identificaciÓn de proteÍnas mediante espectrometrÍa de...

IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

MEDIANTE ESPECTROMETRÍA

DE MASAS

MS:¿Cómo surge en biología?•Técnica clásica de análisis:

Determinación muy exacta de la masa de una molécula

•Técnicas de ionización suave: MALDI y ESIPermiten ionización de moléculas grandes, polares y no volátiles (moléculas biológicas)

•Generalización: Avances en:InstrumentosSotfwareFacilidades de uso

J.B.Fenn K.Tanaka

QUÉ ES?Es una técnica analítica que consiste en la producción de

iones en fase gaseosa a partir de moléculas y la posterior determinación de sus masas moleculares.

El resultado es una representación de la abundancia relativa de los iones producidos frente a la relación m/z

ESPECTRÓMETRO DE MASASEs una balanza de precisión de moléculas.

QUE HACE?Determinación muy precisa de masas moleculares

ESPECTROMETRÍA DE MASAS

699.0 1459.2 2219.4 2979.6 3739.8 4500.0Mass (m/z)

00

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% I

nte

ns

ity

904.48

1296.68

2094.09

2466.191570.64

3659.68

ESPECTROMETRO DE MASAS

CÓMO?Produce iones en fase gaseosa de las moléculas.

Los mueve, y los separa y los selecciona

Los detecta, determinando la relación masa/carga de estos iones.

Ion source: Generación de iones

Mass analyzer: separa los iones

Mass spectrum:Detección y representación

Analito

Espectrometría de masas

• Sensibilidad • Rapidez • Automatización• Economía

ESPECTROMETRÍA DE MASAS:

Conceptos generales:•Definiciones de masa •Resolución•Precisión

Masa y abundancianatural de distintos isótopos

Definiciones de Masa

Definiciones de Masa

”Masa monoisotópica”: suma las masas exactas de los isótopos más abundantes de cada elemento presente,

ej: H = 1.007825, C = 12.000 (por definición).• Medida más precisa• Elegida cuando hay resolución suficiente

Daltons (Da) o unidades de masa (u)

”Masa media”: suma las masas químicas medias de los elementos presentes.

Tiene en cuenta la abundancia natural de cada uno de los isótopos presentes.•No tan exacta, por las variaciones en las abundancias naturales de los isótopos

Masa Monoisotópica

Cuando los isótopos están bien resueltos las masa monoisotópica como la medida más precisa.

Para compuestos que sólo contienen C, H, O, N, S or P, corresponde al pico más pequeño del grupo

Masa Monoisotópica

Masa Media

Masa media

Cuando los isótopos no estan bien resueltos, el centroide de la envuelta de los picos isotópicos en el grupo, corresponde con la masa media

Precisión

Precisión en la medida de la masa: diferencia entre el valor de la masa medida experimentalmente y el valor teórico

• Sólo puede calcularse en compuestos de composición elemental conocida.

•Depende de la calibración y de la reproducibilidad de la medida.

•Puede expresarse como error absoluto, como porcentaje de la masa medida o como partes por millón (ej: 1000 ±0,1 Da, 1000 ±0,01% o 1000 ±100 ppm)

Entrada de

muestra

Ionización

Analizador de Masa

Análisis de masas (selección)

Detector

Detección

Fuente de iones

• Sólido• Líquido

Detecta ionesForma iones(moleculas cargadas)

Separa o Selecciona los ionessegún su masa (m/z)

Componentes de un Espectrómetro de Masas

Procesamiento de datos

Vacío

Rel

ativ

e A

bund

anc e

m/z 1000 2000

Espectro de masas

Datos

Sistema de entrada

Fuente de iones

Analizador Detector Proceso de datos

Sistema de alto vacío

Portamuestras HPLC

MALDIElectrosprayAPIFAB/LSIMSEI, CI

TOFCuadrupoloTrampa de ionesSector MagnéticoFTMS

Placa microcanalMultiplicador de electronesSistemas híbridos

Componentes de un espectrómetro de masas

TÉCNICAS DE IONIZACIÓN UTILIZADAS EN PROTEÓMICA

•MALDI (Karas and Hillenkamp, 1988)

•ESI (Fenn et al., 1989) J.B.Fenn K.Tanaka

ESPECTROMETRÍA DE MASAS MALDI-TOF: IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS MEDIANTE “HUELLA PEPTÍDICA”Matrix-assisted laser desortion-ionization (MALDI).

