producción de proteasas
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Producción de Proteasas y Bacteriocinas por la Cepa Mexicana Bacillus subtilis No. 21Contra Hongos y Bacterias Patógenas en Alimentos
María del Rosario Razo Belmán, José Eleazar Barboza Corona, Rubén Salcedo Hernández,Manuel Vázquez Arista, Ma. Guadalupe L. Basurto Cadena.
Departamento de Alimentos, Instituto de Ciencias Agrícolas, Universidad de Guanajuato. Km9 Carretera Irapuato-Silao, Exhacienda El Copal S/N Irapuato, Gto.
mbasurto@dulcinea.ugto.mx.
RESUMEN
En estudios previos se comprobó la actividad antagónica, “in Vitro” y en invernadero, que
presenta una cepa mexicana de Bacillus subtilis No. 21, aislada de cultivos de fresa de la
región de Irapuato contra los hongos fitopatógenos Fusarium verticillioides y Rhizoctonia
solani . Por tal motivo, se decidió evaluar algunos de los posibles mecanismos de acción de
esta bacteria. En este trabajo se detectó la producción de proteasas y bacteriocinas, las
cuales pudieran estar involucradas en el mecanismo antagónico de la bacteria B . subtilis No.
21.
ABSTRACT
Previous studies, “in vitro” and greenhouse, it was proved that the antagonistic activity of a
Mexican Bacillus subtilis strain 21, isolated from strawberry fields in Irapuato, against its
pathogenic fungi Fusarium verticillioides and Rhizoctonia Solani, Hence, it was decided
evaluate some possible action mechanisms of this bacteria. In this work proteases and
bacteriocinas production were detected, which could be involved in the antagonistic
mechanism of Bacillus subtilis strain 21.
INTRODUCCION
Uno de los aspectos que más afectan la producción de los cultivos a nivel mundial lo es sin
dudas la presencia cada vez más creciente de enfermedades causadas por hongos,
bacterias y virus, esto trae como consecuencia la merma mundial de los cultivos. Este
aumento en las pérdidas de cultivos y el número de enfermedades presentes en éstos, hace
notable la disminución de la efectividad de los productos químicos, lo que con frecuencia da
lugar a problemas económicos para los agricultores.
Actualmente se está desarrollando la base científica de la lucha biológica y como principal
componente de esta se encuentra el control biológico el cual abarca desde la represión o
control de insectos hasta las enfermedades causadas por hongos bacterias y virus. Para su
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control se han utilizado microorganismos los cuales ejercen una actividad antagónica contra
dichas enfermedades, entre estos se encuentran hongos como Beauveria, Metarhizium y
Paecilomyces y bacterias como Bacillus thuringiensis y Bacillus subtilis. (Antela, 2004).
Uno de los principales problemas que limita la productividad de los cultivos es el usoconstante de fungicidas, los cuales son nocivos para la salud y el medio ambiente
(EPA,1999).
Estudios realizados en los últimos años sugieren que el método para combatir plagas y
enfermedades en productos hortícola es el control biológico, el cual puede ser incorporado a
un plan de manejo integral con el uso adecuado de rizobacterias antagonistas contra hongos
fitopatógenos (Fernández, 1999), tal es el caso de la cepa de Bacillus subtilis No. 21, aislada
de cultivos de fresa de la región de Irapuato, la cual demostró, a nivel de invernadero, ser
antagónica contra hongos de Fusarium verticillioides y Rhizoctonia solani (Torres - Basurto,2000).
El objetivo de este trabajo fue estudiar dos de los posibles mecanismos por los cuales la
bacteria B. subtilis No.21 ejerce su antagonismo contra los microorganismos probados. Se
observo la presencia de altos niveles de proteasas y una posible actividad (baja) de
bacteriocina.
MATERIALES Y METODOS
Cultivo deBacillus subtilis
No 21. La cepa, conservada en el cepario del Instituto deCiencias Agrícolas se creció como colonias aisladas en Agar Nutitivo estandar (BD Bioxon).
Una colonia se picó en 3 mL de caldo nutrido (BD Bioxon) y se dejó crecer toda la noche, de
este preinóculo se transfirieron 0.5 mL en 100 mL de Caldo nutritivo y se cultivó en los
tiempos indicados (ver resultados). Las células se centrifugaron y el sobrenadante se utilizó
como “medio condicionado”.
Determinación de proteasas. Se añadieron 100 μL de medio condicionado en pozos
horadados en un medio caseolítico, se dejaron 24 h en refrigeración para la difusión de las
proteasas en el medio y se incubaron a 28 ºC por otras 24 h. Posteriormente se midió el áreade hidrólisis en las diferentes muestras usando el halo transparente delimitado por un círculo
blanquecino formado alrededor de los pozos. Una unidad de proteasa (U) fue definida como
el equivalente a 1mm2
de área de hidrólisis.
