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Detección y caracterización de fagos deStreptococcus thermophilus en Uruguay:
base para el desarrollo de cepas resistentesbase para el desarrollo de cepas resistentes
María Julia PianzzolaProf. Microbiología
Departamento de BiocienciasFacultad de Química. Universidad de la República
mpianzzo@fq.edu.uy
Streptococcus thermophilus
• G+ cocos en pares o cadenas
• Termófila, Tóptima 42°C
• Aanaerobia aerotolerante• Aanaerobia aerotolerante
• Genoma 1,8 Mb
• Separada hace 7000 años de patógenas
• Única especie Strepctococcus usado en la industriaalimentaria
• Única especie GRAS ( Generally Recongnized As Safe) por la FDA (American Food and Drug Administration)
Usos en la industria
• La segunda especie BAL más importante después de Lactococcus lactis
• Uso en yogur y variedades de quesos
• Rápida acidificación• Rápida acidificación
• Producción de productos de fermentación comoformiato, acetaldehído contribuyen aroma y textura
• En yogur: proto-colaboración: St-Lb bulgaricus
• Promisorio candidato a probiótico (no todas lascepas y en asociación con otras cepas)
Bacteriófagos de S. thermophilus
• ADN doble cadena
• 3 grupos de fagos: cos, pac y “nuevo” (Mills et al 2011)
• Organización genómica modular:• Organización genómica modular:
Achigar et al., 2017
Interacción S.thermophilus- fagos
• Ciclos de producción largos aumentan la incidencia de:
materia prima contaminada
superficies contaminadas
subproductos recicladossubproductos reciclados
Fagos en aire-ambiente
• Uso intensivo y repetido de cepas o mezclas estárteres
Consecuencia:
fallas en el proceso de fermentación
La problemática de los fagos a nivel industrial
5,5
6
6,5
7
pH Normal
4
4,5
5
0 1 2 3 4
Tiempo (horas)
Lenta
Fallida
• Caída de productividad• Baja calidad de producto• Pérdida de materia prima
Estrategias de control
• Esterilización de la leche
• Rotación de cultivos estárteres
• Maximizar prácticas de higiene
• Mejorar diseños de las plantas
PERO
el problema no puede erradicarse,
POR TANTO:
Monitoreo de fagos:
-Alerta para incremento en el número
-Estudio de poblaciones y su adaptabilidad a las medidas que se tomen
¿ Por qué el problema persiste?
• Bacterias: resistencia a fagos, mecanismos
• Fagos: co-evolución para ser resistentes
ENTONCES:
Desarrollo de cepas mejoradas para resistencia a fagos
Mecanismos de resistencia a fagos de las bacterias
• Inhibición de la unión al receptor
• Destrucción del genoma del fago que ingresa a la bacteria (R-M) bacteria (R-M)
• Suicidio de células para abortar la infección (Abi)
• Sistema de defensa CRISPR/Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) o Resistencia adquirida
• Construcción de banco de fagos autóctonos
Optimizar técnicas de detecciónAislar fagos de muestras industrialesCaracterizar los fagos
Objetivos:
• Selección de cepas resistentes con potencial para ser utilizadas como iniciadores industriales
Evaluar las cepas de la colección respecto a fagos (desafíos sensibilidad/ resistencia)Seleccionar cepas resistentes por método clásicoEvaluar las características tecnológicas de las cepas
• Evaluar Nuevas estrategias para diseño de cepas resistentes
• Optimización de Técnicas de detección basadas enPCR y Real-Time PCR (qPCR)
Diagnóstico rápido
Detección y aislamiento de fagosDetección y aislamiento de fagos
Diagnóstico rápido
Discriminar entre diferentes fagos
Cuantificación
• Aislamiento de los fagos por técnica de la doble capade agar
Muestreo, detección y aislamiento
Aislamiento de fagos en doble capa de agar
432 muestras analizadas
Del Río et al., 2008
146 aislamientos realizados15 fagos diferentes
432 muestras analizadas
Detección por PCR de fagoscos y pac
Real Time PCR (QPCR)
1203 ensayos de sensibilidad resistencia
Ensayos de sensibilidad/resistenciaEnsayos de sensibilidad/resistencia
103 ensayos de generación, 26 nuevas cepas posiblemente resistentes
Selección de resistentesSelección de resistentes
• Cada clon obtenido debe superar el ensayo de sensibilidad/resistencia para cada fago
Evaluación de resistentesEvaluación de resistentes
• Debe mantener las propiedades tecnológicas de la cepa madre
Selección de resistentesSelección de resistentes
4
4,5
5
5,5
6
6,5
0,00 1,00 2,00 3,00 4,00
pH
Tiempo (horas)
Curvas de fermentación de SBQ28T1, SBQ28T2 y SBQ28T3 comparadas con el rango aceptable de fermentación
Límite superior
Límite inferior
SBQ28T1
SBQ28T2
SBQ28T3
Evaluación de la resistencia adquirida(Sistema CRISPR/Cas)
Amplificación de regionesCRISPR
Secuenciado y análisis de regiones CRISPR
Achigar, 2014Tesis de Maestría
Estudio multigeneracional de laevolución de un locus CRISPR1 en cepas
resistentes
Proteínas hipotéticas Proteínas estructurales Enzimas
Conclusiones
• Colección de fagos de Streptococcus thermophilus
• Método optimizado de QPCR: detección, cuantificación, prevención
• Cepas de S. thermophilus resistentes • Cepas de S. thermophilus resistentes
• 15 fagos identificados, genomas secuenciados
• Cepas caracterizadas de acuerdo al sistema CRISPR/Cas
• Recursos humanos formados en el área
Perspectivas
• Establecer las bases para el diseño de cepas de S. thermophilus resistentes y estables: Tesis Doctorado en Biotecnología Rodrigo Achigar
• Búsqueda de nuevas cepas de BAL en muestras tradicionales y no tradicionales con propiedades tradicionales y no tradicionales con propiedades tecnológicas de interés: colaboración AUTEL y UTEC
• Continuar la colaboración con S. Moineau de la Université Laval, Canadá
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