pirosekuentziazioa aurkezpena
Post on 03-Aug-2015
102 Views
Preview:
TRANSCRIPT
Pirosekuentziazioa
Xabier Arratibel, Bingen Gutierrez, Ines Martin eta Garazi Serna
Oinarriak
Pirosekuentziazioa luziferasa entzimak ATP gastatuz igorriko duen argi ikusgarriaren neurketan onarritzen da.
Argi kantitatea sekuentziako nukleotido kopuruarekiko proportzionala da.
DNA erauzi PCR-a burutu
◦ Mix-a Hasle biotinizatua
(Bisulfitoarekin tratatu metilazioak aztertzen bagaude) Desnaturalizatu
◦ NaOH Biotinadun harizpiak harrapatu
◦ Hutsezko ponpa◦ Estreptabidinari batu
Prozedura
Pirosekuentziadorea◦ 9 putzu daude dispentsadorean
Entzimen mixa, substratuen mixa, A, C, G eta T
◦ Nukleotido desberdinak ordenean sartzen dira plakan
(guk sartzen diogu sekuentzia, gure kasuan)
◦ Harizpiarekin elkartzean PPi askatu
◦ ATP sulfurilasa PPi-ak ATP bihurtzeko (Adenosina 5’ fosfosulfatoaren laguntzaz)
◦ Luziferasa ATP erabiliz, luminiszentzia eragin Luziferina sustratu Oxiluziferina
◦ Apirasa Erabili ez diren nukleotidoak degradatu
◦ Argi izpiak neurtu eta informazioa batu
http://www.labtube.tv/channel.aspx?v=137486&u=QIAGEN
http://www.qiagen.com/knowledge-and-support/videos-and-virtual-demos/videos/pyrosequencing%20cascade%20reaction/
Bisulfitoaren bidezko pirosekuentziazioa
Prozedura:
•DNA erauzi.
•Bisulfitoarekin tratatu
•Demagun hau dela gure sekuentzia 5´GCATCG…….CG………..CG……CG3’o Metilatua badago 5’ GTATCC…....CG……….CG…….CG3’o Ez badago metilatua 5’ GTATTG….….TG……….TG..….TG3’
•Metilazioa kuantifikatzeko teknika.
•PCR burutu.
•Lagina desnaturalizatzen da.
•Hasleak guztiz biotinilizatuak.
•DNA sekuentziak hibridatu hasle espezifikoarekin. Harizpi osagarria aipatutako entzimen presentzian eratuko da.
•Harizpi bakarreko anplikoiak harrapatu egiten dira estreptabidina bidez.
•Sekuentziazioa (3.pausua)
•25-30bp bitarteko sekuentziak
•Pirograma Kontrolak:
•Kontrol negatiboa
Emaitzen interpretazioa SNP
Osasuntsua den batekiko alderatuz nukleotido aldaerak ikusi
Emaitzen interpretazioa metilazioa ikusteko
Bisulfitoaren eraginez CG ak T bihurtu metilatuta ez badaude.
Portzentaiak metilazio maila adierazten du.
top related