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TRANSFORMACIÓN
Fred Griffith 1928, sus estudios los realizó en Streptococcus
pneumoniae
Conclusión: Las células R “absorbieron” “algo” de las células S
“principio transformante”
El Principio transformante es DNA
TRANSFORMACIÓNCAMBIO HEREDABLE EN UNA CÉLULA U ORGANISMO PRODUCIDO POR
LA INTRODUCCIÓN DE UN DNA EXÓGENO
Puede ser
NATURAL (se han encontrado aproximadamente 40 especies que pueden realizar este proceso)
ARTIFICIAL (INDUCIDA)
TRANSFORMACIÓN
¿Para qué tomar DNA exógeno?.... Grandes maquinarias proteícas intervienen en el proceso
de transformación
Algunas hipótesis que no son excluyentes…..
I. Para la diversidad genética (por ejemplo: obtener resistencia a antibióticos)
II. Para la reparación de DNA
III. Como nutrientes: El DNA es fuente de carbono, nitrógeno y fósforo
SEMEJANZAS Y DIFERENCIAS TRANSFORMACIÓN vs CONJUGACIÓN
¿existe DNA libre en todos los
ambientes, es estable?
TRANSFORMACIÓN NATURAL, las bacterias más
estudiadas son
ETAPA 1: Desarrollo de un estado competente
ETAPA 2: Procesamiento del DNAUnión
Importe
Recombinación
GRAM +
Streptococcus pneumoniae
Bacillus subtilis
GRAM -
Neisseria gonorrhoeae
Haemophilus influenzae
El proceso de transformación se puede dividir en 2 ETAPAS
Etapa 1: Desarrollo de un estado competente
¿Qué es una célula competente?Estado fisiológico inducible
Factores que inducen el estado de competencia en la transformación natural:
Limitación en los nutrientes
Mitomicina C
Alta densidad celular
Temperatura, pH
La transcripción de los genes com se inducen durante el
estado de competencia
Velocidad de transferencia: 90-100 nucleótidos/segundo a 30°C
La transcripción de los genes com se inducen durante el estado de
competencia
Transporte DNA en Gram +
ANTES se debe formar el pseudopili que atraviesa la
pared celular
1. Unión del DNA a la superficie por interacción con proteínas (++) del
pseudopili
2. Unión a receptor: ComEA (no es secuencia específica)
3. Fragmentar y degradar la cadena que no se transporta
4. Se ha encontrado una endonucleasa en membrana
ComEC: canal en la membrana
ComFA: unión a ATP
Transporte DNA en Gram +
Se ha sugerido que el reconocimiento es secuencia
específica: (5´GCCGTCTGAA-3´)
Pili tipo IV:
Sistema de secreción tipo II
El pili debe cruzar la membrana interna, el espacio periplásmico y la membrana
externa
Una vez que ingresó el DNA de cadena sencilla ¿qué ocurre dentro
de la célula?
¿DE MANERA NATURAL es fácil intercambiar plásmidos entre bacterias por transformación?
¿es más fácil por conjugación?
TRANSFORMACIÓN ARTIFICIAL
El “caballito de batalla” es la bacteria Escherichia coli
Es una técnica fundamental en biología molecular: clonación y generar organismos
transgénicos
TRANSFORMACIÓN: HERRAMIENTA ÚTIL EN EL CAMPO DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR
VECORES GENÉTICOS: molécula de DNA que es usada como vehículo para transportar segmentos de DNA foráneo en una célula
huésped,
PLÁSMIDOS
OBJETIVO DE LA PRÁCTICA: OBTENER BACTERIAS RESISTENTES A
KANAMICINA
Medio LB + KANAMICINA
Escherichia coli
En la transformación artificial ¿cómo se induce el estado competente de
una bacteria?
1. Tratamiento químico2. Electroporación
Preparar células competentes de E. coliE. coli
3 mL medio Luria
Incubar toda la noche a
37°C
E. coli
A= 0.6 – 0.8 a 600 nm
5000 r.p.m. 5
min 4°C
3 mL NaCl
Resuspender
5 mL CaCl2
Resuspender
Preparar células competentes de E. coliE. coli
Incubar 20 min
2500 r.p.m 7 min
CÉLULAS COMPETENTES
1 hr42°C 70 s
Inmediatamente en hielo
1 mL medio SOC
Incubar a 37°C con agitación
por 45 min
LA TRANSFORMACIÓN SE REALIZARÁ POR CHOQUE TÉRMICO
CÉLULAS COMPETENTES
PLÁSMIDO: DNA EXÓGENO
Buffer TE, CaCl2 y PLÁSMIDO
Al final de la transformación
Utilizaremos el plásmido pET-TEM
Sitio múltiple de restricción
Origen de replicación
Gen que confiere resistencia a kanamicina: kanamicina
fosfotransferasa
Enzimas inactivadoras de aminoglucósidos:La resistencia de las cepas se hace por síntesis de enzimas generalmente codificadas por plásmidos.
La inactivación de los aminoglucósidos se hace por: 1.Adenilación de grupos hidroxilo. 2.Fosforilación de grupos hidroxilo. 3.Acetilación de grupos amino.
ENZIMA INACTIVADORA AMINOGLUCÓSIDO INACTIVADO:
Gentamicina adeniltransferasa
Gentamicinas, Sisomicina, Kanamicinas, Tobramicina.
Gentamicina acetiltransferasa
Netilmicina, Tobramicina, Gentamicinas, Sisomicina.
Kanamicina acetiltransferasa
Netilmicina, Amikacina, Neomicina, Kanamicinas,
Tobramicina, Gentamicinas, Sisomicina.
Neomicina, Kanamicina fosfotransferasa
Gentamicina A, Neomicina, Kanamicina
MECANISMO PROPUESTO PARA LA ENTRADA DE DNA EXÓGENO EN
BACTERIAS COMPETENTES DE E. coli
ANIMACIÓN
Células
transformantes
Células no transformante
s
Medio Luiria + KANAMICINA
ESQUEMA GENERAL
SESIÓN I: TRANSFORMAR cepas de E. coli con un plásmido para que adquieran resistencia a un antibiótico
SESIÓN 3: FUNCIóN DE LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
Cortar el plásmido aislado con enzimas de restricción y visualizarlo en un gel de agarosa teñido con bromuro de
etidio
SESIÓN 2: AISLAR el plásmido mediante la técnica de Lisis alcalina