al., 2006).
Marco Teórico
22
Khamrin y cols en Japón implementaron una técnica PCR multiplex transcriptasa inversa
para la identificación de 10 agentes virales diarreagénicos. En este la positividad para
agentes virales fue de 47,2 % a partir de 235 muestras de heces (Khamrin et al., 2011).
1.5.2.4 Reacción en Cadena de la Polimerasa transcriptasa
reversa en tiempo real (RT-qPCR)
Es el método más sensible para detectar y cuantificar los ácidos nucleicos mediante el uso
de fluorescencia. La emisión de fluorescencia es proporcional a la cantidad de templete en
la muestra. Aún teniendo una cantidad muy pequeña de templete, el sistema garantiza una
alta sensibilidad, especificidad y eficiencia (De Dios et al., 2013). Para el diagnóstico de
agentes virales diarreagénicos en investigación se han usado tanto reacciones simples como
múltiples.
Múltiples investigaciones han implementado estas técnicas para la identificación de
agentes virales diarreagénicos. Feeney y cols en el 2011, describieron dos PCR múltiples,
para el procesamiento de 137 muestras durante un período de 3 años, desde marzo de 2007
a febrero de 2010. Mediante el empleo de una combinación de sondas TaqManTM,
encontraron sensibilidad de 97,3%, 100%, 95,1% y especificidad de 99%, 100%, 97,9%,
en la identificación de AdV, RoV y NoV, respectivamente.
Otro estudio realizado en Estados Unidos en muestras de heces de niños con o sin EDA,
emparejados por edad, recogidos entre octubre de 2008 y septiembre de 2009 fueron
evaluados para la identificación de AdV, AsV, SaV, parechovirus, bocavirus y aichivirus,
mediante técnicas inmunológicas y moleculares (qPCR). Identificándose los virus en
11,8%, 4,9%, 5,4%, 4,8%, 1,4% y 0,2% de los pacientes con EDA y 1,8%, 3,0%, 4,2%,
4,4%, 2,4%, y 0% de los controles sanos, respectivamente (Chhabra et al., 2013).
La detección y tipificación de virus mediante RT-qPCR con sondas TaqMan, ha permitido
la identificación de genogrupos GI, GII de NoV a partir de muestras clínicas y de agua. En
este trabajo estas muestras fueron previamente positivas por RT-PCR convencional. Esto
ayuda en la orientación hacia el uso de RT-qPCR con el uso de sondas TaqMan, puesto
que disminuye el tiempo de post procesamiento de PCR, dado que no se requiere el uso de
geles para la visualización del producto amplificado (Trujillo et al., 2006).
Estos ensayos han demostrado ser útiles en la investigación, salud pública y el diagnóstico
de los laboratorios que necesitan reportar resultados rápidamente a los equipos de gestión
de brotes (Trujillo et al., 2006).
1.5.2.5 Otras técnicas
Nuevas técnicas menos estudiadas pero implementadas como el microarray (Kim et al.,
2012), amplificación isotérmica mediada por bucles (LAMP) y amplificación basada en
secuencias de ácido nucleico (NASBA), han permitido la detección de AsV, NoV, RoV y
AdV disminuyendo el tiempo en el diagnóstico dado que son técnicas que no requieren
infraestructuras estrictas para su implementación. Estas han demostrado mayor sensibilidad
comparada con la RT-PCR (Tai et al., 2002).
Marco Teórico
23
Dentro de las técnicas moleculares en la actualidad se cuenta con un sistema integrado de
un panel Filmarray gastrointestinal, el cual su principal ventaja es la detección de 23
patógenos diarreagenicos, entre ellos, 14 bacterias (Campylobacter (jejuni, coli,
upsaliensis), Clostridium difficile (Toxin A/B), Plesiomonas shigelloides, Salmonella,
Yersinia enterocolitica, Vibrio (parahaemolyticus, vulnificus, cholerae), Vibrio cholerae,
E. coli diarreagénica, Shigella, E. coli O157, E. coli enteroagregativa (EAEC), E. coli
Enteropatógena (EPEC), E. coli enterotoxigénica (ETEC) lt/st, E. coli shigatoxigénica
(STEC) stx1/stx, E. coli O157, E. coli Shigella/Enteroinvasiva (EIEC)); cinco virus
(norovirus GI/GII, rotavirus A, adenovirus F 40/41, astrovirus, sapovirus I, II, IV,V) y
cuatro parásitos (Cryptosporidium, Cyclospora cayetanensis, Entamoeba histolytica,
Giardia lamblia), todos identificados en una sola reacción, de una forma rápida, ya que
solo tarda una hora, sencilla por solo necesitar 2 minutos de manipulación, y fácil por no
requerir de pipeteo o alguna medición precisa de la muestra. Esta técnica integra pasos que
son realizados de forma manual como la extracción y purificación de ácidos nucleicos
directamente de la muestra, la PCR y la detección de las regiones génicas amplificadas. De
esta forma se ofrece un panorama de diagnóstico más rápido y eficaz en las infecciones
gastrointestinales (Farfán et al., 2016; http://www.biomerieux-diagnostics.com/filmarrayr-
gi-panel).
Objetivos
24
2. OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GENERAL
Identificar norovirus (NoV GI, NoV GII), rotavirus, astrovirus, adenovirus y
sapovirus en niños menores de cinco años con enfermedad diarreica aguda
(EDA) y sin EDA de Bucaramanga y su área metropolitana mediante técnicas
moleculares.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Determinar la frecuencia de norovirus (GI, GII), rotavirus, astrovirus,
adenovirus y sapovirus entre los niños menores 5 años de edad con o sin EDA
en Bucaramanga y su área metropolitana (Colombia).
Determinar la frecuencia de genogrupos y genotipos de Norovirus en niños
con o sin EDA en Bucaramanga y su área metropolitana (Colombia).
Identificar los genotipos de rotavirus predominantes en niños con o sin EDA
en Bucaramanga y su área metropolitana (Colombia).
Describir los factores de riesgo y las características clínicas en niños con EDA
de etiología viral en Bucaramanga y su área metropolitana (Colombia).
Materiales y métodos
25
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 Tipo de estudio
Estudio analítico, anidado en un estudio de casos y controles que hace parte del proyecto
multicéntrico “Studies on emergent diarrheagenic E. coli pathogens con grant No.
1R01AI095346 aprobado por National Institute of Allergy and Infectious Diseases”.
National Institutes of Health (NIH) de los Estados Unidos cuyo investigador principal de
la Universidad de Vanderbilt es el Dr. Oscar Gómez Duarte y por el programa de
Bacteriología y Laboratorio Clínico de la Universidad de Santander (UDES) la Dra. Ana
Elvira Farfán García. Alícuotas de las muestras de materia fecal incluidas en el estudio
multicéntrico fueron analizadas para la detección de virus en este trabajo.
3.2 Área geográfica
Bucaramanga y su área metropolitana. Instituciones de salud (Centro de salud el Rosario,
Hospital Local del Norte, Unidad Materno Infantil Santa Teresita, UIMIST, del ISABU,
la Clínica Materno Infantil San Luis, el Hospital San Juan de Dios de Floridablanca y la
Fundación Oftalmológica de Santander, FOSCAL).
3.3 Universo
Niños menores de cinco años de Bucaramanga y su área metropolitana.
3.4 Población
Niños menores de cinco años que asistieron a las 6 instituciones durante el período de
julio 2013 a diciembre 2014.
3.5 Muestra
El tamaño muestral calculado para el estudio multicéntrico fue de 300 casos y 300
controles con una potencia para detectar un odd ratio de 5.2 o mayor, si la prevalencia era
de 0,05 y 0,01 entre los grupos de casos y controles, respectivamente (con un error de tipo
I > 0.5). Sin embargo, se logró la inclusión de 405 casos y 405 controles pareados por
edad 1:1.
3.6 Material biológico
Las muestras de materia fecal procedentes del estudio multicéntrico fueron recogidas en
frascos plásticos desechables, marcados y transportados al Laboratorio de Investigaciones
Biomédicas y Biotecnológicas (LIBB) de la Universidad de Santander (UDES), dentro de
las dos horas siguientes a su recolección e inmediatamente procesadas para estudios
Materiales y métodos
26
bacteriológicos y parasitológicos. Una alícuota de cada muestra fue guardada a -80°C
hasta su posterior procesamiento en la detección de virus diarreagénicos para este trabajo.
La detección viral NoV GI, NoV GII, SaV, AsV y AdV se realizó mediante RT-qPCR.
Rotavirus fue identificado mediante ELISA y PCR convencional. A continuación se
describen cada uno de los procedimientos.
3.7 Procedimientos
3.7.1 Extracción de ARN viral Para la extracción del material genético se usó el kit QIAamp Viral RNA (QIAgen,
Valencia, USA) de acuerdo al protocolo del fabricante. Para ésto, se realizó una
suspensión de materia fecal al 10% en agua ultra pura DEPC (Dietilpirocarbonato) (Life
Technologies, Carlsbad, USA), se mezcló en vortex, luego fue centrifugada dos veces a
máxima velocidad durante 5 min a 4 °C y finalmente, el ARN viral fue extraído a partir
del sobrenadante (Anexo 1).
3.7.2 Extracción de ADN viral
Para la extracción del ADN se usó el Kit QIAamp ADN Stool Mini Kit (QIAgen,
Valencia, USA) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Brevemente, se realizó una
suspensión al 10 % de materia fecal en agua grado molecular (Científica Senna, México),
se mezcló en vortex, seguido se centrifugó dos veces a máxima velocidad durante 5 min
a 25 °C y finalmente, el ADN viral se extrajo a partir del sobrenadante. El ADN fue
mantenido a -20°C en alícuotas hasta su procesamiento (Anexo 2).
Materiales y métodos
27
3.7.3 Reacción en Cadena de la Polimerasa Transcripción
Reversa en Tiempo Real (RT-qPCR) múltiple
El ARN extraído de las muestras clínicas fueron amplificados y cuantificados mediante el
ensayo RT-qPCR con el kit One-Step RT- PCR (TaqMan® Life Technologies, Carlsbad,
USA). Este kit permite la transformación del ARN a cADN para su posterior uso en la
amplificación por medio de qPCR. Este mismo protocolo fue empleado en la
identificación del ADN de adenovirus usando qPCR. De acuerdo a las instrucciones del
fabricante, brevemente, en un tubo eppendorff de 1,5 ml se mezclaron los reactivos y los
primers como se observa en la tabla 2.
Tabla 2. Reactivos para la PCR múltiple por RT-qPCR para detección de sapovirus/astrovirus, norovirus
GI/GII y qPCR para adenovirus.
22 µl del mix fueron adicionados en cada pocillo de la placa, más 3 µl de cada una de las
muestras, una vez preparada la mezcla, la placa se centrifugó y se llevó al termociclador
CFX96 Touch™ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, Hercules, California,
USA). Utilizando las condiciones de amplificación que se describen en la Tabla 3.
Sapovirus/Astrovirus Norovirus GI/GII Adenovirus
Componente Volumen (µl) Componente Volumen (µl) Componente Volumen (µl)
2X RT-PCR buffer 12.5 2X RT-PCR buffer 12.5
2X RT-PCR buffer 12,5 Agua libre de
nucleasas grado
biología molecular.
2.5 Agua libre de nucleasas grado
biología molecular. 1.08
AsFF (10 μM) 0.6 Potenciador de Detección 1.67 Agua libre de nucleasas
grado biología molecular. 4,33
AsFR (10 μM) 0.6 Cog 1F (10 μM) 1
AstZFB (10 μM) 0.25 Cog 1R (10 μM) 1 Potenciador de Detección 1,67
SaV 124F (10 μM) 1.0 Ring 1E (10 μM) 0.5
SaV 1F (10 μM) 1.0 Cog 2F (10 μM) 1
JTVFF(10 μM) 1
SaV 5F (10 μM) 1.0 Cog 2R(10 μM) 1
SaV 1245R (10 μM) 1.0 Ring 2 (10 μM) 0.5
JTVFR (10 μM) 1
SaV124TP (10 μM) 0.25 MS2.F (10 μM) 0.25
SaV 5TP (10 μM) 0.25 MS2.R (10 μM) 0.25 JTVFAP (10 μM) 0,5
25 X Enzima RT-PCR 1 MS2.P 0.25
25 X Enzima RT-PCR 1 25 X Enzima RT-PCR 1
RNA 3 μl
Materiales y métodos
28
Tabla 3. Primers y condiciones amplificación de la PCR múltiple por RT-qPCR para la detección del ARN
y ADN viral (Protocolo del CDC Atlanta, Chhabra Preeti (2013).
N/A: No aplica. MS2 bacteriófago. Control de extracción de RNA.
En cada prueba se procesaron controles negativos y agua grado biología molecular libre
de ADNsas, proteasas y ARNsas (sin emisión de fluorescencia). Cada ensayo se validó
por la fluorescencia emitida de los ADN de plásmidos usados como controles positivos
(controles de CDC, clonados en el vector pGEM)) de cada uno de los virus a identificar.
MS2 fue usado como control interno de extracción de ARN para NoV. MS2 es un
bacteriófago usado para controlar cada paso de amplificación de ácido nucleico con el fin
de evitar resultados falsos negativos debido a la inhibición de la reacción (Dreier et al.,
2005).
Los datos de la amplificación fueron analizados en el software Bio-Rad CFX manager
versión 3.1. Si se detecta la presencia de ADN, la información es reflejada gráficamente
en curvas cinéticas de la reacción para cada una de las muestras y los controles (Anexo 3).
Virus Región
objetivo Primer Secuencia
Concentrac
ión primers
nM
Condiciones
Referencia Ciclos Desnaturalización
Alineamiento /
Extensión
Norovirus
GI
ARN
Unión ORF1-
ORF2 (GI)
Cog 1F CGY TGG ATG CGI TTY CAT GA 400
45 95 °C, 15 segundos
60 °C, 1 minuto
Trujillo et al., 2006 Cog 1R CTT AGA CGC CAT CAT CAT TYA C 400
Ring 1E probe [6-FAM]-AGATYGCGRTCYCCTGTCCA-[Tamra]
[6-FAM]-AGATYGCGRTCYCCTGTCCA-[BHQ1] 200 Hill et al., 2010
Norovirus
GII
ARN
Unión ORF1
ORF2 (GII)
Cog 2F CAR GAR BCN ATG TTY AGR TGG ATG AG 400
Trujillo et al., 2006 Cog 2R TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA 400
Ring 2 probe QUA – TGG GAG GGC GAT CGC AAT CT – BHQ2 200
N/A Región.
289 –387
MS2.F TGG CAC TAC CCC TCT CCG TAT TCA CG 100
Feeney et al., 2011
MS2.R GTA CGG GCG ACC CCA CGA TGA C 100
MS2.P probe HEX - CAC ATC GAT AGA TCA AGG TGC CTA
CAA GC – BHQ1
100
Astrovirus ARN
ORF1b
AsFF GGC CAG ACT CAC AGA AGA GCA 400
40 95 °C, 15 segundos 60 °C, 1 minuto
Grant et al., 2012 AsFR GTC CTG TGA CAC CTT GTT TCC TGA 400
AstZFB HEX - CCA TCG CAT TTG GAG GGG AGG ACC
AGC GA 200
Sapovirus ARN
ORF1
SaV 124F GAY CAS GCT CTC GCY ACC TAC 400
Oka et al., 2006
SaV 1F TTG GCC CTC GCC ACC TAC 400
SaV 5F TTT GAA CAA GCT GTG GCA TGC TAC 400
SaV 1245R CCC TCC ATY TCA AAC ACT A 400
SaV124TP FAM-CCR CCT ATR AAC CA 200
SaV 5TP FAM-TGC CAC CAA TGT ACC A 200
Adenovirus ADN
Hexon
JTVFF AAC TTT CTC TCT TAA TAG ACG CC 400
40 95 °C, 15 segundos 60 °C, 1 minuto Jothikumar et al.,
2005 JTVFR AGG GGG CTA GAA AAC AAA A 400
JTVFAP FAM-CGA AGA GTG CCC GTG TCA GC-BHQ1 200
Materiales y métodos
29
Para cada muestra el programa informático calcula el número de ciclos en el que el lector
empieza a detectar un incremento de fluorescencia significativo, con respecto a la señal
de base. El ciclo en el que se empieza a detectar el aumento de fluorescencia se denomina
punto de corte (Cp, del inglés crossing point) o ciclo umbral (Ct, del inglés threshold
cycle) y es inversamente proporcional a la concentración inicial de ADN blanco presente
en la muestra. Con las concentraciones previamente conocidas de los controles externos y
sus Cp correspondientes se dibuja una curva patrón, interpolando en ella los valores de los
Cp de cada muestra problema (Costa., 2004).
3.7.4 Interpretación de resultados de RT-qPCR
Los resultados son interpretados de acuerdo a los valores de Ct del ciclo en el cual la
producción de fluorescencia pasa el umbral establecido. Es decir los resultados de Ct
menores a 40 ciclos se consideraron positivos. Resultados de Ct iguales o mayores a 40
ciclos se consideraron negativos.
3.7.5 Secuenciación de cADN de Norovirus
Para realizar este procedimiento, se seleccionaron las muestras de material fecal que
fueron positivas por RT-qPCR para norovirus. La secuenciación se realizó con el fin de
determinar cuáles eran los genotipos de NoV, circulantes en niños de Bucaramanga y su
área metropolitana. Los protocolos se realizaron según Kojima et al., 2002 y Vinje et al.,
2004. En el siguiente orden se prepararon los cADN para secuenciación.
El ARN de NoV GI y GII extraído a partir de una suspensión de material fecal al 10% se
utilizó para la realización de la Transcripción Reversa (RT) usando el kit AB High
Capacity cADN Reverse Transcription (Life Technologies, Carlsbad, USA).
Posteriormente, el producto de la PCR fue purificado con el kit QIAquick PCR
purification Kit (QIAgen, Valencia, USA). Estos protocolos fueron realizados de acuerdo
a las instrucciones del fabricante.
