presentación biomol 2
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Relevancia
del
Aislamiento
del ADN
La extracción de ADN es el primer
paso en la tecnología del ADN.
• Determinación del perfil de ADN
• Clonación
• Diagnóstico de enfermedades
• Determinación de secuencias de ADN
• Transferencia génica: Organismos Modificados Genéticamente (OMG), agricultura, farmacéutica
• Pruebas ambientales, bioterrorismo
• AISLAMIENTO DE ADN DE CELULAS BUCALES
Resumen del
Protocolo:Extracción
de ADN Genómico
• • Utilización de agua como enjuague para la recogida de las células bucales
• • Añadir el búfer de lisis para romper las membranas nucleares y celulares y liberar el contenido nuclear
• • Utilización de la proteasa para digerir las proteínas celulares
• • Precipitación del ADN con alcohol frío y alta concentración de sal.
Extracció
n de ADN : Paso-a-
Paso
• Puesto común (Puesto del Maestro)
• Baño a 500C
• Botella de isopropanol 91% o etanol 95%, en hielo
• Puesto de trabajo de los alumnos Número• (4 Estudiantes/Puesto de trabajo )
• Tubos de15 ml con 3 ml de agua 4
• Microtubo rosa marcado “prot”, • con 1.25 ml de proteasa rehidratada con sal
1
• Tubo de 15 ml tubo marcado “lisis” con 10 ml de búfer de 1
• Pipetas de plástico 6
• Gradilla de hule espuma para los tubos 1
• Marcador de tinta indeleble 1
• Taza de papel dispensable o un beaker para sostener los 1• tubos de 15 ml y la subsiguiente colección de basura
• Materiales para hacer el collar de ADN o un micortubo de1.5ml 1
• Guía rápida 1
Extracción y
Precipitación
de ADN
Listado de Materiales
4 Estudiantes/Puesto de
trabajo para un total de
36 Estudiantes
Es de vital
importancia
realizar una
abundante
recogida de
células.
•Para mejores resultados, asegúrese que los alumnos empleen la suficiente cantidad de tiempo recogiendo las células de la mucosa bucal.
•Pueda que la colección de muestra en el tubo de 15 mL sea difícil. Puede utilizar un vaso pequeño para dispensar y coleccionar la muestra.
Protocolo de Práctica de Laboratorio
1. Obtenga del instructor un tubo de 15 mL que contenga 3 ml de agua. Marque el tubo con sus iniciales.
• 2. Cuidadosamente mordisquee el interior de los cachetes por 30 segundos. ¡No sirve de nada sacar sangre!
• 3. Tome el agua del tubo de15 mL, y con el agua enjuague por 30 segundos.
• 4. Cuidadosamente escupa el liquido de regreso al tubo de 15 mL.
Pasos 1 − 4
Protocolo de Práctica de
Laboratorio
5. Obtenga el tubo de búfer de lisis del puesto de
trabajo y añade 2 mL de búfer de lisis a su tubo
que contiene el extracto celular.
6. Cierre el tubo e inviértalo suavemente para
mezclar los componentes. (¡No lo mezcle muy
duro!). Observe su tubo — ¿Ve algunos
cambios? Anótelos.
Pasos 5 − 6
Protocolo de Práctica de
Laboratorio
• 7. Obtenga el tubo de proteasa (marcado “prot”) de su puesto de trabajo. Añade 5 gotas de proteasa a su tubo.
• 8. Cierre el tubo y voltéelo suavemente varias veces.
• 9. Coloque su tubo en la gradilla o en un beaker en el baño de agua y déjelo incubar por 10 minutos a 50°C.
Pasos 7 − 9
Extracció
n y
precipita
ción de
ADN
• ¿Por qué se lleva a cabo cada paso?
1. Colección
de células
El mordisqueo del
interior de la boca, en
combinación con el
enjuague de agua
funciona para separar
las células del epitelio
alineando la boca.
Es crítico recoger la
cantidad suficiente de
células.
2. Búfer de Lisis¿Qué es el Búfer de Lisis?
• 50 mM Tris-HCI, pH 8.0• 1% SDS
Búfer deTris para mantener el pH de la
solución en el cual ADN se mantiene estable
1% SDS para romper y abrir las membranas celulares y nucleares permitiendo que
el ADN quede libre en la solución.
El detergente SDS desnaturaliza y desdobla las proteínas dejándolas
accesibles para las proteasas.
O
S
O
O
O
-
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH3
SDS
Na+
3. ¿Por qué
utilizamos la proteasa?
• • La proteasa se utiliza para destruir
las proteínas nucleares que crean un
enlace con el ADN y para destruir
enzimas citoplasmáticas que degradan y
destruyen el ADN.
• • El tratamiento con proteasa
incrementa la cantidad de ADN intacto
que es extraído.
4. Adición de la
solución salina
• • La solución de proteasa ya contiene sal.
• • Los iones de Na+ del NaCI forman
enlaces con los grupos de fosfato de las
moléculas de ADN, neutralizando las
cargas eléctricas del ADN.
• • La adición de NaCI permite que las
moléculas de ADN se junten en lugar de
repelerse una a la otra. De esta manera
se facilita la precipitación del ADN de la
solución al añadir el alcohol.
5. Precipitación
del ADN con
alcohol frío
• • El ADN no se disuelve en alcohol.
• • El añadir alcohol hace que el ADN se agregue y se precipite de la solución.
