tecnicasbioquimica-130408001551-phpapp01

Universidad de CaraboboFacultad de Ciencias de la Salud

Escuela de Medicina “Dr. Witremundo Torrealba” Campus La Morita

Técnicas enBioquímica

Profa. Fabiola Sarco Lira.

Abril, 2013

• Univ. Ismar Romero.• Univ. José Rojas.• Univ. Kelvin Rojas.• Univ. Victor Rojas.

Grupo #03

Separación, visualización yc del d

ElectroforesisEs una técnica para la separación de moléculas que sebasa en la migración de solutos iónicos bajo lainfluencia de un campo eléctrico; estas partículasmigran hacia el cátodo o ánodo, en dependencia de unacombinación de su carga, peso molecular y estructuratridimensional.

Ventajas

Desventajas

proteínas de una solución.

Afecta la estructura de las proteínas por lo tanto, también afecta a la función de la misma.

Movimiento iónico en uncampo

eléctrico

Durante el proceso de migración de una partícula cargada en uncampo eléctrico, dependiendo de la carga neta ocurrirá lo siguiente:a. Si la partícula posee carga + se moverá hacia el cátodo.b. Si la partícula posee carga – se moverá hacia el ánodo.c. Si la partícula no posee carga no se moverá

Electrodo positivo

Electrodone;atlvo

Aulo de lonu negativos que _5e aleJln del ellctrodo negativo ¡:- -

FluJo de lonal pOlltlvo1 hacia el .1.Cbodo negativo J~

Ag. 4.58. Representación esquemátIca del sentíao de los desplatamlen10s (y fluJos) de los Iones posltlv08 y negativos sobre 108 que actúa un campo elée· trlco.

Electroquímica moderna, Volumen 1.John O'Mara

Bockris

En la electroforesis, la fuerza quemueve la macromolécula es elpotencial eléctrico, E, expresadaen voltios/cm.

La movilidad electroforética de la molécula, μ, es el cociente entre la velocidad de la partícula, V, expresada en cm/seg, y el potencial eléctrico.

v zfl=E=r

La movilidad electroforética esta expresada en cm2 /(V)(s)

Principios de Bioquímica

Lehninge

r

La movilidad depende de la carga de la partícula que, a su vez, depende del pH del medio en el que se encuentre.

Electroforesis libre:

Una disolución tamponada de la mezcla de proteínas se coloca en una célula de observación en forma de U.

Electrodos

Buffer

Proteínasdisueltas

en elbuffer

·- - -1I

Ihttp://pt7mdv.ceingebi.unam.mx/computo/pdfs/met/Electroforesis/Electroforesis/Introduccion/BoundaryElectr.jpg

Electroforesis de

oap"~ '"'f\

La disolución a tratar se aplicacomo una mancha , o como unabanda, y las partículas migran através del disolvente, utilizandoademás un medio de soporteinerte y homogéneo, tal comoel papel o ciertos tipos de geles.

Co!rpooor,ltfmt:1'~H

"'~t>a

~~;;::=~~:;:;::~111;9~';)001~( t )~::::

(~'" 1.1' t.I:~sol\.4·nlf'~3J~O<1'PWdO(,a"

Bioquímica

Christopher K. Mathews

Cámaras Electroforéticas

Cámaras horizontales

En la electroforesis de tipohorizontal generalmente,se trabaja con ADN oARN.

Cámaras verticales

En la electroforesis de tipo vertical, se analizan tanto moléculas de ADN como proteínas.

Medios de Soporte

Método sencillo y rápido

Papel

Separación de:

•Proteínas•Oligonucleótidos•Carbohidratos•Lípidos

Desventajas

•Se desgarra fácilmente•Distorsiona las bandas•Se produce interacción entrelas proteínas y los gruposhidroxilo de la celulosa, por lotanto la migración se frena

Se usa en el análisis de fluidos biológicos

Acetato deC

elulosa

Tiempo de análisis corto

Sencillez de la técnica

Desventaja: Su débil resolución

Gran parte de los grupos hidroxilo de la celulosa se hanesterificado por acetilación, por lo que no hay interaccióncon las proteínas.