Enseguida, se realizó una PCR convencional de la región C para la genotipificación de
NoV Este producto fue visualizado mediante electroforesis en geles de agarosa al 2 %. Se
consideró positivo la presencia de una banda de 329 pb para NoV GI y de 343 pb para
NoV GII.
Posteriormente, se realizó la purificación del material genómico con el kit QIAquick PCR
purification Kit (QIAgen, Valencia, USA). Para esto, se extrajeron del gel las bandas de
cada uno de los genotipos NoV GI y NoV GII.
Finalmente, los productos de la PCR se enviaron a la compañía GENEWIZ para la
secuenciación del ADN mediante el método de secuenciación enzimática sanger.
Materiales y métodos
30
Una vez obtenidas las secuencias estas fueron analizadas, determinando la calidad del
producto secuenciado. Se analizó la calidad de la información de cada una de las bases
de las secuencias obtenidas en el cromatograma que emite el equipo de secuenciación,
considerándose un cromatograma de buena calidad cuando se observaban picos únicos,
bien separados entre sí y con poco ruido de fondo (presencia de líneas inespecíficas debajo
de las líneas que señalan las bases, indicativo de contaminación con otro ADN o
contaminación con otro cebador (normalmente el cebador reverso utilizado en la PCR).
Las secuencias obtenidas con ruido en el cromatograma fueron posteriormente clonadas y
enviadas nuevamente a secuenciación. A continuación se describen cada uno de los
protocolos previos a la secuenciación de forma detallada:
3.7.5.1 Protocolo de Transcripción Reversa (RT) del ARN de
Norovirus GI/GII
Este protocolo fue realizado para obtener cADN a partir de ARN. El master mix fue
realizado con el kit AB High Capacity cADN Reverse Transcription (Applied
Biosystems™, Foster, CA), siguiendo las instrucciones del fabricante. Todos los reactivos
se mantuvieron en hielo. Brevemente, se pipetearon 10 µl de master mix en cada uno de
los 96 tubos de PCR de 0,2 mL (Tabla 4).
Tabla 4. Componentes de reacción de transcriptasa reversa Norovirus (NovGI, NovGII).
Componentes Volumen (µl) con
Inhibidor
10x RT buffer 2
25x dNTP MIX (100mM) 0,8
10x RT random primers 2
Reverse transcriptase - MultiScribe 1
Inhibidor Rnase 1
Agua libre de nucleasa 3,2
Total 10
Luego se adicionaron 10 µl de ARN a cada pozo y se procesaron en el termociclador
C1000 Touch Thermal Cycler con las condiciones descritas en la tabla 5 (Anexo 5).
Tabla 5. Condiciones del ciclado para la PCR transcriptasa reversa
Paso 1 Paso 2 Paso 3 Paso 4
Temperatura 25 °C 37 °C 85 °C 4 °C
Tiempo 10 min 120 min 5min ∞
Materiales y métodos
31
3.7.5.2 Purificación del producto de PCR
Para este procedimiento se utilizó el cADN obtenido en el protocolo anterior (3.7.5.1).
Siguiendo las instrucciones del fabricante del Kit QIAquick PCR purification (QIAgen,
Valencia, USA), brevemente se adicionaron 5 volúmenes de buffer PB a 1 un volumen de
reacción de PCR. El mix anterior se transfirió a una columna (suministrada en el kit), la
cual se centrifugó durante 1 minuto y el volumen del tubo recolector se descartó. 750 µl
de buffer PE fueron adicionados. Posteriormente, se centrifugó durante 1 minuto,
nuevamente, el volumen del tubo recolector fue descartado y se realizó otra
centrifugación. La columna fue transferida a un tubo eppendorf de 1.5 ml nuevo.
Finalmente, se adicionaron 50 µl de buffer EB, eluyente de ADN y el producto fue
almacenado a - 20°C hasta su uso (Anexo 5).
3.7.5.3 Polymerase Chain Reaction (PCR) convencional de
la región C
Esta se realizó para la genotipificación de NoV. A partir del material genómico para NoV
GI/GII se realizó RT-PCR convencional, usando los primers que se muestran en la tabla
6, en una reacción final de 50 µl.
Tabla 6. Primers usados para la identificación de la región C del gen de la cápside viral, según protocolo
establecido por Kojima et al., 2002.
Genogrupo Primer Secuencia (5 ´- 3´) Tamaño del
producto en pb
GI G1SKF CTGCCCGAATTYGTAAATGA
329 G1SKR CCAACCCARCCATTRTACA
GII G2SKF CNTGGGAGGGCGATCGCAA
343 G2SKR CCRCCNGCATRHCCRTTRTACAT
El master Mix se realizó con Go Taq G2 Hot start Green master mix, PCR supermix
(Promega, Madison, WI, USA), como se describe en la tabla 7.
Tabla 7. PCR Master mix
Componente Volumen (μl)
Green mix 25
Primer forward 2
Primer reverse 2
Agua 18
cADN 3
Total 50
La PCR se realizó en un termociclador C1000 Touch Thermal Cycler con las condiciones
de ciclado de la tabla 8.
Materiales y métodos
32
Tabla 8. Condiciones del ciclado PCR convencional
Ciclos Tiempo Temperatura
1 3 min 94 °C
40
30 seg 94 °C
30 seg 50°C
1 Seg 72 °C
1 7 min 72 °C
La migración del material genómico amplificado fue realizado en una electroforesis en
geles de agarosa al 2 % durante 25 minutos a 200 voltios y 300 amp y luego visualizados
con Sybr Safe (Invitrogen, Foster, CA) bajo luz UV (Anexo 6).
3.7.5.4 Análisis de secuenciación y construcción del árbol
filogenético Se analizaron los resultados de la cromatografía de las regiones estables de cada cepa,
enviados por la empresa de secuenciación (GENEWIZ). Para ésto, se determinaron los
picos de cada nucleótido. Se buscó la secuencia complementaria del primer reverse usando
la página web http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html. Se realizó
alineamiento de las secuencias obtenidas de los primer forward y reverse en el software
Bioedit V 7.2.5. Posteriormente, se crearon las secuencias unificadas y las secuencias que
contenían los primers fueron eliminadas. Las secuencias unificadas sin primer, se pegaron
en el software Bioedit V 7.2.5 para realizar su respectivo alineamiento con las secuencias
referencias listadas en la tabla 10. Posteriormente se utilizó el software Mega 6.06 para la
creación de los árboles filogenéticos.
3.7.5.5 Protocolo de clonación
La clonación fue realizada con el fin de mejorar la calidad de las secuencias obtenidas en
el cromatograma. En la figura 13 se observan los detalles del protocolo de clonación
(Figura 13).
Materiales y métodos
33
Figura 13 Metodología de clonación. Modificado del protocolo pGEM®-T and pGEM®-T Easy Vector
Systems.
Fuente: https://worldwide.promega.com/-/media/files/resources/protcards/pgem-t-and-pgem-t-easy-vector-
systems-quick-protocol.pdf
3.7.5.5.1 Purificación del producto de PCR.
Este protocolo se llevó a cabo con el Kit QIAquick PCR purification (QIAgen, Valencia,
USA), según las instrucciones del fabricante (Anexo 5).
3.7.5.5.2 Ligación en el vector p-GEM
Partiendo del producto de PCR purificado con el kit QIAquick PCR purification (QIAgen,
Valencia, USA), se realizó una ligación de cada una de las muestras en el vector p-GEM,
según condiciones del fabricante. Brevemente, los tubos eppendorf que contenían el vector
P-GEM-T, control del ADN y buffer de ligación fueron centrifugados y adicionados a un
tubo de PCR de 0,2 ml, según la tabla 9.
Tabla 9. Condiciones para la ligación de ADN en vectores PGEM
Reactivos Reacción
muestras µl
Control
positivo
µl
Control
negativo
µl
2X Buffer ligación rápida, T4 ADN
ligasa 5 5 5
Vector pGEM-T (50ng) 1 1 1
Producto de PCR 3 - -
ADN control inserto - 2 -
T4 ADN ligasa (3 Unidades/µl) 1 1 1
Volumen final de agua deshionizada 10 10 10
Las reacciones se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente.
Ligación.
Se incubó a temperatura
ambiente durante
1 hora o a 4 ° C durante la
noche.
Descongelación de células
competentes en hielo. Se
añadieron 50 µl de células a 2μl
de reacción de ligación. Se incubó
en hielo durante
20 minutos.
Choque de calor
45-50 segundos
exactamente a 42 ° C
Incubación en hielo 2 minutos
Se añadió medio SOC.
Se incubó a 37 ° C
con agitación.
Placa de Petri:
Se seleccionaron
colonias blancas
Materiales y métodos
34
3.7.5.5.3 Transformación.
Una vez incubadas las reacciones se realizó la transformación. Brevemente, teniendo todo
los tubos eppendorf en hielo. A 5 µl de la reacción de ligación anterior, se le adicionaron
100 µl de células competentes. La reacción fue incubada durante 20 minutos, pasado este
tiempo se transfirieron a agua con una temperatura de 42°C durante 2 minutos, se pasaron
al hielo durante 5 minutos y se procedió a adicionar 950 µl de medio SOC (Invitrogen,
Carlsbad, USA). Este se usó en el paso final de la transformación de células bacterianas
para obtener máxima eficacia de la transformación de E.coli.
La reacción fue incubada durante 1 hora a 37 °C en agitación de 150 r.p.m. 100 µl de este
contenido se transfirieron a cajas de Petri que contenían medio Luria Bertani (LB) más
100 mg/ml de ampicilina. Estas placas fueron incubadas durante toda la noche a 30 °C.
Al día siguiente, se observaron las colonias de color blanco crecidas en las cajas de Petri.
Estas se pasaron a un nuevo medio LB y fueron incubadas toda la noche. Al siguiente día
se realizó extracción de material genético, adicionando una colonia a 20 µl de agua grado
molecular. Estos tubos se transfirieron al termociclador en una temperatura de 100 °C
durante 5 minutos, pasado este tiempo se centrifugaron durante 2 minutos y finalmente se
trasladaron a hielo durante 5 minutos para proceder con la PCR.
3.7.5.5.4 PCR para la visualización del inserto
Brevemente, en un tubo de PCR se adicionaron 12,5 µl de Green mix, 1 µl primer forward,
1 µl primer reverse, 9,5 µl de agua grado molecular y 1 µl de ADN con las condiciones
de la PCR convencional de la tabla 7.
La migración del material genómico amplificado fue realizado en una electroforesis en
geles de agarosa al 2 % durante 25 minutos a 200 voltios y 300 amp y luego visualizados
con Sybr Safe (Invitrogen, Foster, CA) bajo luz UV (Anexo 6).
Una vez se observaron los productos, se procedió a cultivar las colonias originales que
contenían las muestras en caldo LB más ampicilina, toda la noche en agitación a 150 r.p.m
(Anexo 7).
3.7.6 Extracción del plásmido
Brevemente, con el kit QIAprep Spin Miniprep (QIAgen, Canadá, USA) de acuerdo a las
instrucciones del fabricante. El pellet de la bacteria E. coli crecida fue resuspendido en
250 µl de buffer P1.
Posteriormente, fue centrifugado durante 1 minuto a máxima revolución. Se adicionaron
250 µl de buffer P2 y se mezclaron por inversión de 4 a 6 veces. Luego, se le adicionaron
350 µl de buffer N3, nuevamente se mezclaron por inversión de 4 a 6 veces y finalmente
Materiales y métodos
35
se centrifugaron por 10 minutos a 13.000 r.p.m. Este contenido fue transferido a una
columna suministrada por el kit.
Esta columna se centrifugó durante 30 a 60 segundos, el residuo se descartó, la columna
fue lavada con 500 µl buffer PB, se centrifugó durante 1 minuto, se lavó nuevamente con
750 µl buffer PE y nuevamente se centrifugó.
La columna se transfirió a un tubo eppendorf de 1,5 ml nuevo para eluir la muestra. Se
adicionaron 50 µl de buffer EB, se centrifugó durante 1 minuto a máxima revolución
(Anexo 8).
El ADN obtenido a una concentración 100 ng/µl fue enviado para secuenciación a
GENEWIZ con los primers del plásmido. Forward: 5´-
(CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC)-3´ y reverse: 5´-
(TCACACAGGAAACAGCTATGAC)-3´.
3.7.7. Árbol filogenético norovirus
Una vez tenidas las secuencias, se realizó el árbol filogenético usando el test Maximun,
Likelihood tree con el modelo de los dos parámetros de kimura (K2) y Gamma (G)
(MEGA 6.06). Este fue diseñado incluyendo las secuencias disponibles de grupos
genéticos conocidos según Vinje et al., 2015 en el Genbank (Tabla 10).
Tabla 10 Genes de la región C de la cápside de referencia de norovirus GI y GII.
Genotipo
Vp1
Genotipo
Región C Cepa de referencia
N° de acceso
GenBank
Localización
Aislamiento Referencia
GI
GI GI.1 GI/Hu/US/1968/GI.1/Norwalk M87661 Houston Jiang et al., 1993
GI.1 NGI/Hu/GI/US/290507-3/2007/SGP GQ925106 Singapore Aw et al., 2010
GI.1 NGI/Hu/NoV/22_2/2006/SE EU007717 Sweden - Europa Lysen et al., 2009
GI GI.2 GI/Hu/GB/1991/GI.2/Southampton L07418 Southampton -
Inglaterra
Lambden et al., 1993
GI.2 NGI/Hu/GI.2/NJ22/CHN/2014 KP753278 China Wang et al., 2015
GI.2 GI/Hu/HuzhouNS13170/2013/CHN KM462611 China Wu et al.,2015
GI.2 NGI/Hu/GI.2/131015/BE-3540 KM349493 Belgica Wollants et al., 2015
GI.2 NGI/Hu/GI.1/2005/6067/Bishkek/RUS FJ383887 Rusia -Bishkek Podkolzin et al., 2009
GI GI.3a GI/Hu/SA/1990/GI.3/DesertShield395 U04469 Bethesda,
Maryland
Lew et al., 1994
GI.3c Norovirus Hu/GI/Otofuke/1979/JP AB187514 Japón Wakuda et al.,.2005
GI GI.4 GI/Hu/JP/1987/GI.4/Chiba407 AB042808 Tokyo - Japón Someya et al., 2000
GI GI.5 NGI/Hu/GI/2003/3168/Moscow/RUS FJ383818 Moscow, Rusia Podkolzin et al.,2009
GI.5b GI/Hu/JP/1999/GI.5/SzUG1 AB039774
Musashi-
murayama,
Tokyo, Japan
Katayama et al.,2002
GI GI.6b GI/Hu/GB/1995/GI.6/Sindlesham AF093797 Berlin -Germany Schreier et al.,2000
GI GI.7b NGI/Hu/GI.7/Providence191/2010/USA JN899243 Atlanta - USA Barclay et al., 2012
GI GI.8 GI/MO14/aug.2010/BRA KR053451.1 Brasil, Belem Teixeira et al., 2010
Materiales y métodos
36
GI GI.9 CAIQ12110628 nonstructural
polyprotein KF586507.1 China
Han et al., 2012
GII
GII GII.1 GII/Hu/US/1971/GII.1/Hawaii U07611 Bethesda Lew et al., 1994
GII GII.2 GII/Hu/GB/1994/GII.2/Melksham X81879 Southampton Green et al., 2005
GII GII.3a GII/Hu/CA/1991/GII.3/Toronto U02030 Bethesda Lew et al., 1994
GII.3b GII/Hu/AR/1999/GII.3/Arg320 AF190817 Virginia - USA Jiang et al., 1999
GII.3-GII.16 GII/Hu/PV_Voelk0018/2013/DEU KM289172 Germany Hoehne and Zeitlmann,
2014
GII GII.4. Bristol GII/Hu/GB/1993/GII.4/Bristol X76716 Southampton Green et al., 1994
GII GII.4 New
Orleans GII/Hu/US/2009/GII.4/NewOrleans GU445325 USA Vega et al., 2011
GII.4
NSW001P GII/Hu/AU/2008/GII.4/NSW001P GQ845367 Australia Eden et al., 2010
GII GII.4 Sydney GII/Hu/AU/2012/GII.4/Sydney JX459908 Australia Eden et al., 2013
GII.4 GII/Hu/GII.4 KP868597 USA Montazeri et al., 2015
GII GII.5 GII/Hu/GII.P22/GII.5/Kaohsiung/12-
AV-1/2012/TW KM036378 Taiwan Wu et al., 2015
GII GII.6b GII/Hu/US/1994/GII.6/Miami292 AF414410 Miami Ando et al., 2001
GII.6 GII/Hu/GII.4 KM267742 Taiwan Wu et al., 2015
GII GII.7 Hu/GII.7/NSW6038/2014/AU KT239630.1 Australia Lim et al., 2016
GII GII.8 Hu/GII.8/160/2008/USA KJ415787.1 USA Hu,Y., et al., 2015
GII GII.9 GII/Hu/US/1997/GII.9/VA97207 AY038599 Cincinnati - USA Jiang et al., 2002
GII GII.10 Hu/GII.10/NZ14608/2014/NZ KT151035.1 New Zealand Lim et al., 2015
GII GII.11 GII/Po/JP/1997/GII.11/Sw918 AB074893 Japon Sugieda, et al., 2002
GII GII.12 HU/BRA/2009/GII.12/Rio Grande KJ179760.1 Brasil Andrade et al., 2014
GII GII.13 GII/Hu/GII.13/10N4441/2010/NP AB810006 Nepal Hoa Tran et al., 2015
GII GII.14 GII/Hu/GII/Moscow/7844/2005/RUS FJ264893 Moscow, Rusia Podkolzin et al., 2008
GII.14 GII/Hu/GII.14 KR904230 South Afríca Mans et al., 2015
GII GII.15 HU/BRA/2011/GII.15/Rio Grande KJ179756.1 Brasil Andrade et al., 2014
GII GII.16 GII/Hu/US/1999/GII.16/Tiffin AY502010 USA Zheng et al., 2006
GII GII.17 GII/Hu/US/2002/GII.17/CS-E1 AY502009 USA Zheng et al., 2006
GII GII.18 GII/Po/US/2003/GII.18/OH-QW101 AY823304 USA Wang et al., 2005
GII GII.19 GII/Po/US/2003/GII.19/OH-QW170 AY823306 USA Wang et al,., 2005
GII GII.20 Hu/GII.20/WA344G/2014/AU KT239644.1 Australia Lim et al., 2016
GII GII.21 HU/BRA/2007/GII.21/Rio Grande KJ179758.1 Brasil Andrade et al., 2014
GII GII.22 GII/Hu/JP/2003/GII.22/Yuri AB083780 Japón: Akita Kuzuguchi ,et al., 2009
3.7.8 Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) para la
identificación de Rotavirus
Se utilizó un ELISA directo para la detección de antígenos de rotavirus, de acuerdo a las
instrucciones del fabricante AccuDiag™ Rotavirus (Fecal) ELISA Kit (Diagnostic
Automation®, Calabasas, USA). En este ELISA en la primera incubación, los antígenos
de rotavirus presentes en las muestras de materia fecal son capturados por los anticuerpos
policlonales unidos en cada uno de los pozos de la placa. La segunda incubación añade un
Materiales y métodos
37
anticuerpo tipo IgG anti-rotavirus. La tercera incubación contiene peroxidasa de rábano
para la reacción tipo sándwich. Después de realizar lavados para eliminar la enzima no
unida, se añade un cromógeno que desarrolla un color azul en presencia del complejo
enzima y peróxido de hidrógeno. La solución de parada termina la reacción generando un
color amarillo.