• Las moléculas del ADN precipitadas parecen un material fibroso, como los hilos blancos de una telaraña.
• Las burbujas microscópicas de oxígeno, que se generan al mezclar, se “agregan” al precipitarse el ADN.
• Las burbujas visibles más grandes, levantan el ADN fuera de la solución y lo llevan de la fase acuosa a la fase orgánica (fase del alcohol).
Protocolo de Práctica de
Laboratorio • 10. Lentamente añade 10 ml de alcohol frió manteniendo el tubo a un ángulo de 45°. Este paso va a requerir de varias adiciones utilizando la pipeta de transferencia desechable.
• 11. Deje el tubo en posición vertical en la gradilla, a temperatura ambiente y en reposo, durante 5 minutos ¿Que ve?
• 12. Cierre el tubo y voltéelo de lado y de regreso en posición vertical, con mucho cuidado, unas 10 veces, hasta que las fases de agua y alcohol queden mezcladas y el ADN salga de solución.
Pasos 10 − 12
EXTRACCIÓN DE ADNBIOMOL 2012
FMVZFRUTAS
• Extraer el material genético (ADN) de células de guineo y/o fresas.
• Establecer la relación entre el proceso de extracción y propiedades quίmico-fίsicas del ADN
Solución amortiguadora o “buffer”
• 6 mL de detergente líquido de fregar
• 5 g de sal de mesa
• 44 mL de agua destilada
• Una pizca de ablandador de carne
Preparación de la solución
Mida 6 mL del detergente en una probeta de 10 mL. Vierta en un beaker de 100 mL.
Mida 44 mL de agua destilada. Vierta en el “beaker” de 100 mL que ya contiene el detergente. Evite la formación de burbujas.
Finalmente, aňada 5g de sal de mesa y el ablandador de carne. Mezcle bien.
•Remueva la cáscara de un pedazo de guineo de una pulgada.
•Eche el guineo en una bolsa plástica con cierre de seguridad. Cierre la bolsa.
•Macere el guineo (puede ser con la mano) hasta obtener una consistencia bien blanda.
Continuación: Procedimiento
Añada los 50 mL de la solución amortiguadora. Cierre bien. Evite la formación de burbujas. ¿Por qué?
Con cuidado, coloque la bolsa en posición horizontal sobre papel toalla. Asegúrese que el macerado de guineo esté cubierto con la solución amortiguadora. Espere 5 minutos.
¿Por qué el macerado debe estar cubierto por la solución amortiguadora?
¿Por qué debe esperarse 5 minutos?
Continuación: Procedimiento Mientras esperan que
transcurran los cinco minutos, presenten posibles contestaciones a las siguientes preguntas:
¿Cuál es la función del detergente?
¿Cuál es la función de la sal?
¿Cuál es la función del ablandador de carne?
Coloque el paño sobre el vaso plástico y filtre el macerado de guineo. Luego, descarte el paño con el macerado. ¿Por qué hay que filtrar?
Utilice la regla para marcar dos tubos de ensayo a una distancia de 1” y de 2” desde abajo hacia arriba.
Aňada a cada tubo de ensayo un volumen del filtrado hasta que llegue a la marca de 1”.
Continuación: Procedimiento
Añada al tubo de ensayo un volumen
de alcohol etílico 70%-90% frío hasta llegar a la marca de 2”.
Sin mezclar, coloque el tubo de ensayo en una gradilla o en un vaso plástico. Espere por 5 minutos.
Continuación: Procedimiento
Inserte en el tubo de ensayo una varilla decristal o removedor de café para remover elADN de la capa superior del alcohol. Coloqueel ADN en otro tubo de ensayo.Continuación
: Procedimient
o
Preguntas de análisis y discusión
¿Cuál, piensas tú, es la función del detergente en la solución amortiguadora?
Cuando el detergente entra en contacto con la célula, captura los lípidos y las proteínas.
¿Cuál es la función de la sal en la solución amortiguadora?
¿Cuál es la función del alcohol etílico?
Fundamentos, variantes y
aplicaciones
REACCION EN CADENA DE LA
POLIMERASA (PCR)
1985 - Mullis & Falloona
Amplificación enzimática de un fragmento de DNA
(simulando una replicación natural del DNA “in vitro”)
Reacción en cadena de la polimerasa - PCR
PCR es básicamente una técnica de amplificación del DNA.
PCR
amplificación
DNA
(molecule sencilla)
Muchas
moleculas
Síntesis de ácidos nucleicos: generalidades
• La hebra nueva de DNA o RNA se sintetiza en dirección 5’ 3’
• Las RNA polimerasas pueden iniciar la síntesis de una cadena nueva utilizando una hebra molde
• Las DNA polimerasas además de la hebra molde, necesitan un iniciador (primer o cebador de extensión)
• La Transcriptasa Reversa es una DNA polimerasa RNA-dependiente.