Almidón Técnica barata, fácil y rápida

GelPoliacrilamida

Soporte mas usado en electroforesisDe alta resoluciónSus componentesson tóxicos

Agarosa

Buena resoluciónSeparación demoléculas grandescon radio mayor a 5-10nm (virus, ácidosnucleicos)

Factores que afectan laElectrofore

sis

Carga neta Tamaño Intensidad del campo eléctrica Temperatura Medio de soporte Buffer

Electroforesis en gel de poliacrilamida

¿Qué es la poliacrilamida?

Polímero generado a partir de acrilamida y bisacrilamida. Forma un gel con poros y se usa para realizar electroforesis de macromoléculas, en especial proteínas y fragmentos de ácidos nucleicos.

r.:=ii)'=-c:::ió n. depollmerízación

,1f1i.-.:;:iad~ por perEo-U fa.to y

TEI\r1tED)

f:"':;¡-CI'iJ- eH;;.-Iél-E- t:at;y-l{:li-I D IC-=-IQ tC~1) <:=0•·J I~ ~I a;

rIolHtQHRI

NM2- mil

f•=O fI -oGI'I. ~CI-~,CI_'_= eH-=- GHz- ~ 1I

lPolracl"i 1;;3m1 idahttp://biomodel.uah.es/lab/sds-page/electro_def.html

•

¿Como se realiza la electroforesis

en gel de poliacrilamida?

• Primeramente se necesita el gel de poliacrilamida, quien funciona como filtro gracias a su estructura porosa.

)$!.A 7W ~~ _ be ~ e1 ,.~

- -

http://www.esacademic.com/dic.nsf

ftJ 'ffer

/eswiki/943905 http://clinicalmedicine.blogfa.com/post-544.aspx

electroforesis en gel de

poliacrilamida?

• Colocar las muestras en los pocillos.

• Se aplican cargas eléctricas

http://biomodel.uah.es/biomodel-misc/anim/elfo/electrof.html

E31....EC"'W""IORFORlE:S::l-S 1Eit't31 IQ.lEL .:loE P IOiL.'l' ACR :litLAN'tI:l:I:),""" :

IN00:DEaNATURAU ZA.NTJE.

[-=, J

http://preguntassobrecienciaymas.blogspot.com/2012/03/electroforesis-monografia.html

¿Como se realiza la electroforesis

en gel de poliacrilamida?

• Aplicar un colorante tal como el azul deCoomassie.

http://www.quimicaviva.qb.fcen.uba.ar/contratapa/aprendiendo/capitulo14.htm

Electroforesis en gel de

poliacrilamida en SDS

Es otra técnica electroforética también aplicada en proteínas en la que las mismas sufren desnaturalización.

¿SDS?

¿De que habla?

El SDS (Dodecilsulfato sódico) es un compuesto desnaturalizante con una carga fuertemente negativo.

¿Como se realiza la electroforesis

en gel de poliacrilamida SDS?

• Primero deben desnaturalizarse las proteínas.

• En presencia de SDS la proteína:

http://ahorrarnoshacebien.com/articulos/agua-mito- realidad.html

e

http://mariajosevegamiranda.blogspot.com/2012/11/proteinas.html

http://cvclavoz.com/blog/paralel o/page/6/

http://bioquimica6ce.wikispaces.co m/Proteinas

- -

¿Como se realiza la electroforesis

en gel de poliacrilamida SDS?

• Se colocan las muestras en los pocillos y se aplican las cargas eléctricas.

http://farmacologiabasica.blogspot.com/2008/08/electro foresis-en-gel.html

Prolemas más MPM "'1 "'2 M3 8andas más gruesasequIValen a mayor

• Se visualizan añadiendo un colorante como el azul de Coomassie

hacia el otroO,xlremo

L~s prutl$ífUUI f(l~pequeñas quedan<lJb~O

ean~daOde protefna

Bandas más finas equiv~'en ~ ménOr

eanlidad de prOleína

http://coleccion.educ.ar/coleccion/CD17/contenidos/mt/biologia/t ecnologiaadn/estudiar_expresion_gen.html

Electroforesis bidimensional

¿Qué es?

Es una técnica para la separación de mezclas complejas de proteínas, ya que la misma permite la separación y visualización de hasta 1.000 proteínas diferentes en un solo gel.

