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MODELOS EXPERIMENTALES PARA LA EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD FARMACOLÓGICA DE PRODUCTOS NATURALES
Mg. Q.F. Nesquen José Tasayco Yataco
OBJETIVOS:- Determinar los efectos que los diferentes constituyentes de la
planta pueden provocar en el organismo.
- Establecer cual de los principios activos de la planta es responsable del efecto.
- Explicar por diferentes métodos que se pueden implementar, el modo de acción, especificidad de sus efectos en el organismo intacto o en los diferentes órganos y tejidos.
MODELOS EXPERIMENTALES PARA LA EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD FARMACOLÓGICA DE PRODUCTOS NATURALES
MODELOS DE ESTUDIOS EN LOS ANIMALESESTUDIOS PRECLÍNICOS
• Las pruebas de actividad farmacológica de un producto que quiere usarse para consumo humano, debe estudiarse en por lo menos 5 especies de animales diferentes.
• Los animales que se prefieren son los mamíferos como mono, perro, gato, conejo, cuy, rata, ratón.
Extracto total del Producto Vegetal
Principio Activoaislado
Determinación de laEstructura Química
ESTUDIO DE ACTIVIDAD FARMACOLÓGICA
Estudios de Toxicidad
ESTUDIOS DE FARMACODINAMIA
MODELO FARMACOLÓGICO
Animal SanoAnimal Enfermo
provocado artificialmente
En el animal Intacto o en órganos aislados
Modelos farmacológicos en animales enfermos provocados artificialmente
ETIOPATOGENIA DE LA ULCERA PÉPTICA
Helicobacter pylori AINES
ALTERACION DE MECANISMOS DEFENSIVOS DE LABARRERA MUCOSAGASTRODUODENAL
OTROS FACTORES ALCOHOLDIETATABACOESTRÉS
FACTORES DE AGRESIÓNACIDO Y PEPSINA
ULCERA
LESIONES GÁSTRICAS INDUCIDAS POR ESTRÉS POR INMOVILIZACIÓN EN FRÍO (Apecechea y col; 2000)
Grupos Tratamientos Nº Ratas
(150 – 200 g)
Días de tratamiento
Inducción de lesión gástrica
1 Agua 10 5 Si
2 Sucralfato 200 mg/mL
10 5 Si
3 Sustancia de prueba
10 5 Si
LESIONES GÁTRICAS INDUCIDAS POR ESTRÉS POR INMOVILIZACIÓN EN FRÍO (Apecechea y col; 2000)
4º día de tratamiento: Inmovilizar a las ratas y colocarlo en un refrigerador a una temperatura entre 5 y 10 ºC durante 2 horas.
5º día de tratamiento: Repetir la operación. Inmediatamente después las ratas son sacrificadas.
Abrir los estómagos a lo largo de la curvatura mayor, lavar con solución salina fisiológica y fijar en placas para su inspección microscópica.
Determinar el índice de área dañada (Sumatoria del área en milímetros cuadrados de las lesiones producidas en cada estómago).
Determinar el % de Inhibición en la formación de lesiones.
% Inhibición = 100 – tratados x 100 Controles
LESIONES GÁTRICAS INDUCIDAS POR ETANOL (Robert et al; 1979)
Grupos Tratamientos Nº Ratas
Peso Adaptación Inducción de lesiones gástricas
Administración de
Etanol 96 %
1 SSF 1 mL/100g 9
180 – 200g 7 días 20 – 22 ºC
NO SSF
2 SSF 1 mL/100g 9 SI
10 mL/kg V.O.
3 Ranitidina 100 mg/kg 9 SI
4 Sustancia de prueba 1 9 Si
5 Sustancia de prueba 2 9 SI
6 Sustancia de prueba 3 9 SI
Total 54
LESIONES GÁTRICAS INDUCIDAS POR ETANOL (Robert et al; 1979)
- Hora cero: Administrar los tratamientos.