ELEMENTOS QUE SE REQUIEREN EN LA SINTESIS DEL DNA POR PCR
Hebra Templado
Iniciador (cebador, primer): secuencia corta denucleótidos complementaria a la hebra templado. La enzima DNA polimerasa sólo puede iniciar la síntesisde una cadena de DNA a partir de un 3’OH libre.
dNTPs : desoxirribonucleótidos tri-fosfatados
DNA Polimerasa
PCRMelting
94 oC
Tem
pera
tura
100
0
50
Tiempo
5’3’
3’5’DNA de cadena doble
PCRMelting
94 oC
Tem
pera
tura
100
0
50
Tiempo
3’5’
5’3’
CalorDNA de cadena simple
PCRMelting
94 oCAnnealing
Primers
50 oC
Extension
72 oCTem
pera
tura
100
0
50
Tiempo
3’5’
5’3’5’
5’
Melting
94 oC
Hibridaciónde primers
PCRMelting
94 oCMelting
94 oCAnnealing
Primers
50 oC
Extension
72 oCTem
pera
tura
100
0
50
Tiempo
30 ciclos
3’5’
5’3’
Calor
Calor
5’
5’
5’
PCRMelting
94 oCMelting
94 oCAnnealing
Primers
50 oC
Extension
72 oCTem
pera
tura
100
0
50
Tiempo
30ciclos
3’5’
5’3’5’
5’
5’
5’
5’
5’
PCRMelting
94 oCMelting
94 oCAnnealing
Primers
50 oC
Extension
72 oCTem
pera
tura
100
0
50
Tiempo
30ciclos
3’5’
5’3’5’
5’
5’
5’
5’
5’
Calor
Calor
PCRMelting
94 oCMelting
94 oCAnnealing
Primers
50 oC
Extension
72 oCTem
pera
tura
100
0
50
Tiempo
30ciclos
3’5’
5’3’5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
Fragmentos de
tamaño definido
PCRMelting
94 oCMelting
94 oCAnnealing
Primers
50 oC
Extension
72 oCTem
pera
tura
100
0
50
Tiempo
30ciclos
3’5’
5’3’5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
El numero de copias del DNA delimitado por los primers se duplica en cada ciclo de PCR.
0
# ciclos
Numero de copias
1
3
8
2
4
1
2
4
16
5
32
6
64
VENTAJAS DE PCR SOBRE
OTRAS TECNICAS
ALTA SENSIBILIDAD
ALTA ESPECIFICIDAD
RAPIDEZ
DESVENTAJA:
PROBLEMAS DE CONTAMINACION (a partir de trazas de DNA
templado específico o productos amplificados previamente)
• Síntesis por DNA polimerasa
•
• -A T G C A T G C A T G C * *
A C G-T
Reacción en cadena de la polimerasa - PCR
Cortos primers de DNA específicos hibridizan con la cadena que tiene que ser
copiada
5’ 3’
• Síntesis por DNA polimerasa
•
• -A T G C A T G C A T G C * *
A C G T-T
Reacción en cadena de la polimerasa - PCR
5’ 3’
• Síntesis por DNA polimerasa
•
• -A T G C A T G C A T G C * *
A C G T-T A5’ 3’
Reacción en cadena de la polimerasa - PCR
• Síntesis por DNA polimerasa
•
• -A T G C A T G C A T G C * *
A C G T-T A C
Reacción en cadena de la polimerasa - PCR
5’ 3’
• Síntesis por DNA polimerasa
•
• -A T G C A T G C A T G C * *
A C G T-T A C G
Reacción en cadena de la polimerasa - PCR
5’ 3’
• Síntesis por DNA polimerasa
•
• -A T G C A T G C A T G C * *
A C G T-T A C G T
Reacción en cadena de la polimerasa - PCR
5’ 3’
• Síntesis por DNA polimerasa
•
• -A T G C A T G C A T G C * *
A C G T-T A C G T A
Reacción en cadena de la polimerasa - PCR
5’ 3’
Despues del primer periodo de sintesis de DNA, tenemos
copiada una cadena de DNA
Primer 1 Extensión de la cadena
Cadena original de DNA
¿Cómo produce este proceso una AMPLIFICACIÓN?
Reacción en cadena de la polimerasa - PCR
Primero, la fusión separa las dos cadenas de DNA a alta
temperatura (~100°C)
Reacción en cadena de la polimerasa - PCR
Primero, la fusión separa las dos cadenas de DNA a alta
temperatura (~100°C)
Reacción en cadena de la polimerasa - PCR
Primero, la fusión separa las dos cadenas de DNA a alta
temperatura (~100°C)
Luego, usando un segundo primer, se copia la nueva
cadena con la DNA polimerasa
Al mismo tiempo, la cadena original se copia nuevamente, dado que hay
un rexceso de Primer 1
2
1
Ahora tenemos dos copias de la molécula original
Reacción en cadena de la polimerasa - PCR
Para controlar el proceso, necesitamos controlar la temperatura
Si repetimos el ciclo, tendremos cuatro copias
Reacción en cadena de la polimerasa - PCR
Fusión
95 C
Hibridización
50-60ºC
Extensión de
La cadena
75ºC
Primer Ciclo
2do Ciclo
95ºC
50 - 60ºC
75ºC
Múltiples ciclos darán un incremento exponencial en el número de
copias
Hay 7 componentes esenciales en el proceso standard de PCR
• ADN polimerasa termoestable
• Oligonucleotidos iniciadores (“primers”)
• Desoxiribonucleótidos trifosfatados (dNTPs)
• Buffer (para mantener el pH)
• Cationes divalentes
• ADN molde (Templado)
ADN polimerasas termoestables• Llevan a cabo la síntesis de ADN dependiente del
templado.• Estabilidad – Taq: 9 min at 97°C, Pwo >2 hr a 100°C• Fidelidad – Taq: baja, Pfu: alta• Algunas presentan actividad transferasa terminal en el
extremo 3´, ej. Taq agrega una A al exremo 3´, especialmente si en el extremo hay una C. Pwo y Tligeneran extremos romos