:

'

<

¿Cuál es el procedimiento para la

electroforesis bidimensional?• Punto Isoelectrico• Se establece un gradiente de pH.

Se incorpora una

mezcla dea

nfolitos.

pH9 1"'= , e"---',"--~

"O ::. : .. :1:1

;'(

:"";

>

:~'"

~"

pH3

)1 )1

<9

~.'~' _.. :"--- .

.. ;.!,

~

Lehninger 5ta edición

El gel se coloca

d.in

¿Cuál es el procedimiento para

la electroforesis bidimensional?

Primera dimensión . pI decreciente

1=,,('oe,_I,,~tri.co: (nr.t .... in,ese-l i."l r>'~ec:1 00 Sll8

VC)lyaccyJluu.icle eet,

gel de poliacrilamida SDS

Segunda dimensióSneo~nd

sos ltQl5'a<::.rylw:nid~gel ele<::trophoro&ia

Electroforesis en gel de

polaSDS !

0....·..,,;»11

pI1>1

....,¡..

Peso molecular decreciente

decreciente Lehninger 5ta

edición

Electroforesis en gel de

agarosa

o Es una técnica utilizada para fragmentos grandes de ADN.

¿Agarosa?La agarosa es un polímero de galactosa

http://www.ecogen.com/producto.asp?id=196

¿Cómo se lleva a cabo la

electroforesis en gel de agarosa?

• Primero se debe mezclar el polvo de agarosa con un buffer.

CALENTAR

http://www.ugr.es/~mgarrido/Protocolos.html

¿Cómo se lleva a cabo la

electroforesis en gel de agarosa?

muestra

http://html.rincondelvago.com/electroforesis-de-acidos-nucleicos.html

¿Cómo se lleva a cabo la

electroforesis en gel de agarosa?

http://oldearth.wordpress.com/2008/10/16/experimentos-de-biologia-molecular-1-electroforesis/

La EspectrofotometríaEs una de las técnicas experimentales más utilizadas para la detección específica de moléculas. Se caracteriza por su precisión, sensibilidad y su aplicabilidad a moléculas de distinta naturaleza (contaminantes, biomoleculas, etc) y estado de agregación (sólido, líquido, gas)

Principios de laE

spectrofotometría

• Todas las sustancias pueden absorber energía radiante, aun el vidrio que parece ser completamente transparente absorbe radiación de longitudes de ondas que no pertenecen al espectro visible; el agua absorbe fuertemente en la región del infrarrojo.

• La absorción de las radiaciones ultravioletas, visibles e infrarrojas depende de la estructura de las moléculas, y es característica para cada sustancia química. En el proceso de absorción de la radiación, un fotón incidente cede su energía a una molécula, loque da lugar a la excitación de la misma que pasa a un nivel de energía superior.

EEstado repeso

Absorc¡"ónde fOtón

Estadoex eita<io

• Cuando la luz atraviesa una sustancia, parte de la energía es absorbida; la energía radiante no puede producir ningún efecto sin ser absorbida. La frecuencia de la radiación absorbida es proporcional a la diferencia de energía entre ambos niveles.

iffttll~&

• El color de las sustancias se debe a que éstasabsorben ciertas longitudes de onda de la luz blanca que incide sobre ellas y solo dejan pasar a nuestros ojos aquellas longitudes de onda no absorbidas.

.:pe ..en1 .. Cllftósft". SI_"un?

Ti,. 4e ML4iacl.ó. Ro.dio Mi,roond ... "f ..,rojo "hl~le Ult .. "'¡olela R&)IOsX Ra)lOsg .. mm.. l'''giDI4 de .,,4 .. 0.) 10' 10 • 10 • 0,5"10 • 10 • 10 111 10 U

E" .....

.,,..~"'t.A..4e1.. I.ngitud d.... d..

Ui 1~ -P

~ ~ •

Edild .. Hu"' ...... 1.1.,;,..... Pu_d. ProtD:o.~ 1.I0licul... Átomo!: Núcl.o .... mlco aguj ..