- Hora uno: Administrar 1 mL de etanol a los grupos del 2 al 6. Al grupo 1 administrar SSF 1 mL.
- Hora dos: Anestesiar a las ratas con vapores de éter dietílico, luego sacrificar.
- Extraer los estómagos, abrir por la curvatura mayor y fijar sobre una placa porosa con alfileres para su evaluación microscópica.
- Conservar en formol al 10% para su estudio histopatológico con tinción hematoxilina-eosina.
Los resultados de la observación macroscópica es expresado en % de inhibición de las lesiones gástricas.
% Inhibición de lesiones gástricas = (ILGc – ILGt) x100
ILGc
ILGc = Inhibición de lesiones gástricas del grupo control
ILGt = Inhibición de lesiones gástricas de los grupos con tratamiento
Grupo 1: Se observa la conservaciónDe la citoarquitectura del tejido gástrico
Grupo 2: Se observa descamación de las células epiteliales, células Inflamatorias en región mucosa y evidente zonas erosivas.
Escala para calificar el grado y aspecto de la mucosa
GRADO ASPECTO DE LA MUCOSA
0 Normal
LEVE Ligero edema y congestión
MODERADO Regular edema, congestión y sangrado
SEVERO Puntos de erosión, con edema, congestión y sangrado
MUY SEVERO Marcadas erosiones, pequeñas o amplias y extensas, o úlceras.
Medida del índice de lesión gástrica
Pérdida de mucosa, decolaración de mucosa, edema y hemorragia 1 punto
Menos de 10 petequias 2 puntos
Más de 10 petequias 3 puntos
Úlceras de menos de 1 mm 2 puntos
Úlceras de más de 1 mm 3 puntos
Úlceras perforadas 4 puntos
La sumatoria se expresa como índice de lesión gástrica y se expresa en Porcentaje de inhibición.
Calificación del grado de úlcera gástrica
Índice ulceroso 0 Normal
Índice ulceroso Menor a 10 Leve
Índice ulceroso 10 – 20 Moderado
Índice ulceroso 20 – 30 Severo
Índice ulceroso Mayor a 30 Muy severo
PRUEBA PARA MECANISMOS ANTI - ULCEROGÉNICOSPRUEBA PARA MECANISMOS ANTI - ULCEROGÉNICOS
DETERMINACIÓN DE LA SÍNTESIS DE PROSTAGLANDINASDETERMINACIÓN DE LA SÍNTESIS DE PROSTAGLANDINAS(Curtis et al. 1995)(Curtis et al. 1995)
Las ratas son deprivadas de alimentos 24 h antes del experimento.Las ratas son deprivadas de alimentos 24 h antes del experimento.
Grupo 1:Grupo 1: Twen 80 al 12 % (control, administración oral) Twen 80 al 12 % (control, administración oral)
Grupo 2:Grupo 2: Indometacina 20mg/kg (administración sub cutánea) Indometacina 20mg/kg (administración sub cutánea)
Grupo 3:Grupo 3: Sustancia de prueba (administración oral) Sustancia de prueba (administración oral)
Los animales son sacrificados 30 min. Después del tratamiento y el Los animales son sacrificados 30 min. Después del tratamiento y el abdomen es abierto.abdomen es abierto.
DETERMINACIÓN DE LA SÍNTESIS DE PROSTAGLANDINASDETERMINACIÓN DE LA SÍNTESIS DE PROSTAGLANDINAS(Curtis et al. 1995)(Curtis et al. 1995)
Una muestra del cuerpo del estómago (grosor completo) es Una muestra del cuerpo del estómago (grosor completo) es cortada, pesada y suspendida en buffer citrato sódico (10 mM, cortada, pesada y suspendida en buffer citrato sódico (10 mM, pH 7.4; 1 ml).pH 7.4; 1 ml).
El tejido es finamente desmenuzado con tijeras e incubado a 37 El tejido es finamente desmenuzado con tijeras e incubado a 37 ºC por 20 min. ºC por 20 min.