• Cantidad usada = 5 x 1012 moleculas (1.5 unidades)• La mas comunmente usada = Taq ADN polimerasa
Taq Thermus aquaticus, Pwo Pyrococcus woesei, Pfu Pyrococcusfuriosus, Tli Thermococcus littoralis
Oligonucleótidos iniciadores (primers)
• Se conoce su secuencia
• Es el factor mas importante para la eficiencia y la especificidad del proceso
• Deben estar presentes en exceso (1013 = 30 cycles, 1 kb)
• Requieren de un cuidadoso diseño
• Reglas de diseño:(a) longitud = 18-25
(b) Contenido de G+C entre 40-60%
Oligonucleótidos iniciadores (primers)
• Se conoce su secuencia
• Es el factor mas importante para la eficiencia y la especificidad del proceso
• Deben estar presentes en exceso (1013 = 30 cycles, 1 kb)
• Requieren de un cuidadoso diseño
• Reglas de diseño:(a) longitud = 18-25
(b) Contenido de G+C entre 40-60%
(c) Evitar las secuencias repetidas
(c) Evitar las secuencias repetidas
5´
5´
3´
3´
5´
5´
3´
3´
Dímero de primer
PCR
3´ repetido
5’-NNNNNNNNNNNNNTATA-3’
5’-NNNNNNNNNNNNNTATA-3’
5’-NNNNNNNNTATA-3’
3’-ATATNNNNNNNN-5’
(c) Evitar las secuencias repetidas
5´
5´
3´
3´
no hay extensión
PCR
5´ repetido
5´-TATANNNNNNNNNNNNN-3´
5´-TATANNNNNNNNNNNNN-3´
5´-TATANNNNNNNN-3´
3´-NNNNNNNNATAT-5´
5´
5´
3´
3´
Facultad de Farmacia y Bioquímica, UBA
(c) Evitar las secuencias repetidas
5´
5´
3´
3´
Productos de PCR no deseados
PCR
Formación de horquillas
5’-NNNNNNNNNNNGCATGC-3’
5’-NNNNNNNNNNNNNNNNN-3’
5’-NNNNNNNNNNNGCA
3’-CGT
5´
3´
Oligonucleótidos iniciadores (primers)
• Se conoce su secuencia
• Es el factor mas importante para la eficiencia y la especificidad del proceso
• Deben estar presentes en exceso (1013 = 30 cycles, 1 kb)
• Requieren de un cuidadoso diseño
• Reglas de diseño:(a) longitud = 18-25
(b) Contenido de G+C entre 40-60%
(c) Evitar las secuencias repetidas
(d) Valores de Tm de no mas de 5°C uno del otro
ADN molde (templado)
• Puede ser ssDNA o dsDNA (simple o doble cadena)
• ADN circular y cerrado es levemente menos efectivo que el ADN lineal
• Usualmente se utilizan varios miles de copias, ej: 1 µg de humano, 10 ng de levadura, 1 ng de bacteriano o 1 pg of plasmídico
• Se puede amplificar a partir de una sola molécula de ADN molde, pero las condiciones deben estar muy optimizadas
El ciclo de PCR
• Desnaturalización - 94-95°C por 45 segundos si G+C < 55%
• Temperatura de hibridización (Annealing) – debe ser calculada o determinada empiricamente para cada par de primers
demasiado alta = poco o nada de producto
demasiado baja = annealing no específico = productos incorrectos
• Extensión -
a la temperatura óptima de la ADN polimerasa utilizada
ej.: 72°C para Taq
1 min/kb de longitud, dado que la Taq polimeriza 2000 pb/min
solo a partir del 3r ciclo son producidos ADN duplex de la longitud deseada, los cuales a partir de allí se tornan en el producto principal
El ciclo de PCR• Desnaturalización - 94-95°C por 45 segundos si G+C < 55%• Temperatura de hibridización (Annealing) – debe ser calculada o determinada
empiricamente para cada par de primersdemasiado alta = poco o nada de productodemasiado baja = annealing no específico = productos incorrectos
• Extensión -a la temperatura óptima de la ADN polimerasa utilizada
ej.: 72°C para Taq
1 min/kb de longitud, dado que la Taq polimeriza 2000 pb/min
solo a partir del 3r ciclo son producidos ADN duplex de la longitud deseada, los cuales a partir de allí se tornan en el producto principal
• Número de ciclos -- algunos componentes se tornan limitantes despues de
30 ciclos (si el número inicial = 105 moléculas)- se necesitan >25 ciclos para amplificar un gen de copia única a partir de ADN genómico de mamífero DNA
TECNICAS DERIVADAS/ BASADAS EN PCR
RT-PCR : detección de mRNA
PCR Nested: amplificación de una secuencia dentro de otra
previamente amplificada
PCR Multiplex: varios targets diferentes en forma simultánea
In situ PCR : detección en tejido mismo, ubicación del fragmento
IC-PCR : inmunocaptura previa a PCR
PCR-RFLP : polimorfismo genético (usado más que RAPDs)
Real Time PCR : cuantificación de copias iniciales – en tiempo real
PCR Multiplex
- Varias secuencias target en forma simultánea.
- La eficiencia de amplificación de ambos targets no esnecesariamente la misma:
- Secuencia de DNA de los diferentes targets(%GC)
- Temperatura de hibridación de los diferentesprimers
- Tamaño de las diferentes secuencias target
- Artefactos / dímeros entre diferentes primers.
