mineralización de lignina de paja de trigo ( 14 c-mwl) por petriellidium fusoideum: aspectos de su...
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Mineralización de Lignina de Paja de Trigo (14C-MWL) por
Petriellidium fusoideum: Aspectos de su Sistema
Ligninolítico.
Influencia de la relación C/N y la temperatura sobre la degradación de LKP
18,54 9,51
Klason totalTemperatura ºC
Degradación de LKP (%)
Relación C/N LSA LAPLignina de Lignina
1,3 4,85 3,33 4,37 4,8828ºC
13 8,75 7,78
1,3 6,88 1,55 6,44 6,4437ºC
13 6,47 4,01 0 0
18,54 9,51
Tasa acumulativa de 14CO2 tras 30 días de incubación
0
5
10
15
20
25
30
35
Tas
a ac
umul
ativ
a de
14C
O2 (
%)
DHP-O14CH3 DHP-anillo-14CDHP-14C MWL-14C de paja de trigo
0
5
10
15
20
25
0 2 4 6 8 10 12
Días
0
20
40
60
80
Crecimiento de P. fusoideum y mineralización de 14C-MWL de paja de trigo.
Glu
cosa
(m
g / m
l)
Pes
o se
co d
el m
icel
io (
mg)
Rad
ioac
tivi
dad
x 10
3 (dp
m)
Perfil de elución de la 14C-MWL de paja de trigo en Sephadex G-50 tras 30 días de
incubación con P. fusoideum.
0
200
400
600
800
Ra
dio
act
ivid
ad (
dpm
)
1
Coef. de partición (Kav)
0 0.2 0.4 0.6 0.8
Problema
Control
12.4 kDa 6.5 kDa 1.64 kDa
Solubilidad de diferentes ligninas marcadas con 14C y su relación con la mineralización en el
medio optimo de ligninolisis.Sustratosmarcados
Radiactividad total(dpm)
Solubilidad iniciala pH 4.5
Solubilidad iniciala pH 2
MWL –14C de trigo 134.480 73.0 % 70.0 %
DHP-14C 238.000 31.3 % 23.0 %
DHP-14C-anillo 78.000 22.5 % 19.7 %
DHP-O14CH3 110.615 13.5 % 7.8 %
0
5
10
15
20
25
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Días
Ra
dio
act
ivid
ad
x 1
03
(dp
m)
318000 dpm
221081 dpm
0
1
2
3
4
5
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Días
Ra
dio
act
ivid
ad
x 1
03
(dp
m)
147000 dpm
200000 dpm
22300
11260
73 %
Actividades extracelulares producidas por P. fusoideum.
Enzimas ligninolíticasSobrenadante
simple (mU.ml-1)
Sobrenadanteconcentrado 10x
(mU.ml-1)
Peroxidasas (LiP, MnP) - -
Fenoloxidasas (lacasas) 1,49 17,75
Oxidasas (AAO, CQOR,glucosaoxidasa)
--
Catalasa - -
Reducción del citocromo c - -
1.49 17.75
Evolución de la actividad lacasa durante 30 días de cultivo
0
0.4
0.8
1.2
1.6
0 5 10 15 20 25 30
Días
mU
ml-1
Zimograma con ABTS de la lacasa
80.097.4
45.0
66.0
116.0
29.0
kDa A B C
Inductores de la actividad lacasa
Alcohol bencílico 0,8 mM
Alcohol verátrico 6 mM
LKP 0,1 %
Xilano 1 %
Xilidina 10 y 300 M
Mn 2+ 20 M
0
10
20
30
0 2 4 6 8 10
Días
Rad
ioac
tivid
ad x
103
(dp
m)
Con tioglicólico
Sin tioglicólico
Inhibición de la lacasa y su efecto sobre la mineralización de MWL-14C de paja de trigo
0
30
60
90
120
150
0 2 4 6 8 10
Días
mU
ml-1
x 1
0 -2
Con tioglicólico
Sin tioglicólico
Detección de .OH en cultivos del hongo
• Enoki y col., (1989).