Brevemente, las muestras de materia fecal se descongelaron y se realizó una dilución 1:5
mediante la adición de 1 gramo de materia fecal a 4 ml de buffer de lavado diluido. Se
mezclaron bien y se separó el número de pozos necesarios (número de muestras más dos
pozos para los controles) para la reacción. Se añadieron 100 μl de control negativo para el
número 1 y 100 μl de control positivo para el número 2. Posteriormente, se adicionaron
100 μl de sobrenadante de las heces, se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos
y luego se realizaron 3 lavados de la placa con buffer de lavado. Luego, se añadieron 2
gotas de reactivo 1 que contiene anticuerpos policlonales anti-rotavirus con color azul y
timerosal, a cada pocillo, la placa fue incubada a temperatura ambiente durante 5 minutos
y luego se lavó nuevamente 3 veces. Después de esto, se añadieron 2 gotas de reactivo 2
que contenía suero anti-cabra conjugada con peroxidasa de color rojo y timerosal a cada
pocillo y la placa fue incubada a temperatura ambiente durante 5 minutos. Posterior a esto,
se lavó 3 veces y se adicionaron 2 gotas de cromógeno que contenía tetrametilbenzidina
(TMB) y peroxidasa a cada pocillo. Esto se incubó a temperatura ambiente durante 5
minutos. La reacción se detuvo con 2 gotas de solución ácido fosfórico a cada pocillo.
Finalmente, se realizó la lectura de los resultados en un espectrofotómetro mediante una
lectura bicromática a 450nm y 620-650 nm.
La interpretación de los resultados se realizó considerando una muestra reactiva, a aquella
que evidenciara color amarillo y en el espectrofotómetro la lectura mostrara niveles
superiores a 0.15. Controles positivos y negativos fueron utilizados (Anexo 9).
3.7.8.1 PCR para la identificación y posterior secuenciación de
rotavirus
A las muestras de materia fecal positivas en la prueba de ELISA para rotavirus, se les
realizó extracción de ARN viral (3.7.1), transformación de ARN en cADN (3.7.5.1) y
purificación del producto (3.7.5.2) de acuerdo a los protocolos previamente descritos.
Posterior a esto, se realizó una PCR convencional para los genes VP4 y VP7 (Aly et al.,
2015), usando los primers que se muestran en la tabla 11 en una reacción final de 50 µl.
Tabla 11. Oligonucleótidos primers para la identificación de los genes VP4 y VP7, según protocolo
establecido por Aly et al., 2015.
Gen Primer Secuencia (5 ´- 3´) Tamaño del
producto en pb
VP4 Forward TAT GCT CCA GTN AAT TGG
628 Reverse ATT GCA TTT CTT TCC ATA ATG
VP7 Forward ATG TAT GGT ATT GAA TAT ACC AC
844 Reverse AAC TTG CCA CCA TTT TTT CC
Materiales y métodos
38
El master mix se realizó con Go Taq G2 Hot start Green master mix, PCR supermix
(Promega, Madison, WI, USA), como se describió en la tabla 7.
La PCR fue realizada en un termociclador C1000 Touch Thermal Cycler con las siguientes
condiciones de ciclado para los genes VP4 y VP7 (tablas 12 y 13).
Tabla 12. Condiciones del ciclado VP4
Ciclos Tiempo Temperatura °C
1 10 min 95
35
1 min 94
1 min 50
1 min 72
1 10 min 72
Tabla 13. Condiciones del ciclado VP7
Ciclos Tiempo Temperatura °C
1 10 min 95
40
1 min 94
3 min Gradiente 45 a 65
1 min 72
1 10 min 72
La migración del material genómico amplificado fue realizado en una electroforesis de
geles de agarosa al 2 % durante 25 minutos a 200 voltios y 300 amp y luego visualizados
con Sybr Safe (Invitrogen, Foster, CA) bajo luz UV (Anexo 6). Las muestras positivas en
la PCR se purificaron y fueron enviadas para secuenciación siguiendo el mismo protocolo
descrito para norovirus (Anexo 10).
Posteriormente, se realizó el árbol filogenético usando el test Maximun, Likelihood tree
con el modelo de Tamura de los 3 parámetros (T92) y Gamma (G) (MEGA 6.06). Este
fue diseñado incluyendo las secuencias disponibles en el Genbank (Tabla 14).
Tabla 14. Genes VP4 / VP7 referencia de rotavirus.
Genotipo
Proteína VP4 Cepa de Referencia
N° de acceso
GenBank
Localización
Aislamiento Referencia
P8 RVA/Human/SA/Taif-3/2013/G1P[8] KP281281.1 Saudi Arabia:
Al-Taif Abdel-Moneim et al., 2015
P8 Human-wt/BRA/AC314/2012/G12P[8] KT025876.1 Brasil Neves et al., 2016
P8 RVA/Human-wt/USA/VU12-13-
149/2013/G12P[8] KT919043.1
USA: Davidson
County, TN Das et al., 2015
P8 Hu-wt/ITA/PA144/12/2012/G12P8 KU048596.1 Italia De Grazia et al., 2016
P8 RVA/Human
wt/BEL/BE1001a/2008/G9P[8] JN849127.1 Belgica Zeller et al., 2012
P8 RVA/Human wt/BG/2013/G9P[8] KC484721.1 Bangladesh:
Matlab Afrad et al., 2013
P8 RVA/Human-
wt/USA2008747369/2008/G3P[8] HM773659.1 USA Spiro et al., 2014
Materiales y métodos
39
P8 RVA/Human-
wt/ITA/PR1015/2013/G3P[8] KT988296.1 Italia Medici et al., 2015
P8 RVA/Human-
wt/ITA/TO01/2012/G4P[8] KF202511.1 Italia Ianiro. et al., 2014
P8 Hu/CU-B1775/KK/2013/G2P[4] KT007888.1 Thailandia Chieochansin et al., 2015
P4 Hu/CU-B1912/KK/2014/G1P[8] KT007949.1 Thailandia Chieochansin et al., 2015
Genotipo
Proteína VP4 Cepa de referecnia
N° de acceso
GenBank
Localización
Aislamiento Autores / año
G9 Human/KOR/Seoul1354/2010/G9P[4] KF812606.1 Korea del sur Han et al., 2014
G9 RVA/Human-wt/SVN/SI-
1975/12/2012/G9P[8] KJ432723.1 Slovenia Steyer et al., 2015
G9 RVA/Human-
wt/Italy/PG08/2012/G9P[8] KM205791.1 Italia Delogu et al., 2015
G12 RVA/Human-
wt/PRY/1471SR/2006/G12P[9] KJ412580.1
Paraguay:
Asuncion Kirkness et al., 2015
G12 Hu-wt/ITA/PA144/12/2012/G12P8 KU048640.1 Italia De Grazia et al., 2016
G12 Hu-wt/ITA/RG179/13/2013/G12P8 KU048654.1 Italia De Grazia et al., 2016
G2 RVA/Human-
wt/BRA/RS18922/2010/G2P[4] KJ638639.1 Brasil Gomez et al., 2014
3.8 ASPECTOS ÉTICOS
Esta investigación se considera sin riesgo, de acuerdo con el artículo 11 de la resolución
No.008430 de 1993 del Ministerio de Salud. El proyecto multicéntrico en el cual se anida
este trabajo de grado fue aprobado por los comités de ética de la Universidad de Santander
(UDES), Vanderbilt University de Estados Unidos y de las instituciones incluidas en el
estudio. Las muestras y la información de los pacientes fueron obtenidas directamente de
los padres o acudientes mediante un cuestionario previa firma del consentimiento
informado.
3.9 ANÁLISIS DE DATOS
Los datos de este estudio fueron archivados en bases de datos elaboradas en la REDcap
https://redcap.vanderbilt.edu (Página web para la construcción, gestión de encuestas y
bases de datos en línea, que apoya la captura de datos para estudios de investigación).
Toda la información requerida fue manejada con códigos. Una vez la base de datos estaba
en la REDcap esta fue descargada en una hoja de Microsft Excel (Santa Rosa, California,
2013). En este estudio se determinó la prevalencia de cada virus en las muestras fecales
mediante porcentajes. Se determinaron diferencias significantes entre los 6 virus
estudiados, tanto en casos como en controles, usando el test X2. Valores p < 0.05 se
consideraron estadísticamente significativos. Se determinaron los odd ratio (OR) con los
intervalos de confianza del 95 % usando el software Epidat 3.1 (Área de análisis de salud
y sistemas de información sanitaria, Organización panamericana de la salud, enero 2006).
Resultados
40
4. RESULTADOS
4.1. Datos sociodemográficos y factores de riesgo
En este estudio se seleccionaron 810 muestras de niños menores de 5 años de
Bucaramanga y su área metropolitana, que asistieron a seis instituciones de salud. Del
total de las muestras analizadas 374 (46,2 %) y 436 (53,7 %) fueron del sexo femenino
y masculino, respectivamente. El promedio de edad en la población de estudio fue de
20 meses (DS: 14,7) con un rango entre 0 meses (días de nacido) y 59 meses. Estos se
agruparon en tres grupos pareados 1:1entre casos y controles, grupo 1 (0 a 11 meses),
2 (12 a 23 meses) y 3 (24 a 59 meses). El promedio de edad en meses de cada grupo
fue de 5,4 (DS: 4,5), 15,6 (DS: 3,4), 38,2 (DS: 9,6) para controles y 6,8 (DS: 2,9), 16,9
(DS: 3,3), 37,8 (DS: 10,2) para casos (Tabla 15).
Durante el período de estudio se realizó una encuesta sobre aspectos epidemiológicos
y clínicos. Se recolectaron datos de los cuidadores principales responsables del infante,
acceso a servicios de salud y antecedentes vacunales. Adicionalmente, se evaluaron
las principales condiciones ambientales y socioeconómicas. Entre éstos, la frecuencia
de la recolección de basuras, procedencia del agua de la casa, la forma de tratamiento
del agua y la eliminación de la misma, el contacto con animales durante los últimos 7
días antes de la encuesta.
Los niños incluidos procedían de los estratos desde 1 al 6, siendo el estrato 3 el de
mayor frecuencia en los casos (31,3 %) y en el de los controles el 2 (34,3%). La
mayoría de los niños tanto en casos como en controles habían tenido durante el periodo
anterior al muestreo contacto con animales (57,5% y 60,2% respectivamente). Sin
embargo, la mayor frecuencia fue para perros en ambos grupos, seguido de gatos.
Los resultados de este cuestionario también mostraron que existe una recolección
periódica de las basuras de 2 a 3 veces por semana, lavado de manos con jabón y
disposición de las aguas residuales tanto en casos como en los controles. Entre los
antecedentes vacunales para rotavirus el mayor porcentaje de los niños tenían entre
uno a dos dosis (Tabla 15).
Tabla 15. Datos sociodemográficos y factores de riesgo para EDA en la población de estudio
Variables Casos (405) Controles (405)
Sexo n (%) n (%)
Femenino 181 (44,6) 193 (47,6)
Masculino 224 (55,3) 212 (52,3)
Edad
0 – 11 meses 126 (31,1) 126 (31,1)
12 – 23 meses 145 (36,8) 145 (36,8)
24 – 59 meses 134 (33,0) 134 (33,0)
Estrato
1 104 (2,6) 103 (25,4)
2 118 (29,1) 139 (34,3)
3 127 (31,3) 115 (28,3)
4 44 (10,8) 37 (9,1)
5 3 (0,7) 3 (0,7)
Resultados
41
6 3 (0,7) 1 (0,2)
Desconoce 6 (1,4) 7 (1,7)
Educación Cuidadores Principales
Escuela primaria 69 (17) 55 (13,5)
Secundaria 218 (53,8) 191 (47,1)
Tecnología 59 (14,5) 78 (19,2)
Universitario 51 (12,5) 74 (18,2)
Posgrado 0 (0) 4 (0,9)
Otro 0 (0) 0 (0)
Ninguno 4 (0,9) 3 (0,7)
Desconoce 4 (0,9) 0 (0)
Acceso a servicios de salud
EPS subsidiada 148 (36,5) 164 (40,4)
EPS contributiva 224 (55,3) 134 (33)
Privado – Paga directamente 15 (3,7) 99 (24,4)
Privado – medicina prepagada 12 (2,9) 2 (0,4)
Desconoce 1 (0,2) 0 (0)
No respondió 4 (0,9) 6 (1,4)
Antecedentes Vacúnales (Vacuna de
Rotavirus)
Si 384 (94,8) 382 (94,3)
No 16 (3,9) 22 (5,4)
Desconoce 5 (1,2) 1 (0,2)
N° de dosis de vacuna Rotavirus
1 10 (2,6) 34 (8,9)
2 358 (93,2) 335 (87,6)
3 11 (2,8) 11 (2,8)
Desconoce 5 (1,3) 2 (0,5)
Contacto con animales
Ninguno 172 (42,4) 244 (60,2)
Si tuvo contacto 233 (57,5) 161 (39,7)
Aves 16 (6,8) 16 (9,9)
Gatos 62 (26,6) 63 (39,1)
Perro 133 (57,0) 129 (80,1)
Pollo 10 (4,2) 12 (7,4)
Cerdo 2 (0,8) 0 (0)
Vacas 1 (0.4) 0 (0)
Caballos 0 (0) 0 (0)
Cabra 0 (0) 0 (0)
Reptiles (Serpiente, lagartija, Tortuga) 1 (0,4) 2 (1,24)
Anfibios (Ranas, Salamandras) 0 (0) 0 (0)
Insectos 0 (0) 0 (0)
Roedores 3 (1,2) 3 (1,86)
Otros 5 (2,1) 3 (1,86)
Desconoce 0 (0) 1 (0,62)
Frecuencia de la recolección de basuras
Ninguno 5 (1,2) 2 (0,4)
Si hubo frecuencia 400 (98,7) 403 (99,5)
Diario 22 (5,5) 26 (6,4)
2 – 3 días en la semana 374 (93,5) 372 (92,3)
Una vez a la semana 4 (1) 5 (1,2)
Procedencia del agua de la casa
Agua de la llave 402 (99,2) 399 (98,5)
Agua de la llave fuera de casa 1 (0,2) 3 (0,7)
Agua de pozo comunal 1 (0,2) 2 (0,4)
Camión Cisterna 0 (0) 0 (0)
Resultados
42
Otro 1 (0,2) 1 (0,2)
Lavado de manos con jabón
Si 383 (94,5) 398 (98,2)
No 22 (5,4) 3 (0,7)
Desconoce 0 (0) 4 (0,9)
Tratamiento del agua
No 148 (36,5) 145 (35,8)
Si se trata el agua 257 (63,4) 260 (64,1)
Hervida 220 (85,6) 237 (91,1)
Filtrada 37 (14,3) 23 (8,8)
Con límpido 0 (0) 0 (0)
Desconoce 0 (0) 0 (0)
Eliminación de aguas residuales
Ninguno 1 (0,2) 0 (0)
Si hay eliminación de aguas residuales 404 (99,7) 405 (100)
Alcantarillado 398 (98,5) 403 (99,5)
Tanque séptico 5 (1,2) 2 (0,4)
Calle 0 (0) 0 (0)
Desconoce 1 (0,2) 0 (0)
*Las categorías no son exhaustivamente, ni mutuamente excluyentes debido a las respuestas múltiples
para algunas preguntas del cuestionario, por lo tanto el porcentaje de positividad es mayor de 100.
4.2. Estudio viral
4.2.1. Proporción de agentes virales
En 222 (27,4%) de las 810 muestras analizadas se logró la identificación de 244
(30,1%) de uno o más de los virus analizados, 184 (45,4%) en casos y 60 en controles
(14,8 %). 120 (14,8%) NoV GI/GII fueron identificados, existiendo una diferencia
estadísticamente significativa entre casos y controles para norovirus GII (p = 0.00). El
segundo virus con mayor prevalencia fue RoV en 42 (5,1%), seguido de 42 (5,1%)
SaV con p = 0,42, 26 (3,2%) AsV p = 0,02 y AdV 14 (1,7 %, p = 0,00) (Tabla 16).
Resultados
43
Tabla 16. Proporción de infecciones por virus entéricos mediante ensayos moleculares y ELISA en
casos y controles.