Multiplex PCR
• Describe una PCR enla cual hay presentes multiples pares de primers (hasta 8) lo que da una serie de productos. Los mismos pueden verse como múltiples bandas en un gel de agarosa
• Multiplex PCR es frecuentemente usada en diagnóstico médico
• Ahorra templado, tiempo y gastos
• Requiere una cuidadosa optimización
mRNA
cDNA (simple cadena)
cDNA (doble cadena)
PCR
RT-PCR
Consiste en dos pasos:
• Transcripción reversa
• PCR
OBJETIVO:
Detección de la expresión de un gen – por presencia de mRNA
Transcripción Reversa
1. Purificación de RNA mensajero
2. Transcripción reversa a cDNA (DNA copia)
Nested PCR
• A veces 1 ronda de PCR no da un producto único producto a partir de un templado complejo, apareciendo un “chorreado”
• Se puede resolver utilizando un segundo par de primers que hibriden un poco mas internamente que los primeros
• Realizar una segunda ronda de PCR usando el producto de la primera (chorreado)
• Rinde un producto único porque solo el fragmento correcto de ADN posee los sitios correctos de hibridización para el segundo par de primers
Nested PCR
2da PCR
Chorreado de ADN
1era PCR
ADN específico
Facultad de Farmacia y Bioquímica, UBA
Clonado con PCR: clonado T-A
3’-A
A-3’
T-3'
3'-T
AA
T-3'
3'-T
Ligamiento con extremo adhesivo de 1 base = 50 veces mejor
que ligamiento con extremos romos
ligamiento
Producto de PCR
a partir de Taq Vector con cola-T
Mutagénesis por PCR• Introduce cambios de secuencia dentro de
fragmentos (clonados) de ADN
• El método de extensión solapada requiere 2 primers mutagénicos y otros 2
• Amplifica un fragmento 5´ y un fragmento 3´ que se solapan. Ambos portan la mutación
• Usa los productos en otra reacción para producir el ADN mutado de longitud completa
Dos 1ras
PCRs
separadas
Primer SP6 Primer mutagénico directo (forward)
primer mutagénico inverso (reverse) Primer T7
X
x
x
x
remover primers, desnaturalizar y re-hibridizar
2da PCR
Mutagenesis con PCR- extension solapada
• Para amplificar copias de cDNA de RNA
• Es especialmente útil cuando solose dispone de pequeñas cantidades de RNA
• Frecuentemente usada para amplificar genes específicos (como cDNAs) si algo de su secuencia es conocida
• Requiere primer “antisense” y un DNA polimerasa dependendinte de RNA
• Puede ser usada para construir bibliotecas de cDNA
• Primero se hace un cDNA a partir del templado de ARN
• Luego se usa un segundo primer (“sense”) para hacer el duplex de cDNA por PCR
RT-PCR = PCR con transcriptasa reversa
RT-PCR
AAAAAAAAAA-3’
TTTTTTTTTT-5’
Transcripción reversa
PCR usando
GSP+GSP1
AAAAAAAAAA-3’
TTTTTTTTTT-5’
mRNA
(sense)
Primer Antisense:
oligo(dT)o
1ra cadena cDNA
GSP1 (sense)
GSP (antisense)
GSP1
GSP
Requiere el conocimiento de la secuencia para diseñar GSP and GSP1
RAPD of P. aeruginosa
Immuno-PCR
- DETECCION DE ANTÍGENO ESPECÍFICO POR ELANTICUERPO ESPECIFICO
- ALTA SENSIBILIDAD - POR PCR
Immuno-PCR vs ELISA
protein
E
S P
ELISA
antibody with linked enzyme
StB
protein
Immuno-PCR
antibody with linked DNA
B
El Producto de PCR puede ser detectado por electroforesis o por ELISA
APLICACIONES DE PCR EN MEDICINA
• Detección de cantidades mínimas (diagnóstico temprano enpacientes asintomáticos)
•Monitoreo de terapia (por ej. disminución de carga viral)
• Evaluación de terapia - pronostico de recaída
• Detección de cepas resistentes a antibióticos
• Detección temprana de Citomegalovirus y otros patógenos en pacientes con transplante de órganos (por inmunosupresióny mayor riesgo a infecciones latentes)
MUESTRAS QUE PUEDEN PATOGENOS QUE PUEDEN SER
SER EVALUADAS POR PCR DETECTADOS POR PCR
•Sangre - Bacterias
•Mucosa - Hongos
•Tejido - Parásitos
•Orina - Virus
•Heces - Mutaciones en Genes
•Líquido cefalorraquídeo - Ausencia /Deleción de
genes
USOS DE LA TECNOLOGIA MOLECULAR EN LA SOCIEDAD
• Medicina : Diagóstico Molecular:
Enfermedades geneticas
Enfermedades infecciosas
• Identificación genética y filiación (Pruebas de paternidad, medicina forense, pedigree de animales, etc...)
