lÍnea de investigaciÓn - enlinea3.uia.mxenlinea3.uia.mx/www/archivo/protocolo/microbiologÍa de...
Post on 20-Sep-2018
226 Views
Preview:
TRANSCRIPT
1
LÍNEA DE INVESTIGACIÓN
AMBIENTAL
PROYECTO
MICROBIOLOGÍA DE LOS PROCESOS DE REMOCIÓN DE CONTAMINANTES
2005-2008
RESPONSABLE
Dr. Rubén Moreno Terrazas Casildo
Participantes UIA
Quím. Carmen Doria Serrano Ing. Bioq. Lorena Pedraza Segura
M. en C. Margarita Hernández Esparza M. en C. Samuel Macías Bravo
2
ANTECEDENTES
Una gran variedad de industrias que llevan a cabo procesos como los
petroquímicos, de polimerización, de producción de pinturas, de barnices, de
elaboración de productos farmacéuticos, de extracción de aceites y grasas entre
otros, descargan una gran variedad de desechos orgánicos en sus efluentes
acuosos, gaseosos y sólidos; algunas sustancias son aromáticas y se consideran
peligrosas a la biota y a los seres humanos. Entre ellos están el fenol, el tolueno y
sus derivados. Otras sustancias como los aceites, las grasas y el metanol son
fácilmente biodegradables pero en altas concentraciones en los residuos
constituyen un problema de contaminación que debe resolverse (Chappe y col.,
1994; Fries y col., 1997; García Garcia y col. 2000; Rogers y Reardon 2000;
Fontoulakis y col. 2002; Jacobs y col., 2004; Sampedro y col., 2004).
Los problemas de contaminación han sido abordados a través de distintas
tecnologías en fase acuosa, gaseosa o sólida por medio de procesos
fisicoquímicos como la coagulación-floculación, precipitación, adsorción en
soportes especiales, oxidación, etc. Estos métodos pueden ser eficientes, pero
generalmente son costosos y/o requieren reactivos químicos para llevarse a cabo.
Otra forma de enfrentar estos problemas es por medio de un tratamiento
biológico, ya que los microorganismos en particular, tienen una gran diversidad y
flexibilidad metabólica para utilizar como fuente de carbono y energía los
contaminantes del medio ambiente mencionados (Collins y Daugilis, 1996;
Feitkenhauer y col., 2001; Kim y col. 2002; Komarkova y col. 2003).
Se han aislado e identificado diversos microorganismos que tienen la
capacidad de utilizar fenol como fuente de carbono y energía, algunos de ellos con
una alta capacidad para hacerlo; entre los microorganismos estudiados se
encuentran bacterias, levaduras y hongos tales como Pseudomonas sp., Bacillus
sterearothermophilus, Burkholderia sp. Geotrichum candidum, Aspergillus terreus,
3
Alcaligenes sp., Streptomyces sp. Rhodopseudomonas sp. Candida sp.y
Trichosporon sp., entre otros. Ya que los microorganismos que degradan tolueno
utilizan las mismas vías metabólicas que para el fenol, varios se han utilizado
también para degradar este contaminante.
Han sido diseñados tratamientos aerobios y anaerobios en aguas
residuales y en biofiltros para degradar metanol, algunas especies de
Pseudomonas y Sphingomonas, Candida boidinii, Hansenula polymorpha y
hongos celulolíticos han estado involucrados en esta biorremediación aerobia
(Ramírez-López y col., 2002; Pineda y col. 2004).
En cuanto a los triglicéridos se han desarrollado muchos trabajos para aislar
microorganismos con alta actividad de lipasa a partir de alimentos, de suelos
contaminados con aceites y grasas y de otros orígenes; algunos ejemplos son
Pseudomonas spp., Bacillus spp., Shewanella, Staphyloccoccus spp., Micrococcus
spp., Pantoea aglomerans, Rhizopus spp. entre otros (Chappe y col., 1994; Hita y
col., 1996)
Se ha reportado que la concentración óptima de fenol y de tolueno
para su degradación por bacterias es de de 50-100 mg/L. A concentraciones
mayores, su crecimiento se inhibe debido al efecto tóxico de estos compuestos,
aunque la capacidad para resistir estas sustancias, la forma y el tiempo que tarda
su degradación varía de un organismo a otro. (Hita y col., 1995; Collins y Daugilis,
1996; Feitkenhauer y col., 2001; Bandhyopadhyay y col. 2001; Kim y col. 2002;
Komarkova y col. 2003).
En la naturaleza los microorganismos se adaptan formando poblaciones
mixtas que interactúan en algunos casos para hacer más eficiente la utilización de
nutrimentos disponibles. Estudios recientes resaltan la importancia de entender la
funcionalidad de los microorganismos dentro de su comunidad, ya que muchas
veces diversas poblaciones no pueden mantener una estabilidad adecuada dentro
de su ecosistema de forma aislada. Por ello, al reconocer la diversidad y las
4
interacciones de grupos clave dentro de un sistema dado puede mejorar la
estabilidad del proceso (Jiang y col.,2004).