Las prostaglandinas E2 (PGE2) en el buffer es medido por Las prostaglandinas E2 (PGE2) en el buffer es medido por inmunoensayo enzimático. La densidad óptica se lee a 450 nm. inmunoensayo enzimático. La densidad óptica se lee a 450 nm.
ACTIVIDAD ANTIDIARREICAMODELO DE DIARREA INDUCIDA CON ACEITE DE RICINO (Edwin E, et al; 1997)
Grupos Tratamiento Nº Ratas
1 hora después
Aceite de ricino
Medición
Durante 5 horas
1 Carboximetilcelulosa 1% 6 1 mL Material fecal
2 Loperamida 3mg/kg 6 1 mL Material fecal
3 Sustancia de prueba 6 1 mL Material fecal
Total 18
MODELO ANIMAL DE RESISTENCIA FÍSICA
Grupo control Grupo tratado
Agua Extracto acuoso
30 días de tratamiento por vía oral
Prueba de nado forzado
Registrar tiempo de resistencia de cada animalSacrificar luego de 5 minutos post ejercicio
Medición de actividad enzimática
Superóxido Dismutasa (SOD)
Lactato Deshidrogenasa (LDH)
Catalasa
ACTIVIDAD ANTINOCICEPTIVA: TEST DEL ACIDO ACÉTICO
ANIMALES: Ratones machos con peso entre 23-30g
FUNDAMENTO: Inducir contorsiones abdominales en el ratónMediante la inyección de AcH 1% V/V i.p.
PROCEDIMIENTO: Cinco minutos después de la administraciónDe AcH contar el número de contorsiones en todos los
Animales durante 20 minutos.
Grupo Dosis (mg/kg) Nº de contorsiones
% Inhibición
Control ____ 50.67 ____
Indometacina 10 12.60 74.93
Extracto 1 250 40.00 21.06
Extracto 2 500 32.08 36.69
ACTIVIDAD ANTINOCICEPTIVA: TEST DE LA FORMALINA
ANIMALES: Ratones machos con peso entre 23-30g
FUNDAMENTO: Fase 1: Indicativa de dolor neurogénico (primeros 5 minutos)
Fase 2: Indicativa de dolor inflamatorio (15 a 30 min. DespuésDe la administración de formalina)
Evaluación de las fases: Se mide el tiempoAcumulado en segundos durante el cual el animal se lame la pata
PROCEDIMIENTO: Se estímulo doloroso se induce por laInyección de 20 ul de formalina al 2.5% en la pata trasera
Izquierda del ratón.
ACTIVIDAD ANTIINFLAMATORIATEST DEL EDEMA DE PATA EN RATA INDUCIDO POR CARRAGANINA
ANIMALES: Ratas hembras con un peso entre 180 y 200g
PROCEMIENTOS: El edema se induce inyectando 0.1 mL deCarragenina al 1% en SSF en la almohadilla plantar de la
Pata trasera derecha.La inflamación se cuantifica midiendo el volumen de las patas
Utilizando un Pletismómetro a las 0, 1, 3 y 4 después de laInyección de carragenina.
La diferencia entre el volumen de la pata izquierda y el de la Derecha es indicativa del grado de inflamación.
MODELO DE INFLACIÓN INTESTINAL CRÓNICA INDUCIDA POR INDOMETACINA (Sartor et al; 1992)
ANIMAL: Ratas machos de 250g, ambientados 5 días antes del experimento.
PROCEDIMIENTO: Administrar dos veces indometacina vía s.c. 7.5 mg/kg cada 24 horas
Los tratamientos se administran por 6 días vía oral.Después de 7 días de la administración de la primeraInyección de indometacina, las ratas son sacrificadas
Se extrae el yeyuno, se lava con SSF y se fija en formolAl 10 % para estudio histopatológico.