• Mejoramiento genético en animales y plantas
• Productos biomédicos
• Terapia génica
REAL TIME PCR
INTRODUCCION
- PCR (estandar)
- RT-PCR
- PCR Cuantitativo (end point analysis)
- PCR en tiempo real (análisis de la cinética de reacción)
- ventajas
- desventajas
- aplicaciones
Cuantificación de copias de mRNA
1. Diferencias en la expresión de genes (por efecto de drogas por ejemplo)
2. La poca cantidad de mRNA disponible en ciertos procedimientos:•células obtenidas por LCM (laser capture microdissection)•cantidades pequeñas de tejidos•células primarias
REAL TIME PCR - PCR EN TIEMPO REAL
•Cuantificación del número de copias de DNA presentes en la muestra (diagnóstico, monitoreo de carga viral, comparación entre número de copias en diferentes subespecies, etc.)
•Cuantificación del mRNA por RT-PCR en tiempo real (análisis de la expresión de genes en diferentes tejidos o en diferentes condiciones normales vs patológicas, efecto de drogas, etc)
•Análisis de la cinética de la reacción
PCR en tiempo real
• Detección y cuantificación de reporteros fluorescentes.
• La fluorescencia emitida es proporcional a la cantidad de producto formado en cada ciclo de PCR.
• Reporteros fluorescentes: TaqMan, Beacons moleculares, SYBR Green
Real Time PCR
2a. excitation
filters
2b. emission
filters
1. halogen
tungsten lamp
4. sample plate
3. intensifier5. ccd
detector
350,000
pixels
Log phase Level off/ plateau
32
16
8
4
2
Amplification Plot of real-time PCRD
NA
co
py
nu
mb
er
(lo
g)
PCR cycle (Ct)
ARTEFACTOS - PRODUCTOS NO ESPECIFICOS:
• Unión inespecífica de primers (mispriming): por unión de los
primers a secuencias parcialmente complementarias presentes en
el DNA o cDNAs de la muestra
• Dímeros : los primers pueden hibridarse entre ellos creando
productos pequeños
PROBLEMAS
PRODUCTOS NO ESPECIFICOS (artefactos) : que
pueden incrementar el valor de fluorescencia obtenida
durante la reacción. Esto es mas frecuente cuando se utiliza
SYBR-green.
CURVA DE DENATURACION
Muesta el perfil de denaturación de los productos
amplificados.
Si un producto presenta un perfil de denaturación diferente
(valores de Tm diferentes), significa que es otro producto (no
específico) de amplificación, pueden ser dímeros.
DISEÑO EN PLACA
Ventajas del PCR en tiempo real
• Simple y rápida (semi-automatizada).
• No hay manipulación post-PCR.
• Eliminación de contaminación por amplicones.
• Cuantificación del DNA o RNA molde inicial.
• Muy sensible.
• Detección de productos inespecíficos con la opción “curva de desnaturalización” (Melt-Curve).
• Detección de más de un producto específico en una misma reacción.
• Extraordinariamente específico.
Journal of Virological Methods 102:119-128, 2002
Journal of Clinical Virology 28:233-238, 2003
ELECTROFORESIS EN POLIACRILAMIDA
Electroforesis 1
ElectroforesisGiovanni\clase 10 feb\electroforesis\Making an Agarose Gel.flv 2
Pulse Field Gel Electrophoresis (PFGE)
E.coli O157:H7
Target
region
for
PFGE
Principle: Strain diversity
Foreign DNA
Host DNA
New Host DNA
Insertion event
Principle: Strain diversity
Host DNA
New Host DNA
Deletion event
Excised fragment
Principle: Strain diversity
Host DNA
New Host DNA
Rearrangement event
Practice
24 hour culture
Cell suspension
abs ~1.8
Make agarose plugs
Lyse cells and wash
plugs
Practice
Restrict DNA in plugsSlice 2mm piece of
plug
Load slices onto comb
Pour gel and remove comb
Electric current 18-20 hours
buffer 14 Celectrodes
The End Result
The Analysis Process: Normalization
• Blue Loading Buffer: 33 mM NaCl, 70 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 2% (w/v) SDS, 0.01 % (w/v) bromophenol blue, 10% glycerol, pH 6.8 A 25 °C.
Bandas del fragmento mitocondrial ND2-WANCY
gel de agarosa al 1.5% (Sea Kem de Cambrex)
Tinción de Bromuro de Etidio y solución tampón de
1X TBE
1Kb plus DNA ladder( Invitrogen)
Foto Analyst Investigator (Fotodyne)
CR CR CR CR CR PTY PTY CR
• Verificación del producto de PCR.
• Para evidenciar la presencia y calidad de las bandas, se utilizaron 5µl del producto amplificado y se realizó una corrida electroforéticaen un gel de agarosa al 1.5% (Sea Kem de Cambrex) en tinción deBromuro de Etidio y solución tampón de 1X TBE, las bandas sevisualizaron y revelaron por exposición a la luz ultravioleta.Posteriormente se procedió a tomar la foto del gel de corridamediante la revelación por exposición a luz ultravioleta, con unacámara fotográfica Foto Analyst Investigator (Fotodyne) con filtropara Bromuro de Etidio, la foto revelada del gel se imprimió en unaDigital Graphic Printer marca Sony. El tamaño del amplicón severificó mediante la comparación con un marcador de pesomolecular de 1Kb (Invitrogen).
• Autoradiografía (autoradiography) Técnica que detecta moléculas marcadas con radioactividad mediante la creación de una imagen sobre una película fotográfica.
Autoradiografía de hibridizaciónSouthern realizada con ADN de plantas de maíz obtenidas por cultivo de teji
Mutaciones
Alteración en la secuencia del ADN de un individuo que se transmite por herencia.