Por ejemplo, Jiang y col., (2004) han aislado, caracterizado e identificado
microorganismos relevantes dentro de una comunidad en gránulos aerobios
agregados que se utilizan en reactores por lote para degradar fenol. De estos
aislados, algunos tuvieron alta capacidad para degradar este contaminante,
mientras que otros tenían la habilidad para autoagregarse y formar los gránulos
aunque degradaban poco fenol; esto ha permitido proponer un modelo de
comunidad que haga más eficiente la remoción de esta sustancia.
Este mismo efecto se ha mencionado en consorcios que se presentan en
lugares contaminados con una mezcla de formaldehído y metanol o bien con
grasas y aceites (Fries y col., 1997; García Garcia y col. 2000; Rogers y Reardon
2000; Fontoulakis y col. 2002; Jacobs y col., 2004; Prado y col. 2004; Sampedro y
col., 2004).
Cuando se presenta un efecto adverso por la exposición a substancias
tóxicas es muy recomendable inmovilizar las células en hidrogeles poliméricos o
en soportes artificiales o naturales. Esta técnica aumenta la capacidad de
degradación por parte de la biomasa. Por ejemplo, diferentes especies de
Pseudomonas y Candida no toleran más de 1500 mg/L de fenol, aunque las
células toleran por periodos cortos concentraciones más elevadas cuando están
inmovilizadas. (Torres y col. 1998; Chung y col. 1998; Chen y col. 2002).
5
ORIGINALIDAD
Se espera aislar y caracterizar microorganismos de sustratos naturales no
reportados en la literatura y/o con alta capacidad de remoción de contaminantes
comunes en el aire y en el suelo. Normalmente estos microorganismos se
desarrollan dentro de un consorcio, por lo que no se sabe cuál es su papel como
degradadores en forma individual. De lo anterior surge la posibilidad de establecer
qué microorganismos tienen mayor y mejor capacidad de remover cada
contaminante, conociendo estas características se puede hacer una selección y
combinación ideal de microorganismos que tengan el rendimiento más adecuado
en la degradación de estos contaminantes.
6
OBJETIVOS
Objetivo general
Caracterizar por técnicas tradicionales y moleculares, microorganismos
aislados de medios naturales con alta capacidad para degradar sustancias que
contaminan el medio ambiente.
Objetivos específicos
Identificar, por técnicas tradicionales, microorganismos que metabolizan
fenol y triglicéridos aislados de medios naturales.
Adecuar técnicas de análisis molecular de los microorganismos, para
identificarlos a nivel de especie.
Caracterizar por técnicas tradicionales y moleculares, microorganismos
aislados de biofiltros con soportes naturales que degraden contaminantes
volátiles como tolueno, metanol y la mezcla de ambos.
Seleccionar entre los microorganismos aislados, los que tengan mayor
tolerancia a concentraciones crecientes de cada uno de los contaminantes.
Determinar la cinética de remoción de fenol, tolueno, metanol y triglicéridos
por parte de los microorganismos seleccionados en reactores por lote a
nivel laboratorio para establecer cuáles son los más eficientes.
7
METAS
Científicas
Disponer de un conjunto de bacterias, levaduras y mohos identificados por
métodos tradicionales y moleculares que degraden fenol, tolueno, metanol y
triglicéridos con una alta eficiencia, para la eventual aplicación en su remoción de
en agua y suelos contaminados.
Formación de recursos humanos
Aislamiento e identificación de microorganismos de los diferentes contaminantes 11 alumnos de las licenciaturas de Ingeniería Química y Tecnología de alimentos
de la Universidad Iberoamericana.
1 alumno de doctorado en Ciencias Biológicas por parte de la Universidad
Autónoma de Aguascalientes.
Selección de microorganismos y desarrollo de cinéticas 1 alumno de maestría en Ingeniería Química Universidad Iberoamericana
4 alumnos de las licenciaturas de Ingeniería Química y de Alimentos y de
Tecnología de Alimentos de la Universidad Iberoamericana
La formación de los alumnos de las licenciaturas de Ing Química y de
Alimentos será parte de su formación terminal en el Seminario de Opción
Terminal, los Laboratorios Experimentales, la Estancia Industrial y las Prácticas
Profesionales.
8
METODOLOGÍA Obtención del consorcio microbiano con capacidad para degradar fenol a partir de lodos activados Se tomarán muestras de los lodos del reactor aerobio de la planta de
tratamiento de aguas residuales de la UIA., se aclimatarán a fenol como única
fuente de carbono. Se utilizarán concentraciones crecientes de fenol hasta 1.5 g/L
con un medio mineral según la composición y condiciones reportadas por Jacobs y
col. (2004)
Se tomarán muestras comerciales de cecina de tres lugares diferentes de compra
que tengan en su superfiicie una capa de manteca de cerdo.
Una vez que los consorcio se desarrolle se procederá al aislamiento y
purificación utilizando los medios de cultivo apropiados.