Time of flight (TOF).

MALDI láser

1. La muestra (A) se mezcla con un exceso de matriz (M) y se seca en una placa portamuestras para MALDI.

2. Flashes de láser ionizan las moléculas de matriz

3. Las moléculas de la muestra se ionizan por transferencia de protones desde la matriz en fase gaseosa:

MH+ + A M + AH+.

AH+

+20 kV

Placa portamuestras

Se forman iones con una sola carga: AH+

Analizador de tiempo de vuelo TOF (time-of-flight)

+

+

+

+

Fuente Tubo de vuelo

det

ecto

r

V• Los iones se forman mediante pulsos de láser.

• Los iones se aceleran mediante la aplicación de un voltaje

• Los iones pequeños llegan al detector antes que los grandes

• Se mide el tiempo que tardan los iones en llegar al detector.

Tubo de vuelo

Detector

Fuente de iones

¿Qué es tiempo de vuelo (TOF)?

20-25 kV

Principio: Si todos los iones son acelerados con el mismo potencial en un punto determinado en el momento inicial, y posteriormente, se les

permite volar, se separarán según sus relaciones masa/carga

KE = 1/2 Mv2KE =energía cinética (=zeV)M =masav= velocidad 2KE/M = v2

Detector20-25 kV

¿Qué es tiempo de vuelo (TOF)?

Tubo de vuelo

Fuente de iones

Vacio: no rozamiento

+

-1000 V -100 V

Primary Ion from Flight Tube

e-

e- e-

e-

L

D= 6 u

e-

~103

Amplification per

MCP

e-

e-

e-e-

e-

e-

to 2nd MCP

Amplificación de la señal en una placa microcanal (MCP)

Identificación de proteínas

Caracterización

automática

Separación

Mezcla de péptidos

Búsqueda en bases de datos

protein ID

digestión

detección

Adquisición de la imagen

Corte

Análisis de imagen

Secuencia “de novo”

ESI-MS/MS

Etiqueta de secuencia

Huella péptica

MALDI-TOF

Huella peptídica

-Aproximación más sencilla a la identificación de proteínas:

Fácil y rápido

-Sólo pueden identificar proteínas depositadas en bases de datos:

GENOMAS SECUENCIADOS

Identificación de proteínas:

Digestión con tripsina

N CR R RPKR K

N C

N

Huella peptídica

Huella peptídica

Espectro de masas característico de cada proteína obtenido al analizar la mezcla de péptidos obtenidos por digestión enzimática (por ej. con tripsina)

Este espectro es comparado con los espectros teóricos calculados de las secuencias proteicas de las bases de datos

Cuando un número adecuado de péptidos coinciden con los péptidos teóricos de una proteína en la bases de datos y cubren un porcentaje adecuado de la proteína: IDENTIFICACIÓN

Digestión de la muestra en el gel

Su buen funcionamiento depende de:

• Evitar contaminaciones• Digerir la proteína eficientemente• Recuperar la mayor cantidad de

péptidos posible• Minimizar las pérdidas por

manipulaciones

Tratamiento de las manchas proteícasDestinción

Reducción y alquilación

Deshidratación

Hidratación con tripsina y digestión

Extracción de los péptidos

¿Concentración y limpieza?

Corte del gel

Seleccionar una matriz

Preparar la matriz

Preparar la muestra

Mezclar la matriz y la muestra (exceso de matriz)

Poner sobre una placa de muestras limpia

Secar

Preparación de la muestra

Selección de la matriz

Ácido Sinapínico Proteínas >10kDa

Ácido α-Cyano-4-hydroxy-cinámico (CHCA)

Péptidos<10kDa

Ácid 2,5-Dihydroxybenzoico (DHB)

Carbohydratos neutros,Polímeros sintéticos

“Super DHB” Proteínas,

Proteínas glicosiladasOligonucleótidos

HABA Proteínas,

Oligosacáridos

Ácido-3-Hydroxypicolínico

α−cyano Ácido Sinapínico Cristales pequeñoscompactos y redondeados

Apariencia de la matriz cristalizada

Cristales romboides ypuntiagudos

Limpieza de las muestras

Eliminar sales procedentes de los tampones, urea, guanidina, EDTA, glicerol, DMSO, detergentes, etc.:•Dilución•Lavado•“Drop dialysis”: Diálisis de gota•Intercambio iónico•Puntas de pipeta con columnas de cromatografías (ZipTips)

Voyager 96x2 Sample Plate P/N V700813

Standard de calibraciónMuestra

Placa portamuestrasPlaca de 96 pocillos de acero inoxidable recubierta de teflón. Disposición de pocillos pàra calibración externa cercana.

