reflexiones sobre el procesamiento de muestras...

Reflexiones sobre el procesamiento de

muestras biológicas

Luzia CaputoSupervisora del Sector de Histotecnología

Laboratorio de PatologíaInstituto Oswaldo Cruz - Fiocruz

Procesamiento

¿Qué es procesamiento de una

muestra biológica?

Objetivo del Procesamiento

• Muestra de tejido Rígida, dura.

1720 (Leeuwenhoek) - Secado de los tejidos

Ebullición (evaporación del agua)

Uso de ceras (carnauba, abeja) - períodos posteriores

1842 Benedict Stilling - Congelado

1869 - Albrecht Theodor Edwin Klebs - Parafina (sin

impregnación) – evaporación (sin clarificación)

Paul Mayer – lo perfeccionó a lo que es hoy.

Diversidad de Muestras x Protocolos

I. Diversidad de formas de obtención de muestras.

II. Diversidad de profesionales recogiendo;

III. Diversidad de líquidos fijadores;

IV. No existe estandarización de protocolo de recojo y

fijación en diversos contextos hospitalarios, mucho

menos cuando se tratad de tiempo de fijación, intervalo

entre el recojo y la fijación y apertura o corte de las

muestras para penetración de la fijación.

Variables preanalíticas

Errores de Fijación/Procesamiento en el 2003-2004

La naturaleza del Procesamiento está

directamente relacionada a:

Al tipo de medio de inclusión utilizado.

A la especie animal en cuestión.

Al tipo de tejido, tamaño y consistencia,

Al tipo de fijador y descalcificador empleado

I - Medios de inclusión de tejidos:

¿Qué determina el protocolo del Procesamiento?

Morfología - HE

Biomoléculas – CE, HQ, IHQ , ISH,

CISH

Elementos inorgánicos

Microorganismos

Ultraestrutura

• Microscopía de Luz (fluorescencia común, fluorescencia

confocal, campo claro, contraste de fase, microscopía

de interferencia de Nomarski, polarización)

• Microscopía Electrónica¿C

óm

o?

La naturaleza del Procesamiento está

directamente relacionada a:

Al tipo de medio de inclusión utilizado.

A la especie animal en cuestión.

Al tipo de tejido, tamaño y consistencia.

Al tipo de fijador y descalcificador empleado.

II- Origen de la muestra

¿Qué determina el protocolo del Procesamiento?

A natureza do Procesamiento está

diretamente relacionada:

Al tipo de medio de inclusión utilizado.

A la especie animal en cuestión.

Al tipo de tejido, tamaño y consistencia.

Al tipo de fijador y descalcificador empleado.

III- Tipo de tejido

• Densidad/Consistencia (Espacios intersticiales / permeabilidad)

• Tamaño

¿Qué determina el protocolo del Procesamiento?

Difusión:

Es el movimiento de los liquidos a través de lostejidos, a veces más rápido en unas direcciones queen otras.

La velocidad de difusión

dependerá de la consistencia

del tejido, de los espacios

intersticiales y del tamaño de

la muestra.

Naturaleza diferente

tamaño diferente

forma diferente

La naturaleza del Procesamiento está

directamente relacionada a:

Al tipo de medio de inclusión utilizado.

A la especie animal en cuestión.

Al tipo de tejido, tamaño y consistencia.

Al tipo de fijador y descalcificador empleado.

Fijadores que necesitan del tratamiento post Fijación:

Zenker, B-5, Orth, Helly –cloreto de mercurio

Carnoy, Metacarn, Clarke.

Bouin, Rosman :

Fijadores tamponados con sales de fosfato – Lavar en agua

corriente por 1 hora e iniciar la deshidratación a partir de

Etanol al 65% - precipitación de las sales de fosfato.

Fijador utilizado

Etapas del Procesamiento Histológico

Características de los reactivos empleados

en el Procesamiento histológico

1. Miscibilidad:

2. Viscosidad:

3. Polaridad

4. Concentración de los reactivos

5. Tasa de evaporación.

Medios de Inclusión

• Procesamiento Resinas hidrofóbicas – ME (Spurr, LR-White,Epon....);

• Procesamiento con Resinas Hidrofílicas – semi-finos 0,5µ -3µ (Historesinas, JB-4, Metacrilato, GMC);

• Nitrocelulosa;

• Celoidina (nitrocelulosa de baja viscosidad)

• OCT (sustancia crioprotectora);

• Gelatina;

• PEG 200 a 4000 o carbowax;

• Parafina.

Parafina

No es miscible en agua ni en lamayoría de Fijadores acuosos yalcohólicos;

Necesita procedimientos previosa la infiltración.

Etapas del Procesamiento

I- Deshidratación

1. Por difusión. (Aumento de las concentraciones)

2. Por deshidratación química: Ej.: Dimetoxipropano y

dietoxipropano. (El Deshidratante es hidrolizado por

el agua de los tejidos que forman acetona y metanol

en una reacción endotérmica).