Sustrato diana: ácido 2-ceto.tiometilbutírico (KTBA).
Producto final: etileno.
• Babs y Gale (1987).
Sustrato diana: dimetil sulfóxido (DMSO).
Producto final: ácido metil sulfínico.
0
5
10
15
20
25
0 2 4 6 8 10
Días
Rad
ioac
tivid
ad x
10
3 (dp
m)
0
4
8
12
16
20
Etil
eno
(ppm
)
Generación de radical hidroxilo (.OH) en los cultivos del hongo con 14C-MWL
Mineralización de MWL-14C de paja de trigo en presencia de secuestradores de .OH
Benzoato de sodio 24,66
Catecol 23,32
Tiourea 31,19
Secuestrador Inhibición de la mineralización (%)
Rad
ioac
tivid
ad x
103
(dpm
)
Sustancia de bajo peso molecular
0
0.1
0.2
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
Coefic. de partición (Kav)
Abs
(28
0 nm
)
0
0.1
0.2
0.3
0 2 4 6 8 10
Días
Abs
(28
0 nm
)
Etil
eno
(ppm
)
0
5
10
15
20
25
Características del sistema ligninolítico de P. fusoideum.
• Una actividad lacasa como única enzima
relacionado con la degradación de la lignina.
• Radicales .OH involucrados en la mineralización.
• Una sustancia de bajo peso molecular (1.6
kDa, Fe++ = 0,1%, libre de proteínas)
Ensayo in vitro:
• KTBA (3 mM).
• Tampón acetato, pH 4,5
• Oxígeno.
• Ácido ascórbico (1 mM).
• Sustancia de bajo peso molecular (1mg/ml).
• Lacasa de Petriellidium fusoideum (1,62 mU/ml).
1er Sistema:
KTBA (3 mM)
Tampón acetato pH 4.5
Oxígeno
Ácido ascórbico (1 mM)
LMW-S (1 mg / mL)
Lacasa de P. fusoideum (1.62 mU / mL)
0
50
100
150
200
250
Eti
leno
(pp
m)
1º ensayo 2º ensayo 3ºensayo 4º ensayo 5º ensayo 6º ensayo
1er Sistema:
KTBA (3 mM)
Tampón acetato pH 4.5
Oxígeno
Ácido ascórbico (1 mM)
LMW-S (1 mg / mL)
Lacasa de P. fusoideum (1.62 mU / mL)
1er Sistema:
KTBA (3 mM)
Tampón acetato pH 4.5
Oxígeno
Ácido ascórbico (1 mM)
LMW-S (1 mg / mL)
Lacasa de P. fusoideum (1.62 mU / mL)
1er Sistema:
KTBA (3 mM)
Tampón acetato pH 4.5
Oxígeno
Ácido ascórbico (1 mM)
LMW-S (1 mg / mL)
Lacasa de P. fusoideum (1.62 mU / mL)
KTBA (3 mM)
Tampón acetato pH 4.5
Oxígeno
Ácido ascórbico (1 mM)
LMW-S (1 mg / mL)
Lacasa de P. fusoideum (1.62 mU / mL)
Scavengers:
Benzoato sódico (10 mM)
Tiourea (10 mM)
Catalasa (6 U)
Nitrógeno
Scavengers:
Benzoato sódico (10 mM)
Tiourea (10 mM)
Catalasa (6 U)
Nitrógeno
Scavengers:
Benzoato sódico (10 mM)
Tiourea (10 mM)
Catalasa (6 U)
Nitrógeno
Scavengers:
Benzoato sódico (10 mM)
Tiourea (10 mM)
Catalasa (6 U)
Nitrógeno
Scavengers:
Benzoato sódico (10 mM)
Tiourea (10 mM)
Catalasa (6 U)
Nitrógeno
Q2-
Q.- Q
Lacasa oxidada
Lacasa reducida
H2O
O2
O2 O2.- H2O2
Sustancia Fe3+
Sustancia Fe2+
M I C E L I O
Lacasa
Poder reductor
.OH
KTBA
H2O
ETILENO
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