FRcuud .. O'f:)

T.mp.'_'" d. l.:.~..j...a 'os

<11"'0$1.. n.Ílació .. C'n .<IIL

'tngiDI4 4e ... 4.. es

10' 10 •

10° 10u 10" 10" 10»

1& mÁs 10 .DOO.DOOK

10.D00.DOO·C

• La espectrofotometría se basa en dos leyes que relacionan la absorción de luz a una determinada longitud de onda con la concentración del material absorbente y la longitud del camino que debe atravesar. Estas dos leyes, que combinadas resultan en la ley de Lambert-Beer

d"1 .,¡""' ,_\\ ..,.,. _ .1.. ,

Espectro de absorción

• Representación gráfica de la absorbancia de un analito (o de otra magnitud equivalente) en función de la longitud de onda de la radiación, l, (o de otro parámetro relacionado con la energía de la radiación utilizada).

fPRN ADO ILongitud de Color Color Complementario

Onda.), (nm)

380-435 VIOIem VenJe.anurillo

435-480 Azul AnmiIIo

480-490 Azul-\"CfCIcso An:I.IUDjado

49()..SOO VerdoxtzuIado Rojo

)

.......... 1 1. _~. _'_.', _. ~_."04 _, ..,"ool 'u tI.... ~._ _ •• 1 ·11" ,1,..' ••,

E~ctro de emlslon V de absoróón de LI"I mismo etementc

500-560

56()..S80

V~

Vri.'3Dl:IIÍUO

Púrpura

VIOIi!UI

S8()..S95 Rojo Azul

595-650 ADatanjado AzuI·,'enIoso

I

65()"780 Rojo VenJe.3ZU1ndo

I

••

Ley de Lambert Beer • I

III

ASPECTOS TEÓRICOS I

I

La fotometría

Medición

Ide luz

La espectrofotometría

La colorimetría

Luz monocromática

Leyes deLambert y Beer

Lambert yBeer

relacionan

observando

••

La medida de la absorción• IIII

El espesor de la sustancia absorbente I

II

La cantidad de sustancia que absorbe

I

crecimiento exponencial de la absorción

de radiación

En Función de

espesor de la región absorbente

la cantidad de esa especie

Ley de Lambert BeerLey de Lambert:

Medio absorbente

«la cantidad de luz absorbida por un cuerpo depende de la concentración en la solución»

Intensidad transm.

1. Agua con azúcar disuelta.2. Agua con mayor cantidad de azúcar.

Ley de Lambert BeerLey de Beer:

Sustancia absorbente

«La cantidad de luz absorbida por un objeto depende de la distancia recorrida por la luz»

Intensidad trans.

1. Agua con azúcar disuelta.2. Agua con azúcar disuelta

en un vaso con mayordiámetro.

Ley de Lambert Beer

Estas dos leyes se combinan en la ley deLambert-Beer:

«Relaciona la absorción de luz con las propiedades del material atravesado, relaciona la intensidad de luz entrante en un medio con la intensidad saliente después de que en dicho medio se produzca absorción»

http://absorcion-atomica.blogspot.com/2009/08/la-absorbancia-de-radiacion_11.html

T:

••

Ley de Lambert Beer • I

IIIII

• Transmitancia (T) I

Es la fracción de radiación incidente transmitida por la solución

ISi T se expresa en %, T % = 100 I/I0

• Absorbancia (A)Es la fracción de radiación incidente absorbida por la solución, expresadacomo

A = -log T = -log (I/I0) = log (P0/P) = log 1/T

Si T se expresa en % A = log100/T% = 2 -logT%

Ley de Lambert Beer

A = C . ξ . L

La ley de Lambert-Beer establece que laabsorbancia está directamente relacionadacon las propiedades intrínsecas del analito,con su concentración y con la longitud dela trayectoria del haz de radiación alatravesar la muestra

• ξ: Absortividad molarEs una propiedad de la materia relacionadaúnicamente con la naturaleza de la misma.

a cuando la concentración está en mg/L

ξ cuando la concentración está en mol/L

• L: Trayectoria de la radiación a través de la muestra (cm)

• C: Concentración (mg/L ó mol/L)

lo e, a

I

e x p b a s q u i m i ca - g 1- z b -09-10. w i k i sp a ces . c o m

-

1.5

- =

'

O.

