unidad 8
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MMÉÉTODOS TODOS MICROBIOLMICROBIOLÓÓGICOSGICOS
Unidad VIII
Cultivo de microorganismos en el laboratorio
Muestra Ambiental
Inoculación
Aislamiento
IdentificaciónBioquímicas
Tinción
Microscopia
Toma de muestras
Materiales estérilesUso de guantes, cubrebocasToma de muestrasConservación de las muestras
Medios de cultivo
Macronutrientes necesariosMacronutrientes necesarios
Medios de cultivo
MicronutrientesMicronutrientes necesariosnecesarios
Medios de cultivo
Factores de crecimientoFactores de crecimiento
Medios de cultivoSoluciones nutritivas que se utilizan en el Soluciones nutritivas que se utilizan en el laboratorio para el cultivo de microorganismos.laboratorio para el cultivo de microorganismos.
QUIMICAMENTEQUIMICAMENTEDEFINIDOSDEFINIDOS COMPLEJOSCOMPLEJOS
Medios de cultivoMedios de Cultivo para microorganismos que Medios de Cultivo para microorganismos que requieren nutrimentos simples o complejosrequieren nutrimentos simples o complejos
Preparación de los medios de cultivo
•• Los medios sLos medios sóólidos se preparan igual que los llidos se preparan igual que los lííquidosquidos
•• Se agrega Se agrega agaragar al 1.5 %al 1.5 %
•• EsterilizaciEsterilizacióón de los medios de cultivon de los medios de cultivo
•• Vertido sobre placas de cristal o plVertido sobre placas de cristal o pláásticostico
•• SolidificaciSolidificacióónn
•• Prueba de esterilidad (incubaciPrueba de esterilidad (incubacióón)n)
Técnicas de aislamiento
Permiten la obtenciPermiten la obtencióón de microorganismos a partir n de microorganismos a partir de muestras complejas:de muestras complejas:
SUELOSUELO AGUAAGUA ALIMENTOSALIMENTOS
Técnicas de aislamiento
Existen diferentes mExisten diferentes méétodos para aislar microorganismos:todos para aislar microorganismos:
Enriquecimiento Enriquecimiento
Métodos de diluciónMétodos de dilución
Siembra en placa por extensiónSiembra en placa por extensión
Medios sólidos por estría en placaMedios sólidos por estría en placa
Métodos de enriquecimiento y aislamiento
TECNICA DE CULTIVO DE ENRIQUECIMIENTO
Cultivo y aislamiento de microorganismos en medios altamente selectivosselectivos.
Las muestras son inoculadas directamente al medio de cultivo.
Los restos de materia orgánica por la muestra puede favorecer el crecimiento de especies que no precisamente son selectivos del medio preparado.
Métodos de enriquecimiento y aislamiento
Aislamiento de Aislamiento de AzotobacterAzotobacter
Métodos de enriquecimiento y aislamiento
Columna de Columna de WinogradskyWinogradsky
Método de dilución (Numero Mas Probable)
Método de dilución (Numero Mas Probable)
10 ml N M P
PresuntivaC. Totales
1.0 ml
0.1
0.01
0.001
+++
+++
+++
0.0001
Técnica asépticaSerie de procedimientos que evitan la contaminaciSerie de procedimientos que evitan la contaminacióón n durante la manipulacidurante la manipulacióón de los cultivos, muestras y medios n de los cultivos, muestras y medios de cultivos estde cultivos estéériles.riles.
Técnica estría en placa
Técnica estría en tubo
Siembra en placa por extensión
Siembra en profundidad
Cultivo axénico o puroMedios de cultivo sMedios de cultivo sóólidoslidos
Cultivos axénicos de alta tecnologíaPinzas lPinzas lááserser
IdentificaciónBioquBioquíímicasmicas
IdentificaciónBioquBioquíímicasmicas
Identificación
TINCIÓN
IdentificaciónMicroscopía
Identificación
Microscopio óptico
Campo claro
Contraste de fases
Campo oscuro
Fluorescencia
Identificación
Identificación
No cultivables
Nuevos métodos para cultivar bacterias (Katie Greene)
No todos los microorganismos pueden ser cultivables.
El cultivo de microorganismos tiene muchas ventajas (se
puede aislar de ellos, enzimas o antibióticos).
Recreación de condiciones naturales.
Aislamiento de microorganismos no cultivables simulando un ambiente natural
(T. Kaeberlein, K. Lewis, S.S. Epstein)
Metodología:
Muestra: Sedimento marino.
Medios:
1) Cámaras con sedimento y agua marina, O2, membranas con nutrientes y químicos ambientales.
2) Placas Petri con caseína y caldo marino.
Resultados:
* Crecimiento de diferentes formas en una semana.
* El 99 % de éstas no eran visibles.
* 300 veces más el número de colonias en las cámaras
que en las placas Petri.
* Microcolonias obtenidas en diferentes meses:
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Febrero Marzo Junio Julio Agosto Septiembre
Aislaron 11 cepas puras (MSC1, MSC2 y otras 9).* Fueron diferenciadas y detectadas por formas macroscopicas (colonia) por microscopía y por técnicas moleculares (PCR y 16s rRNA).* En las placas crecieron las cepas MSC1 y MSC2 juntas.
Métodos Moleculares16s rRNA
• 16s rRNA son de aproximadamente 1,500 nucleotidos.
• Contienen varias regiones altamente conservadas.
• Regiones que consiguen alinear las secuencias adecuadamente.
• Pero, presentan suficiente variabilidad de secuencias en otras regiones.
• Son excelentes cronómetros filogenéticos.
Ribosoma 70S Subunidad 50S
Subunidad 30S5S (120 nucleotidos)
16S (1500 nucleotidos)
23S (2900 nucleotidos)
Genome-enabledMuestras ambientales
Células DNA mRNA Proteínas
Cultivo Secuenciar Análisis con microsatélites
ProteomicsAmbiental
Secuenciación
Función de los genes
Modelo conceptual de genes
Inferencia de la funciónY regulación de las
Condiciones ambientalesDe los genes que se
expresan
Genoma Completo
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