medios de cultivo metodos de siembra

MEDIOS DE CULTIVO

Conocer los medios de cultivo

Aplicar fisiología al cultivo de

microorganismos en el laboratorio

Identificar medio de cultivo –

método de siembra

Recordar técnicas de tinción en

microbiología

OBJETIVOS

Principios de cultivo microbiológico

Facilitar el crecimiento y el aislamiento de las bacterias presentes en una muestra clínica.

Determinar qué bacterias entre las que se desarrollan tienen más probabilidades de ser las

causantes de la infección y cuales son sus posibles contaminantes o colonizadores.

Obtener un desarrollo suficiente de las bacterias de importancia clínica para permitir su

identificación y su caracterización.

CULTIVO PURO CULTIVO MIXTO CULTIVO CONTAMINADO

DEFINICIÓN Sustrato sólido, líquido o semisólido que contiene todos los nutrientes necesarios para el crecimiento y desarrollo de los gérmenes.

Fuentes de energía, carbono, nitrógeno, fósforo, azufre y varios minerales.

pH

Luz

Temperatura

Esterilidad absoluta (salvo excepciones)

Recipientes adecuados

Es importante destacar que la transición exitosa de un microorganismo in vivo a un ambiente in vitro va a depender de:

Disponibilidad de nutrientes esenciales

Condiciones ambientales adecuadas

pH

Temperatura

Oxígeno y CO2

Presión

Luz

Clasificación de los medios de cultivo según

consistencia

SEMISÓLIDOS

LÍQUIDOS

SÓLIDOS

MEDIOS SÓLIDOS

semisólido

Caldo nutritivo

Caldos de enriquecimiento

Caldos revitalizadores

Clasificación de los medios de cultivo según

utilización

Selectivo y diferencial

Nutritivo

Enriquecimiento

Contienen nutrientes que favorecen el desarrollo de la mayoría de los microorganismos sin requerimientos especiales de cultivo.

No promueven el crecimiento de ningún agente en particular

MEDIOS NUTRITIVOS

MEDIOS DE ENRIQUECIMIENTO

Contienen nutrientes específicos requeridos para el crecimiento de

patógenos que pueden estar presentes solo o con otras especies

de bacterias en la muestra de un paciente

Se utilizan para favorecer el desarrollo de un patógeno

determinado a partir de una mezcla de microorganismos mediante el uso

de especificidad de nutrientes

En general, son medios líquidos

MEDIOS SELECTIVOS

Contienen uno o más agentes que inhiben el crecimiento de los microorganismos que no se quieren estudiar

Agentes inhibidores: colorantes, sales biliares, alcoholes, ácidos y antibióticos

MEDIOS DIFERENCIALES

Contienen un factor o factores que permite que las colonias de una especie o un tipo bacteriano exhiban ciertas características

metabólicas o de cultivo que puedan utilizarse para diferenciarlas de otras bacterias que crecen en el mismo agar

MEDIOS ESPECIALES

MEDIOS CROMÓGENOS

MEDIOS DE TRANSPORTE

MEDIOS DE CONSERVACIÓN

Sustancias cromogénicas:

- Son productos químicos de síntesis que son incoloros cuando se unen a sustratos naturales por enlaces que son hidrolizados por enzimas microbianas específicas.

- Cuando la enzima microbiana hidroliza el enlace, se libera el compuesto cromogénico, que adquiere un color intenso.

- Ejemplo: Cromo agar (agentes uropatógenos), se pone en evidencia la actividad enzimática de la B- glucoronidasa o B- galactosidasa de las bacterias formándose colonias de diferentes colonias según la especie.

- Identificación presuntiva, haciendo innecesaria la realización de pruebas bioquímicas.

Medios para bacterias no exigentes

- agar

- extracto de carne

- peptona

- NACL

- leche descremada (congelar cepas)

NORMATIVA ISP, entregar

CONTROL DE CALIDAD

El Control de Calidad en la preparación y evaluación de los medios de cultivo es considerado como una esencial y buena práctica de laboratorio, necesaria para mantener el nivel y la ejecución de cualquier técnica microbiológica.

Proceso continuo que se extiende desde las materias primas ; a través del productor hasta el producto final utilizado en los diferentes departamentos de análisis y diagnóstico microbiológico.

▪ Recuperación o supervivencia de los microorganismos de interés (Productividad) ▪ Inhibición o suspensión de los microorganismos no deseados. (Selectividad) ▪ Propiedades bioquímicas (diferenciales y diagnósticas) ▪ Propiedades físicas (por ejemplo, pH, Volumen) ▪ Sea estéril .... etc.

El Jefe inmediato responsable del área * Deberá analizar mensualmente los resultados de las pruebas realizadas por el responsable del departamento de control de calidad * Evaluará el cumplimiento de objetivos a través de los resultados

CRITERIOS DE EVALUACIÓN DE LA CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVOS PREPARADOS.