*En algunos pacientes las identificaciones fueron múltiples (varios tipos de virus), por lo tanto, no se
puede asociar la presencia de un solo tipo de virus a cada caso o control.
Entre los casos se identificó con mayor frecuencia NoVGII (OR 4,93 IC 95% 2,85-
8,53), seguido de RoV (OR 22,08 IC 95% 5,29-92,01) y SaV (OR 1,35 IC 95 % 0,72-
2,53). NoVGI, AdV y AsV mostraron porcentajes que variaron entre 3,2 y 4,6. Por el
contrario, en los controles se identificó con mayor frecuencia SaV (4,4%), seguido en
menor proporción de NoVGII y NoVGI (4,1 % y 3,7 %). Las prevalencias de AdV,
RoV y AsV variaron entre 0,2 % y 1,7 % (Tabla 16).
Cabe resaltar que todos casos a los que se les identificó RoV, tenían la vacuna. Los
dos controles no habían sido vacunados.
4.2.2. Detección viral en meses del año entre casos y
controles
Durante los meses de agosto del 2013 a diciembre del 2014 se presentaron infecciones
por alguno de los 6 agentes virales. Mayo fue el mes en donde se identificó el mayor
número de casos de NoVGI Gráfica 1 (A). Por el contrario NoVGII, se identificó en
los casos durante los meses de marzo, julio, agosto, septiembre, octubre y noviembre
y en los controles durante el mes de diciembre del año 2013 (B). La mayor
identificación de RoV se realizó en los casos en comparación con los controles, siendo
agosto del año 2014 el mes en donde se observó mayor detección viral para los
controles. Al mismo tiempo, en este mes la identificación disminuyó en los casos (C).
Para SaV, AsV y AdV la mayor identificación en los casos se observó en el mes de
mayo del 2014 (D, F, G).
Grupo Total
Norovirus
GI OR - IC
Norovirus
GII OR - IC
Sapovirus
OR - IC
Astrovirus
OR - IC
Adenovirus OR -
IC
Rotavirus
(ELISA) OR - IC
Total
positivos
n (%)
Total
negativos
n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%)
Casos 405 16 (3,9) 1,06
(0,52 – 2,19)
72 (17,7) 4,93
(2,85 -8,53)
24 (5,9) 1,35
(0,72 - 2,53)
19 (4,6) 2,79
(1,16 - 6,73)
13 (3,2) 13,23
(1,72 -
101,63
)
40 (9,8) 22,08
(5,29 - 92,01)
184 (45,4) 221 (54,5)
Controles 405 15 (3,7) 17 (4,1) 18 (4,4) 7 (1,7) 1 (0,2) 2 (0,4) 60 (14,8) 345 (85,1)
Total 810 31 (3,8) 89 (10,9) 42 (5,1) 26 (3,2) 14 (1,7) 42 (5,1) 244 (30,1) 566 (69,8)
Valor p 1.00 <0.01 0,42 0,02 <0.01 <0.01 <0.01
Resultados
44
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
N°
de P
osi
tiv
os
Meses
Norovirus GI
Casos
Controles
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
N°
de P
osi
tiv
os
Meses
Norovirus GII
Casos
Controles
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
N°
de P
osi
tiv
os
Meses
Rotavirus
Casos
Controles
A
B
C
Resultados
45
Gráfica 1. Identificación de norovirus GI/GII (A, B), rotavirus (C), sapovirus (D), astrovirus (E) y
adenovirus (F), durante los meses agosto 2013 a diciembre 2014.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
N°
de P
osi
tiv
os
Meses
Sapovirus
Casos
Controles
02468
1012141618
N°
de
Posi
tivos
Meses
Astrovirus
Casos
Controles
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
N°
de P
osi
tiv
os
Meses
Adenovirus
Casos
Controles
D
E
F
Resultados
46
4.2.3 Detección viral entre casos y controles por
rangos de edad y durante los meses de estudio
En la gráfica 2 se muestra la detección viral en casos y controles para cada tipo de
virus en cada mesa del periodo de estudio. NoVGI fue identificado en los tres grupos
de edad tanto en casos como en controles (A). NoVGII se identificó más en los casos
que en los controles, siendo los niños de 1 a 2 años los de mayor identificación (B). El
mes de mayo fue donde se presentaron las mayores identificaciones en casos de niños
de 1 a 2 años con NoVGI y para NoVGII fue el mes de septiembre, con 10 casos.
SaV y RoV presentaron la mayor identificación en los casos de niños de 2 a 5 años,
principalmente en los meses de mayo a octubre (C y D).
AsV se presentó en mayor prevalencia en el mes de mayo en niños de 1 a 5 años (E) y
AdV presentó positividad en los casos en los tres grupos de edad (F).
N°
Po
sitiv
os
Meses
Norovirus GI < 1 año
Casos
Controles
0
1
2
3
N°
Po
sitiv
os
Meses
Norovirus GI 1 a 2 años
Casos
Controles
A
Resultados
47
0
1
2
N°
Po
sitivo
s
Meses
Norovirus GI 2 a 5 años
Casos
Controles
0
1
2
3
4
5
N°
Po
sitiv
os
Meses
Norovirus GII < 1 año
Casos
Controles
0
2
4
6
8
10
12
N°
Po
sitiv
os
Meses
Norovirus GII 1 - 2 años
Casos
Controles
B
Resultados
48
0
1
2
3
4
5
N°
Po
sitivo
s
Meses
Norovirus GII 2 a 5 años
Casos
Controles
0
1
2
3
N°
Po
sitiv
os
Meses
Sapovirus < 1 año
Casos
Controles
0
1
2
3
4
5
6
N°
Po
sitiv
os
Meses
Sapovirus 1 - 2 años
Casos
Controles
C
Resultados
49
0
1
2
3
N°
Po
sitivo
s
Meses
Sapovirus 2 - 5 años
Casos
Controles
0
1
2
3
4
N°
Po
sitiv
os
Meses
Rotavirus < 1 año
Casos
Controles
0
1
2
3
4
N°
Po
sitiv
os
Meses
Rotavirus 1 - 2 años
Casos
Controles
D
Resultados
50
0
1
2
3
4
5
N°
Po
sitivo
s
Meses
Rotavirus 2 - 5 años
Casos
Controles
0
1
2
3
N°
Po
sitiv
os
Meses
Astrovirus < 1 año
Casos
Controles
0
1
2
3
N°
Po
sitiv
os
Meses
Astrovirus 1 - 2 años
Casos
Controles
E
Resultados
51
0
1
2
3
4N
°p
osi
tivo
s
Meses
Astrovirus 2 a 5 años
Casos
Controles
0
1
2
N°
Po
sitiv
os
Meses
Adenovirus < 1 año
Casos
Controles
0
1
2
3
N°
Po
sitiv
os
Meses
Adenovirus 1 - 2 años
Casos
Controles
F
Resultados
52
Gráfico 2. Identificación de norovirus GI / GII (A, B), rotavirus (C), sapovirus (D), astrovirus (E) y
adenovirus (F), durante los meses agosto 2013 a diciembre 2014 en los tres rangos de edad.
4.2.4 Detección viral en meses del año por sexo entre
casos y controles
La gráfica 3 evidencia los tipos de virus analizados con respecto al sexo tanto en casos
como en controles y durante el período de estudio. NoVGI, se identificó en los casos
del sexo femenino con 2 en el mes de febrero y 2 en mayo. Se detectaron 6 positivos
en los controles de este mismo sexo, repartidos en los meses de septiembre y octubre
del 2013, febrero, junio, septiembre del 2014. En el sexo masculino, se presentaron en
6 casos y 9 en controles (A).
NoVGII tuvo mayor identificación en 44 casos del sexo masculino a diferencia de 28
casos en el sexo femenino. El mes septiembre del 2014, fue el mes que presentó 8
casos tanto del sexo femenino como en masculino, seguido de 5 en noviembre en el
masculino y 4 en el femenino. Este mismo agente se presentó en solo 7 y 10 de los
controles del sexo femenino y masculino, respectivamente (B).
En general RoV se detectó en igual número de los casos para los dos sexos, 20 en el
femenino, 20 en el masculino. Al igual que 1 control del sexo femenino y 1 control del
masculino. 4 de los casos del sexo femenino fueron en el mes de octubre. Los casos
del sexo masculino, estaban repartidos, 2 en el mes de septiembre del 2013, 2 en
noviembre del 2013, 2 en enero, 2 en mayo, 2 en junio, 4 en julio, 2 septiembre y 4
octubre (C).
Del total de los 17 casos en el que se aisló SaV en el sexo masculino, 6 se presentaron
en el mes de mayo, siendo el mes con mayor identificación, a diferencia de 3 de los 10
controles fueron en el mes de noviembre del 2013, seguido de 2 en el mes de octubre
del 2013. En el sexo femenino se presentaron 7 casos y 8 controles, 1 caso, 1 control
en octubre del 2013, 1 caso en diciembre del 2013, 1 control en abril, en mayo 1 caso
con 2 controles, 1 control en junio, 1 caso en julio, agosto, en octubre del 2014 un caso,
2 controles, un caso en noviembre y diciembre (D).
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
N°
Po
sitivo
s
Meses
Adenovirus 2 - 5 años
Casos
Controles
Resultados
53
AsV fue identificado en 9 casos y 4 controles del sexo femenino y en 10 casos y 3
controles del masculino. Mayo fue el mes con mayor número de casos, 3 del sexo
femenino y 3 del masculino. Los controles en el sexo femenino fueron positivos
durante los meses de mayo, julio, agosto, octubre, a diferencia del sexo masculino que
fueron en septiembre del 2013, junio y agosto del 2014 (E).
AdV se detectó en 3 y 10 de los casos de los sexos femenino y masculino,
respectivamente. Durante el año de estudio no se identificaron controles del sexo
femenino para este agente viral, en el sexo masculino solo se presentó en un control
durante mayo (F).
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
N°
de
Posi
tivos
Meses
Norovirus GI
Masculino Controles
Masculino Casos
Femenino Controles
Femenino Casos
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
N°
de
Posi
tivos
Meses
Norovirus GII
Masculino Controles
Masculino Casos
Femenino Controles
Femenino Casos
A
B
Resultados
54
0
2
4
6
8
10
N°
de
Posi
tivos
Meses
Rotavirus
Masculino Controles
Masculino Casos
Femenino Controles
Femenino Casos
-1
1
3
5
7
9
11
13
15
N°
de
Posi
tivos
Meses
Sapovirus
Masculino Controles
Masculino Casos
Femenino Controles
Femenino Casos
0
1
2
3
4
5
6
78
9
10
N°
de
Posi
tivos
Meses
Astrovirus
Masculino Controles
Masculino Casos
Femenino Controles
Femenino Casos
D
E
C
Resultados
55
Gráfico 3. Identificación de norovirus GI/GII (A, B), rotavirus (C), sapovirus (D), astrovirus (E) y
adenovirus (F), durante los meses agosto 2013 a diciembre 2014 en el sexo femenino y masculino.
4.2.5 Coinfecciones virales en casos y controles
De los 222 niños, se presentó coinfección en 201 de los 244 agentes virales
identificados. Las infecciones fueron únicas y en 43 se observaron coinfecciones. Se
observaron 40 infecciones dobles entre las que se encuentran principalmente
AsV/AdV (2,5%), AsV/RoV (7,5%), SaV/AsV (2,5%), SaV/NoVGI (10%),
SaV/NoVGII (2,5%), SaV/RoV (5%), NovGI/GII (2,5%), AdV/NoVGII (2,5%),
NoVGI/RoV (10%), NoVGII/RoV (10%) y en 3 se observaron infecciones triples con
la presencia de AsV, SaV y NoVGII (Tabla 17).
Tabla 17. Proporción de coinfecciones por virus entéricos.
En el rango de edad de 12 a 23 meses de los casos se identificó el mayor porcentaje de
infecciones únicas y coinfecciones (Tabla 18).
00,5
11,5
22,5
33,5
44,5
5N
°d
e P
osi
tivos
Meses
Adenovirus
Masculino Controles
Masculino Casos
Femenino Controles
Femenino Casos
Virus
Infección
Única
Coinfección
(2 virus)
Coinfección
(3)
n % n % n %
Norovirus GI 24 11,9 7 17,5 - -
Norovirus GII 81 40,3 7 17,5 1 33,3
Rotavirus 31 15,4 11 27,5 - -
Sapovirus 33 16,4 8 20 1 33,3
Astrovirus 20 10,0 5 12,5 1 33,3
Adenovirus 12 6,0 2 5 - -
Total 201 82,3 40 16,3 3 1,2
F
Resultados
56
Tabla 18. Proporción de coinfecciones por virus entéricos según rangos de edad
Virus
Infección Única Confección (2 ó 3)
0 - 11 meses 12 - 23 meses 24 - 59 meses 0 - 11 meses 12 - 23 meses 24 - 59 meses
Casos
n=33
Controles
n=21
Casos
n=58
Controles
n=22
Casos
n=52
Controles
n=15
Casos
n=5
Controles
n=0
Casos
n=9
Controles
n=0
Casos
n=6
Controles
n=1
n % n % n % n % n % n % n % n % n % n % n % n %
Norovirus GI 2 6,1 4 19 3 5,17 5 22,7 5 9,6 5 33,3 2 20 0 0 3 15,8 0 0 1 8,3 1 50
Norovirus GII 16 48,5 6 28,6 33 56,9 8 36,4 15 28,8 3 20 1 10 0 0 6 31,6 0 0 1 8,3 0 0
Rotavirus 5 15,2 0 0 8 13,8 1 4,55 16 30,8 1 6,67 3 30 0 0 4 21,1 0 0 4 33,3 0 0
Sapovirus 3 9,1 9 42,9 6 10,3 5 22,7 7 13,5 3 20 2 20 0 0 3 15,8 0 0 3 25 1 50
Astrovirus 5 15,2 1 4,8 3 5,17 3 13,6 5 9,6 3 20 2 20 0 0 2 10,5 0 0 2 16,7 0 0
Adenovirus 2 6,1 1 4,8 5 8,62 0 0 4 7,7 0 0 0 0 0 0 1 5,3 0 0 1 8,3 0 0
Total 33 21 58 22 52 15 10 0 0 19 0 0 12 2
Se observó infección única en los dos sexos para NoVGI, RoV, SaV, AsV en casos y
controles (Gráfico 4 (A, B)).
En los casos del sexo femenino el mayor agente que se identificó fue NoVGII con
42,1%, seguido de RoV, NoVGI, AsV, SaV y AdV con 22,8%, 12,3%, 10,5%, 7,0%
y 5,3 %, respectivamente. En los controles de este mismo sexo el mayor porcentaje fue
para SaV con 29,6%, después de NoVGII, NoVGI y AsV con 25,9%, 22,2% y 14,8%,
cada uno. RoV y SaV correspondieron a 3,7% cada uno.
NoVGII, RoV, SaV, AdV, AsV y NoVGI, fueron identificados en 46,5%, 18,6%,
14,0%, 9,0%, 8,1% y 3,5% de los casos del sexo masculino, a diferencia de los
controles en los que se detectaron en el 29,0%, 25,8%, 9,7% y 3,2% SaV, NoVGI,
AsV y RoV. AdV no se identificó en los controles del sexo masculino (B).
05
101520253035404550
Po
rce
nta
je %
Virus
Casos
Femenino
Masculino
A
Resultados
57
Gráfico 4. Infección única e identificación de norovirus GI/GII, rotavirus, sapovirus, astrovirus y
adenovirus en el sexo femenino y masculino.
Todos los casos del sexo masculino presentaron coinfecciones entre los 6 agentes
virales. SaV con 23,8%, fue el virus con mayor coinfección en este grupo, seguido de
19,0% tanto para NoVGI como RoV. AsV y NoVGI se detectaron en 14,3% cada uno.
AdV fue positivo en 9,3% (Gráfica 5A).
No se presentaron coinfecciones en los controles del sexo femenino, contrario a los
casos en los que se presentó el 35% de RoV, seguido de 20% de NoVGII. NoVGI, SaV
y AsV presentaron 15% cada uno. AdV no se encontró en coinfecciones en los casos
del sexo femenino. El sexo masculino fue el único que presentó coinfección en los
controles, en los agentes NoVGI y SaV (Gráfica 5B).
05
101520253035404550
Po
rce
nta
je %
Virus
Controles
Femenino
Masculino
B
Resultados
58
Gráfico 5. Coinfección e identificación de norovirus GI/GII, rotavirus, sapovirus, astrovirus y
adenovirus en el sexo femenino y masculino.
4.3 Filogenia de aislados de norovirus GI y
norovirus GII
A los 120 aislados identificados mediante RT–qPCR como NoVGI o NoVGII (31 y
89 respectivamente), se les realizó purificación del producto de PCR a partir de una
reacción de transcriptasa reversa para la obtención del cADN. El producto de la
purificación de la PCR se almacenó a –80°C. 31 (100%) de los aislados de NoVGI y
85 (95,5%) de NoVGII fueron enviados a secuenciación. El alineamiento de
secuencias se realizó utilizando el software Bioedit V 7.2.5 (actualizado 12/ 11 / 2013).
El análisis filogenético de los aislados de RNA de NoVGI y NoVGII se basó en la
región C del extremo 5’ del ORF2. Se compararon con 17 y 30 secuencias de referencia
para cada genotipo a partir de la base de datos de GenBank.
Según el análisis se determinó que el genotipo de NoVGI, GI.2 (n=22) con 70,9 % fue
el más frecuente a diferencia de GI.1, GI.3 y GI.5 (29%, 3,2% y 12,9%
respectivamente). Dos muestras identificadas como NoVGI presentaron 2 genotipos
diferentes una GI.1/GI.2 y la otra GI.2/GI.5.
