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Diagnóstico molecular de PRRS
Reunión GITEP 11/12/13
Ariel Pereda
Laboratorio de Aves y Porcinos
Instituto de Virología - INTA
Clínica: Fallas reproductivas – Respiratorias (depende de patogenicidad)
Diagnóstico de PRRS
Adultos Camadas afectadas Lechones destetados
Reducción del apetito Mortinatos Pérdida de apetito - Letargia
Fiebre Alta mortandad pre destete Fallas en crecimiento
Partos prematuros - Abortos Lechones momificados Distress respiratorio
≥10% de mortandad Nacimientos deparejos Petequias y equimosis en piel
Prob. neurológicos Edema periorbital Pelo áspero
Complementarios: Laboratorio • Serología ELISA (Clasif. Granjas, circ. Viral, Cuarentena) • Virología Aislamiento (lento, no afectado x mutaciones) • Molecular RT-PCR – Real Time RT-PCR – EPIMOL
Diangóstico diferencial
Muestras a remitir para diagnóstico Serología: Suero o plasma. A partir de los 5 días post infección hay presencia de IgM y a los 14-21 dpi IgG sérica. Pico máximo a los 40-50 dpi y caen lentamente hasta los 4 a 6 meses Aislamiento viral y Diagnóstico Molecular: (1 – 2 dpi, pico de viremia a los 10 dpi) Sangre entera EDTA) Buffy Coat Suero Plasma Pulmones Linfonódulos (mediastínico) Bazo Tonsilas PRRSV replica en macrófagos alveolares
TEST MOLECULARES DISPONIBLES
RT-PCR CONVENCIONAL • Muchos protocolos existentes • La mayoría dirigidos al ORF7 • Simples o “nested” • Más rápidos que el aislamiento • No requiere de virus viable • Alta sensibilidad • Riesgo de contaminación cruzada
RT-PCR EN TIEMPO REAL • Menor cantidad de protocolos existentes • Dirigidos al ORF5, ORF 6 y ORF7 • Semi cuantitativos • Más rápidos que el aislamiento • No requiere de virus viable • Más sensibles que el convencional • Menor Riesgo de contaminación cruzada
Kits Comerciales para Real Time RT-PCR
Por la naturaleza del virus
Se deben tener al menos 2 o 3
diferentes test diagnósticos
2013 - USA
2012 - EU
Biología Molecular Epidemiología
Epidemiología Molecular
" el estudio de la distribución y determinantes de enfermedades que afectan
transitoriamente a muchos individuos en un sitio determinado"
Epidemiología: definición
Evolución: definición
La teoría que explica como los organismos cambian a través del tiempo
Fenotipo
• Caracteres: color de la flor
• Estados de cada carácter: rojo, amarillo, rosa.
Genotipo
Caracteres: cada posición de nucleótido o aminoácido
Estados de cada carácter: A, G, T o C
Secuencia
¿Para qué son necesarios
estudios filogenéticos?
•Filogenia: ¿Cuál es la historia de este grupo de especies? ¿Cómo se
relacionan? ¿cuál es la historia de este gen?
•Delimitación de especies: ¿Pertenecen estas dos poblaciones a una sola
especie o a dos especies diferentes?
•Estructura de poblaciones: ¿Como se explica la diferenciación entre
poblaciones de la especie X?
•Origen: ¿De dónde viene el individuo X?
•Relaciones: ¿Está este grupo de individuos relacionado?
•Individualización: ¿Cómo la muestra del individuo X se relaciona con el
individuo Y?
Metodologías aplicadas a los estudios
epidemiológicos
•Hibridización por sonda
•PCR diferencial
•Corte por enzima de restricción
PRESENCIA Y TIPIFICACIÓN
•RAPDs
•AFLP
•Microsat
•Secuenciación
PRESENCIA, TIPIFICACIÓN Y ANÁLISIS
FILOGENÉTICO
0.1 O1Campos58
OTaiwan97
Asia1
Paquistan54
SAT3
Bechuanaland 65
SAT1
Bostwana68
SAT2
Kenya57
A24Cruzeiro55
A27Colombia67
C1SantaPau58
C3Argentina85
Representación visual de la posible relación histórica entre los
organismos en estudio
Árbol filogenético
• Nucleótidos vs. proteínas
• Mutaciones: Cambios en la composición genética del individuo durante la
replicación del ADN en relación a un estado ancestral.
• 1.Sustituciones.
• 2.Eliminaciones.
• 3.Inserciones.
• 4.Inversiones.
Regiones conservadas vs. regiones variables
Saturación: se debe a múltiples cambios en el mismo sitio
•En el estudio de la evolución, es fundamental conocer la escala
temporal y espacial de la dinámica de los procesos
Análisis filogenético
Grupo monofilético
Ramas
Árbol sin raíz
Tiempo evolutivo
Dicotomía
Politomía
Ancestro
OTU
Árbol con raíz
98
remuestreo
Unidades
Taxonómicas
Operativas
La evolución de los patógenos presenta un desafío
para el sistema de salud.
Le permite escapar de la respuesta inmune del
huesped
Le permite cambiar el rango de hospedador y
modificar su virulencia.
La identificación de sitios claves en el genoma viral
Desarrollo de modelos de evolución viral y transmisión
Evolución
¿Para qué son necesarios
estudios filogenéticos?
•Filogenia: ¿Cuál es la historia de este grupo de especies? ¿Cómo se
relacionan? ¿cuál es la historia de este gen?
•Delimitación de especies: ¿Pertenecen estas dos poblaciones a una sola
especie o a dos especies diferentes?
•Estructura de poblaciones: ¿Como se explica la diferenciación entre
poblaciones de la especie X?
•Origen: ¿De dónde viene el individuo X?
•Relaciones: ¿Está este grupo de individuos relacionado?
•Individualización: ¿Cómo la muestra del individuo X se relaciona con el
individuo Y?
ORF 5
Conclusiones
Diagnóstico molecular de PRRS • Más Rápido • Más sensible • Más costoso
Sigue necesitando del diagnóstico clínico anamnesis
No es suficiente contar con un solo test
Epidemiología molecular de PRRSV • Ubicación temporo-espacial • Análisis de riesgo • Taxonomía - clasificación • Indicador de antigenicidad
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