Corte histológico del Epitelio intestinal normal
Corte histológico del Epitelio intestinal destruido.La ulceración alcanza la Capa muscular
Intestino delgado luegoDe la administración de los tratamientos
Modelos farmacológicos en animales sanos
MODELO DE ESTUDIO PARA EVALUAR LA FERTILIDAD EN RATAS NORMALES
Grupos Tratamientos Nº Ratas
Sexo Peso
Ratas
Edad
Ratas
Días de
ambientación
1 Control SSF 5 mL/kg
48 24 machos
24 hembras
180 a 200 g
2 meses
7
2 Dosis sustancia de prueba
48 24 machos
24 hembras
180 a 200 g
2 meses
7
MODELO DE ESTUDIO PARA EVALUAR LA FERTILIDAD EN RATAS NORMALES
Grupos Tratamiento Sub grupos Criterios de medición
1 SSF 5 mL/kg 6 machos Testosterona
6 hembras LH, FSH, estrógeno y progesterona
6 machos y 6 hembras Fecundación o gravidez
2 Sustancia de prueba
6 machos Testosterona
6 hembras LH, FSH, estrógeno y progesterona
6 machos y 6 hembras Fecundación o gravidez
Total 48 ratas
Gravidez en ratas controles Gravidez en ratas tratadas
Método de evaluación del sistema reproductorMétodo de evaluación del sistema reproductorEfecto sobre la función sexualEfecto sobre la función sexual
Evaluación del apareamiento por 1 díaEvaluación del apareamiento por 1 día
Material Biológico:Material Biológico: Ratones machos y hembra 23 - 25 g Ratones machos y hembra 23 - 25 g
Material Farmacológico:Material Farmacológico: Sustancias de prueba Sustancias de prueba Estradiol benzoatoEstradiol benzoato ProgesteronaProgesterona
Procedimiento:Procedimiento: Evaluación sobre el apareamiento por un día Evaluación sobre el apareamiento por un día
Procedimiento: Evaluación de apareamiento por un díaProcedimiento: Evaluación de apareamiento por un día
NN TratamientosTratamientos Vía administraciónVía administración
G 1G 1
G 2 G 2
Control (n = 10)Control (n = 10)
Sustancia de prueba (n = 10)Sustancia de prueba (n = 10)
OralOral
OralOral
Procedimiento: Evaluación de apareamiento por un díaProcedimiento: Evaluación de apareamiento por un día
1.1. Cada ratón macho es colocado en jaula separadaCada ratón macho es colocado en jaula separada
2.2. Después de una hora se admiten 5 ratones hembras a cada machoDespués de una hora se admiten 5 ratones hembras a cada macho
3.3. Cada Cada ratón hembraratón hembra es expuesto en es expuesto en estro estro con dosis única s.c. de benzoato con dosis única s.c. de benzoato estradiol y progesteronaestradiol y progesterona
4.4. Observación:Observación: La mañana siguiente se examina una muestra vaginal bajo un La mañana siguiente se examina una muestra vaginal bajo un microscopio para la presencia de espermamicroscopio para la presencia de esperma
5.5. Registrar:Registrar: El número de hembras positivo para esperma en cada jaula. El número de hembras positivo para esperma en cada jaula.