0
10
20
30
40
50
60
Po
rce
nta
je %
Virus
Casos
Femenino
Masculino
0102030405060
Po
rce
nta
je %
Virus
Controles
Femenino
Masculino
A
B
Resultados
59
El genotipo de NoVGII con mayor identificación fue GII.4 (n=50) con 58.8%. Los
otros genotipos en menor proporción identificados fueron GII.3, GII.5, GII.6, GII.9,
GII.13, GII.14 y GII.17 (1,17%, 5,8%, 8,2%, 2,3%, 4,7%, 22,3%, 1,17%,
respectivamente). De las cuatro muestras que fueron clonadas para NoVGII, 1 presentó
un mismo genotipo NGII.4 Sydney (Figura 1, 2). Los árboles filogenéticos se
realizaron con el programa MEGA 6.06 (Test Maximun - Likelihook tree, bootstrap,
1000, método Kimura2 - Gamma).
Resultados
60
Figura 14. Análisis filogenético de la secuencia de nucleótidos de norovirus. Árbol filogenético de la
región C del extremo 5’ del ORF-2, de norovirus GI (muestras seleccionadas con rombo de color rojo),
comparadas con las secuencias de referencia de la base de datos GeneBank.
785GI
821GI
759GI
693GI
649GI
360GI
358GI
309GI
264GI
228GI
214GI
173GI
833.3 NGI
164GI
96GI
58GI
33GI
43GI
39.3 NGI
170.2 NGI
833.2 NGI
300GI
GI.2.KP753278
GI.2 KM462611
GI.2.KM349493
GI.2-L07418
GI.2.FJ383887
98GI
150GI
39.2NGI
378GI
GI.5 FJ383818
GI.5b-AB039774
GI.6b-AF093797
GI.4-AB042808
GI.1-M87661
GI.1. EU007717
GI.1. GQ925106
532GI
170.3NGI
833.1GI
570GI
338GI
244GI
308GI
594GI
170.1GI
GI.7b-JN899243
GI.9.KF586507.1
GI.3c-AB187514
752GI
GI.3a-U04469
GI.8.KR053451.1
Resultados
61
Figura 15. Análisis filogenético de la secuencia de nucleótidos de norovirus. Árbol filogenético de la
región C del extremo 5’ del ORF-2, de norovirus GII (muestras seleccionadas con rombo de color rojo), comparadas con las secuencias de referencia de la base de datos GeneBank.
584GII
609GII
583GII
556GII
544GII
522GII
496GII
495GII
486GII
430GII
428GII
322GII
480GII
481GII
476GII
628GII
724GII
711GII
700GII
710GII
571GII
810GII
650GII
132GII
751.9GII
166GII
171GII
221GII
595GII
673GII
767GII
801GII
751.4.2GII
456GII
580GII
167GII
173GII
507GII
GII.4.KP868597
502GII
621GII
198GII
199GII
197.4GII
153GII
197GII
200GII
266GII
197.2GII
GII.4-Bristol-X76716
GII.4-New Orleans GU445325
GII.4-NSW001P-GQ845367
GII.4-Sydney-JX459908
180GII
181GII
9GII
GII.3-GII.16.KM289172
GII.3a-U02030
GII.3b-AF190817
531GII
GII.13.AB810006
555GII
438GII
543GII
798GII
GII.17-AY502009
GII.1-U07611
GII.16-AY502010
GII.11-AB074893
GII.19-AY823306
187GII
304GII
542GII
GII.5.KM036378
520GII
453GII
GII.2-X81879
GII.22-AB083780
117GII
191GII
206GII
443GII
613GII
631GII
744GII
GII.6.KM267742
GII.6b-AF414410
GII.18-AY823304
54GII
113GII
GII.9-AY038599
508GII
709GII
527GII
528GII
612GII
663GII
680GII
717GII
GII.14 FJ264893
GII.14.KR904230
514GII
539GII
516GII
559GII
578GII
599GII
606GII
813GII
599.3NGII
632.1GII
632.4GII
Resultados
62
4.4. Filogenia de aislados de rotavirus
42 aislados positivos en el ELISA para RoV (40 casos y 2 controles) fueron analizados
para clasificar los diferentes genotipos. A los productos obtenidos a partir de la
reacción de transcriptasa reversa para la obtención del cADN, se les realizó PCR
simple convencional para la identificación de las proteínas estructurales VP4 y VP7
(proteasa o proteína P; glicoproteína o proteína G, respectivamente). Se purificó el
producto de la PCR. 24 de los aislados de RoV positivos para los dos genes VP4 y
VP7 fueron enviados a secuenciación. 8 de los 42 solo presentaron uno de los dos
genes. El alineamiento de secuencias se realizó utilizando el software Bioedit V 7.2.5
(actualizado 12/ 11 / 2013).
El análisis filogenético de los aislados de RoV se basó en la comparación de secuencias
de las proteínas VP4 y VP7 alineadas en la base de datos de GenBank. La
secuenciación mostró que los genotipos detectados se agrupaban en los clúster (G1P8,
G2P4, G4P8, G12P8, G12P4, G12P9, G9P8, G9P4) (Figura 16 y 17).
Resultados
63
Figura 16. Análisis filogenético de la secuencia de nucleótidos de rotavirus. Árbol filogenético de la
proteína VP4 de rotavirus (muestras seleccionadas con rombo de color rojo), comparadas con las
secuencias de referencia seleccionadas de la base de datos GeneBank.
36VP4
KT919043.1-G12P8-USA
136VP4
158VP4
290VP4
44VP4
106VP4
127VP4
247VP4
341VP4
356VP4
497VP4
KF202511.1-G4P8-Italia
KU048596.1-G12P8-Italia
465VP4
KC484721.1-G9P8-Bangladhes
665VP4
338VP4
478VP4
161VP4
176VP4
KT025876.1-G12P8-Brazil
KP281281.1-G12P8-Saudi Arabia
374VP4
655VP4
KT007949.1-G1P8-Thailandia
155VP4
154VP4
151VP4
JN849127.1-G9P8-Belgium
HM773659.1-G3P8-USA
KT988296.1-G3P8-Italia
KT007888.1-G12P4-Thailandia
427VP4
440VP4
Resultados
64
Figura 17. Análisis filogenético de la secuencia de nucleótidos de rotavirus. Árbol filogenético de la
proteína VP7 de rotavirus (muestras seleccionadas con rombo de color rojo), comparadas con las
secuencias de referencia seleccionadas de la base de datos GeneBank.
Una vez obtenidas las secuencias de RoV, también fueron analizadas en el programa
RotaC 2.0, permitiendo la clasificación como se observa en la tabla 19, 20.
106VP7
127VP7
136VP7
338VP7
478VP7
176VP7
44VP7
290VP7
36VP7
161VP7
KU048640.1-G12P8-Italia
665VP7
KJ412580.1-G12P9-Paraguay
655VP7
374VP7
KU048654.1-G12P8-Italia
247VP7
158VP7
440VP7
KJ638639.1-G2P4-Brazil
427VP7
KJ432723.1-G9P4-Slovenia
154VP7
155VP7
151VP7
341VP7
356VP7
465VP7
497VP7
KF812606.1-G9P4-South Korea
KM205791.1-G9P8-Italia
Resultados
65
Tabla 19 Clasificación de rotavirus detectados según programa RotaC 2.0, de acuerdo a cada una de
las secuencias de las proteínas VP4 y VP7
Identificación de la
muestra
Genotipo
36 G12; P8
44 G12; P8
106 G12; P8
127 G12; P8
136 G12; P8
151 G9; P8
154 G9; P8
155 G9; P8
158 G12; P8
161 G12; P8
176 G12; P8
247 G12; P8
290 G12; P8
338 G12; P8
341 G9; P8
356 G9; P8
374 G12; P8
427 G2; P4
440 G2; P4
465 G9; P8
478 G12; P8
497 G9; P8
655 G12; P8
665 G12; P8
Tabla 20 Tabla resúmen de los genotipos identificados mediante la base de datos del RotaC 2.0
Genotipo Número %
G12P8 15 62,5
G9P8 7 29,1
G2P4 2 8,3
4.4.1 Comparación del análisis filogenético de las
proteína VP4/VP7 de rotavirus
Se evidenció concordancia cuando se compararon los dos análisis filogenéticos. La
agrupación de los genotipos identificados en la base de datos RotaC 2.0 de las tabla 21
y 22 resume la clasificación de los genotipos P y G según las proteínas VP4 y VP7,
respectivamente, basado en la base de datos GenBank.
Resultados
66
Tabla 21 Resumen de los genotipos de la proteína VP4 mediante la base de datos GenBank
Rota C
P8 P4
VP4
GenBank
P8 22 -
P4 - 2
Tabla 22 Resumen de los genotipos de la proteína VP7 mediante la base de datos GenBank
Rota C
G12 G9 G2
VP7
GenBank
G12 15 - -
G9 - 7 -
G2 - - 2
4.5 Factores demográficos implicados en EDA de
etiología viral
De los 405 casos, 224 correspondieron al sexo masculino y 181 al femenino. Se logró
identificar algún tipo de virus en 47,8% y 42,5% respectivamente. 221 de los controles
correspondieron al sexo masculino y 194 al femenino, en éstos se identificó positividad
a algún virus en 15,6% y en 13,9% respectivamente.
140 muestras positivas eran del sexo masculino tanto para casos como para controles,
seguido de 104 muestras en el femenino (Tabla 23).
Tanto en el grupo de los casos como en los controles, NoVGII fue el virus más
frecuente en ambos sexos, 38,6% en el masculino, p<0.01 (OR 4.91 IC95% 2,40-
10,04) y 33,7% en el femenino, p<0.01 (OR 4,88 IC95% 2,07-11,49), seguido de SaV
con 19,3% y 14,3%.
Adicionalmente, para RoV se observaron diferencias estadísticamente significativas
entre casos y controles en los dos sexos. En el sexo femenino 20,2% p<0,01 (OR 23,97
IC95% 3,18-180,59) y para el sexo masculino 15,0% (OR 20,58 IC 95% 2,73-154,82)
(Tabla 23).
AdV se identificó en 4,5% en los casos del sexo masculino, presentándose diferencias
estadísticamente significativas p<0.01 (Tabla 23).
Resultados
67
Tabla 23. Distribución de virus identificados por sexo en casos y controles
Virus
Casos (n=405) Controles (n=405)
P OR – IC
Masculino
P OR – IC
Femenino
Total positivos
Masculin
o (n=224)
Femenino
(n=181)
Masculin
o (n=211)
Femenino
(n=194)
Masculino
(n=140)
Femenino
(n=104)
n % n % n % n % Masculino Femenino n % n %
Norovirus GI 6 2,7 10 5,5 9 4,3 6 3,1 0.43 0,61
(0,21 - 1,76) 0.30
1,83
(0,65 - 5,14) 15 10,7 16 15,4
Norovirus GII 44 19,6 28 15,5 10 4,7 7 3,6 <0.01 4,91
(2,40 - 10,04) <0.01
4,88
(2,07 -11,49) 54 38,6 35 33,7
Sapovirus 17 7,6 7 3,9 10 4,7 8 4,1 0.23 1,65
(0,73 - 3,69) 1.00
0,93
(0,33 - 2,63) 27 19,3 15 14,4
Astrovirus 10 4,5 9 5,0 3 1,4 4 2,1 0.08 3,23
(0,87 - 11,93) 0.16
2,48
(0,75 - 8,21) 13 9,3 13 12,5
Adenovirus 10 4,5 3 1,7 0 0,0 1 0,5 <0.01 / 0.35 3,25
(0,33 - 31,55) 10 7,1 4 3,85
Rotavirus 20 8,9 20 11,0 1 0,47 1 0,5 <0.01 20,58
(2,73 - 154,82) <0.01
23,97
(3,18 -180,59) 21 15,0 21 20,2
Total virus 10
7 47,8 77 42,5 33 15,4 27 13,9 <0.01
4,93
(3,13 - 7,77) <0.01
4,57
(2,77 - 7,56) 140 100 104 100
* La positividad a virus en cada columna no fue única por paciente. En un mismo individuo se
presentaron coinfecciones (2 o más virus).
Con respecto a la edad, se observó mayor positividad a cualquiera de los virus
estudiados en los casos del rango de edad de 12 a 23 meses (grupo 2) con 52,7%,
seguido del rango de 24 a 59 meses (grupo 3) con 48,1% y 34,1% para el rango de 0 a
11 meses (grupo 1), contrario para controles cuyos valores fluctuaron entre 12,8% y
16,7%, mayor para el grupo 1 (Tabla 24).
En el grupo 1 se observaron diferencias estadísticamente significativas entre casos y
controles para NoVGII y RoV (Tabla 24). Sin embargo, en el grupo 2 y 3 la diferencia
fue significante adicionalmente para AdV entre casos y controles (Tabla 24). Tabla 24 Distribución de virus identificados por grupos de edad en casos y controles
*La positividad a virus en cada columna no fue única por paciente. En un mismo individuo se
presentaron coinfecciones (2 o más virus).
Virus
0 – 11 Meses (n=252)
P
12 – 23 meses (n=292)
P
24 – 59 meses (n = 266)
Casos
(n= 126)
Controles
(n=126) OR - IC
Casos
(n=146)
Controles
(n=146) OR - IC
Casos Controles
P
(n=133) (n= 133) OR - IC
n % n % n % n % N % n %
Norovirus
GI 4 3,2 4 3,2 1.00
1,00
(0,24 - 4,08) 6 4,1 5 3,4 1.00
1,20
(0,36 -4,05) 6 4,5 6 4,51 1.00
1,00
(0,31 -3,18)
Norovirus
GII 17 13,5 6 4,8 0.02
3,11
(1,18 - 8,19) 39 26,7 8 5,5 <0.01
6,28
(2,82 -
14,01)
16 12,0 3 2,26 <0.01 5,92
(1,68 -20,85)
Sapovirus 5 4,0 9 7,1 0.41 0,53
(0,17 - 1,65) 9 6,2 5 3,4 0.41
1,85
(0,60 -5,66) 10 7,5 4 3,01 0.16
2,62
(0,80 - 8,58)
Astrovirus 7 5,6 1 0,8 0.06 7,35
(0,89 - 60,66) 5 3,4 3 2,1 0.72
1,69
(0,39 -7,20) 7 5,3 3 2,26 0.33
2,40
(0,60 - 9,51)
Adenovirus 2 1,6 1 0,8 1.00 2,01
(0,18 -22,52) 6 4,1 0 0,0 0.02 / 5 3,8 0 0 <0.01 /
Rotavirus 8 6,3 0 0,0 <0.01 / 12 8,2 1 0,7 <0.01
12,98
(1,66 -
101,21)
20 15,0 1 0,75 <0.01
23,36
(3,08 -
176,82)
Total virus 43 34,1 21 16,7 <0.01 2,59
(1,42 - 4,70) 77 52,7 22 15,1 <0.01
6,28
(3,60 -
10,98)
64 48,1 17 12,8 <0.01 6,32
(3,43 -11,67)
Resultados
68
Respecto a la presencia de síntomas relacionados a la infección viral, NoVGII, fue
identificado cuando los niños tenían la presencia del 60% de disentería seguido de
42,6% de vómitos, 36,6 de diarrea, 31% de fiebre y 19,5% de dolor abdominal en el
sexo femenino. En el masculino el síntoma con mayor frecuencia fue disentería en
45,5%, seguido de vómitos en 41,3%, diarrea en 40,2%. Fiebre y dolores abdominales
en proporciones muy parecidas, 35,8% y 34,5%, respectivamente.
En los casos del sexo femenino en los que se identificó NoVGI, se les relacionó con la
presencia de fiebre en 15,5%, 11,5% de vómitos, 11,4% diarrea, 12,2% dolor
abdominal y 9,0% de fiebre, este agente a diferencia de NoVGII no estaba presente
cuando el paciente presentaba disentería. Al igual que en los casos del sexo femenino,
cuando se presentó positividad por AsV, el principal síntoma fue la fiebre en 13,8%,
seguido de diarrea 12,7% y vómito en 11,5%.
SaV se identificó más frecuentemente en pacientes que referían todos los síntomas
previamente descritos, tanto en los casos del sexo femenino como del masculino.
En los casos positivos para RoV, la presencia de dolor abdominal se observó en 39,0%
del sexo femenino seguido de diarrea con 26,8%. En el sexo masculino, la fiebre fue
en 24,4% y después el dolor abdominal en el 21,8%.
AdV no se correlacionó con la presencia de disentería, ni en el sexo femenino ni el
masculino, adicionalmente el sexo masculino no presentó fiebre cuando presentaban
infección con este agente (Gráfico 6).
Grafico 6. Identificación de norovirus GI/GII, rotavirus, sapovirus, astrovirus y adenovirus en presencia
de diarrea, disentería, vómito, fiebre, dolor abdominal en el sexo femenino y masculino.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Fem
enin
o
Mas
culi
no
Fem
enin
o
Mas
culi
no
Fem
enin
o
Mas
culi
no
Fem
enin
o
Mas
culi
no
Fem
enin
o
Mas
culi
no
Diarrea Disenteria Vómito Fiebre Dolor
abdominal
Porc
enta
je
Síntomas
Rotavirus
Adenovirus
Sapovirus
Astrovirus
Norovirus GII
Norovirus GI
Resultados
69
En los tres rangos de edad NoV fue el virus más frecuente, seguido de RoV (Gráfico
7). NoVGI, no estuvo presente en los niños que presentaban disentería en el segundo
y tercer rango de edad, por el contrario si en los otros síntomas. En los tres rangos la
fiebre fue el principal síntoma con un 12,5%, 10,2 y 13,3%, respectivamente.
NoVGII, fue el agente que en los tres rangos de edad presentaron disentería, en 50%
en los rangos 1 y 2 y el 75% en el rango 3. Datos similares a los de la presencia de
SaV, a diferencia en el grupo tres, el principal síntoma fue el dolor abdominal.
AsV, no se identificó en los niños del rango 1 que presentaron disentería. El mayor
síntoma para los tres grupos, fue el dolor abdominal en 28,6%, 10,0% y 12,5%,
respectivamente. Síntoma igual en la infección con RoV.
