transformaciÓn. fred griffith 1928, sus estudios los realizó en streptococcus pneumoniae...

TRANSFORMACIÓN

Fred Griffith 1928, sus estudios los realizó en Streptococcus

pneumoniae

Conclusión: Las células R “absorbieron” “algo” de las células S

“principio transformante”

El Principio transformante es DNA

TRANSFORMACIÓNCAMBIO HEREDABLE EN UNA CÉLULA U ORGANISMO PRODUCIDO POR

LA INTRODUCCIÓN DE UN DNA EXÓGENO

Puede ser

NATURAL (se han encontrado aproximadamente 40 especies que pueden realizar este proceso)

ARTIFICIAL (INDUCIDA)

TRANSFORMACIÓN

¿Para qué tomar DNA exógeno?.... Grandes maquinarias proteícas intervienen en el proceso

de transformación

Algunas hipótesis que no son excluyentes…..

I. Para la diversidad genética (por ejemplo: obtener resistencia a antibióticos)

II. Para la reparación de DNA

III. Como nutrientes: El DNA es fuente de carbono, nitrógeno y fósforo

SEMEJANZAS Y DIFERENCIAS TRANSFORMACIÓN vs CONJUGACIÓN

¿existe DNA libre en todos los

ambientes, es estable?

TRANSFORMACIÓN NATURAL, las bacterias más

estudiadas son

ETAPA 1: Desarrollo de un estado competente

ETAPA 2: Procesamiento del DNAUnión

Importe

Recombinación

GRAM +

Streptococcus pneumoniae

Bacillus subtilis

GRAM -

Neisseria gonorrhoeae

Haemophilus influenzae

El proceso de transformación se puede dividir en 2 ETAPAS

Etapa 1: Desarrollo de un estado competente

¿Qué es una célula competente?Estado fisiológico inducible

Factores que inducen el estado de competencia en la transformación natural:

Limitación en los nutrientes

Mitomicina C

Alta densidad celular

Temperatura, pH

La transcripción de los genes com se inducen durante el

estado de competencia

Velocidad de transferencia: 90-100 nucleótidos/segundo a 30°C

La transcripción de los genes com se inducen durante el estado de

competencia

Transporte DNA en Gram +

ANTES se debe formar el pseudopili que atraviesa la

pared celular

1. Unión del DNA a la superficie por interacción con proteínas (++) del

pseudopili

2. Unión a receptor: ComEA (no es secuencia específica)

3. Fragmentar y degradar la cadena que no se transporta

4. Se ha encontrado una endonucleasa en membrana

ComEC: canal en la membrana

ComFA: unión a ATP

Transporte DNA en Gram +

Se ha sugerido que el reconocimiento es secuencia

específica: (5´GCCGTCTGAA-3´)

Pili tipo IV:

Sistema de secreción tipo II

El pili debe cruzar la membrana interna, el espacio periplásmico y la membrana

externa

Una vez que ingresó el DNA de cadena sencilla ¿qué ocurre dentro

de la célula?

¿DE MANERA NATURAL es fácil intercambiar plásmidos entre bacterias por transformación?

¿es más fácil por conjugación?

TRANSFORMACIÓN ARTIFICIAL

El “caballito de batalla” es la bacteria Escherichia coli

Es una técnica fundamental en biología molecular: clonación y generar organismos

transgénicos

TRANSFORMACIÓN: HERRAMIENTA ÚTIL EN EL CAMPO DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR

VECORES GENÉTICOS: molécula de DNA que es usada como vehículo para transportar segmentos de DNA foráneo en una célula

huésped,

PLÁSMIDOS

OBJETIVO DE LA PRÁCTICA: OBTENER BACTERIAS RESISTENTES A

KANAMICINA

Medio LB + KANAMICINA

Escherichia coli

En la transformación artificial ¿cómo se induce el estado competente de

una bacteria?

1. Tratamiento químico2. Electroporación

Preparar células competentes de E. coliE. coli

3 mL medio Luria

Incubar toda la noche a

37°C

E. coli

A= 0.6 – 0.8 a 600 nm

5000 r.p.m. 5

min 4°C

3 mL NaCl

Resuspender

5 mL CaCl2

Resuspender

Preparar células competentes de E. coliE. coli

Incubar 20 min

2500 r.p.m 7 min

CÉLULAS COMPETENTES

1 hr42°C 70 s

Inmediatamente en hielo

1 mL medio SOC

Incubar a 37°C con agitación

por 45 min

LA TRANSFORMACIÓN SE REALIZARÁ POR CHOQUE TÉRMICO

CÉLULAS COMPETENTES

PLÁSMIDO: DNA EXÓGENO

Buffer TE, CaCl2 y PLÁSMIDO

Al final de la transformación

Utilizaremos el plásmido pET-TEM

Sitio múltiple de restricción

Origen de replicación

Gen que confiere resistencia a kanamicina: kanamicina

fosfotransferasa

Enzimas inactivadoras de aminoglucósidos:La resistencia de las cepas se hace por síntesis de enzimas generalmente codificadas por plásmidos.

La inactivación de los aminoglucósidos se hace por: 1.Adenilación de grupos hidroxilo. 2.Fosforilación de grupos hidroxilo. 3.Acetilación de grupos amino.

ENZIMA INACTIVADORA AMINOGLUCÓSIDO INACTIVADO:

Gentamicina adeniltransferasa

Gentamicinas, Sisomicina, Kanamicinas, Tobramicina.

Gentamicina acetiltransferasa

Netilmicina, Tobramicina, Gentamicinas, Sisomicina.

Kanamicina acetiltransferasa

Netilmicina, Amikacina, Neomicina, Kanamicinas,

Tobramicina, Gentamicinas, Sisomicina.

Neomicina, Kanamicina fosfotransferasa

Gentamicina A, Neomicina, Kanamicina

MECANISMO PROPUESTO PARA LA ENTRADA DE DNA EXÓGENO EN

BACTERIAS COMPETENTES DE E. coli

ANIMACIÓN

Células

transformantes

Células no transformante

s

Medio Luiria + KANAMICINA

ESQUEMA GENERAL

SESIÓN I: TRANSFORMAR cepas de E. coli con un plásmido para que adquieran resistencia a un antibiótico

SESIÓN 3: FUNCIóN DE LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

Cortar el plásmido aislado con enzimas de restricción y visualizarlo en un gel de agarosa teñido con bromuro de

etidio

SESIÓN 2: AISLAR el plásmido mediante la técnica de Lisis alcalina