Caracterización microbiológica
Cuantificación, aislamiento e identificación tradicional de microorganismos
La cuantificación, el aislamiento, la identificación y la conservación de los
diversos grupos microbianos que constituyan los consorcios, se realizará mediante
técnicas tradicionales. Las determinaciones anteriores se detallan a continuación:
A los microorganismos que se desarrollen en los medios con fenol se les
harán diluciones decimales en serie hasta 10-9. en agua peptonada estéril al 0.1%
y se sembrarán por extensión de superficie (Andrews y Hammack, 2003).
9
Bacterias Para la cuantificación y aislamiento de bacterias se utilizará agar soya
tripticaseina. Incubando a 37° C durante 5 días. Se realizará la cuenta de unidades
formadoras de colonias y se seleccionarán todas aquellas con morfología
diferente.
En los aislados seleccionados se observará su morfología celular, se
realizarán pruebas de tinción de Gram, catalasa, oxidasa y de
oxidación/fermentación de glucosa, así como el desarrollo en diferentes medios
selectivos.
Dependiendo del resultado de estas pruebas se seleccionarán los sistemas
de identificación de API (BioMeriux) que existen en el mercado para su
caracterización específica. La caracterización e identificación de las bacterias que
no se logren identificar con los sistemas API se realizará conforme a las
metodologías y claves compiladas en el manual de Bacteriología Sistemática de
Bergey (1992).
Levaduras y mohos
Su cuantificación se hará utilizando las mismas diluciones y la técnica que
para las bacterias: empleando placas de agar rosa de Bengala-dicloran-
cloranfenicol (aRBDC) (Difco) (Mislevic y col., 1992) y de agar extracto de malta
(aEM) acidificado a pH 3.7. A ambos medios de cultivo se adicionarán también los
contaminantes de prueba a las concentraciones ya indicadas (Difco). Las placas
se incubarán a 27°C durante diez días, se cuantificarán las ufc/ml de cada sustrato
(Mislevic y col., 1992), y se aislarán y purificarán las que presenten morfología
colonial diferente (Yarrow, 1998).
10
La identificación de las levaduras se hará de acuerdo al esquema de
Yarrow (1998) donde se observarán las características de: reproducción asexual y
sexual, morfología celular y colonial, pruebas fisiológicas y bioquímicas. Con estos
resultados se seguiran las claves y diagnosis de las monografías de Barnett y col,
(2000), Kurtzman y Fell (1998) y la base de datos de la colección CBS
(Centraalbureau voor Schimmelculture, 2004).
Caracterización molecular
Una vez realizada la identificación tradicional de los aislamientos se hará su
caracterización molecular mediante la secuenciación de regiones específicas. En
el caso de bacterias se amplificarán y secuenciarán regiones del gene 16S, y para
levaduras y mohos el dominio D1/D2 del gene 26S del ADNr, o diferentes
regiones ITS.
La extracción del ADN de los diferentes microorganismos se hará a partir de
un cultivo joven y se tomará una porción del cultivo.
Se probarán métodos de extracción y de amplificación de ADN reportados
en la literatura y kits comerciales disponibles en el mercado para elegir el más
adecuado a los microorganismos aislados. En el anexo 1 se mencionan algunas
metodologías iniciales que se probarán para los diferentes grupos de
microorganismos.
Para bacterias se amplificará la subunidad menor del gene 16S del ADNr
usando los primers universales P27f (5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’) y
P1495r (5’-CTA CGG CTA CCT TGT TAC GA-3’)
11
Los iniciadores universales que se utilizaran serán para levaduras y mohos
serán inicialmente el NL-1 (5’- GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG) y el NL-
4 (5’- GGT CCG TGT TTC AAG ACG G).
Se utilizará un equipo termociclador personal (Eppendorf) y se amplificarán
inicialmente conforme a lo reportado por Baggi y col. (2004) para bacterias y por
Libkind y col. (2003) para levaduras y mohos (anexo No. 1).
El ADN amplificado será purificado con el kit de purificación QIAquick
(QIAGEN) de acuerdo con las instrucciones del proveedor.
El marcaje y secuenciación de las dos hebras complementarias se realizará
con la técnica de Saenger et al. (1977), en un secuenciador automático (Abi-Prism
310, Perkin-Elmer).
La secuencia de datos se alineará visualmente con el programa BioEdit
Programm 7.1 Y se compararán las secuencias alineadas con las depositadas en
el GenBank con el Blast-Program. Todas las secuencias obtenidas se registrarán y
depositarán en el GenBank reportando el número de acceso (Altschul et al. 1997).
Obtención del consorcio microbiano a partir de soportes contenidos en biofiltros degradadores de contaminantes
A nivel de laboratorio, se dejará que se desarrolle el consorcio microbiano
presente en dos diferentes soportes húmedos, semillas de uva y olote. Contenidos
en un sistema de biofiltros tubulares de 1.0 L. de volumen, con alimentación de
gas con flujo descendente. El tiempo de incubación será fijo y permitirá el
desarrollo de los consorcios; cuando estos estén estables se tomará una muestra
de los soportes. Los biofiltros serán desarrollados en la Universidad Autónoma de
Aguascalientes.