Características de un deshidratante ideal:

• Ser rápido,

• No endurecer el tejido,

• No evaporarse rápidamente,

• No remover los colorantes de los márgenes,

• No ser tóxico,

• Riesgo reducido de inflamabilidad y explosión.

Deshidratación

Excesiva

Endurecimiento exagerado del

tejido

Incompleta

Perjudica la penetración del

clarificador

Biopsias x Piezas quirúrgicas

La deshidratación de los tejidos es la etapa más importante durante el

Procesamiento, ya que si el agua no fuera removida de forma adecuada,

el resto del Procesamiento, se impedirá la difusión completa del

clarificador (xilol) hacia el interior de los tejidos y con esto se perjudica la

impregnación de la parafina no permitiendo la completa infiltración de la

parafina hacia el interior de las muestras.

Etapas del Procesamiento Histológico

II- Clarificación o Diafanización:

• Ocurre entre la deshidratación y la infiltración por la parafina.

• Se utilizan reactivos solventes a los agentes deshidratantes y a los

medios de inclusión.

• Recibe este nombre debido a que el tejido está translúcido debido

al alto índice de refracción de los solventes utilizados,

aproximándose del índice de refracción de las proteínas del tejido.

Elección del Reactivo Clarificador:

Rapidez en la remoción del agente deshidratante;

Provocar el menor daño posible al tejido;

Riesgos ofrecidos;

Costo ($);

Fácil remoción de la parafina, caso fuera necesario;

Viscosidad.

III- Infiltración

• Los tejidos son saturados u ocupados por el

medio de inclusión.

• Debe garantizarse que no haya más agua ni

alcohol en el tejido.

Etapas del Procesamiento Histológico

Propiedad de la parafina:

- Varía de acuerdo con la cantidad de polímeros y punto de fusión;

Punto de fusión de acuerdo con la densidad del tejido;

Aditivos que aumentan o disminuyen el punto de fusión

de la parafina. (cera de abeja, estearina, cera de

carnauba...)

Naturaleza de la Parafina

Condiciones de Procesamiento

•

Agitación

Calentamiento

Condiciones de Procesamiento

• Temperatura Baja: ¡POCO UTILIZADO!

• Temperatura ambiente: Depende del país. ¡Normalmentefunciona muy bien en Brasil y en países tropicales!

• Temperatura Alta: Disminuye la viscosidad de los reactivos.

• OBS.: En temperaturas de aproximadamente 65°C ocurreretracción de las fibras de colágeno, y el consecuenteendurecimiento excesivo de tejidos fibrosos.

Vacuo (Presión Negativa)

Condiciones de Procesamiento

Tiempo

Condiciones de Procesamiento

Los protocolos varían según:

• El tamaño del espécimen;

• Tipo de reactivo utilizado;

• Especie (humana, ratón de laboratorio, molusco, insecto,vegetal);

• Propiedades de los tejidos (ojo, diente, uña, cuerno, pico);

• Presencia de vacuo;

• Temperatura durante el Procesamiento.

Calidad X Urgencia

Paso Etapa Reactivo Tiempo

1 Deshidratación Etanol 60% 1 h

2 Deshidratación Etanol 70 % 1 h

3 Deshidratación Etanol 80 % 1 h

4 Deshidratación Etanol 90 % 1 h

5 Deshidratación Etanol 95 % 1 h

6 Deshidratación Etanol 100% 1 h

7 Deshidratación Etanol 100% 1 h

8 Deshidratación Etanol 100% 1 h

9 Clarificación Xilol I 1 h

10 Clarificación Xilol II 1 h

11 Impregnación Parafina I 1 h

12 Impregnación Parafina II 2 h

Protocolo de Procesamiento Estándar

Tejido Nervioso

ESQUEMAS DE PROCESAMIENTO

Laboratorio de neuropatologí de la AFIP

ReactivosENCÉFALO

(BEBÉ)

ENCÉFALO

(ADULTO)

CORTES

MONTADOS

ENTEROS

FRAGMENTOS

DE NERVIOS Y

MÚSCULOS

Etanol a 70% 24h --- 24h 30min

Etanol 80% 24h 24h 24h 30min

Etanol 95%

(3x)2h cada 2h cada 8h cada 15min cada

Etanol

Absoluto (3x)2h cada 2h cada 8h cada 15min cada

Etanol-Xilol 2h 2h 8h 15min

Xilol (2x) 2h cada 2h cada 8h cada 15min cada

Parafina b

(3x)c

2h cada 3h cada 8h cada 15min cada

Hueso temporal

ESQUEMA DE PROCESAMIENTO MANUAL PARA EL HUESO

TEMPORAL

1. Etanol etílico 80%, 3 cambios, 24 horas cada.

2. Etanol etílico 95%, 2 cambios, 24 horas cada.

3. Etanol etílico 100%, 2 cambios, 24 horas cada.

4. Etanol etílico 100% + éter etílico 100% (1:1), 2 cambios, 24

horas cada a.

