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Deseo hacer constar mi agradecimiento a las numerosasDeseo hacer constar mi agradecimiento a las numerosas
personas que han contribuido a la realización de esta Tesispersonas que han contribuido a la realización de esta Tesis
Doctoral.Doctoral.
En primer lugar a mis directores, por la confianzaEn primer lugar a mis directores, por la confianza
depositada en mi y su continuo apoyo. Al Dr. Juan Evaristodepositada en mi y su continuo apoyo. Al Dr. Juan Evaristo
Suárez por aceptarme en su grupo de investigación y por susSuárez por aceptarme en su grupo de investigación y por sus
provechosas enseñanzas y a la Dra. Pilar García por ser mas queprovechosas enseñanzas y a la Dra. Pilar García por ser mas que
una directora una compañera de trabajo.una directora una compañera de trabajo.
Al Ministerio de Educación y Cultura por haber financiadoAl Ministerio de Educación y Cultura por haber financiado
este trabajo y por concederme una beca de Formación de Personaleste trabajo y por concederme una beca de Formación de Personal
Investigador.Investigador.
A la Dra. Margarita Salas por la cesión de la A la Dra. Margarita Salas por la cesión de la σσAA–RNA–RNA
polimerasa de polimerasa de Bacillus subtilisBacillus subtilis..
Al Dr. Juan Carlos Alonso por permitirme realizar variasAl Dr. Juan Carlos Alonso por permitirme realizar varias
estancias cortas en su laboratorio y por sus valiosos comentariosestancias cortas en su laboratorio y por sus valiosos comentarios
durante todo el desarrollo del trabajo.durante todo el desarrollo del trabajo.
También me gustaría expresar mi agradecimiento a losTambién me gustaría expresar mi agradecimiento a los
que me habéis ayudado con vuestros conocimientos y trabajo. Aque me habéis ayudado con vuestros conocimientos y trabajo. A
Quirós por su ayuda filtrando en el FPLC, a Victoria por losQuirós por su ayuda filtrando en el FPLC, a Victoria por los
mutantes, a Silvia por el promotor, Oscar, mucho vicio con elmutantes, a Silvia por el promotor, Oscar, mucho vicio con el
pov..., al Dr. E. Méndez por el Malditof y los extremos amino,pov..., al Dr. E. Méndez por el Malditof y los extremos amino,
Gracias a todos.Gracias a todos.
A los compañeros del laboratorio A, a todos los que estáis yA los compañeros del laboratorio A, a todos los que estáis y
a los que nos habéis abandonado, (y en especial a Soniaa los que nos habéis abandonado, (y en especial a Sonia
compañera de fatigas desde hace muchos años), por todos loscompañera de fatigas desde hace muchos años), por todos los
buenos momentos que hemos pasado juntos, pipeta con pipeta, ybuenos momentos que hemos pasado juntos, pipeta con pipeta, y
por vuestro apoyo constante.por vuestro apoyo constante.
A la gente del CNB, por su buena acogida y ayuda en todoA la gente del CNB, por su buena acogida y ayuda en todo
momento, dentro y fuera del laboratorio y en especial a Silvia &momento, dentro y fuera del laboratorio y en especial a Silvia &
Silvia, Arantxa y Charo.Silvia, Arantxa y Charo.
A los compañeros del Area de Microbiología y del IPLA,A los compañeros del Area de Microbiología y del IPLA,
becarios y precarios, por estar dispuestos siempre a prestar vuestrabecarios y precarios, por estar dispuestos siempre a prestar vuestra
ayuda desinteresada para que todo avance, por esos buenosayuda desinteresada para que todo avance, por esos buenos
momentos de camaradería delante de un café o una birra (omomentos de camaradería delante de un café o una birra (o
mas), y por escucharme aunque yo a veces hiciera oídos sordos.mas), y por escucharme aunque yo a veces hiciera oídos sordos.
Gracias.Gracias.
Y por último, pero no menos importante a mis padres por suY por último, pero no menos importante a mis padres por su
apoyo y constante ánimo para superarme. Y a Eva, sufridora enapoyo y constante ánimo para superarme. Y a Eva, sufridora en
casa de esta Tesis, gracias por tu compresión y apoyo en loscasa de esta Tesis, gracias por tu compresión y apoyo en los
momentos difíciles.momentos difíciles.