12
Los biofiltros se trabajarán con alimentación gaseosa de metanol y tolueno
con cada uno de los soportes. La concentración del tolueno será de 1 ppm y la de
metanol de 10 ppm y la mezcla estará en la misma proporción.
El mecanismo para la obtención de cepas puras, así como la identificación
de los microorganismos por pruebas morfofisiológicas y moleculares se realizará
de igual manera que lo indicado anteriormente para las cepas degradadoras de
fenol.
Selección de cepas degradadoras de fenol
Los microorganismos aislados, purificados e identificados, se adaptarán a
desarrollarse en fenol en concentración inicial de adaptación de 1 g/L en un medio
mineral se utilizará un inóculo inicial ajustado a 2 de Macfarland en 10 ml de medio
de inoculación. Para la selección de cepas se utilizarán microorganismos aislados
del consorcio que tengan cuando menos un crecimiento de biomasa mayor a 106
UFC/ml de medio y una resistencia a 2 g/L de fenol.
Selección de cepas degradadoras de tolueno, metanol y triglicéridos
En cuanto a los microorganismos degradadores de tolueno y metanol, a
cada cepa aislada de los dos biofiltros y a las obtenidas para degradación de
triglicéridos se le realizarán las mismas pruebas que para fenol con el objeto de
determinar la capacidad de remover estos compuestos en una solución acuosa a
distintas concentraciones (0.5 a 1.5 g/L). Se elegirán los que tengan una mayor
eficiencia de degradación.
Se probará la capacidad lipolítica de los aislados del alimento adaptándolos
a una mezcla de trioleína como única fuente de carbono con un agente
tensoactivo (Tween 80). Se utilizarán concentraciones crecientes de este
13
triglicérido hasta 1.5 g/L en un medio mineral según la composición y condiciones
reportadas por Jacobs y col. (2004)
Los microorganismos seleccionados serán precultivados en el medio basal
anterior adicionados con la concentración más alta de los 2 diferentes
contaminantes (fenol, tolueno, metanol y triglicéridos) previamente a la realización
de la cinética.
Cinética de degradación de contaminantes
Métodos analíticos
La degradación de cada contaminante se medirá por cromatografía de
gases en un cromatógrafo VARIAN MODELO 3800 con detector de Ionización de
flama, la medición se hará a partir de la solución acuosa previamente filtrada en
una membrana de filtración de 0.2 µm con punta Luer de 0.2 µm (Agilent Tech.)
para jeringa, con l filtro resistente a solventes de PTFE 30/20. La cantidad de
muestra que se inyectará será de un microlitro. Con una columna capilar de 30m X
0.32 mm D.I. con 0.5 µm de película DB-WAX marca JW.
Las condiciones de trabajo del cromatógrafo serán:
Temperatura del Inyector 200°C
Temperatura del detector 200°C
Temperatura del horno columna
Inicial 60°C durante 1 min
Con 5°C/min de incremento de temperatura
Hasta una temperatura final de 150°C 1min
La concentración inicial de células será medida por densidad óptica a 600
nm y la concentración de células viables será realizada por cuenta en placa en
AST según la correlación de Rogers y Reardon (2000). La cantidad de inóculo se
14
determinará usando una relación inicial de sustrato a biomasa de 300 masa/masa
(Jiang y col. 2004).
Las cepas seleccionadas para la cinética de degradación de cada uno de
los contaminantes se trabajarán por duplicado. Se inocularán en matraces de 500
mL con un medio mineral según la composición reportada por Jacobs y col.
(2004). Se usarán condiciones aerobias con agitación rotatoria a temperatura
ambiente y se dejarán hasta que el contaminante desaparezca.
La concentración inicial de sustrato será calculada tomando como base la
concentración máxima a la que se desarrollen los microorganismos en el proceso
de selección.
Para comprobar que la inmovilización en hidrogeles poliméricos favorece la
degradación se llevarán a cabo las cinéticas con microorganismos suspendidos e
inmovilizados siguiendo la técnica reportada por Hernández y col. (en prensa).
Una vez que se obtengan los datos de las diferentes cinéticas de
degradación se desarrollará el modelo matemático
Para cada contaminante se hará un diseño experimental del número de
cepas seleccionadas contra microorganismos inmovilizados y suspendidos
teniendo como variable de respuesta la degradación del contaminante y el
incremento en el número de ufc/ml.
15
BIBLIOGRAFÍA 1. Andrews W.H. y T. S. Hammack 2003 Food Sampling and Preparation of Sample
Homogenate in: Bacteriological Analytical Manual Online Food and Drugs Administration.
Eds. http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam.
2. Altschul, S. F., Madden, T. L., Schäffer, A. A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. Y y Lipman,
D. J. 1997. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein data base search
programs. Nucleic Acid Research 25: 3389-3402.
3. Baggi, G., L., Cavalca, P., Francia y M. Zangrossi 2004. Chlorophenol renoval from soil
suspensions: effects of a specialised microbial inoculum and a degradable analogue.
Biodegradation 15:153-160.