5. Nitrocelulosa (celoidina) 6%, tiempo mínimo, 3 semanas.

6. Nitrocelulosa (celoidina) 12%, tiempo mínimo, 3 semanas.

7. Nitrocelulosa (celoidina) 20%, tiempo mínimo, 3 semanas.

8. Nitrocelulosa (celoidina) 30%, tiempo mínimo, 3 semanas.

9. Nitrocelulosa (celoidina) 35%, hasta volverse firme b.

Procesar especímenes en celoidina involucra el uso de

ingredientes altamente explosivos.

Asegúrese de que los equipos eléctricos y otras instalaciones

cuenten con cable a tierra, no hayan chispas, llamas prendidas,

etc. Prepare bajo capilla.

b La consistencia es similar a la de una gelatina firme.

Ojo

Reactivo Tiempo

Etanol 70% - Fenol 4% 1 hora

Etanol 95% - Fenol 4% 1 hora

Etanol 95% 1 hora

Etanol 95% 1 hora

Etanol Absoluto 1 hora

Etanol Absoluto 1 hora

Etanol Absoluto 1 hora

Etanol Absoluto /Xilol 2 horas

Xilol 2 horas

Xilol 2 horas

Parafina I 2 horas

Parafina II 3 horas

Posee ≠s densidades / Algunos autores recomiendan descalcificar y/o procesar para inclusión de resinas.

Clorofomo

Diente

• Descalcificar y procesar normalmente de acuerdo a los

protocolos específicos...

Piel, pelo y uña

• Piel muy queratinizada = ablandar con Fenol al 4%.

• Procesar = ojo

Uña

• Formol al 10%, conteniendo ácido tricloroacético al 5%.

• Fijado pelo formol 10% e amolecer pelo ácido nítrico 5%

• KOH al 20%, calentado a 56°C por 15 minutos

• Solución acuosa al 10% de Tween 40 por 24 horasantes de la Fijación

Cuernos, cascos de patas y picos de aves

Sustancias ablandadoras:

• Hidróxido de Amonio;

• Ácido Sulfúrico;

• Ácido Nítrico;

• Formol al 10%, conteniendo ácido tricloroacético al 5%;

• Fijar con formol al 10% y ablandar con ácido nítrico al 5%;

• KOH al 20%, calentado a 56°C por 15 minutos;

• Solución acuosa al 10% de Tween 40 por 24 horas antes de la Fijación.

Insectos - Quitina

Remover quitina.

• Ácido acético en soluciones Fijadoras (10%);

• Fenol al 4% en Etanol absoluto por 24 horas

• Ácido nítrico…

Enzima (quitinasa) diluida de un hongo (?) a 37o C por 4 semanas (métododescrito por Carlisle (1960)

Procesamiento con alcohol butílico o isobutílico. (Karl A. Stiles, Normal ButylAlcohol Technic for Animal Tissues with Special Reference to Insects 1934,Vol. 9, No. 3 , Pages 97-100 )

Esponjas de mar- sílica

• Remoción del sílice con ácido

fluorhídrico al 4% por 8 horas.

Helmintos y moluscos

• Después de la fijación y deshidratación clarificar en

butanol a dos cambios de 6 horas cada uno

(dependiendo del tamaño).

• Infiltrar en parafina (2 x 2 horas).

El butanol deshidrata y clarifica sin endurecer

excesivamente.

REACTIVO CONCENTRACIÓN TIEMPO

etanol 70% 1h

etanol 95% 1h

etanol 99% 1h

etanol 99% 1h

etanol 99% 1h

etanol 99% 1h

etanol 99% 1h

REACTIVO CONCENTRACIÓN TIEMPO

etanol 20% 30 minutos

etanol 30% 30 minutos

etanol 50% 30 minutos

etanol 70% 30 minutos

etanol 95% 30 minutos

Procesamiento

semimanual

COMPARACIÓN DE LOS PROCESAMIENTOS

SEMIMANUAL Y AUTOMÁTICO

DE MOLUSCOS PARA ANÁLISIS HISTOLÓGICO

Luzia de Fátima Gonçalves CaputoEster Maria Mota

Pedro Paulo de Abreu MansoAndréa Natividade da Silva

Procesamiento

Automático convencionall

REACTIVO CONCENTRACIÓN TIEMPO

Butanol 100% 30 min.

Butanol 100% 40 min.

Butanol 100% 1h

REACTIVO CONCENTRACIÓN TIEMPO

xilol 100% 1h:30min.

xilol 100% 1h:30 min.

REACTIVO TIEMPO

parafina 30 min.

parafina 1 h

REACTIVO TIEMPO

parafina 1h

parafina 1h

Procesamiento

semimanual

Procesamiento

convencional

RESULTADOS

Artefactos de

Procesamiento

Mala impregnación

Material quemado

Contaminación de reactivos

Deshidratación excesiva

Errores de Fijación/Procesamiento en el 2003-2004

¡¡¡Gracias!!! ¡¡¡Muy Agradecida!!

lcaputo@ioc.fiocruz.br

luzia.caputo@gmail.com

WhatsApp: +5502199647-5490