Cuantificación de proteasas por el método de Kunitz. Se preparó una mezcla de 0.5 mL
de enzima + 1 mL de sustrato de caseína en regulador con glicina, se incubó a 37 °C durante
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30 min. Una vez terminada la incubación se agregaron 3.5 mL de ácido tricloroacético 4%
para detener la reacción, se agitó durante unos segundos para mezclar y se tomó una
muestra de 1 mL la cual se depositó en un microtubo y posteriormente se centrifugo durante
10 min a 10,000 rpm. Una vez terminada la centrifugación se recuperó el sobrenadante paramedir la absorbencia a 280 nm una unidad fue definida como
A280nm*Dilución*160.566/volumen/30 min. (Rojas I., 1994).
Método de difusión de pozos para la determinación de bacteriocinas. Para la evaluación
de bacteriocinas se inocularon previamente las cepas de diferentes bacterias patógenas y
Bacillus cereus en 15 mL de Caldo de Soya Tripticaseína (CST), se incubaran a 37 °C y 28
°C respectivamente con una agitación de 200 rpm durante 24 h. Después de la incubación se
ajusto la concentración de células a una absorbencia a 2.0 nm y posteriormente se
mezclaron 105 µL de B. cereus + 15 ml de agar para pozos. Se realizó la misma mezcla paracada una de las 12 especies patógenas que se utilizaron, la mezcla se vació en cajas de
Petri y se dejó solidificar, una vez solidificado el medio se hicieron pozos de 8 mm y se
dejaron secar a 37 °C durante 2 h. Después se agregaron 100 µL de la bacteriocina (medio
condicionado) y se incubaron a 4 °C durante 24 horas para la absorción de la bacteriocina,
luego se incubó a B. cereus a 28°C y las cepas patógenas a 37°C durante 24 h. Si la prueba
es positiva se observaran halos de inhibición y se medirá el diámetro del halo para
determinar así la actividad de bacteriocinas.
Método de fluorescencia para determinación de bacteriocinas. Se preparó un preinoculóde B. cereus , el cual constó de 10 mL de Caldo de Soya Tripticaseína (CST)+ 2 asadas de la
colonia y se incubara a 28 °C durante 24 h. Después se efectuó una siembra de 5 µL de
preinoculó +45 mL de CST y se incubara a 28 °C a 200 rpm durante 2 h, posteriormente se
tomarán 35 mL de la muestra y se centrifugaron a 0 °C durante 5 – 10 min a 4000 rpm. El
sobrenadante se tiró y se resuspendió la pastilla en buffer de fosfatos hasta ajustar las
células a una absorbencia de 0.887 nm. Se preparó un blanco agregando 50 µL buffer de
fosfatos + 20 µL células normales + 930 µL (Berberina + buffer de fosfatos) y un control
agregando 45 µL buffer de fosfatos + 5 µL muestra +20 µL células normales + 930 µL(Berberina + buffer de fosfatos). La preparación de las muestras se realizaron agregando 50
µL muestra + 20 µL células normales + 930 µL (Berberina + buffer de fosfatos), se agitaron
unos segundos en el vortex y se realizó la medición en el fluorómetro Hoefer DynA Quant
200 a una longitud de onda de 360 nm de excitación y 460 de emisión (Fuente –Salcido,
2007).
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RESULTADOS
Determinación de proteasas. Los resultados obtenidos mostraron la presencia de
proteasas. En la Tabla 1, se muestran los resultados del diámetro que presentaron los halos
de hidrólisis al colocar la cepa de Bacillu s subtilis No. 21, en dos diferentes medios. LasFiguras 2 y 3 muestran el ensayo de proteasas a 24, 48 y 72 h en medio de caldo nutritivo.
Las Figuras 4 y 5 muestran el ensayo de proteasas a las 24, 48 y 72 h en medio de quitina
coloidal. En estas figuras se puede observar que las muestras colocadas en caldo nutritivo
tuvieron mayor actividad de proteasas que las muestras colocadas en quitina coloidal.
Tiempo
Medio de Cultivo
Caldo
Nutritivo
Quitina
Coloidal
24 1.3823 0.3534
48 2.8589 0.7461
72 2.7568 1.1545
Tabla 1. Determinación de proteasas (U) producidas por B. subtilis No. 21 al cultivarlos en diferentes medios de cultivo
Fig. 1. Ensayo de proteasas Fig. 2. Ensayo de proteasas
a las 24, y 48 h en caldo nutritivo a las 72 h en caldo nutritivo
24 48 72
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Fig. 3. Ensayo de proteasas a Fig. 4. Ensayo de proteasas a
las 24, y 48 h producidas por células las 72 h producidas por células
crecidas en quitina coloidal crecidas en quitina coloidal
Cuantificación de proteasas por el método de Kunitz. Los resultados obtenidos de la
cuantificación de proteasas para B. subtilis No. 21 se muestra en la Figura 5, donde se
realizaron muestreos cada 2 h durante 74 h.