4. Bandhyopadhyay, K., D., Das, P., Bhattacharyya y B., Maiti 2001. reaction engineering
studies on biodegradation of phenol by Pseudomonas putida MTCC 1194 immobilized on
calcium alginate biochemical Engineering Journal 8:179-186.
5. Barnett, J. A. Payne, R. W. y Yarrow, D. 2000. Yeasts: Characteristics and Identifications.
3a. edn. Cambridge University Press, Cambridge. pp 1139.
6. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. 1993. Vol 2. Williams and Wilkins, Baltimore.
pp 1043-1093.
7. C.B.S. Centraalbureau voor Schimmelculture, 2004. Base de datos para la identificación de
levaduras Holanda. Página web. http://www.cbs.knaw.nl/.
8. Chappe, P., A., Mourey y J., Manem 1994. Microflora of Aerobic activated sludge
acclimated to high lipid levels. Revue des sciences de l’eau 7(4): 395-404.
9. Chen, K., Y., Lin, W. Chen y Y. Liu 2002. Degradation of phenol by PAA-immobilized
Candida tropicalis. Enzyme and Microbial Technology 31:490-497.
10. Chung, T., Loh, K. y Goh S. 1998. Development of cellulose acetate membranes for
bacteria immobilization to remove phenol. J of Applied Polymer Science 68:1677-1688.
11. Feitkenhauer, H. S., Schnicke, R. Müller y H. Märkl 2001. Determination of the kinetic
parameters of the phenol-degrading thermophile Bacillus themoleovorans sp. A2. Applied
Microbiology and Biotechnology 57:744-750.
12. Fries, M., L., Forney y J., Tiedje 1997. Phenol and Toluene degrading microbial populations
from an aquifer in which successful trichloroethene cometabolism occurred. Applied and
Environmental Microbiology 63 (4): 1523-1530.
13. Fountoulakis, M., N.. Dokianakis, M. Kornaros, G., Aggelis y G. Lyberatos 2002. Renoval
of phenolics in olive mill wastewater using the white-rot fungus Pleurotus ostreatus. Water
Research 36: 4735-4744.
16
14. García García, I., P., Jiménez Peña, J., Bonilla Venceslada, A., Martín Martín, M. Martín
Santos y E., Ramos Gómez 2000. Removal of phenol compounds from olive oil mill
wastewater using Phanerochaete chrysosporium, Aspergillus niger, Aspergillus terreus and
Geotrichum candidum. Process Biochemistry 35: 751-758.
15. Hita, C., E., Parlanti, P., Jambu, J., Jofre y A., Ambles 1996. Triglyceride degradation in
soil. Organic Geochemistry 25: 19-28.
16. Jacobs, P., I., De Bo, K., Demeestere, W., Verstraete, H., van Langenhove. 2004. Toluene
removal from waste air using a flat composite membrana bioreactor. Biotechnology and
bioengineering 85(1): 68-77.
17. Kaszycki P. y H., Koloczek 2000. Formaldehyde and metanol biodegradation with the
methylotrophic yeast Hansenula polymorpha in model wastewater system. Microbiological
Research 154(4):289-296.
18. Kim, J., K. Oh, S. Lee, S. Kim y S. Hong 2002. Biodegradation of phenol and chlorophenols
with defined mixed culture in shake-flasks and a packed bed reactor. Process Biochemistry:
1367-1373.
19. Kurtzman, C. P. y Fell J. W. Eds. 1998. The Yeasts, A Taxonomic Study, 4a edn. Elsevier,
Amsterdam pp 1055.
20. Kurtzman C. y Robnett C. 1998. Identification and phylogeny of ascomycetous yeasts from
analysis of nuclear large subunit (26S) ribosomal DNA partial sequences. Antonie van
Leewenhoek 73: 331-371.
21. Libkind, D., S., Brizzio, A. Ruffini, M., Gadanho M. van Broock y P. Sampaio 2003.
Molecular characterization of carotenogenic yeasts from aquatic environments in
Patagonia, Argentina. Antonie van Leewenhoek 84:313-322.
22. Mislevic, P. B., L. R., Beuchat, y M. A., Cousin 1992. Yeasts and Molds. En: Vanderzant C.
y Splittstoesser D. F. Eds. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of
Foods. American Public Health Association. pp. 239-249.
23. Pineda, R., J. Alba, F., Thalasso y T. Ponce Loyola 2004. Microbial characterization of
organic carrier colonization during a model biofiltration experiment. Letters in Applied
Microbiology 38:522-526.
24. Prado O., M., Veiga y C., Kennes 2004. biofiltration of waste gases containing a mixture of
formaldehyde and metanol. Applied Microbiology and Biotechnology 65:235-242.
25. Rogers, J. y K. Reardon 2000. Modeling susbstrate interactions during the biodegradation
of mixtures of toluene and phenol by Burkholderia species JS150. Biotechnology and
Bioengineering 70 (4):428-434.
26. Sampedro, I., C. Romero, J. Ocampo, M., Brenes e I. García 2004. Removal of monomeric
phenols in dry mill olive residue by saprobic fungi. Journal of Agricultural and Food
Chemistry 52: 4487-4492.
