fluorescencia extrínseca - facultad de ciencias,...

Fluoróforos en bioquímica

• Fluorescencia intrínseca fluorescencia natural, propia del sistema

• Fluorescencia extrínsecaagrego a la muestra un fluoróforo externo

(sonda fluorescente)

Fluorescencia en:

• Proteínas, fluorescencia intrínseca debido a residuos aminoacídicos aromáticos, predomina el triptofano. Además marcado con sondas fluorescentes (FITC, DNS). GFP y derivados.

• Ácidos nucleicos, sin fluorescencia intrínseca, se agregan sondas fluorescentes catiónicas planares (EtBr, DAPI) o fosfolípidos marcados

• Membranas, no fluorescentes, se agregan sondas liposolubles con baja fluorescencia en agua (DPH, ANS)

Fluorescencia en:

• NAD(P)H

• FAD, FMN

• Piridoxal fosfato (PLP)

• Clorofilas

• Indicadores fluorescentes (pH, Na+, Cl-, Ca2+, O2)

0.4 ns en solución1-5 ns unido a DH

4.7 ns en solución(2.3 ns FMN)0.3-1 ns unido a prot.

Sondas fluorescentes para proteínas

DNS-Cl sensible a polaridad del entorno, fluorescencia polarizada

Fluoresceína (y Rodaminas) absorbe y emite en el visible, alto rendimiento, ε=80.000 M-1cm-1

Problema: autoquenching, fotosensible, pH

Prof. Gregorio Weber1916 - 1997

Compuestos de B (BODIPY) absorben y emiten en el visible, alto rendimiento, ε=80.000 M-1cm-1, fotoestables, insensible al solvente y pH

http://probes.invitrogen.com/handbook/

Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG antibody/pH 8.0.

http://probes.invitrogen.com/handbook/

No autoquenching

Fotoestable

Sondas fluorescentes para membranas

DPH = difenil hexatrieno

LiposolubleEmisión polarizada

Ácido cis-parinárico

Ácido graso fluorescente, sensible a polaridad del solvente

Sonda fluorescente unida al ácido graso o fosfolípido

Colesterol = no fluorescente

Análogo fluorescente del colesterol

Sondas fluorescentes para ácidos nucleicos

Bases modificadas fluorescentes

Sondas que se unen (no covalentemente) al ADN

Sondas que emiten en el NIR

Cianinas

Excitación en el visible con laser

No autofluorescencia

Sondas fluorescentes para detectar bioanalitos

Desactivación por cloruro Cl-

Cambioespectralpor Ca2+

Sondas fluorogénicas

Producto de la reacción es fluorescente – especificidad -

Formaciòn de sonda fluorescente por reacción con grupos amino

Medida de actividad enzimática por foramción de producto fluorescente

Product Spectra - JC-1/pH 8.2

Sondas fluorescentes para medir potencial de membrana

Adipocitos cargados con JC-1

(5 µM, 37ºC, 30 min) + 10 nM FCCP.

Exc. = 488 nm Em = entre 515–545 nm y 575–625 nm.

514/529585/590

Fluoróforos de vida media larga

• Pirenos (100 – 400 ns)

• Lantánidos (0.5 – 3 ms)

Eu (III), Tb (III)

Baja absorción (10 M-1 cm-1), se usan complejos metálicos conligandosorgáncios.

Emisión desde orbitales 4f, transición prohibida, lenta

Emisión no polarizada

• Complejo metal transición-ligando

Ru(II), Re(I), Os(II), ligando diimina

Eimisión por transferencia de carga metal-ligando, parcialmente prohibida

Emisión polarizada

τ larga, evita autofluorescencia

GFP = Green Fluorrescent Protein

Formación espontánea del fluoróforo al plegarse