Mu
taci
on
es
Tipo de célula GerminalSomática
Genoma nuclearGenoma mitocondrial
Secuencia no codificante
Secuencia codificanteRegión estructuralRegión reguladora
MagnitudAnomalías cromosómicas
Mutaciones medianas: secuencias repetidas
Mutaciones pequeñas o puntuales
MecanismoEspontáneas
Inducidas por mutágenos externos
Mutaciones
Alteración en la secuencia del ADN de un individuo que se transmite por herencia.
Mu
taci
on
es
Tipo de célula GerminalSomática
Genoma nuclearGenoma mitocondrial
Secuencia no codificante
Secuencia codificanteRegión estructuralRegión reguladora
MagnitudAnomalías cromosómicas
Mutaciones medianas: secuencias repetidas
Mutaciones pequeñas o puntuales
MecanismoEspontáneas
Inducidas por mutágenos externos
Secuencia de acontecimientos de la enfermedad genética
Ej: mutación en un único gen, que afecta a una sola proteína
ARNm alteradoHerencia Expresión
Proteína anómalaenzima
receptor
transportador
hormona
colágeno
factor de transcripción
factor de coagulación
etc.
Función incorrecta
Alteración de:
- estructura
- capacidad de unión
- localización celular
- estabilidad
- concentración
- etc.
Enfermedad
Síntomas Clínicos
Gen normal
Gen mutante
Mutación
Estrategia de Diagnóstico Genético
La patología:
1) ¿Está asociada a una alteración cromosómica?
2) ¿Presenta herencia mendeliana?
3) ¿Locus localizado?
4) ¿Gen identificado?
5) ¿Muchos alelos mutados?
5) ¿Un alelo prevalente?
NoSi
Diagnóstico Citogenético No
Estudios de asociación y factores
de riesgo
Si
Diagnóstico por patrón de segregación
NoSi
SiDiagnóstico indirecto con
marcadores
No
Diagnóstico indirecto con marcadores
Diagnóstico Directo
Estrategia de Diagnóstico Genético
La patología:
1) ¿Está asociada a una alteración cromosómica?
2) ¿Presenta herencia mendeliana?
3) ¿Locus localizado?
4) ¿Gen identificado?
5) ¿Un alelo prevalente?
No
Si
Si
Si
Diagnóstico Directo
Diagnóstico Directo
• Máximo nivel de precisión en el diagnóstico:
Secuenciación del locus mutado (inviable su generalización)
• Generalmente el diagnóstico directo de una mutación se realiza mediante el estudio de:
Cambios en la estructura primaria del ADN (secuencia).Variaciones de tamaño; pérdida o ganancia de sitios de restricción.
Variaciones en sus propiedades físico-químicas.Alteración de su movilidad electroforética o sus propiedades de apareamiento.
Cambios en los productos génicos.ARNm inestables o de tamaño distinto. Proteínas truncadas.
Herramientas para la detección de mutaciones
Enzimas de Restricción
Técnicas de separación electroforética de ác. nucleicos
Hibridación de ácidos nucleicos
Amplificación enzimática del ADN (PCR)
Herramientas para la detección de mutaciones
Enzimas de Restricción
Técnicas de separación electroforética de ác. nucleicos
Hibridación de ácidos nucleicos
Amplificación enzimática del ADN (PCR)
Enzimas de Restricción
ALTA ESPECIFICIDAD: reconocen secuencias cortas de ADN doble hebra y cortan ambas cadenas.
Sitio de restricción: secuencia de reconocimiento.
Clasificación:
3 subunidades que reconoce, metila y restringe (corta). El corte ocurre al azar lejos del sitio de reconocimiento.
1 subunidad que reconoce y corta. El corte ocurre en el sitio de restricción o adyacente. Interés en ingeniería genética y análisis de ADN.
Tipo I
Tipo II
2 subunidades y cortan el ADN a 25 pb del sitio de reconocimiento.
Tipo III
Eco RIEscherichia coli
Cepa RY13
1ª enzima descubierta
Papel biológico de las ER en bacterias
Acción de las ER Tipo II
Sitio de restricción Lugar de reconocimiento e hidrólisis del ADN
Secuencia palindrómica de 4-8 pb
Dos tipos de cortes:
romos y cohesivos
RFLP: Polimorfismo del largo de los fragmentos de restricción
Variante usando PCR
RFLP en Análisis Genético Familiar
Mutaciones puntuales asociadas a Trombofilia
• La enfermedad tromboembólica venosa es un problema médico mayorpor su alta frecuencia, importante mortalidad y gran morbilidad.
• El abordaje clínico-terapeútico más racional para disminuir lamorbimortalidad es la prevención.
• Es esencial la identificación de pacientes con riesgo aumentado dedesarrollar trombosis.
Grupo 1: Deficiencias hereditarias de factores inhibidores de la coag.
Pobl. gral. Pacientes Tipo de mutación
Def. Proteína C 0,2-0,5% 2-5% Heterogénea (>160)Def. Proteína S 0,1% 2-5% Heterogénea (>69)Def. Antitrombina <0,1% 1-2% Heterogénea (>79)
Grupo 2: Desórdenes hereditarios asociados a un aumento del nivel de factores de la coagulación
Pobl. gral. Pacientes Tipo de mutación
FV Leiden 1-5% 20-60% PuntualFII 20210A 1-3% 10-15% Puntual
niveles FVIII, IX y XI niveles Lipoproteína A
Otros:Hiperhomocisteinemia - MTHFR C677TDeficiencia plasminógeno
Principales condiciones protrombóticas hereditarias
Mutación de Leiden en Factor V
• RPCA: respuesta anticoagulante pobre del plasma a la proteína C.