17
27. Sanger, F., Nicklen, S. y Coulson A. 1977. DNA sequencing with chain-terminating
inhibitors. Proceedings of Natural Academy of Science 74: 5463-5467.
28. Torres, L., A., Sánchez de la Vega, N. Beltrán y B. Jiménez 1998. Production and
characterization of a Ca-alginate biocatalyst for renoval of phenol and chlorophenols from
wastewaters. Process Biochemistry 33:625-634.
29. Yarrow, D. 1998. Methods for the isolation, maintenance, and identification of yeasts. En:
Kurtzman C. P. y Fell J. W. Eds. The Yeasts, A Taxonomic Study. 4a edn. Elsevier.
Amsterdam. pp 77-110.
18
GRUPO DE TRABAJO
UNIVERSIDAD IBEROAMERICANA DR. RUBÉN MORENO TERRAZAS C.
MAESTRA CARMEN DORIA SERRANO
MAESTRA MARGARITA HERNÁNDEZ ESPARZA
MAESTRA LORENA PEDRAZA SEGURA
MAESTRO SAMUEL MACIAS BRAVO
ALUMNO DE MAESTRÍA EN INGENIERÍA QUÍMICA
ALUMNOS DE LICENCIATURA DE INGENIERÍA QUÍMICA Y DE ALIMENTOS
Actividades UNAM INSTITUTO DE BIOLOGÍA DRA. PATRICIA LAPPE OLIVERAS
DRA. LAURA MÁRQUEZ D.
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE AGUASCALIENTES DRA. MARCELA RAMÍREZ LÓPEZ
MAESTRA DOLORES BARBA (ALUMNA DOCTORADO)
Comentario: Los biofiltros que se utilizarán para la remoción de tolueno, metanol y la
mezcla de ambos se instalarán en Universidad Autónoma de Aguascalientes y su
operación es parte del proyecto doctoral de la alumna doctorado. La directora de
este trabajo será la Dra. Marcela Ramírez colaboradora de este proyecto y el Dr.
Rubén Moreno Terrazas será asesor externo.
La comprobación de la identificación morfofisiológica de levaduras, será
apoyada por la Dra. Patricia Lappe del Instituto de Biología de la UNAM.
19
La adaptación de técnicas de extracción de ADN, su purificación y
secuenciación también serán realizadas en el Instituto de Biología de la UNAM
con el apoyo de la Dra. Laura Márquez y de la Dra. Patricia Lappe.
El trabajo experimental de caracterización microbiológica de todos los
microorganismos, incluyendo los aislados en los biofiltros se llevará a cabo en las
instalaciones de la UIA, bajo la supervisión del Dr. Moreno Terrazas y de Ma. Del
Carmen Doria.
La selección de microorganismos y las cinéticas de remoción también se
llevarán a cabo en la UIA y el análisis de resultados se hará con la colaboración de
las otros profesores participantes en el proyecto.
INFRAESTRUCTURA
TERMOCICLADOR PERSONAL
CÁMARA DE ELECTROFORESIS
TRANSILUMNADOR P/OBSERVAR GELES DE ELECTROFORESIS
INCUBADORAS
AUTOCLAVE
CAMPANA DE FLUJO LAMINAR
BAÑOS DE TEMPERATURA CONTROLADA
REFRIGERADORES
MESA DE AGITACIÓN CONSTANTE
CROMATOGRAFO DE GASES
20
CONSISTENCIA CON EL PROGRAMA DE LA UIA
Este proyecto busca mecanismos para la optimización de la remoción de
contaminantes de agua, suelo y aire a través del conocimiento de los
microorganismos involucrados. Consideramos que este objetivo tiene
implicaciones sociales y económicas en nuestro país, ya que queda mucho trabajo
por hacer para disponer de procesos industriales “limpios”.
Por otro lado, promoveremos la formación de alumnos en nivel licenciatura,
maestría y doctorado que interactúen para su capacitación en técnicas modernas
de identificación y uso de microorganismos, así como el intercambio de
experiencias entre los tres niveles de estudio. Además, las metodologías que se
desarrollen se podrán implementar en los diversos laboratorios y talleres de los
curricula de las licenciaturas a cargo de los Departamentos de ICQ y de Salud de
la UIA.
Participarán en el proyecto profesores del Departamento de Ingeniería y
Ciencias Químicas que pertenecen a diferentes áreas del mismo (Química, Ing.
Química e Ing. de Alimentos) y que se integrarán en un objetivo común.
Finalmente, aunado a nuestra experiencia hemos buscado el apoyo de
expertos de otras instituciones académicas de nuestro país para lograr resultados
de excelencia.
RESULTADOS ENTREGABLES 5 artículos en revistas arbitradas
5 presentaciones en congresos internacionales y nacionales
1 tesis de doctorado
1 tesis de maestría
7 reportes finales de las materias de formación terminal de los alumnos de las
licenciaturas involucradas.
