Mineralización de Lignina de Paja de Trigo (14C-MWL) por

Petriellidium fusoideum: Aspectos de su Sistema

Ligninolítico.

Influencia de la relación C/N y la temperatura sobre la degradación de LKP

18,54 9,51

Klason totalTemperatura ºC

Degradación de LKP (%)

Relación C/N LSA LAPLignina de Lignina

1,3 4,85 3,33 4,37 4,8828ºC

13 8,75 7,78

1,3 6,88 1,55 6,44 6,4437ºC

13 6,47 4,01 0 0

18,54 9,51

Tasa acumulativa de 14CO2 tras 30 días de incubación

0

5

10

15

20

25

30

35

Tas

a ac

umul

ativ

a de

14C

O2 (

%)

DHP-O14CH3 DHP-anillo-14CDHP-14C MWL-14C de paja de trigo

0

5

10

15

20

25

0 2 4 6 8 10 12

Días

0

20

40

60

80

Crecimiento de P. fusoideum y mineralización de 14C-MWL de paja de trigo.

Glu

cosa

(m

g / m

l)

Pes

o se

co d

el m

icel

io (

mg)

Rad

ioac

tivi

dad

x 10

3 (dp

m)

Perfil de elución de la 14C-MWL de paja de trigo en Sephadex G-50 tras 30 días de

incubación con P. fusoideum.

0

200

400

600

800

Ra

dio

act

ivid

ad (

dpm

)

1

Coef. de partición (Kav)

0 0.2 0.4 0.6 0.8

Problema

Control

12.4 kDa 6.5 kDa 1.64 kDa

Solubilidad de diferentes ligninas marcadas con 14C y su relación con la mineralización en el

medio optimo de ligninolisis.Sustratosmarcados

Radiactividad total(dpm)

Solubilidad iniciala pH 4.5

Solubilidad iniciala pH 2

MWL –14C de trigo 134.480 73.0 % 70.0 %

DHP-14C 238.000 31.3 % 23.0 %

DHP-14C-anillo 78.000 22.5 % 19.7 %

DHP-O14CH3 110.615 13.5 % 7.8 %

0

5

10

15

20

25

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Días

Ra

dio

act

ivid

ad

x 1

03

(dp

m)

318000 dpm

221081 dpm

0

1

2

3

4

5

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Días

Ra

dio

act

ivid

ad

x 1

03

(dp

m)

147000 dpm

200000 dpm

22300

11260

73 %

Actividades extracelulares producidas por P. fusoideum.

Enzimas ligninolíticasSobrenadante

simple (mU.ml-1)

Sobrenadanteconcentrado 10x

(mU.ml-1)

Peroxidasas (LiP, MnP) - -

Fenoloxidasas (lacasas) 1,49 17,75

Oxidasas (AAO, CQOR,glucosaoxidasa)

--

Catalasa - -

Reducción del citocromo c - -

1.49 17.75

Evolución de la actividad lacasa durante 30 días de cultivo

0

0.4

0.8

1.2

1.6

0 5 10 15 20 25 30

Días

mU

ml-1

Zimograma con ABTS de la lacasa

80.097.4

45.0

66.0

116.0

29.0

kDa A B C

Inductores de la actividad lacasa

Alcohol bencílico 0,8 mM

Alcohol verátrico 6 mM

LKP 0,1 %

Xilano 1 %

Xilidina 10 y 300 M

Mn 2+ 20 M

0

10

20

30

0 2 4 6 8 10

Días

Rad

ioac

tivid

ad x

103

(dp

m)

Con tioglicólico

Sin tioglicólico

Inhibición de la lacasa y su efecto sobre la mineralización de MWL-14C de paja de trigo

0

30

60

90

120

150

0 2 4 6 8 10

Días

mU

ml-1

x 1

0 -2

Con tioglicólico

Sin tioglicólico

Detección de .OH en cultivos del hongo

• Enoki y col., (1989).

Sustrato diana: ácido 2-ceto.tiometilbutírico (KTBA).

