MMÉÉTODOS TODOS MICROBIOLMICROBIOLÓÓGICOSGICOS

Unidad VIII

Cultivo de microorganismos en el laboratorio

Muestra Ambiental

Inoculación

Aislamiento

IdentificaciónBioquímicas

Tinción

Microscopia

Toma de muestras

Materiales estérilesUso de guantes, cubrebocasToma de muestrasConservación de las muestras

Medios de cultivo

Macronutrientes necesariosMacronutrientes necesarios

Medios de cultivo

MicronutrientesMicronutrientes necesariosnecesarios

Medios de cultivo

Factores de crecimientoFactores de crecimiento

Medios de cultivoSoluciones nutritivas que se utilizan en el Soluciones nutritivas que se utilizan en el laboratorio para el cultivo de microorganismos.laboratorio para el cultivo de microorganismos.

QUIMICAMENTEQUIMICAMENTEDEFINIDOSDEFINIDOS COMPLEJOSCOMPLEJOS

Medios de cultivoMedios de Cultivo para microorganismos que Medios de Cultivo para microorganismos que requieren nutrimentos simples o complejosrequieren nutrimentos simples o complejos

Preparación de los medios de cultivo

•• Los medios sLos medios sóólidos se preparan igual que los llidos se preparan igual que los lííquidosquidos

•• Se agrega Se agrega agaragar al 1.5 %al 1.5 %

•• EsterilizaciEsterilizacióón de los medios de cultivon de los medios de cultivo

•• Vertido sobre placas de cristal o plVertido sobre placas de cristal o pláásticostico

•• SolidificaciSolidificacióónn

•• Prueba de esterilidad (incubaciPrueba de esterilidad (incubacióón)n)

Técnicas de aislamiento

Permiten la obtenciPermiten la obtencióón de microorganismos a partir n de microorganismos a partir de muestras complejas:de muestras complejas:

SUELOSUELO AGUAAGUA ALIMENTOSALIMENTOS

Técnicas de aislamiento

Existen diferentes mExisten diferentes méétodos para aislar microorganismos:todos para aislar microorganismos:

Enriquecimiento Enriquecimiento

Métodos de diluciónMétodos de dilución

Siembra en placa por extensiónSiembra en placa por extensión

Medios sólidos por estría en placaMedios sólidos por estría en placa

Métodos de enriquecimiento y aislamiento

TECNICA DE CULTIVO DE ENRIQUECIMIENTO

Cultivo y aislamiento de microorganismos en medios altamente selectivosselectivos.

Las muestras son inoculadas directamente al medio de cultivo.

Los restos de materia orgánica por la muestra puede favorecer el crecimiento de especies que no precisamente son selectivos del medio preparado.

Métodos de enriquecimiento y aislamiento

Aislamiento de Aislamiento de AzotobacterAzotobacter

Métodos de enriquecimiento y aislamiento

Columna de Columna de WinogradskyWinogradsky

Método de dilución (Numero Mas Probable)

Método de dilución (Numero Mas Probable)

10 ml N M P

PresuntivaC. Totales

1.0 ml

0.1

0.01

0.001

+++

+++

+++

0.0001

Técnica asépticaSerie de procedimientos que evitan la contaminaciSerie de procedimientos que evitan la contaminacióón n durante la manipulacidurante la manipulacióón de los cultivos, muestras y medios n de los cultivos, muestras y medios de cultivos estde cultivos estéériles.riles.

Técnica estría en placa

Técnica estría en tubo

Siembra en placa por extensión

Siembra en profundidad

Cultivo axénico o puroMedios de cultivo sMedios de cultivo sóólidoslidos

Cultivos axénicos de alta tecnologíaPinzas lPinzas lááserser

IdentificaciónBioquBioquíímicasmicas

IdentificaciónBioquBioquíímicasmicas

Identificación

TINCIÓN

IdentificaciónMicroscopía

Identificación

Microscopio óptico

Campo claro

Contraste de fases

Campo oscuro

Fluorescencia

Identificación

Identificación

No cultivables

Nuevos métodos para cultivar bacterias (Katie Greene)

No todos los microorganismos pueden ser cultivables.

El cultivo de microorganismos tiene muchas ventajas (se

puede aislar de ellos, enzimas o antibióticos).

Recreación de condiciones naturales.

Aislamiento de microorganismos no cultivables simulando un ambiente natural

(T. Kaeberlein, K. Lewis, S.S. Epstein)

Metodología:

Muestra: Sedimento marino.

Medios:

1) Cámaras con sedimento y agua marina, O2, membranas con nutrientes y químicos ambientales.

2) Placas Petri con caseína y caldo marino.

Resultados:

* Crecimiento de diferentes formas en una semana.

* El 99 % de éstas no eran visibles.

* 300 veces más el número de colonias en las cámaras

que en las placas Petri.

* Microcolonias obtenidas en diferentes meses:

0

5

10

15

20

25

30

35

40

Febrero Marzo Junio Julio Agosto Septiembre

Aislaron 11 cepas puras (MSC1, MSC2 y otras 9).* Fueron diferenciadas y detectadas por formas macroscopicas (colonia) por microscopía y por técnicas moleculares (PCR y 16s rRNA).* En las placas crecieron las cepas MSC1 y MSC2 juntas.

Métodos Moleculares16s rRNA

• 16s rRNA son de aproximadamente 1,500 nucleotidos.

• Contienen varias regiones altamente conservadas.

• Regiones que consiguen alinear las secuencias adecuadamente.

• Pero, presentan suficiente variabilidad de secuencias en otras regiones.

• Son excelentes cronómetros filogenéticos.

Ribosoma 70S Subunidad 50S

Subunidad 30S5S (120 nucleotidos)

16S (1500 nucleotidos)

23S (2900 nucleotidos)

Genome-enabledMuestras ambientales

Células DNA mRNA Proteínas

Cultivo Secuenciar Análisis con microsatélites

ProteomicsAmbiental

Secuenciación

Función de los genes

Modelo conceptual de genes

Inferencia de la funciónY regulación de las

Condiciones ambientalesDe los genes que se

expresan

Genoma Completo