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INTRODUCCIÓNINTRODUCCIÓN
La identificación en el menor tiempo posible y de una forma fiable de organismos patógenos es fundamental para mininizar los daños que producen. Sin embargo, para algunos hongos,
sobre todo los que atacan al sistema radicular, la determinación tradicional basada en la observación de estructuras morfológicas y en propiedades fisiológicas no es suficiente para obtener
una identificación fiable. El desarrollo de técnicas moleculares, sobretodo con el descubrimiento en 1985 de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), ha permitido establecer la
identidad de cada organismo y sus relaciones filogenéticas, lo que ha revolucionado la sistemática de hongos (EDEL, 1998).
Las aplicaciones de la técnica PCR son muy amplias y en la actualidad se utiliza en la detección e identificación de virus, bacterias, hongos, nematodos, etc. (CENIS, 1993). El éxito de esta
técnica consiste en su sencillez teórica y en la rapidez en su ejecución, ya que permite la identificación de un patógeno en un día. El poder aplicar con garantías técnicas moleculares supone
una enorme ganancia en tiempo que beneficia el control de la enfermedad. Por este motivo el objetivo de este trabajo fue adaptar un protocolo de PCR, complementado con el análisis de la
longitud de fragmentos de restricción (RFLP), para los géneros fúngicos Armillaria, Phytophthora y Fusarium.
CONCLUSIONESCONCLUSIONESEl género Armillaria presentaba grandes dificultades en la identificación de especies y los métodos propuestos resultaban complicados, de mucha duración
(entre cuatro o quinco semanas) y con resultados la mayor parte de las veces confusos. La aplicación de la técnica PCR junto con el análisis RFLP ha posibilitado la identificación de las especies en menos de un día de una forma fiable. Para Phytophthora y Fusarium, estas técnicas constituyen, por el momento, un buen complemento al diagnóstico por la metodología tradicional, pero estudios posteriores permitirán sin duda un mejor desarrollo de las mismas.
(1) Diputación Provincial de Pontevedra. Servicio Agrario. Estación Fitopatológica Do Areeiro. Subida a la Robleda, s/n. 36153 Pontevedra. Www.efa-dip.org(2) Departamento de Producción Vegetal, Universidad de Santiago de Compostela, Campus Universitario, 27002 Lugo
LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) COMO TÉCNICA DE DIAGNÓSTICO EN FITOPATOLOGÍA FORESTAL
LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) COMO TÉCNICA DE DIAGNÓSTICO EN FITOPATOLOGÍA FORESTAL
O. Aguín (1); M. Sabarís (1); A. Abelleira (1); C. Pintos (1) y J.P. Mansilla (1, 2)
MATERIAL Y MÉTODOSMATERIAL Y MÉTODOS
Se utilizó el EZNA fungal DNA miniprep KitExtracción del ADN
HONGOS CEBADORES CONDICIONES DE AMPLIACIÓN (*)
- 95 segundos a 951C.
Armillaria 0-1: 5'-AGTCCTATGGCCGTGGTAT-3' - 35 ciclos: 60 segundos a 601C
120 segundos a 721C
-LR12R: 5' CTGAACGCCTCTAAGTCAGAA-3' 60 segundos a 951C
- 10 minutos a 721C
- 120 segundos a 961C
Phytophthora ITS4: 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3' - 35 ciclos: 60 segundos a 961C
60 segundos a 551C
ITS5: 5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3' 120 segundos a 721C
- 10 minutos a 721C
- 182 segundos a 951C
Fusarium ITS1: 5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3' - 35 ciclos: 60 segundos a 95 1C
60 segundos a 551C
P3: 5'-CCTTGGTCCGTGTTTCAAGACGGG-3' 60 segundos a 721C
- 3 minutos a 721C
* Condiciones propuestas para Armillaria (PÉREZ et al, 1999), Phytophthora (RISTAINO et al, 1998) y Fusarium (EDEL et al, 1996).
Secuencias de cebadores y condiciones de amplificación para los géneros Armillaria, Phytophthora y Fusarium.
AMPLIFICACIÓN Se utilizaron las Ready-To-Go-PCR beads
RFLP
ARMILLARIA: Alu I, Bsm I, Nde I
PHYTOPHTHORA I:
Rsa I, Hae III, Msp
Material fúngico utilizado:
ARMILLARIA:
Micelio sobre plantaMicelio en medio de cultivo
PHYTOPHTHORA: Micelio en medio de cultivo
FUSARIUM: Micelio en medio de cultivo
RESULTADOSRESULTADOSLa amplificación del ADN de las muestras fúngicas permitió observar una banda situada aproximadamente a 900 pb en el caso de Armillaria y Phytophthora, mientras que para Fusarium los
cebadores amplificaron una región de 1200 pares de bases.
En las muestras con Armillaria, se produjo éxito en la amplificación en todos los casos, identificándose cuatro especies : A. mellea, A. ostoyae, A.cepistipes y A. gallica, en distintos hospedadores.
En el caso de Phytophthora, mediante la aplicación de las técnicas PCR-RFLP se han detectado hasta el momento tres especies: P. cinnamomi, P. cactorum y P. capsici.
En las muestras de Fusarium solo se ha llegado a determinar el género mediante PCR; estudios posteriores con las enzimas de restricción adecuadas permitirán la diferenciación de especies.
500
100
Gel de agarosa al 3%, mostrando los fragmentos de restricción obtenidos
al digerir el DNA amplificado de muestras de Armillaria con Alu I
500
100
Gel de agarosa al 2%, mostrando los fragmentos de restricción obtenidos al
digerir el DNA amplificado de muestras de Phytophthora con Rsa I y Hae III
Rsa I Hae III
Gel de agarosa al 1%, mostrando el DNA amplificado de muestras
de Fusarium
1000
1500
III Congreso Forestal Español, Sierra Nevada (Granada) 25-28 septiembre 2001 III Congreso Forestal Español, Sierra Nevada (Granada) 25-28 septiembre 2001
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