0 10 20 30 40 50 60 70 80
100
200
300
400
500
U P / m L / m i n .
tiempo (h)
Fig. 5. Curva de Producción de proteasas
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Determinación de Actividad de Bacteriocinas por el método de difusión en pozos. Los
resultados obtenidos de está prueba en la cual se midió la efectividad de las bacteriocinas
producidas por la cepa de B. subtilis No. 21 contra las 12 especies de bacterias patógenas
utilizadas las cuales afectan a productos alimenticios se muestran en la tabla 2.
Nombre
Bacteria
Medio de Cultivo
Caldo Nutritivo Quitina Coloidal
Streptococcus pyogenes 25.13 19.44
Bacillus cereus 183 275.68 35.34
Enterobacter cloacae ATCC13047 25.13 25.13
Staphylococcus aureus ATCC 25923 275.68 21.99
Staphylococcus xylosus ATCC700404 0 0
Pseudomona aeruginosa ATCC27853 0 0
Escherichia coli 0 0
Listeria inocua 0 0
Proteus vulgaris ATCC13315 0 0
Salmonella sp. 0 0
Shigella flexneri 0 0
Streptococcus pneumoniae 0 0
Tabla 2. Determinación de actividad de Bacteriocinas producidas
por B. subtilis No. 21 al enfrentarlo contra diferentes bacterias patógenas
Método de fluorescencia para determinación de bacteriocinas. Las mediciones
obtenidos en está prueba se graficaron y se ajustaron a una curva sigmoidal la cual se
muestra en la Figura 6. Se observó un máximo de actividad de bacteriocinas después de las
60 horas de cultivo, de acuerdo con el ajuste el máximo se alcanza después de las 50 horas.
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0 10 20 30 40 50 60 70 80
20
40
60
80
100
120
140
160
180
f l u o r e s c e n c i a ( U R )
tiempo (h)
Fig. 6. Curva de actividad de bacteriocinas
DISCUSIÓN
Los resultados obtenidos sugieren que la cepa mexicana de Bacillus subtilis No. 21
analizada en este trabajo puede ejercer una actividad antagónica contra diversas cepas de
hongos fitopatógenos como son Fusarium verticillioides y Rhizoctonia solani mediante la
liberación de proteasas donde su mayor producción se presentó entre las 18 y 24 h, de
acuerdo a la Figura 5. Además de producir proteasas, B. subtilis No. 21 produce también
bacteriocinas, las cuales según los resultados obtenidos pueden inhibir el crecimiento de
algunas bacterias patógenas para el ser humano y las cuales pueden ser encontradas en los
alimentos. Dichas bacteriocinas alcanza su mayor actividad a después 60 h de cultivo, la
cual es de 160 UR. En posteriores trabajos se realizar estudios adicionales para la
determinación cuantitativa de proteasas mediante zimogramas, además de realizar pruebas
para determinar que otros compuestos pueden ser producidos por dicha cepa bacteriana. El
ensayo de fluorescencia está diseñado específicamente para la detección rápida de
bacteriocinas (Fuente Salcido, et. al., 2007), en nuestro caso pudimos detectar actividad con
dicho ensayo, sin embargo nos falta una prueba adicional para demostrar que la actividad
medida efectivamente es una bacteriocina: la prueba de que la actividad mostrada es debida
a una molécula de naturaleza protéica, actualmente estamos trabajando en ese tema.
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BIBLIOGRAFIAAntela- Arrastía., O., 2004. Control biológico como estrategia en el manejo integrado de
plagas.
EPA., 1999 Environmental Protection Agency and pesticides.
Fernández, G.J., 1999. Agroecología Americana. En Enciclopedia Práctica de la Agricultura y
Ganadería: 11-18. Grupo Editorial Océano. Barcelona, España.
Fuente Salcido N., Salcedo Hernandez R., Alanís Guzmán M., K. Bideshi D., Barboza
Corona J., 2007. A new rapid fluorogenic method for measuring bacteriocin actiity.,
Journal of Microbiological Methods.
Torres G.L.I., Basurto C.M.G. 2000. Control Biológico De Hongos Fitopatógenos De La Raíz
y Corona De Fresa Con Cepas Antagónicas De Bacillus subtilis . Tesis de Licenciatura.
ICA. U. de Guanajuato. Irapuato, Gto. México.
Rojas I. 1994. Producción de proteasas por Bacillus thuringensis crecido en medios a base
de materiales protein-quitinosos. Posible uso de estas enzimas en la obtención de hidrolizados de carne y harinas de pescado. Tesis de Maestría. Instituto Tecnológico
de Veracruz. Veracruz, Veracruz, México.
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