21
PROGRAMA DE ACTIVIDADES DEL PROYECTO 2005* 2006 2007 2008
FENOL Aclimatación de lodos activados a fenol (realizado en un proyecto anterior)
X
Aislamiento de microorganismos a partir de un consorcio removedor de fenol X Purificación de levaduras y mohos X Purificación de bacterias X Identificación por métodos morfo-fisiológicos de levaduras X Adaptación de técnicas para extracción de ADN X Extracción del ADN levaduras para probar las técnicas reportadas X Amplificación y secuenciación de ADN X Identificación de bacterias por métodos morfo-fisiológicos X Extracción de ADN de bacterias X Amplificación y secuenciación de ADN de bacterias. X Identificación molecular de levaduras y bacterias X Análisis de resultados y elaboración de artículos y documentos de alumnos X X TRIGLICÉRIDOS Aislamiento de microorganismos de cecina X Aislamiento de microorganismos X Purificación X Prueba de su capacidad lipolítica X Extracción y amplificación de las levaduras X Extracción y amplificación de las bacterias X Secuenciación y caracterización X Análisis de resultados y elaboración de artículos y documentos de alumnos X TOLUENO Y METANOL Instalación y puesta en marcha de biofiltros removedores de tolueno X Aislamiento de microorganismos adsorbidos en el soporte sólido X Purificación de levaduras y mohos X Purificación de bacterias X Identificación por métodos morfo-fisiológicos de levaduras X Extracción del DNA de levaduras X Amplificación del DNA y sus secuenciación. X Identificación por métodos morfo-fisiológicos de bacterias X Extracción de DNA de las bacterias para probar las técnicas reportadas X Amplificación del DNA de la bacteria y su secuenciación. X Análisis de resultados y elaboración de artículos y documentos de alumnos X X FENOL Selección de levaduras, bacterias mohos de mayor crecimiento X X Pruebas cinéticas de los microorganismos para determinar la velocidad de biodegradación
X X
Análisis de resultados y elaboración de artículos y documentos de alumnos X X TRIGLICÉRIDOS Selección de levaduras, bacterias mohos de mayor crecimiento X Pruebas cinéticas de los microorganismos para determinar la velocidad de biodegradación
X X
Análisis de resultados y elaboración de artículos y documentos de alumnos X X TOLUENO Y METANOL Selección de levaduras, bacterias mohos de mayor crecimiento en tolueno X Selección de levaduras, bacterias mohos de mayor crecimiento en metanol X Pruebas cinéticas de los microorganismos para determinar la velocidad de biodegradación de tolueno
X X
Pruebas cinéticas de los microorganismos para determinar la velocidad de biodegradación de metanol
X X
Análisis de resultados y elaboración de artículos y documentos de alumnos X * Este proyecto fue aprobado y tuvo asignación de presupuesto por parte de la UIA en 2005
22
ANEXO No. 1
Método mecánico inicial para la extracción de ADN de bacterias
Congelar por 10 min a -80°C
Moler las bacterias con el minipistilo.
Agregar 30 µL de SDS al 10%, 6 µL de proteinasa K (20 mg/mL) y 6 µL de RNAsa (10 mg/mL).
Si es necesario, centrifugar por 10 seg a velocidad máxima (para mezclar perfectamente).
Colocar en baño maría durante 1 h a 37°C.
Agregar 100 µL de NACl 5 M y 80 µL de CTAB/NaCl.
Incubar a 65°C durante 10 min.
Agregar cloroformo:alcohol isoamílico (24:1) en volumen igual al que se tiene en el tubo (aprox.
700 µL). Mezclar suavemente.
Centrifugar 5 min a 14000 rpm. La fase acuosa (fase superior) se pasa a otro tubo eppendorf de
1.5 mL.
Agregar fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1) en volumen igual al que se tiene en el tubo.
Mezclar suavemente.
Centrifugar 5 min a 14000 rpm. El sobrenadante (fase superior) se pasa a otro tubo eppendorf de
1.5 mL.
Agregar isopropanol suficiente para que corresponda al 60% del volumen final total del tubo. Dejar
reposar una noche a -20°C.
Mezclar y centrifugar 5 min a 14000 rpm. Tirar la fase superior y conservar la hojuela del fondo.
A la hojuela se le agrega etanol al 70% a 4°C (mismo volumen agregado de isopropanol). Mezclar
ligeramente.
Centrifugar 5 min a 14000 rpm. Tirar el sobrenadante y repetir el lavado.
Dejar secar a temperatura ambiente. Colocar los tubos abiertos en una caja cerrada.
El ADN obtenido se resuspende con 50 �L de buffer Tris-HCl 10 mM EDTA 1 mM, pH 7.6.
Guardar las muestras a -20°C.
Método mecánico inicial para levaduras y mohos
Congelar la muestra a -80°C por 10 min
Moler con un minipistilo.
Adicionar 1000 µL se solución amortiguadora de SDS al 20% (200 g SDS + 800 mL agua
destilada). Invertir los tubos varias veces con suavidad hasta homogeneizar.
Incubar durante 40 min en baño maría a 37°C, agitando los tubos suavemente cada 15 min.
Retirar los tubos del baño y esperar un minuto a que se refresquen.