Grafico 7 Identificación de norovirus GI/GII, rotavirus, sapovirus, astrovirus y adenovirus en
presencia de diarrea, disentería, vomito, fiebre, dolor abdominal en los tres rangos de edad.
No es observaron diferencias estadísticamente significativas cuando se presentaron
casos de disentería. Sin embargo, si se presentaron en los casos con fiebre cuando se
identificaron AsV y RoV. El dolor abdominal fue más frecuente en los casos de
NoVGII y RoV (Tabla 25).
En los casos con infecciones únicas fue más alta la presencia de diarrea (92,31%)
seguido de vómito (86,71%), fiebre (68,53%) y dolor abdominal (53,85%). La
frecuencia de síntomas en los casos con infecciones dobles fue similar al grupo de
infección única (Tabla 25).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 - 11 12 - 2324 - 59 0 - 11 12 - 2324 - 59 0 - 11 12 - 2324 - 59 0 - 11 12 - 2324 - 59 0 - 11 12 - 2324 - 59
Diarrea Disenteria Vómito Fiebre Dolor abdominal
Porc
enta
je
Síntomas
Rotavirus
Adenovirus
Sapovirus
Astrovirus
Norovirus GII
Norovirus GI
Resultados
70
Tabla 25 Proporción de diarrea, diarrea sanguinolenta (disentería), vómito y dolor abdominal en casos
de EDA con infección por virus diarreagénicos
Infección Casos
identificados
Diarrea Disentería Vómito Fiebre Dolor abdominal
n % n % n % n % n %
Única 143 132 92,31 13 9,09 124 86,71 98 68,53 77 53,85
Doble 19 19 100 2 10,53 16 84,21 4 21,05 8 42,11
Triple 1 1 100 - - 1 100 1 100 1 100
Total 163 152 93,25 15 9,20 141 86,50 103 63,19 86 52,76
Agentes virales p p p p p
Norovirus GI 16 14 87,5 1.00 1 6,25 0.24 12 75 0.70 15 93,75 0.25 7 43,75 0.83
Norovirus GII 72 67 93,06 <0.01 9 12,5 0.85 64 88,89 <0.01 27 37,5 0.16 42 58,33 <0.01
Astrovirus 19 19 100 <0.01 1 5,26 0.34 15 78,95 0.02 15 78,95 0.03 13 68,42 <0.01
Sapovirus 24 23 95,83 0.34 3 12,5 0.61 21 87,50 0.04 20 83,33 0.19 15 62,50 0.14
Adenovirus 14 13 92,86 <0.01 - - - 11 78,57 <0.01 5 35,71 1.00 6 42,86 0.12
Rotavirus 40 37 92,5 <0.01 3 7,5 0.61 36 90,00 <0.01 28 70 <0.01 28 70 <0.01
Total 185 173 93,51 17 9,189 159 85,95 110 59,46 111 60
Discusión
71
5. DISCUSIÓN
El principal objetivo de este estudio fue la identificación de agentes virales
diarreagénicos en niños menores de cinco años de edad de Bucaramanga y su área
metropolitana, con el fin de conocer la prevalencia de NoV GI/GII, SaV, AsV, AdV y
RoV, relacionados a enfermedad diarreica aguda en niños con o sin EDA.
Del total de las muestras analizadas, 30,1% fueron positivas para algún agente viral,
14,7% identificados como NoV, 3,8% fueron NovGI y 10,9% NovGII, seguido de RoV
y SaV, cada uno en 5,1%, AsV 3,2% y AdV en 1,7%. Este es el segundo reporte
realizado sobre la detección simultánea de diferentes agentes virales por técnicas
moleculares, en la población menor de cinco años en Bucaramanga y su área
metropolitana en Santander, Colombia.
De forma general en este estudio, NoV fue identificado con una prevalencia de 14,7%
considerándose el agente viral más frecuente, a nivel mundial la prevalencia de este
virus oscila entre 6 al 19% (Mousavi et al., 2015). Los datos reportados de este estudio
son concordantes con las investigaciones realizadas a nivel mundial para determinar la
epidemiología de gastroenteritis asociada a infecciones mixtas y la prevalencia de NoV
en niños menores de cinco años. En Irán, de 170 muestras analizadas, 15 fueron
positivas para NoV, lo que equivale al 8,8% (Mousavi et al., 2015). Adicionalmente,
otros países como Brasil y Bolivia, han demostrado prevalencias más altas después de
la introducción de la vacuna para RoV, en 32,6% y 34,3% respectivamente (Portal et
al., 2016; McAtee et al., 2016). Los datos indican que después de la implementación
de la vacuna de RoV a nivel mundial se ha logrado la disminución de casos o la
severidad de otros, pero ha aumentado la prevalencia de las infecciones causadas por
NoV.
En Qatar, muestras de materia fecal de personas de diferentes grupos de edad,
procesadas mediante qPCR, evidenciaron a NoV en 12,2% de los niños menores de 1
año y 20,7% entre las edades de 1 a 10 años (AlThani et al., 2013). Estos datos son
mayores en frecuencia que los de este estudio, pero menores a los reportados por Huhti
et al., 2011 en Finlandia, durante los años 2000 al 2002. En ese trabajo NoV fue
detectado en 192 de 485 episodios de gastroenteritis de 405 niños. En Colombia, un
estudio realizado en el año 2009, para determinar la prevalencia de NoV, evidenció
que al igual que en este estudio, NoV, fue el principal agente diarreagénico identificado
en dos regiones Colombianas, Bogotá en 9% y el Chocó con el 8%, seguido de las
infecciones por RoV (Fernández et al., 2015). Los resultados de estos trabajos son
variables indicando que el número de identificaciones dependen del número de
pacientes incluidos, las técnicas utilizadas, el área geográfica y factores del huésped.
A pesar de la alta prevalencia de NoVs, sólo una pequeña parte se confirma mediante
pruebas de laboratorio. El corto curso de la infección y la dificultad para disponer de
procedimientos diagnósticos adecuados hacen que la enfermedad sea subvalorada. En
los últimos 15 años, la disponibilidad de métodos diagnósticos moleculares sensibles
como RT-PCR han permitido esclarecer el papel etiológico de diferentes agentes
virales, principalmente el de NoV (Lopman 2006; Glass, 2000).
Discusión
72
El género NoV está clasificado en 7 genogrupos (GI-GVII), subdivididos en 41
genotipos. Siendo GI, GII y GIV implicados en las infecciones de los humanos (Vinjé
el at., 2015). El genotipo GII.4 es el más frecuente en los casos esporádicos y de brotes
de EDA a nivel mundial, tanto en países desarrollados como en vías de desarrollo
(Vinjé el at., 2015; Vega et al., 2014; Fu et al., 2014).
En este trabajo se identificaron los dos genogrupos NoVGI, NoVGII y los genotipos
más prevalentes relacionados con brotes a nivel mundial, mediante métodos
moleculares y filogenéticos. NoV se detectó en 21,7% (88/405) de los casos y 7,9% de
los controles (32/405), con resultados similares a los obtenidos en Brasil en una
población de niños con y sin diarrea, mayores de 3 años de edad, en los que la carga
viral fue cuantificada por qPCR y al igual que en este estudio los virus también fueron
genotipificados. Este agente viral tuvo prevalencias del 17% (40/229) en niños
sintomáticos y 13% (12/90) en asintomáticos, respectivamente (Barreira et al., 2010).
En Zanzíbar, Tanzania, NoVGII fue el agente más correlacionado en los casos de EDA
en un 17,1%, a diferencia del 4,1%, en los controles, presentado una tasas de detección
global de 19%, el 20% de casos y el 2,4% de controles (Elfving et al., 2014).
El genotipo de NoVGI, ha sido más relacionado en la ruta de transmisión por
alimentos, a diferencia del genotipo GII, que es de persona a persona (Verhoef et al.,
2015). De acuerdo a los genotipos se puede reconocer la vía de transmisión de estas
infecciones.
Los análisis filogenéticos de este estudio demostraron que el genotipo de NoVGI con
mayor frecuencia fue GI.2 con 70,9%, relacionado con cepas que han estado presentes
en Southampton/Inglaterra, China, Bélgica/Europa y Rusia, seguido de GI.1, GI.3 y
GI.5 en 29%, 3,2% y 12,9%, respectivamente. Dos muestras identificadas como
NoVGI presentaron 2 genotipos diferentes una GI.1/GI.2 y la otra GI.2/GI.5. El
genotipo de NoVGII con mayor identificación fue GII.4 con 56%, genéticamente
correlacionadas con genotipos identificados en Australia, USA, Taiwan, y
Southampton/Inglaterra. Los otros genotipos en menor proporción identificados
fueron GII.3, GII.5, GII.6, GII.7, GII.9, GII.13, GII.14 y GII.17 (1,09%, 5,4%, 7,6%,
2,1%, 2,1%, 4,3%, 20,8%, 1,09%, cada uno). Según los datos a nivel mundial,
actualmente NoVGII, está presente en un 89% de los casos, a diferencia de un 11% de
NoVGI, principalmente NoVGI.1 (Vega et al., 2014). En Estados Unidos, se ha
demostrado que los brotes causados por alimentos están relacionados con los genotipos
GI.3, GI.6, GI.7, GII.3, GII,4, GII.6 y GII.12 (Verhoef et al., 2015). Observándose
circulación de estas cepas también en Santander.
Diferentes estudios han demostrado la epidemiología y la distribución de estos
genotipos a nivel global, datos que son congruentes con los encontrados en esta
investigación. Según lo reportado por Portal et al., 2016, NoVGII fue el principal
agente viral en EDA y mediante genotipificación se demostró la clasificación de
alguno de los genotipos en GII.3 (n=1), GII.4 (6), GII.5 (1), GII.7 (2), GII.12 (1) y
GII.16 (1). Evidenciando que el genotipo más frecuente fue el GII.4.
Discusión
73
Adicionalmente, en una cohorte de 373 niños de la India, aproximadamente en un
tercio de los niños, se asoció la presencia de diarrea a la infección con NoV. Los
genotipos circulantes de NoV fueron GI.3 y GII.4 en 40,3% y 53,0% respectivamente.
En otro estudio realizado en niños menores de cinco años, con gastroenteritis en Hanoi,
Vietnam, el genotipo más prevalente de NoVGII fue GII.4 en 93%, seguido de otros
menos identificados como GII.3 (4,4%), GII.13 (1,7%), GII.2 (0,6%). No se
identificaron cepas de NoVGI (Trang et al., 2012). La alta incidencia de estos
genotipos en la población infantil indican la necesidad de la implementación de
estudios sobre la caracterización adicional de las cepas, la infección asintomática, la
excreción y la respuesta inmune para mejorar, la comprensión de la infección por
norovirus (Menon et al., 2016).
Aunque varios genotipos pueden cocircular en la comunidad, las cepas GII.4 han sido
responsables de la mayoría de los brotes desde mediados de 1990, estudios recientes
han demostrado que las cepas GII.4 han evolucionado con el tiempo en nuevas
variantes emergentes (Constantini et al., 2010). Numerosos estudios realizados a nivel
mundial para determinar la prevalencia de NoV, han relacionado las infecciones
causadas por este virus con el mayor porcentaje de EDA, debido en gran parte a la
reducción de las infecciones por RoV, por implementación de la vacuna.
Estudios a nivel mundial como los reportados por Chieochansin et al., 2015 en
Thailand, Azaran et al., 2016 en Iran, Hassan et al., 2013 en Bangladesh, señalan a
RoV como el principal agente causal de diarrea en niños menores de cinco años. Este
virus presenta una alta variabilidad genética. Entre los grupos de importancia clínica
se encuentra, el grupo A, relacionado con EDA en niños, el grupo B, implicado
principalmente en casos de EDA en adultos.
Las infecciones de RoV oscilan entre el 28% y el 50% (Azaran et al., 2015). RoV, en
nuestros resultados fue el segundo agente viral identificado con 5,1%, por ELISA y en
50% de estos se les identificaron los dos genotipos VP4 y VP7. Estos datos fueron
menores comparados con el 43% identificado en Bogotá, entre abril de año 2000 y
febrero de 2001, en niños menores de cinco años (Cáceres et al. 2005), lo que evidencia
una buena efectividad de la vacuna en estas poblaciones, luego de su introducción en
todo el territorio nacional.
Otras investigaciones realizadas en diferentes regiones Colombianas, han evidenciado
la presencia de RoV. En Bogotá y Chocó 5,5 % de RoV estaban presentes en las
infecciones, en niños con o sin diarrea. A diferencia de lo encontrado en nuestros datos,
en un estudio descriptivo transversal realizado en Bucaramanga, para la identificación
de la prevalencia de agentes patógenos comunes asociados con EDA, en niños menores
de cinco años, se encontró la presencia de RoV, en 44,4%, como principal agente
causante de episodios de diarrea. Cabe resaltar que este estudio no tuvo en cuenta otros
agentes virales relacionados con EDA (Yepes et al., 2009).
Es importante resaltar que las infecciones causadas por RoV son más graves que las
causadas por NoV, pero en la actualidad con la presencia de la vacunación han
disminuido las infecciones, sin embargo se han subestimado las infecciones
gastrointestinales por NoV (Donaldson et al., 2008, Fernández et al. 2015).
Discusión
74
En América Latina entre los años 2003 al 2005 se evaluó la eficacia de la vacuna
(Rotarix), suministrada en diferentes países, determinándose que ningún niño de la
cohorte vacunada tuvo más de un episodio de gastroenteritis grave por RoV, durante
los 2 años de seguimiento, por el contrario la incidencia de gastroenteritis grave en el
grupo placebo fue mayor. Aunque mayor frecuencia de RoV se evidenció en los casos,
que en los controles (Paternina et al., 2015). En este estudio todos los niños clasificados
como casos habían sido vacunados con al menos una dosis y dos de los controles no
habían sido vacunados, lo cual indica que no fueron protegidos contra la infección.
Resaltando que la vacuna disponible en Colombia es Rotarix, vacuna basada en la cepa
atenuada G1P8.
Los genotipos de RoV que identificamos fueron clasificados de acuerdo al genotipo.
Para VP4 se identificó P[8] (91,5%) y P[4] (16,6%). Los genotipos VP7, fueron G12
(62,5%), G9 (29,1%) y G2 (8,3%). Las cepas tanto con VP4 como VP7 fueron G12P[8]
en 62,5%, seguido de 29,1% de G9P[8] y 8,3% para G2P[4]. Esto fue similar a lo
observado en los aislados de muestras clínicas de niños con EDA en la unidad de
cuidados hospitalarios de Riyadh, en Arabia, Saudita. Entre 2011 a 2012, el genotipo
VP4, que mostraron el 96,7% eran los genotipos P[8], seguido de 2,6% P[4] y 0,66%
P[6], sin embargo 11,7% de las muestras no fueron tipificables. En el genotipo VP7 se
identificó, GI en 61,7%, G2 en 5,5%, 3,9% G3, 3,9% G4, 18,8% G9, 6,3% G12 y el
25,1% no se genotipificaron. Las cepas con los dos genotipos fueron G1P [8] (61,9%),
G9P [8] (16,8%), G12P [8] (6,2%), G3P [8] (4,4%), G4P[8] (3,5), G2P [8] (2,6%),
G2P [4] (2,6%), G1P [4] (0,88%) y G12P [6] (0,88%) (Aly et al., 2015).
Las cepas circulantes a nivel mundial incluyen G1P[8], G2P[4], G3P[8], G4P[8] y
G9P[8], relacionadas con un 80% a 90% en las infecciones RoV, siendo estas cepas
las identificadas también en nuestro estudio (Aly et al., 2015; Pelaez et al., 2014).
En los años 2002 y el 2003, en Colombia los genotipos de RoV que circularon fueron
G1P[8], G2P[4] y G3P[8], cepas que también fueron identificadas en este estudio
(Urbina et al., 2008). En Bogotá el genotipo G1P8 en 36,9%, 18,4% en Cali y 14% en
Facatativá. Sin embargo, en la región Atlántica se han encontrado en menor
proporción, con 5,3% en Cartagena y 4,1% en Barranquilla. Otro estudio realizado
entre los años 2008 al 2012, realizado en la vigilancia activa de las cepas presentes
antes y después de la introducción de la vacuna de RoV, demostró que el genotipo G2
fue el más prevalente en 54%, seguido de G9 (14%) y entre el P el genotipo P[4] fue
el más prevalente en 47%, seguido de P[6] en 27% y P[8] en 10%. Siendo G2P4, la
cepa que cocirculó antes y durante la introducción de la vacuna, destacando que su
prevalencia fue disminuyendo desde el 2008 al 2012 entre 47% a 32% (Pelaez et al.,
2014). Después de la introducción de la vacuna de RoV, la prevalencia de infección
ha disminuido, al igual que la severidad. Sin embargo, se observan diversos genotipos
circulando en las poblaciones pediátricas.
Los otros agentes virales que se identificaron en este estudio fueron SaV, AsV y AdV
con una frecuencia de 5,1%, 3,2% y 1,7%, respectivamente. Estos datos son
concordantes con lo reportado globalmente, donde son menos frecuentes en las heces
de niños, sin embargo se han realizado otras investigaciones para su identificación
como las realizadas en Kenya, Africa, en el que se encontró a SaV en un rango de 4 a
Discusión
75
6%, seguido de AsV entre 3 al 8% (Shioda et al., 2016). En Francia, durante enero a
diciembre del 2007, se identificó AdV, AsV en 5% y 1,8%, respectivamente. A
diferencia de los porcentajes identificados en Holanda, AdV tuvo mayor prevalencia
con 9,9%, seguido de AsV con 6,0% y SaV en 0,4% (Van Maarseveen et al., 2010).
En Colombia, también han sido identificados estos agentes en las regiones de Tunja,
Boyacá, en el que el 3,61% de las muestras fueron positivas para AsV, con mayor
proporción del evento en pacientes de 1 a 4 años (Ramírez et al., 2014). En Cartagena
y Quibdó, se encontró una prevalencia global de 2,8% de AsV (Fernández et al., 2005).