Se evalúa utilizando criterios objetivos del medio respecto a: La recuperación o supervivencia de los microorganismos de interés La inhibición o supresión de los microorganismos no deseados tiene que ser cuantitativa Los atributos ( por ejemplo: Propiedades físicas y bioquímicas) Rajadura del plato o envase Variaciones en el volumen del medio Hemólisis Cristales en el medio Presencia de burbujas Presencia de coágulos Cambio de color normal Contaminación Falla en la inhibición de microorganismos saprofitos Esterilidad

PRUEBAS FUNCIONAMIENTO Para evaluar cada lote de medio de cultivo que sea recibido en el laboratorio, se emplean cepas patrones (ATCC) de varios géneros y especies de acuerdo al medio de cultivo a analizar. El control del funcionamiento consistirá en comprobar:

capacidad del medio de recuperar un bajo número de los microorganismos más sensibles para los que ha sido preparado.

capacidad de inhibir un alto número de los microorganismos que deben ser inhibidos en caso de los medios selectivos y

diferenciar los microorganismos para los que ha sido diseñado en caso de los medios diferenciales.

RECONSTRUCCIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO

DESHIDRATADO

• Cumplir con las instrucciones de preparación del medio de cultivo indicado en la etiqueta del envase

• Cumplir con los procedimientos técnicos de fórmulas enviadas por el cliente

• Utilizar agua destilada de calidad

• Determinar el pH del M de C

• Esterilización del medio de cultivo

• Procedimiento escrito

• Control de esterilidad del Medio de Cultivo

AGAR INFUSION DE CARNE

MEDIO DE LOWENSTEIN JENSEN

AGAR SANGRE

DEFECTO

Apelmazamiento del Producto deshidratado

El valor de pH no coincide Con el indicado

ERRORES EN LA PREPARACIÓN

Apelmazamiento del producto deshidratado

El envase no fue cerrado correctamente después de su uso.

El envase permaneció abierto por largo rato. El producto sobrepasó la fecha de vencimiento.

El valor de pH no coincide con el indicado

• No fue empleada agua destilada• El medio fue sobrecalentado durante su preparación• El Ph no fue determinado correctamente• El medio estaba vencido.

Aparición de turbiedad o precipitados:

El medio preparado perdió agua por evaporación

El medio se calentó en exceso El medio no se calentó lo suficiente.

No fue empleada la cantidad del medio o suplemento recomendada.

El color del medio no coincide con el indicado:

El medio fue sobrecalentado durante su preparación.

El pH no fue ajustado correctamente.

El recipiente empleado estaba sucio.

Los azúcares contenidos en el medio se caramelizaron

El gel se obtiene más blando que lo característico para el medio:

No fue garantizada la disolución total del agar durante la preparación del medio. No fue empleada la cantidad del medio recomendada o se añadió agua en exceso.

El crecimiento de los microorganismos es pobre:

El medio fue sobrecalentado El valor del pH no fue ajustado correctamente. La adición de suplementos al medio se efectuó a excesiva temperatura. El medio no fue mezclado correctamente.

El crecimiento de los microorganismos es atípico:

Quedaron residuos de sustancias inhibidoras del crecimiento no deseables, en los recipientes donde se preparó o distribuyó el medio.

El medio de cultivo fue preparado de manera incorrecta.

El producto sobrepasa la fecha de vencimiento.

ES, POR LO TANTO, MUY IMPORTANTE QUE EL TECNÓLOGO MÉDICO SEA QUIEN SUPERVISE Y

CONTROLE TODOS LOS FACTORES NECESARIOS EN LA PREPARACIÓN Y CONSERVACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO, PARA ASÍ LOGRAR AISLAR

E IDENTIFICAR CON EXCELENCIA LOS DISTINTOS AGENTES

MICROBIANOS.

MÉTODOS DE SIEMBRA Y

AISLAMIENTO

VAMOS A CONTESTARNOS

ALGUNAS INTERROGANTES

¿Para qué sembramos?

¿dónde sembramos?

¿qué necesitamos para realizar una correcta siembra?

Microbiología, Prescott´s

Microbiología, Prescott´s

Los métodos de siembra se utilizan para inocular por distintos métodos sobre un medio de cultivo apropiado una muestra que contenga bacterias con el fin de reproducirlas para aumentar el número de individuos de la población y formar colonias en el caso de medios sólidos.

Siembra por aislamiento

I. Siembra con rastrillo

II. Siembra con asa de cultivo - Diseminación en superficie- Agotamiento en superficie- Tubos en superficie- Tubos en profundidad o picada

III. Siembra con tórula

Figura 12: Siembra con rastrilloManual de microbiología 2011, U. Mayor

Figura 13: Siembra de diseminación en superficieManual de microbiología 2011, U Mayor

Figura 14: Siembra semi-cuantitativa de agotamiento en superficie.

Manual de microbiología 2011, U Mayor

Figura 15: Siembra de tubo en superficie.

Manual de microbiología 2011, U Mayor

Figura 16: Siembra de tubo profundidad.

Manual de microbiología 2011, U Mayor

TINCIÓN DE GRAM

Pared celular bacteria gram positiva y gram negativa

Gram positiva Gram negativa

Gram negativa

de Braun

Gram positiva

1 minuto

1 minuto

30 segundos

15segundos

Decolorar con alcohol-acetona

Primera aproximación al posible diagnóstico

Técnicas rápidas y baratas

Diagnósticos rápidos y certeros

DIRECTOS

EXAMEN AL FRESCO MATERIA GENITAL

Secreción vaginal y/o uretral

Semen, secreción prostática

Orina de primer chorro

LEVADURAS

BACTERIAS

CLUE CELLS

LEUCOCITOS

TRICHOMONAS