>--

TABLA DE MEDIClONFS,

Dllucionos (Concentración

%', (o) ~mol!L % r 1Absorban-r.ill IAl Tra nsrn itancía ~t.T

E(L mor' cm'}

10 0.0001 0.01 0.979 0.104954242 10.50 9790

20 0.0002 0.02 1.087 0.0818464 78 8.18 4895

30 0.0003 0.03 1.238 0.057809604 5.78 4126.666667

40 0.0004 0..04 1.303 0.049773708 4.98 3257.5

SO U.0005 0.05 1.458 0.034833731 3.4tl 2916

GO 0.0006 0.06 1.SG? 0.02710191G 2.71 2611.600667

70 0.0007 0.07 1.684 0.020701413 2.07 2405.714286

80 0.0008 0.08 1.786 0.016368165 1.64 2232.5

YO U.0009 O.OY 1.sss 0.013551594 1.3ü 2Ufo.óóOOó6

100 0.001 0.1 1.95 0.011220184 1.12 1950X 1.69 0.020417379 2.04 2316.575147

Grá!;ca d~ absorba m::;a

2.5

L-- - 1- - - - - - -21- 1:- :- .1.- -

.!l! >-- 1- 1- -

o - 1- -1- 1- - -

1- 1- -~ lr- I- r- -'l: L-- - - - - - - - - - 1-- - - - -

0.5 e 1-

- 1- 1- 1= 1- ,- 1- - 1= - :-

Skoog, D. A.; West, D. M.; Holler, F. J.; Crouch, S. R. FUNDAMENTOS DE QUÍMICA ANALÍTICA. Absorción de la luz. MacGraw Hill: México.

0- ,- '- _,_,-

0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 0.1

Concentración (':lo)

• Datos -- Regrasion linea

-

4 1- - ~ <, -

- - - -

TABLA DE MEDIClONFS,

Dllucionos (Concentración

%', (o) ~mol!L % r 1Absorban-r.ill IAl Tra nsrn itancía ~t.T

E(L mor' cm'}

10 0.0001 0.01 0.979 0.104954242 10.50 9790

20 0.0002 0.02 1.087 0.0818464 78 8.18 4895

30 0.0003 0.03 1.238 0.057809604 5.78 4126.666667

40 0.0004 0..04 1.303 0.049773708 4.98 3257.5

SO U.0005 0.05 1.458 0.034833731 3.4tl 2916

GO 0.0006 0.06 1.SG? 0.02710191G 2.71 2611.600667

70 0.0007 0.07 1.684 0.020701413 2.07 2405.714286

80 0.0008 0.08 1.786 0.016368165 1.64 2232.5

YO U.0009 O.OY 1.sss 0.013551594 1.3ü 2Ufo.óóOOó6

100 0.001 0.1 1.95 0.011220184 1.12 1950X 1.69 0.020417379 2.04 2316.575147

THANSMITANCIA

12 - - -- 1- - - -

10

-I- r- - - - - -

~ 1- - - - - - - - - -8 "-

- ~

1- .1- 1- ~ t-- - .::..... 1-.1- - - -=-1-.

1- 6 -

~ ~ - - 1- = 1-~ - - -- - - - - - - - - - - - -

=- :_ -1-. -2 - - 1:-- 1- 1- 1- - - - ~

-Skoog, D. A.; West, D. M.; Holler, F. J.; Crouch, S. R. FUNDAMENTOS DE QUÍMICA ANALÍTICA. Absorción de la

o

• - -

o.nrrn o nmz 0.000:\ 0.00040.0005 O,OOOno 00n7 n oma o OOO!=0!.001

%1J

1-luz. MacGraw Hill: México. Transmitancia I

%

I

••

Ley de Lambert Beer • I

II

1) Una disolución 100 µM de un determinado cromóforo tuvo una I

transmitancia a 525 nm de 0.5 cuando se midió en una celda 1.5 cm de I

longitud. Calcular: a) la absorbancia de la disolución; b) la

Iabsorptividad molar del cromóforo.

Ia) A = -log T = - log 0.5 = 0.301

b) A = C . ξ . L Reordenando la ecuación obtendremos:ξ = A/(C . L) = 0.301 /(10-4 M x 1.5 cm) = 2 x 103 M-1 cm-1

%

0,5

0,01% Concentración

Nadie puede volver atrás ycomenzar de nuevo. Perocualquiera puede comenzar hoymismo y hacer un nuevo final, no

te rindas.

Anónimo