Agregar 600 µL de cloroformo/alcohol isoamílico (24:1). Agitar suavemente por 5 min.
Centrifugar a 13000 rpm por 10 min.
Transferir el sobrenadante a un tubo de 2 mL y agregar 10 µL de RNAsa (10 mg/mL).
23
Incubar durante 20 min a 37°C.
Adicionar 700 µL de isopropanol previamente enfriado a -20°C. Agitar suavemente hasta
mezclar completamente las dos fases.
Colocar a -80°C por 10 min.
Centrifugar a 13000 rpm por 5 min. Decantar el sobrenadante.
Adicionar a la pastilla de ADN 200 µL de etanol al 70% para lavar.
Centrifugar a 13000 rpm por 5 min. Decantar el sobrenadante.
Dejar secar a temperatura ambiente. Colocar los tubos abiertos en una caja cerrada.
El ADN obtenido se resuspende con 40 µL de buffer Tris-HCl 10 mM EDTA 1 mM, pH 7.6.
Guardar las muestras a -20°C.
Mientras el ADN esté húmedo, se agregarán 100 µl de agua bidestilada estéril, despegando el
ADN del fondo del tubo y se calentará el tubo Eppendorf en baño de agua a 55°C durante 15 min o
hasta que el ADN se disuelva por completo. De esta preparación se obtendrá el stock genómico de
ADN. Se almacenarán las muestras a –20°C hasta que se realice la secuenciación.
Para realizar la reacción de amplificación se diluirá el ADN adicionando a 996 µl de agua
bidestilada estéril 4 µl del “stock”. La dilución del ADN (templado) será utilizada para la
amplificación simétrica. En la Tabla 1 se muestra la cantidad de reactivos de la mezcla maestra
necesaria para una reacción de PCR
Tabla 1. Cantidad de reactivos necesarios en la mezcla maestra para la amplificación de ADN de
los microorganismos de prueba
Reactivos Concentración Inicial Concentración Final Volumen (µl)
H2O estéril (QSP) 28.8
Amortiguador PCR
(KCl 1 M 12.5 ml, Tris-
HCl 1 M pH 8.4 2.5 ml,
MgCl2 1 M, 625 µl
gelatin 2.5 mg, ddH2O
9.37 ml)
10 X 1 X 25
Mezcla de
desoxinucleótidos
(dNTPs)
10 mM/µl 0.2mM/µl 4.0
Iniciador externo 5’
final P27f (bacterias)
bacterias
0.2 µM
2.5
24
y NL1f (levaduras y
mohos)
10 pmol/µl
levaduras y mohos
0.5 pmoles
Iniciador externo 3’
final P1495r
(bacterias)
y NL4r (levaduras y
mohos)
10 pmol/µl
bacterias
0.2 µM
levaduras y mohos
0.5 pmoles
2.5
Taq polimerasa 0.2
Volumen final 49.0
En un tubo del termociclador de 500 µl se transferirán 48 ó 49 µl de la solución de mezcla maestra
y 2 ó 1 µl del templado compensando el volumen final con mayor o menor cantidad de agua
obteniéndose un volumen final de 50 µl, se agitará y centrifugarán por 10 seg a una velocidad de 3
000 rpm.
Los iniciadores universales que se utilizaran serán para levaduras y mohos serán el NL-1 (5’- GCA
TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG) y el NL-4 (5’- GGT CCG TGT TTC AAG ACG G) y la
polimerasa fue Gold Taq-polimerasa (Boheringer y QIA DNA minikit QIAGEN).
Para bacterias se amplificará la subunidad menor del gene 16S del ADNr usando los primers
universales P27f (5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’) y P1495r (5’-CTA CGG CTA CCT TGT
TAC GA-3’)
Para las bacterias las los tubos con las muestras de ADN se colocarán en el equipo termociclador
personal (Eppendorf) y se amplificarán conforme el siguiente programa (Baggi y col., 2003):
Precalentamiento: 95°C 3 min
Desnaturalización: 94°C por 1 min
Alineamiento: 55°C por 1min
35 ciclos Extensión: 72°C por 2 min
Extensión final: 72°C 15 min
Para las levaduras y los mohos los tubos con las muestras se colocarán en el mismo equipo y se
amplificarán conforme el siguiente programa (Libkind y col., 2003):
25
Precalentamiento: 95°C 12 min
Desnaturalización: 95°C por 1 min
Alineamiento: 52°C por 55 seg
40 ciclos Extensión: 72°C por 2 min
Extensión final: 72°C 8 min
Una vez que terminen los ciclos el termociclador se mantendrá 4°C, hasta que la muestra sea
retirada. Se verificará la calidad del producto de PCR por electroforesis en un gel de agarosa (1%)
con una solución amortiguador TAE 1X Los pozos del gel se cargará n con una mezcla con 4 µl del
producto de PCR y 2µl de la mezcla de tinción. La electroforesis se correrá durante 15-20 min a
120 volts. El gel se observará y fotografiará en un transiluminador UV (Libkind y col 2003; Baggi y
col. 2004).
top related