Adicionalmente, AdV fue el virus menos prevalente en este trabajo, cuya prevalencia
fue de 1,7 %, similar a lo reportada por Urbina et al., 2008, en el que se identificó en
1,35%, en niños de las tres regiones Colombianas.
En las regiones Bogotá, Facatativá, Cartagena y Quibdó, durante el periodo
comprendido entre 1996 y el año 2002 se determinó la baja presencia, pero alta
importancia de la infección por estos virus (Urbina et al., 2008).
Los ensayos moleculares han sido de gran utilidad en la identificación de las causas de
enfermedad diarreica aguda, principalmente en las infecciones asintomáticas (Elfving
et al., 2014), estudios previos han demostrado que los métodos moleculares presentan
alta sensibilidad analítica comparados con las técnicas convencionales (Sinha et al.,
2013; Khamrin et al., 2011).
La detección temprana de los agentes virales en especial de NoV y RoV es crucial para
controlar la propagación de la enfermedad en los brotes, por eso es de vital importancia
el empleo de técnicas, que permitan el conocimiento de la etiología de la enfermedad
gastrointestinal (Costantini et al., 2010). Una gran variedad de técnicas se han
empleado en la identificación de agentes virales diarreagénicos, sin embargo los
ensayos RT-qPCR en combinación con análisis de secuencias, han dado lugar a una
mejor comprensión de la importancia de estos virus, en el impacto de la gastroenteritis
epidémica y una causa importante de gastroenteritis esporádica. Por lo que estas
técnicas presentan buena especificidad y sensibilidad, adicionalmente requieren de
menor cantidad de material genético para realizar la identificación (Costantini et al.,
2010; Khamrin et al., 2011; Sidoti et al., 2015).
En algunas regiones colombianas, los reportes que existen son fundamentados en la
identificación de agentes virales como NoV, RoV, AsV, AdV y pocos han sido
dirigidos al conocimiento de SaV. Para Santander este es el segundo informe de la
prevalencia de estos agentes virales, relacionados con la enfermedad diarreica aguda.
En esta investigación se identificaron 201 muestras con infección única y 20 con
infección múltiple, de las cuales 19 fueron causadas por dos clases de virus y solo una
muestra presentó infección triple (SaV, AsV y NoVGII). En el estudio de Yan et al.,
2003 se reportan infecciones únicas causadas por NoV, SaV y AsV en 42, 16 y 4 de
62 muestras positivas, respectivamente. Sin embargo, Román et al., 2003 muestra que
el agente más prevalente en su estudio fue RoV en 25 % seguido de 3 % AdV y AsV.
En este se evidenció la presencia de infecciones mixtas por RoV/AsV y RoV/AdV en
niños. Las coinfecciones son importantes en el diagnóstico y el tratamiento de
Discusión
76
pacientes con gastroenteritis, puesto que el intestino puede alojar una variedad de
patógenos, no solo virales sino parasitarios y bacterianos que ayudan a potenciar las
manifestaciones clínicas (Zhang et al., 2016).
Está claro que NoV y RoV tienen un gran impacto en las enfermedades diarreicas en
los niños, las coinfecciones con otros patógenos entéricos incrementan la gravedad de
la diarrea. Estos resultados deben servir de evidencia para los servicios de salud pública
en la planificación y desarrollo de programas de intervención (Zhang et al., 2016).
Las principales infecciones virales en este estudio, se presentaron en el sexo masculino
a diferencia en lo reportado en Colombia por el Sivigila durante este año,
principalmente se ha visto implicado el sexo femenino en un 55,1%.
El principal agente relacionado con los síntomas de diarrea, vómito, fiebre, dolor
abdominal fue NoV, siendo presente la diarrea en 93,0%. Estos datos concuerdan con
lo reportado por Patel et al. 2009.
En una cohorte de 373 niños de la India, se evidenció que de 1856 episodios de diarrea,
207 (11,2%), presentaron infección con NoV y de los 147 episodios de vómito sólo 30
(20,4%) fueron positivos para norovirus en las heces (Menon et al., 2016). El principal
síntoma identificado en RoV fue la diarrea en 92,5%, seguido de vómitos en 90%,
datos que se correlacionan con lo reportado a nivel mundial y nacional. En Brasil
según Neves et al., 2016, la diarrea fue la principal manifestación clínica en 93,6% y
luego vómitos en 59,6% de niños a quienes se les demostró infección por RoV. En
niños de la ciudad de Cartagena y Sincelejo con infecciones por RoV se observaron
episodios de vómitos y diarreas acompañados de fiebre y dolor abdominal (Urbina el
at. 2003).
Los virus identificados no presentaron un patrón de estacionalidad marcado durante el
año de estudio, puesto que se identificaron en todos los 18 meses. NoVGII, fue el único
virus en el que se observó mayor frecuencia durante los meses de junio a diciembre en
los casos. Es importante mencionar que durante esta temporada hubo mayor
recolección de muestras. A diferencia de lo reportado en la literatura en los países
desarrollados, las infecciones se correlacionan con los meses de invierno (Urbina et
al., 2003; Vinjé et al., 2015).
Conclusiones
77
6. CONCLUSIONES
En este estudio de casos y controles en niños menores de cinco años de
Bucaramanga se identificaron seis virus (NoVGI, NoVGII, SaV, AsV, AdV y
RoV), siendo NoV y RoV los virus más frecuentes.
El género NoV fue el más frecuente y presentó asociación estadísticamente
significativa con la EDA (p<0.01), el subtipo más común fue el NoV GI.2 y NoV
GII.4.
Rotavirus se identificó en 42 pacientes, 40 en los casos y 2 en los controles (p<0.01),
todos vacunados, lo que podría indicar que aunque la vacuna no confirió protección
contra la infección, sí disminuyó la severidad.
Los análisis de las secuencias de rotavirus en las dos bases de datos fueron
concordantes.
Se implementaron técnicas moleculares para la identificación de cinco virus
diarreagénicos, se determinaron los genogrupos de NoVGI, NoVGII y el género
RoV. Lo que permite evidenciar que los genotipos circulantes en Colombia no
tienen comportamiento similar a las de otros países.
La etiología de la diarrea aguda en niños varía en diferentes grupos de edad. La alta
frecuencia de la infección por virus diarregénicos sugiere la demanda urgente de
nuevo desarrollo de vacunas virales, al igual que el empleo de técnicas diagnósticas
moleculares.
Recomendaciones
78
7. Recomendaciones
Este es el segundo reporte realizado en el departamento de Santander, que permite el
conocimiento de la epidemiología de los agentes virales relacionados con EDA, en
niños menores de cinco años, que aporta bases para el progreso de investigaciones
futuras, direccionadas hacia disminución de estas infecciones, en la comunidad
pediátrica.
1. Divulgación de los datos, a las instituciones de salud participantes, para
concientizar no solo al personal de salud si no a la comunidad del impacto de
estos virus en la salud de la comunidad pediátrica.
2. Investigaciones futuras deben ser desarrolladas con el fin de recomendar la
implementación de técnicas rápidas para la identificación de los agentes virales
diarreagénicos.
3. Teniendo en cuenta que la prevalencia de NoV ha aumentado en los últimos
años y adicionalmente se identifica de forma frecuente en acientes sintomáticos
y asintomáticos, se recomienda realizar un estudio para determinar la
susceptibilidad de la infección por NoV, mediante búsqueda de receptores
celulares que permita el cocimiento de los factores que predisponen al
individuo a la infección. Esto ayudaría a implementar estrategias
farmacológicas y farmacocinéticas para el control de dicha enfermedad.
Referencias
79
7. REFERENCIAS
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Referencias
99
Anexos
100
8. ANEXOS
ANEXO 1. Protocolo: Extracción de ARN.
Equipos Vortex vx-200 Labnet International Inc.
Centrifuga (Labnet C2500-R)
Reactivos y materiales Tubos eppendorf de 1.5ml
agua ultra pura DEPC (Dietilpirocarbonato) (Life Technologies, Carlsbad,
USA)
Micropipeta de 200 μl, 1000 μl.
Puntas de 20 μl, 200μl, 1000 μl.
Kit Viral QIAamp RNA mini.
Etanol (96 – 100%).
Procedimiento 1. Dilución 1:10 de las muestras de materia fecal:
1.1. En tubos eppendorf de 1.5 ml previamente marcados con el nombre de la
muestra, adicionar 1000 µl de agua DEPC, UltraPure DEPC-Treated Water.
1.2. Adicionar para las muestras que son liquidas 100 µl de Materia fecal y las que
son sólidas una cantidad equivalente a 1 gr de materia fecal.
1.3. Mezclar con vortex durante 15 segundos.
1.4. Centrifugar el mix durante 5 min a máxima revolución (13000 rpm).
1.5. Transferir el sobrenadante a un tubo eppendorf de 1.5ml limpio.
1.6. Descartar el pellet.
1.7. Realizar el paso 1.4.
1.8. Usar el sobrenadante para realizar la extracción de RNA.
2. Extracción de RNA viral mediante la utilización del kit QIAamp viral RNA
(QIAgen):
2.1 Pipetear 560 µl de buffer AVL preparado (contiene carrier ARN en un tubo 1.5
ml).
2.2 Adicionar 20 µl de Fago MS2 previamente preparado siguiendo el protocolo
MS2 Bacteriophage (ATCC15597 – B1).
2.3 Añadir 140 µl de sobrenadante de la dilución, al búffer AVL-carrier ARN en
el tubo de eppendorf. Mezclar en un vórtex durante 15 segundos.
2.4 Incubar a temperatura ambiente (15-25 ° C) durante 10 minutos.
2.5 Centrifugar brevemente el tubo para eliminar las gotas del interior de la tapa.
2.6 Añadir 560 µl de etanol (96-100%) a la muestra, y mezclar por un vórtex por
15 segundos. Después de mezclar, centrifugar brevemente el tubo para quitar
gotas del interior de la tapa.
2.7 Adicionar 630 µl de la solución de la etapa 5 a la columna QIAamp Mini (en
un tubo recolector de 2 ml) sin mojar el borde. Cerrar el tapón y centrifugar a
6.000 x g (8.000 rpm) durante 1 min. Colocar la columna QIAamp Mini en un
tubo recolector de 2 ml limpio, y desechar el tubo que contiene el filtrado.
2.8 Abrir cuidadosamente la columna QIAamp Mini, y repetir el paso 2.6.
Anexos
101
2.9 Abrir cuidadosamente la columna QIAamp Mini, y añadir 500 µl de Buffer
AW1. Centrifugar a 6000 x g (8.000 rpm) durante 1 min. Colocar la columna
QIAamp Mini en un tubo recolector limpio de 2 ml (suministrado por el kit), y
desechar el tubo que contiene el filtrado.
2.10 Abrir cuidadosamente la columna QIAamp Mini, y añadir 500 µl de Buffer
AW2. Centrifugar a toda velocidad (20.000 x g; 14.000 rpm) durante 3
minutos. Continuar directamente con el paso 2.11, o para eliminar cualquier
posibilidad de presencia de Buffer AW2, realice el paso 2.10, y después
continúe con el paso 2.11.
2.11 Recomendado: Colocar la columna QIAamp Mini en un nuevo tubo de
recolección de 2 ml (no incluido), y desechar el tubo con el filtrado. Centrifugar
a máxima velocidad durante 1 minutos.
2.12 Colocar la columna QIAamp Mini en un tubo de eppendorf de 1,5 ml limpio
(no suministrado). Deseche el tubo de extracción que contiene el filtrado. Abrir
cuidadosamente la columna QIAamp Mini y añadir 60 µl de buffer AVE
equilibrado a temperatura ambiente. Cerrar el tapón, e incuba a temperatura
ambiente durante 1 minutos. Centrifugar a 6000 x g (8.000 rpm) durante 1
minutos.
Anexos
102
ANEXO 2. Protocolo: Extracción de ADN.
Equipos Vortex vx-200 Labnet International Inc.
Centrifuga (Labnet C2500-R).
Bloque seco (Labnet AccuBlock – Digital Dry Bath).
Reactivos y materiales Tubos eppendorf de 1.5ml, 2.ml.
agua grado molecular (Científica Senna, Mexico).
Micropipeta de 200 μl, 1000 μl.
Puntas de 20 μl, 200μl, 1000 μl.
Kit QIAamp RNA stool mini.
Etanol (96 – 100%).
Procedimiento 1. Dilución 1:10 de las muestras de materia fecal:
1.1 En tubos eppendorf de 1.5 ml previamente marcados con el nombre de la
muestra, adicionar 1000 µl de agua DEPC, UltraPure DEPC-Treated
Water.
1.2 Adicionar para las muestras que son liquidas 100 µl de Materia fecal y las
que son sólidas una cantidad equivalente a 1 gr de materia fecal.
1.3 Mezclar con vortex durante 15 segundos.
1.4 Centrifugar el mix durante 5 min a máxima revolución (13000 rpm).
1.5 Transferir el sobrenadante a un tubo eppendorf de 1.5ml limpio.
1.6 Descartar el pellet.
1.7 Realizar el paso 1.4.
1.8 Usar el sobrenadante para realizar la extracción de ADN.
2. Extracción de ADN viral mediante la utilización del kit QIAamp viral RNA
(QIAgen):
2.1 Transferir 200 μl del sobrenadante de la dilución a un tubo eppendorf de
2ml.
2.2 Adicionar 1400 μl de buffer ASL a cada muestra. Llevar al vortex
cuidadosamente durante 1 min hasta que la muestra quede totalmente
homogénea.
2.3 Incubar la suspensión por 5 minutos a 70°C, en bloque seco.
2.4 Mezclar en vortex durante 15 segundos y centrifugar la muestra a alta
velocidad durante 1 minuto para sedimentar las partículas de las heces.
2.5 Pipetee 1.200 µl del sobrenadante en un nuevo tubo eppendorf de 2.0ml
(no proporcionado) y descarte le pellet.
Nota: los tubos de 2ml usados deben ser suficientemente amplio para
acomodar la tableta InhibitEX. Transferir una pequeña cantidad del pellet
no afectara el procedimiento.
2.6 Adicionar 1 tableta InhibiteX a cada muestra y mezclar con vortex
inmediatamente durante 1 minuto hasta que la tableta este totalmente
suspendida. Incubar la suspensión durante 1 minuto a temperatura
Anexos
103
ambiente para dejar que los inhibidores se absorban en la matrix
InhibitEX.
2.7 Centrifugue la muestra a alta velocidad durante 3 minutos para ligar los
inhibidores del pellet a la matrix InhibitEX.
2.8 Pipetee todo el sobrenadante a un nuevo tubo eppendorf de 1.5 ml (no
proporcionado) y descarte el pellet. Centrifugue la muestra a alta
velocidad por 3 minutos.
2.9 Pipetee 15 μl de proteinasa K en un nuevo tubo de microcentrifuga de 1.5
ml (no proporcionado).
2.10 Pipetee 200 μl del sobrenadante obtenido en el paso 2.8 al tubo
eppendorf de 1.5 ml que contiene proteinasa k.
2.11 Adicionar 200 μl de buffer AL y llevar al vortex durante 15 seg.
Nota: no adicionar proteinasa k directamente al buffer AL. Es esencial
que la muestra y el buffer AL sean mezclados homogéneamente.
2.12 Incubar a 70°C durante 10 minutos. Centrifugue brevemente para
remover las gotas de la tapa (este es opcional).
2.13 Adicione 200 μl de etanol (96 -100%) para la lisis, y mezclar por vortex
rapidamente. Centrifugue brevemente para remover las gotas de la tapa
(este es opcional).
2.14 Rotule la tapa de una mini columna QIAamp y colóquela en un tubo.
Agregar cuidadosamente el lisado completo de la etapa 2.13 a la columna
de centrifugación QIAamp sin humedecer el borde. Cerrar la tapa y
centrifugar a máxima velocidad durante 1 min. Colocar la columna de
centrifugación QIAamp en un nuevo tubo de de 2 ml y desechar el tubo
que contiene el filtrado.
2.15 Cerrar la columna cada paso con el fin de evitar la formación de
aerosoles durante la centrifugación. Si el lisado no ha pasado
completamente a través de la columna después de la centrifugación,
centrifugar de nuevo hasta que la columna de centrifugación QIAamp este
vacía.
2.16 Abrir cuidadosamente la columna QIAamp y agregar 500 μl de buffer
AW1. Cerrarla y centrifugar a alta velocidad durante 1 minuto. Colocar la
columna de QIAamp en nuevo tubo de 2 ml y descartar el tubo que
contienen el filtrado.
2.17 Abrir cuidadosamente la columna QIAamp y agregar 500 μl de buffer
AW2. Cerrarla y centrifugar a alta velocidad durante 3 minutos. Colocar
la columna de QIAamp en nuevo tubo de 2 ml y descartar el tubo que
contienen el filtrado.
2.18 Recomendado: Colocar la columna de centrifugación QIAamp en un
nuevo tubo de de 2 ml (no proporcionado) y deseche el tubo con el
filtrado. Centrifugar a máxima velocidad durante 1 min. Este paso ayuda
a eliminar los residuos del buffer AW2.
2.19 Transferir la columna de centrifugación QIAamp, con la etiqueta a un
tubo eppendorf de 1.5 ml (no se incluyen). Abrir cuidadosamente la
columna de centrifugación QIAamp y pipetear 200 μl Buffer AE
directamente sobre la membrana QIAamp. Cierre la tapa e incube durante
1 min a temperatura ambiente, a continuación centrifugue a máxima
velocidad durante 1 min para eluir el ADN.
Anexos
104
ANEXO 3. Protocolo: Reacción en Cadena de la Polimerasa
Transcripción Reversa en Tiempo Real (RT-qPCR) múltiple.
Equipos Vortex vx-200 Labnet International Inc.
Centrífuga (Labnet C2500-R).