•

1. Muestra+matriz se secan en la placa

Time

High voltage

20 - 25 kV

6. Un sistema informático, controla los parámetros del aparato, adquiere las señales/tiempo y procesa los datos

5. Los iones golpean el detector a distintos tiempos, según su relación m/z

4. Los iones son acelerados mediante un campo eléctrico adquiriendo la misma energía cinética. Van atravesando el tubo de vuelo y separándose según su masa

3. Las muestras son irradiadas con pequeños pulsos de láser

2. La placa es introducida en el portamuestras

Tubo de vuelo

Alto vacío

láser

1. Quitar ruido del espectro.

2. Excluir las masas contaminantes.

3. Identificar las masas monoisotópicas.

Procesamiento de datos:

Filtrar los datos de pesos moleculares obtenidos del espectro

Seleccionar los péptidos correspondientes a nuestra proteína

Espectro de MALDIA

bu

nd

anc

ia r

ela

tiv a

Masa (m/z)

1. Quitar ruido del espectro. electrónico: señal-ruidoquímico: iones contaminantes

2. Excluir las masas contaminantes: origen proteíco: queratinas, tripsina

origen no proteíco: matrizpolímerosaductos Na (+22Da) , K

Las contaminaciones dificultan la detección de los iones del analito y pueden llevar a identificaciones erróneas.

3. Identificar las masas monoisotópicas.

Masa monoisotópica

Suma de los pesos exactos de los isótopos más abundantes de cada elemento presente. ej: H = 1.007825, C = 12.000 (por definición).

•Medida más precisa

• Elegida cuando hay resolución suficiente

Aumento de la resolución y de la precisión

• Reflector• Tiempo de retardo

Tubo de vueloReflectorDetector

Fuente de iones

Reflector TOF

20-25 kV

Reflector (Espejo de iones)

Reflector

++ +

Iones de la misma masa tienen diferentes velocidades (por la energía del láser)

1: No hay campo eléctrico, los iones se mueven

2: Voltaje. El gradiente acelera los iones lentos más que los rápidos.

++ +

3: Todos los iones llegan al detector al mismo tiempo

+20 kV

+20 kV

0 V

+++

Tiempo de retardo

AUTOMATIZACIÓN

Análisis a gran escala para la obtención de la huella peptídica

1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800m/z0

100

%

1619.28968.64

836.58

893.67

1251.93

969.70

970.69

1013.80

1060.23

1061.26

1252.97

1254.00

1570.17

1448.14

2313.69

2312.761621.14

1670.25

1671.24

1672.14

1873.46

1853.38 2019.571876.41

2271.83

2036.57

2314.75

2315.80

2366.83

2367.90

2368.85

2369.91 2718.09

1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800m/z0

100

%

1619.28968.64

836.58

893.67

1251.93

969.70

970.69

1013.80

1060.23

1061.26

1252.97

1254.00

1570.17

1448.14

2313.69

2312.761621.14

1670.25

1671.24

1672.14

1873.46

1853.38 2019.571876.41

2271.83

2036.57

2314.75

2315.80

2366.83

2367.90

2368.85

2369.91 2718.09

1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800m/z0

100

%

1619.28968.64

836.58

893.67

1251.93

969.70

970.69

1013.80

1060.23

1061.26

1252.97

1254.00

1570.17

1448.14

2313.69

2312.761621.14

1670.25

1671.24

1672.14

1873.46

1853.38 2019.571876.41

2271.83

2036.57

2314.75

2315.80

2366.83

2367.90

2368.85

2369.91 2718.09

1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800m/z0

100

%

1619.28968.64

836.58

893.67

1251.93

969.70

970.69

1013.80

1060.23

1061.26

1252.97

1254.00

1570.17

1448.14

2313.69

2312.761621.14

1670.25

1671.24

1672.14

1873.46

1853.38 2019.571876.41

2271.83

2036.57

2314.75

2315.80

2366.83

2367.90

2368.85

2369.91 2718.09

2D Gel

Robot digestor

MALDI-TOF-MS

(modo automático)

Procesamiento automatizado de los datos y búsqueda en las

bases de datos.

Obtención de resultados

Robot que corta las manchas