Producto final: etileno.

• Babs y Gale (1987).

Sustrato diana: dimetil sulfóxido (DMSO).

Producto final: ácido metil sulfínico.

0

5

10

15

20

25

0 2 4 6 8 10

Días

Rad

ioac

tivid

ad x

10

3 (dp

m)

0

4

8

12

16

20

Etil

eno

(ppm

)

Generación de radical hidroxilo (.OH) en los cultivos del hongo con 14C-MWL

Mineralización de MWL-14C de paja de trigo en presencia de secuestradores de .OH

Benzoato de sodio 24,66

Catecol 23,32

Tiourea 31,19

Secuestrador Inhibición de la mineralización (%)

Rad

ioac

tivid

ad x

103

(dpm

)

Sustancia de bajo peso molecular

0

0.1

0.2

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

Coefic. de partición (Kav)

Abs

(28

0 nm

)

0

0.1

0.2

0.3

0 2 4 6 8 10

Días

Abs

(28

0 nm

)

Etil

eno

(ppm

)

0

5

10

15

20

25

Características del sistema ligninolítico de P. fusoideum.

• Una actividad lacasa como única enzima

relacionado con la degradación de la lignina.

• Radicales .OH involucrados en la mineralización.

• Una sustancia de bajo peso molecular (1.6

kDa, Fe++ = 0,1%, libre de proteínas)

Ensayo in vitro:

• KTBA (3 mM).

• Tampón acetato, pH 4,5

• Oxígeno.

• Ácido ascórbico (1 mM).

• Sustancia de bajo peso molecular (1mg/ml).

• Lacasa de Petriellidium fusoideum (1,62 mU/ml).

1er Sistema:

KTBA (3 mM)

Tampón acetato pH 4.5

Oxígeno

Ácido ascórbico (1 mM)

LMW-S (1 mg / mL)

Lacasa de P. fusoideum (1.62 mU / mL)

0

50

100

150

200

250

Eti

leno

(pp

m)

1º ensayo 2º ensayo 3ºensayo 4º ensayo 5º ensayo 6º ensayo

1er Sistema:

KTBA (3 mM)

Tampón acetato pH 4.5

Oxígeno

Ácido ascórbico (1 mM)

LMW-S (1 mg / mL)

Lacasa de P. fusoideum (1.62 mU / mL)

1er Sistema:

KTBA (3 mM)

Tampón acetato pH 4.5

Oxígeno

Ácido ascórbico (1 mM)

LMW-S (1 mg / mL)

Lacasa de P. fusoideum (1.62 mU / mL)

1er Sistema:

KTBA (3 mM)

Tampón acetato pH 4.5

Oxígeno

Ácido ascórbico (1 mM)

LMW-S (1 mg / mL)

Lacasa de P. fusoideum (1.62 mU / mL)

KTBA (3 mM)

Tampón acetato pH 4.5

Oxígeno

Ácido ascórbico (1 mM)

LMW-S (1 mg / mL)

Lacasa de P. fusoideum (1.62 mU / mL)

Scavengers:

Benzoato sódico (10 mM)

Tiourea (10 mM)

Catalasa (6 U)

Nitrógeno

Scavengers:

Benzoato sódico (10 mM)

Tiourea (10 mM)

Catalasa (6 U)

Nitrógeno

Scavengers:

Benzoato sódico (10 mM)

Tiourea (10 mM)

Catalasa (6 U)

Nitrógeno

Scavengers:

Benzoato sódico (10 mM)

Tiourea (10 mM)

Catalasa (6 U)

Nitrógeno

Scavengers:

Benzoato sódico (10 mM)

Tiourea (10 mM)

Catalasa (6 U)

Nitrógeno

Q2-

Q.- Q

Lacasa oxidada

Lacasa reducida

H2O

O2

O2 O2.- H2O2

Sustancia Fe3+

Sustancia Fe2+

M I C E L I O

Lacasa

Poder reductor

.OH

KTBA

H2O

ETILENO