6.6. CalcularCalcular el promedio de hembras Espermas – positivo para el grupo control el promedio de hembras Espermas – positivo para el grupo control y esperimental y esperimental
MODELO DE ESTUDIO DE TOXICIDAD SUB AGUDO
Grupo Control Grupo Tratado
30 días de tratamiento
Muestras de sangreInicio, 15 y 30 días de tratamiento
Día 30, las ratas son sacrificadas
Estudios de perfil bioquímicoGlucosa, Triglicéridos
LDL-Colesterol, HDL-ColesterolColesterol total
Proteínas totalesAlbúmina, TGO, TGP
Estudios HematológicosHemoglobinaHematocrito
Estudios AnatomopatológicosHígado, corazón
Páncreas, estómagoRiñones
Actividad hipoglucemiante del extracto hidroalcohólico de las hojas del Smallanthus sonchifolius (Yacón) en ratas con diabetes
mellitus tipo 1 y 2
1.- Material Biológico: Ratas albinas cepa Holtzmann
Características DMT1 DMT2
Número de ratas
Edad
Peso
Sexo
Procedencia
Temperatura
Alimentación
Agua
45
8 semanas
180 ± 20 g
Machos
INS
20 – 23 ºC
Obtenidas del INS
Ad libitum
24
8 a 9 semanas
225 ± 25 g
Machos
INS
20 – 23 ºC
Obtenidas del INS
Ad libitum
nesquenty4@hotmail.com
2.- Materila Farmacológico:
Extracto hidroalcohólico al 10% p/v de Smallanthus sochifolius (yacón)
Glibenclamida tableta 5 mg.
Aloxano (5,6 - dioxyuracil).
3.- Equipos:
Balanza analítica al 0.001g (Metter Zurich)
Estufa (Memmert)
Refrigerador
Glucómetro Accu-Chek Active (Laboratorios Roche)
Kit Sistemas Elecsys 1010/2010 (Laboratorios Roche)
Equipo de disección
nesquenty4@hotmail.com
4.- Descripción del estudio
Estudio prospectivo, longitudinal experimental del tipo “casos y controles”.
nesquenty4@hotmail.com
100g HOJAS DESHIDRATADAS Y MICROPULVERIZADASDE Smallantus sonchifolius (yacón)
MACERACIÓN EN 1000 mL de ALCOHOL AL 80% POR 7 DÍAS
FILTRACIÓN
SECADO A 40 GRADOS
PESADO
ALMACENAMIENTO
REFRIGERACIÓNnesquenty4@hotmail.com
2.- Inducción de diabetes mellitus tipo 1 y 2 a ratas
DMT1 DMT2
Método
Aloxano buffer citrato pH 4.75
Glucemia
Mendez JD et al 1994
Tres dosis 150 mg/kg p.c. / 48 h
Mayores a 300 mg/dL
Zanoello Am et al 2002
Cuatro dosis de 75 mg/kg p.c. / 48 h
Entre 125 – 359 mg/dL
nesquenty4@hotmail.com
3.- Criterios de medición
DMT1Determinación de glucosa
Determinación de insulina
DMT2Determinación de glucosa
Determinación de efectos adversos a nivel bioquímico
Determinación de efectos adversos a nivel hematológico
nesquenty4@hotmail.com
4.- Diseño experimental de diabetes mellitus tipo 1.
Grupos Tratamientos Nº Ratas Aloxano
1
2
3
4
5
Control + SSF
Glibenclamida 10 mg/Kg
Yacón 250 mg/Kg
Yacón 500 mg/Kg
Yacón 1000 mg/Kg
TOTAL
9
9
9
9
9
45
Recibió
Recibió
Recibió
Recibió
Recibió
SSF. = Solución Salina Fisiológica
5.- Diseño experimental de diabetes mellitus tipo 2.
Grupos Tratamientos Nº Ratas Aloxano Días de Tratamiento
1
2
3
4
Normal + SSF
Control (+) + SSF
Glibenclamida 10 mg/Kg
Yacón 500 mg/Kg
TOTAL
6
6
6
6
24
S.S.F.
Recibió
Recibió
Recibió
30
30
30
30
SSF = Solución Salina Fisiológica
Se compararon los resultados obtenidos para cada grupo (caso y control), se realizaron procedimientos estadísticos como media de tendencia central; promedio y error estándar, y para probar la hipótesis el análisis de varianza ANOVA mediante el paquete estadístico SPSS versión 13.0 y fueron considerados estadísticamente significativos a p<0.05. Los resultados se muestran en tablas y gráficos.
6.- Análisis estadístico
MUCHAS GRACIAS
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