• Causa de más del 90% de los casos de resistencia a PCA.
Extracción de ADN a partir de sangre periférica
Amplificación por PCR de la región codificante
del sitio de clivaje para PCA
Digestión del producto de PCR con enzima de restricción Mnl I
Electroforesis en gel de agarosa
Exón 10 Intrón 10
• La transición de G a A en laposición 1691 está asociada a lapérdida de uno de los sitios Mnl I.
Producto PCR: 147 pb
Diagnóstico Molecular de mutación de Leiden
Alelo normal
Alelo mutado
Gel:
N/N M/M N/M
122 pb
85 pb
37 pb
25 pb
• La transición de G a A en laposición 1691 está asociada ala pérdida de uno de los sitiosMnl I.
Diagnóstico Molecular de mutación de Leiden
25 122
25 37 85
PM 1 2 3 4 5 6 7 M C- C+
Mutación 20210A en Factor II
• Mutación puntual: G por A en la posición 20210 de la 3´-UTR
Niveles incrementados de protrombina
plasmática funcional
• Prevalencia en población gral.: 1-3%
• Se detecta en el 10-15% de los pacientes con trombofilia
• Heterocigotas: riesgo incrementado 3-4 veces de sufrir TV.
Mutación 20210A en Factor II
• Mutación puntual: G por A en la posición 20210 de la 3´-UTR
Niveles incrementados de protrombina
plasmática funcional
Diagnóstico Molecular de mutación de 20210A
Extracción de ADN a partir de sangre periférica
Amplificación por PCR de la región 3´-UT
con primer mutado
Digestión del producto de PCR con enzima de restricción Hind III
Electroforesis en gel de agarosa
Producto PCR: 506 pb
Exón 14 3´-UT
---------TTCGAA----
---------AAGCTT----
---------CTCGAA---
---------GAGCTT---
Mutado
Normal
Gel:
406 pb
Alelo normal
Alelo mutado
N/N M/M N/M
383 pb
23 pb
• La transición de G a A en laposición 20210 está asociadaa la aparición de un sitio HindIII.
Diagnóstico Molecular de mutación de 20210A
100 383 23
100 406
Deficiencias hereditarias de inhibidores de la coagulación
• Deficiencia de proteína C, proteína S y antitrombina III.
• Prevalencia: <1% de la población general.
• Juntos representan el 5-10% de las alteraciones genéticas
encontradas en pacientes con trombosis venosa.
• Asociadas a un mayor riesgo de sufrir trombosis, manifestándose
como púrpura fulminante en neonatales homocigotas con deficienciacompleta.
Proteína C: > 160 mutaciones
Antitrombina: > 79 mutaciones
Proteína S: > 69 mutaciones
• Deficiencias difíciles de diagnosticar a nivel molecular
Trombosis venosa como enfermedad multifactorial
• En muchos pacientes se identifican más de un factor de riesgo genético y/o adquirido.
• La combinación de factores genéticos con ambientales ejerce un efecto aditivo sobre el riesgo a desarrollar trombosis.
• Condiciones trombofílicas ambientales o adquiridas:
- inmovilidad - estado post operatorio
- cáncer - uso de anticonceptivos orales
- tabaquismo - embarazo
- obesidad - terapia estrogénica
- síndrome antifosfolipídico
Importancia del diagnóstico de mutaciones asociadas a trombofilia
• Determinar causa del evento trombótico en el paciente.
• Detectar población de riesgo: medicina preventiva.
• ¿A quién se debe realizar el estudio?:
- Trombosis venosa en jóvenes < de 45 años
- Eventos trombóticos reiterados
- Pérdida de embarazo recurrente
- Previo a cirugía mayor, embarazo, anticonceptivos orales o
terapia estrogénica con historia familiar o personal de trombosis
- Familiar portador.
La trombosis venosa debe ser encarada como una
enfermedad crónica, poligénica, donde la ocurrencia
de eventos trombóticos es el resultado de la
interacción de causas genéticas y adquiridas.
DIAGNÓSTICO MOLECULAR EN EL FUTURO
MAPAS DE RESTRICCIÓN
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
•son enzimas que cortan los enlaces fosfodiester del material genético a partir de una secuencia que reconocen.
Las mismas permiten cortar DNA de hebra doble, donde reconocen secuencias palindrómicas
Tipos de enzimas de restricción
Sistemas tipo I
Una sola enzima (multimérica que posee 3
subunidades) reconoce la secuencia específica de
ADN, metila y restringe. Pero la restricción no ocurre
en el sitio de reconocimiento, sino que es al azar y en
sitios distantes al de reconocimiento.
Sistemas tipo II
Enzimas diferentes realizan la restricción y modificación.
La restricción ocurre en el sitio de reconocimiento ó
adyacente. Estas enzimas tipo II son las utilizadas en
genética molecular puesto que permiten romper el ADN
en sitios específicos, y así, recuperar secuencias conocidas
Sistemas tipo III
Es similar al sistema tipo I, utilizan una enzima
oligomérica que realiza todas las actividades
enzimáticas, y rompen el DNA 25-27 bp, más allá del sitio de reconocimiento.
Ejemplos de enzimas de restricción tipo II
Mapa de restricción
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