Termociclador CFX96 Touch™ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad,
Hercules, California, USA).
Reactivos y materiales Tubos eppendorf de 0.2ml, 1.5ml.
agua grado molecular (Científica Senna, Mexico).
Micropipeta de 2μl, 20 μl, 200 μl, 1000 μl.
Puntas de 10μl, 20μl, 200μl, 1000 μl.
kit One-Step RT- PCR (TaqMan® Life Technologies, Carlsbad, USA).
Procedimiento RT-qPCR múltiples para ARN de Norovirus GI – GII y Sapovirus – Astrovirus.
1. Limpiar el área de trabajo, mantener los reactivos en hielo hasta su uso,
agitar los primers y las sondas durante 5 segundos, realizar spin para
eliminar burbujas de aire.
2. Realizar el master mix en un tubo eppendorf de 1.5ml usando los reactivos
del protocolo Ag - path one - step RT-PCR kit (TaqMan® Life
Technologies, Carlsbad, USA) de acuerdo a la tabla.
Sapovirus/Astrovirus Norovirus GI/GII
Componente Volumen (µl) Componente Volumen (µl)
2X RT-PCR
buffer 12.5
2X RT-PCR
buffer 12.5
Agua libre de
nucleasas
grado biología
molecular.
2.5
Agua libre de
nucleasas grado
biología
molecular.
1.08
AsFF (10 μM)
0.6 Detector enhancer 1.67
AsFR (10 μM)
0.6 Cog 1F (10 μM) 1
AstZFB (10 μM)
0.25 Cog 1R (10 μM) 1
SaV 124F (10
μM) 1.0 Ring 1E (10 μM) 0.5
SaV 1F (10 μM) 1.0 Cog 2F (10 μM) 1
SaV 5F (10 μM) 1.0 Cog 2R(10 μM) 1
SaV 1245R (10
μM) 1.0 Ring 2 (10 μM) 0.5
SaV124TP (10
μM) 0.25 MS2.F (10 μM) 0.25
SaV 5TP (10 μM) 0.25 MS2.R (10 μM) 0.25
Anexos
105
25 X Enzima RT-
PCR 1
MS2.P 0.25
25 X Enzima RT-
PCR 1
3. Determinar el número de reacciones por ensayo:
Si el número de muestras incluidas son de 1 a 14, se recomienda hacer
una reacción más.
Si el número de muestras incluidas son más de 15, se recomienda
preparar el master mix para dos muestras más.
4. Adicionar 22 μl de master mix en cada pozo de las placas de PCR de 96
pozos.
5. Adicionar 3 μl de agua libre de RNasas, a los controles negativos NTC.
6. Adicionar 3 μl de RNA de cada muestra en cada pozo.
7. Centrifugar para eliminar burbujas de aire, durante 1min a 2.500 rpm a 4
°C.
8. Seguir condiciones de amplificación usando el termociclador CFX96
Touch™ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, Hercules,
California, USA).
RT-qPCR múltiples para ADN de Adenovirus:
1. Limpiar el área de trabajo, mantener los reactivos en hielo hasta su uso,
agitar los primers y las sondas durante 5 segundos, realizar spin para
eliminar burbujas de aire.
2. Realizar el master mix en un eppendorf usando los reactivos del
protocolo Ag - path one - step RT-PCR kit (TaqMan® Life Technologies,
Carlsbad, USA) de acuerdo a la tabla.
Componente Volumen (μl)
2X RT-PCR buffer 12,5
Agua libre de nucleasas 4,33
Detección Enhancer 1,67
JTVFF (10 μM) 1
JTVFR (10 μM) 1
JTVFAP (10 μM) 0,5
25X RT-PCR enzima 1
Total 22
3. Determinar el número de reacciones por ensayo:
Si el número de muestras incluidas son de 1 a 14, se recomienda hacer
una reacción más.
Ciclos Tiempo Temperatura (°C)
1 10 min 45
1 10 min 95
45 (Norovirus)
40 (Sapovirus -
Astrovirus)
15 sec 95
1 min 60
Anexos
106
Si el número de muestras incluidas son más de 15, se recomienda
preparar el master mix para dos muestras más.
4. Adicionar 22 μl de master mix en cada pozo de las placas de PCR de 96
pozos.
5. Adicionar 3 μl de agua libre de RNasas, a los controles negativos NTC.
6. Adicionar 3 μl de RNA de cada muestra en cada pozo.
7. Centrifugar para eliminar burbujas de aire, durante 1min a 2.500 rpm a 4
°C.
8. Seguir condiciones de amplificación usando el termociclador CFX96
Touch™ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, Hercules,
California, USA).
Ciclos Tiempo Temperatura (°C)
1 10 min 45
1 10 min 95
40 15 sec 95
1 min 60
Anexos
107
ANEXO 4. Protocolo: Protocolo Transcripción Reversa (RT) RNA de Norovirus
GI/GII con el kit AB High Capacity cADN Reverse Transcription.
Equipos Vortex vx-200 Labnet International Inc.
Centrifuga (Labnet C2500-R).
Termociclador C1000 Touch Thermal Cycler (Bio-Rad, California, USA).
Reactivos y materiales Tubos eppendorf de 0.2ml, 1.5ml.
agua grado molecular (Científica Senna, Mexico).
Micropipeta de 2μl, 20 μl, 200 μl, 1000 μl.
Puntas de 10μl, 20μl, 200μl, 1000 μl.
kit AB High Capacity cADN Reverse Transcription (TaqMan® Life
Technologies, Carlsbad, USA).
Procedimiento 1. Preparar el master mix siguiendo las instrucciones en la siguiente tabla,
mantener todos los reactivos en hielo.
Componentes Volumen (µl)
10x RT buffer 2
25x dNTP MIX (100mM) 0,8
10x RT random primers 2
Reverse transcriptase 1
Rnase inhibitor 1
Nuclease-free water 3,2
Total 10
2. Pipetear 10 µl de master mix en cada pozo de la placa de PCR con 96 pozos.
3. Pipetear 10 µl de RNA de las muestras en cada pozo. Pipetear de arriba abajo
dos veces para mezclar.
4. Cerrar los tubos.
5. Realizar spin a los tubos para eliminar burbujas de aire.
6. Mantener en hielo la placa con los tubos hasta que se inicie el proceso en el
termociclador C1000 Touch Thermal Cycler.
7. Condiciones de los ciclos:
Paso 1 Paso 2 Paso 3 Paso 4
Temperatura 25 °C 37 °C 85 °C 4 °C
Tiempo 10 min 120 min 5 min ∞
Anexos
108
ANEXO 5. Protocolo: Purificación del producto de PCR con el kit QIAquick PCR
purification.
Equipos Vortex vx-200 Labnet International Inc.
Centrifuga (Labnet C2500-R).
Reactivos y materiales Tubos eppendorf de 1.5ml.
Micropipeta de 2μl, 20 μl, 200 μl, 1000 μl.
Puntas de 10μl, 20μl, 200μl, 1000 μl.
kit QIAquick PCR purification (QIAgen)
Procedimiento 1. Adicionar 5 volúmenes de buffer PB a un volumen de reacción de PCR y
mix.
2. Transferir el mix anterior columna (suministrada en el kit.
3. Centrifugar durante un minuto a máxima revolución
4. Descartar el volumen del tubo recolector
5. Adicionar 750μl de buffer PE a la columna.
6. Centrifugar durante 1 minuto a máxima revolución.
7. Descartar el volumen del tubo recolector.
8. Centrifugar nuevamente por un minuto.
9. Transferir la columna a un tubo eppendorf de 1.5ml.
10. Adicionar 50 µl eluyente para ADN (buffer EB)
ANEXO 6. Protocolo: Polymerase Chain Reaction (PCR) convencional de la
región C, Norovirus.
Equipos Vortex vx-200 Labnet International Inc.
Centrifuga (Labnet C2500-R).
Termociclador C1000 Touch Thermal Cycler (Bio-Rad, California, USA).
Reactivos y materiales Tubos eppendorf de 1.5ml.
Micropipeta de 2μl, 20 μl, 200 μl, 1000 μl.
Puntas de 10μl, 20μl, 200μl, 1000 μl.
Go Taq G2 Hot start Green master mix (Promega, Madison, USA)
Procedimiento 1. mantener limpio el área de trabajo.
2. Alistar los tubos eppendorf de 0.2µl.
3. Preparar el master mix en tubos eppendorf de 1.5ml.
4. Realizar el master Mix con Go Taq G2 Hot start Green master mix, PCR
supermix (Invitrogen), como se describe en la tabla.
Anexos
109
Componente Volumen (μl)
Green mix 25
Primer forward 2
Primer reverse 2
Agua 18
cADN 3
Total 50
5. Usar el termociclador C1000 Touch Thermal Cycler con las siguientes condiciones
de ciclado. Ciclos Tiempo Temperatura
1 3 min 94 °C
40
30 seg 94 °C
30 seg 50°C
1 Seg 72 °C
1 7 min 73 °C
6. Visualizar los productos de PCR mediante electroforesis en geles de agarosa al 2
% durante 25 minutos a 200 voltios y 300 amp. Estos deben ser visualizados con
Sybr Safe (Invitrogen) bajo luz UV.
Anexos
110
ANEXO 7. Protocolo: Protocolo de clonación.
Equipos Vortex vx-200 Labnet International Inc.
Centrifuga (Labnet C2500-R).
Reactivos y materiales Tubos eppendorf de 1.5ml.
Micropipeta de 2μl, 20 μl, 200 μl, 1000 μl.
Puntas de 10μl, 20μl, 200μl, 1000 μl.
kit QIAquick PCR purification Kit (QIAgen, Valencia, USA)
vector p-GEM (Promega, Madison, USA)
Medio y caldo Luria Bertani
Ampicilina
Procedimiento
1. Purificación del producto de PCR
1.1 Del producto de PCR realizar Purificación del producto de PCR, como el anexo
5.
2. Ligación en el vector p-GEM
2.1 cuidadosamente centrifugar los tubos que contiene el vector PGEM-T, control
del ADN y buffer de ligación.
2.2. Preparan las reacciones adicionando a un tubo de PCR de 0,2 ml, según
reactivos presentes en la tabla.
Reactivos
Reacción
muestras µl
Control
positivo
µl
Control
negativo
µl
2X Buffer ligación rápida, T4 ADN
ligasa
5 5 5
Vector pGEM-T (50ng) 1 1 1
Producto de PCR 3 - -
ADN control inserto - 2 -
T4 ADN ligasa (3 Unidades/µl) 1 1 1
Volumen final de agua deshionizada 10 10 10
2.3 Las reacciones se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente.
3. Transformación.
3.1 Mantener todos los tubos eppendorf en hielo
3.2 Del producto de incubación, adicionar 5µl, a cada tubo eppendorf
3.3 Adicionar al mismo tubo 100 µl de células competentes.
3.4 Incubar durante 20 minutos,
3.5 Transferir los tubos a agua con una temperatura de 42 °C durante 2 minutos.
3.6 Transferir los tubos nuevamente a hielo durante 5 minutos
3.7 Adicionar 950 µl de medio caldo súper óptimo con la represión catabólica
(Presencia de Glucosa) SOC de (Invitrogen, Carlsbad, USA).
3.8 Incubar durante 1 hora 37 °C en agitación 150 r.p.m.
3.9 Transferir 100 µl de este contenido anterior a cajas de Petri que contengan medio
Luria Bertani (LB) más ampicilina a 100 mg /ml.
Anexos
111
3.9 Incubar las cajas durante toda la noche a 30 °C.
3.10 Al día siguiente, observar las colonias de color blanco crecidas en las cajas de
Petri.
3.11 Cultivar las colonias crecidas en un nuevo medio LB.
3.12 Incubar toda la noche.
3.13 Al siguiente día realizar extracción de material genético, adicionando una colonia
a 20 µl de agua grado molecular.
3.14 Transferir estos tubos al termociclador a una temperatura de 100 °C durante 5
minutos, pasado este tiempo centrifugar durante 2 minutos, finalmente transferir los
tubos a hielo durante 5 minutos para proceder con la PCR.
4. PCR para visualización del inserto
4.1 En un tubo de PCR adicionar 12.5 µl Green mix, 1 µl primer forward, 1 µl primer
reverse, 9.5 agua y 1 µl de ADN con las condiciones de la PCR convencional tabla.
Ciclos Tiempo Temperatura
1 3 min 94 °C
40
30 seg 94 °C
30 seg 50°C
1 Seg 72 °C
1 7 min 72 °C
4.2 Visualizar, el producto en gel de agarosa al 2 %.
4.3 cultivar las colonias originales que contienen las muestras, en caldo LB más
ampicilina, toda la noche en agitación a 150 r.p.m.
Anexos
112
ANEXO 8. Protocolo: Extracción del plásmido.
Equipos Vortex vx-200 Labnet International Inc.
Centrifuga (Labnet C2500-R).
Reactivos y materiales Tubos eppendorf de 1.5ml.
Micropipeta de 2μl, 20 μl, 200 μl, 1000 μl.
Puntas de 10μl, 20μl, 200μl, 1000 μl.
kit QIAprep Spin Miniprep (QIAgen, Canada, USA).
Procedimiento
1. Resuspender el pellet de la bacteria E. coli clonada crecida en 250 µl de buffer P1.
2. Centrifugar durante 1 minuto a máxima revolución.
3. Adicionar 250 µl de buffer p2, invertir los tubos de 4 a 6 veces.
4. Adicionar 350 µl de buffer N3, realizar inversión de 4 a 6 veces.
5. Centrifugar por 10 minutos a 13.000 r.p.m.
6. Transferir este contenido a una columna suministrada por el kit.
7. Centrifugar durante 30 a 60 segundos.
8. Descartar el residuo.
9. Lavar la columna con 500 µl buffer PB.
10. Centrifugar durante 1 minuto.
11. Lavar nuevamente con 750 µl buffer PE.
12. Centrifugar nuevamente.
13. Transferir la columna a un tubo eppendorf de 1.5 ml nuevo, para eludir la muestra,
adicionando 50 µl de buffer EB.
14. Centrifugar durante 1 minuto a máxima revolución.
15. El ADN a una concentración 100 ng/µl que se obtenga sera enviado a
secuenciación a GENEWIZ con los primers seleccionados del plásmido. Forward:
5´-(CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC)-3´ y reverse: 5´-
(TCACACAGGAAACAGCTATGAC)-3´.
Anexos
113
ANEXO 9. Protocolo: Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) para la
identificación de Rotavirus
Equipos Vortex vx-200 Labnet International Inc.
Centrifuga (Labnet C2500-R).
Espectrofotómetro.
Reactivos y materiales Tubos eppendorf de 1.5ml.
Micropipeta de 2μl, 20 μl, 200 μl, 1000 μl.
Puntas de 10μl, 20μl, 200μl, 1000 μl.
AccuDiag™ Rotavirus (Fecal) ELISA Kit (Diagnostic Automation®,
Calabasas, USA).
Procedimiento
1. Romper el número de pozos necesarios (número de muestras más dos pozos para
los controles).
2. Añadir 100 μl de control negativo para el pozo 1 y 100 μl de control positivo para
el pozo 2 (sin diluir).
3. Añadir 100 μl de sobrenadante de las heces a las pruebas adecuadas.
4. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos, luego lave.
5. Añadir 2 gotas de reactivo 1 (solución de azul) a cada pocillo.
6. Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos, luego lave.
7. Añadir 2 gotas de reactivo 2 (solución de color rojo) a cada pocillo.
8. Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos, luego lave.
9. Añadir 2 gotas cromógeno a cada pocillo.
10. Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos.
11. Añadir 2 gotas de solución a cada pocillo.
12. Lea los resultados visualmente o en un espectrofotómetro mediante una lectura
bichromatica, con la absorbancia establecidas a 450nm y 620-650 nm.
El lavado consistirá en utilizar el tampón de lavado diluido para cubrir a la parte
superior de cada pozo, la agitación y recarga de los pozos en un total de 3 veces.
Evitar la generación de burbujas en los pozos durante el paso de lavado. Controles
deben incluirse cada vez que el kit se ejecuta.
Interpretación de los resultados Visual
Reactiva: cualquier muestra bien distinta y que evidencia color amarillo.
No reactivo: cualquier muestra que no desarrolla color amarillo.
Anexos
114
ANEXO 10. Protocolo: PCR para la identificación de rotavirus
Equipos Vortex vx-200 Labnet International Inc.
Centrifuga (Labnet C2500-R).
Termociclador C1000 Touch Thermal Cycler (Bio-Rad, California, USA).
Reactivos y materiales Tubos eppendorf de 1.5ml.
Micropipeta de 2μl, 20 μl, 200 μl, 1000 μl.
Puntas de 10μl, 20μl, 200μl, 1000 μl.
Go Taq G2 Hot start Green master mix (Promega, Madison, USA)
Procedimiento 1. mantener limpio el área de trabajo.
2. Alistar los tubos eppendorf de 0.2µl.
3. Preparar el master mix en tubos eppendorf de 1.5ml.
4. Realizar el master Mix con Go Taq G2 Hot start Green master mix, PCR
supermix (Invitrogen), como se describe en la tabla.
Componente Volumen (μl)
Green mix 25
Primer forward 2
Primer reverse 2
Agua 18
cADN 3
Total 50
5. Usar el termociclador C1000 Touch Thermal Cycler con las siguientes condiciones
de ciclado.
Condiciones del ciclado VP4
Ciclos Tiempo Temperatura °C
1 10 min 95
35
1 min 94
1 min 50
1 min 72
1 10 min 73
Condiciones del ciclado VP7
Ciclos Tiempo Temperatura °C
1 10 min 95
40
1 min 94
3 min Gradiente 45 a 65
1 min 72
1 10 min 73
Anexos
115
6. Visualizar los productos de PCR mediante electroforesis en geles de agarosa al 2
% durante 25 minutos a 200 voltios y 300 amp. Estos deben ser visualizados con
Sybr Safe (Invitrogen) bajo luz UV.
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