A Eva y PaulaA Eva y Paula
Indice i
INDICE i
ABREVIATURAS v
I. INTRODUCCION 1
I.1. LAS BACTERIAS LACTICAS. 1
I.1.1. Características generales. 1
I.1.2. Importancia y aplicaciones a nivel industrial. 2
I.2. LOS BACTERIOFAGOS DE LAS BACTERIAS LACTICAS. 4
I.2.1. El problema del desarrollo viral en la industria láctea. 4
I.2.2. Características estructurales. 5
I.2.3. Desarrollo viral. 7
I.2.3.1. Ciclo lítico. 8
I.2.3.2. Ciclo lisogénico. 10
I.2.4. Regulación de la decisión lisis / lisogenia. 11
I.2.5. Aplicaciones biotecnológicas de los fagos de bacterias lácticas. 15
I.3. EL BACTERIOFAGO A2 16
I.4. OBJETIVOS. 17
II. MATERIALES Y METODOS. 19
II.1. MICROORGANISMOS Y PLASMIDOS. 19
II.2. CONDICIONES DE CULTIVO Y CONSERVACION. 20
II.2.1. Lactobacillus casei. 20
II.2.2. Escherichia coli. 21
II.2.3. Bacteriófago. 21
II.3. OBTENCION Y PURIFICACION DE LOS VIRIONES DE A2. 21
II.4. OBTENCION DE MUTANTES DE DELECION DE A2. 22
II.5. PROCEDIMIENTOS DE TRANSFORMACION GENICA. 22
II.6. MANIPULACION Y ANALISIS DEL DNA. 23
II.6.1. Aislamiento del DNA. 23
II.6.2. Visualización del DNA. 23
ii Indice
II.6.3. Tratamientos enzimáticos del DNA. 24
II.6.4. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). 24
II.6.5. Purificación de fragmentos de DNA. 25
II.6.6. Transferencia e hibridación del DNA. 25
II.6.7. Secuenciación del DNA. 25
II.6.8. Análisis de las secuencias de DNA. 26
II.7. MANIPULACION Y ANALISIS DEL RNA. 27
II.7.1. Obtención del RNA. 27
II.7.2. Visualización del RNA. 27
II.7.3. Transferencia e hibridación del RNA. 28
II.8. PURIFICACION Y ANALISIS DE PROTEINAS. 28
II.8.1. Electroforesis de proteínas. 28
II.8.2. Obtención de las proteínas estructurales del fago A2. 29
II.8.3. Purificación de CI. 29
II.8.4. Purificación de Cro. 31
II.9. ANALISIS DE LA INTERACCION DNA – PROTEINA. 32
II.9.1. Ensayos de retención en filtro. 32
II.9.2. Ensayos de retardo en gel. 33
II.9.3. Ensayos de protección frente a la digestión con DNasa I. 34
II.10. TRANSCRIPCION in vitro. 34
III RESULTADOS. 37
III.1. LOCALIZACION DEL GEN DEL REPRESOR. 37
III.2. ANALISIS DE LA SECUENCIA. 39
III.3. EL GEN cI CONFIERE INMUNIDAD A LA SUPERINFECCION. 43
III.4. CARACTERIZACION DE LOS PROMOTORES PL Y PR. 44
III.5. INTERACCION DE CI CON EL CONMUTADOR GENETICO DE A2.49
III.5.1. Purificación del represor. 49
III.5.2. CI se une de forma específica a la región intergénica cI – cro. 49
III.5.3. CI se une cooperativamente a la región intergénica cI – cro. 51
III.5.4. CI se une a los operadores del bacteriófago A2. 55
Indice iii
III.5.5. CI reprime la transcripción a partir de PR. 56
III.5.6. CI recoloca la RNA polimerasa en la región intergénica cI – cro. 57
III.6. INTERACCION DE CRO CON EL CONMUTADOR GENETICO DEL
CICLO. 63
III.6.1. Purificación de Cro. 63
III.6.2. Cro se une de forma específica a la región intergénica cI – cro. 66
III.6.3. Cro se une a los operadores del sistema. 71
III.6.4. Cro inhibe la transcripción a partir de PL. 72
III.6.5. Cro desplaza a la RNAP del promotor PL en la región intergénica
cI – cro. 74
III.7. IDENTIFICACION DEL OPERON DE LAS PROTEINAS
ESTRUCTURALES DEL FAGO A2. 78
III.7.1. Composición proteica de los viriones. 78
III.7.2. Localización de las proteínas mayoritarias de la cápsida. 80
III.7.3. Localización de los genes estructurales en el genoma del fago. 81
III.7.4. Análisis de la secuencia de nucleótidos. 84
III.7.5. Análisis de la secuencia de aminoácidos. 87
III.7.6. Expresión de los genes estructurales. 92
IV DISCUSION. 95
IV.1. EL CONMUTADOR DE CICLO DEL BACTERIOFAGO A2. 96
IV.2. CARACTERISTICAS Y FUNCION DE CI. 101
IV.3. CARACTERISTICAS Y FUNCION DE CRO. 104
IV.4. EL OPERON DE LAS PROTEINAS ESTRUCTURALES. 107
CONCLUSIONES. 117
BIBLIOGRAFIA. 119
Anexo I
Anexo II
Abreviaturas v
ABREVIATURAS
A Adenina o Adenosina.
aa Aminoácidos.
Ap Ampicilina.
ATCC American Type Culture
Collection.
BrEt Bromuro de etidio.
C Citosina o citidina.
CAPS Acido 3-(ciclohexilamino)-
1-propanosulfónico.
cDNA Acido desoxirribonucleico
complementario.
Ci Curios.
Cm Cloranfenicol.
Da Dalton(s).
dATP Desoxiadenina 5´-trifosfato.
dCTP Desoxicitosina 5´-trifosfato.
DEPC Dietilpirocarbonato.
dGTP Desoxiguanina 5´-trifosfato.
DNA Acido desoxirribonucleico.
DNasa Desoxiribonucleasa.
DO Densidad óptica.
dsDNA DNA en doble cadena.
DTT Ditiotreitol.
dTTP Desoxitimina 5´-trifosfato.
EDTA Acido etileno-
diaminotetraacético.
EMBL European Molecular
Biology Laboratory.
EMSA Ensayos de retardo en gel.
Ery Eritromicina.
FPLC Fast Performance Liquid
Chromatography.
G Guanina o guanosina.
I Inosina.
IPTG 1-isopropil-β-D-1-
tiogalactopiranósido.
Kapp Constante aparente de
equilibrio.
kb kilobase(s).
KD Constante de disociación.
mdi Multiplicidad de infección.
MOPS Acido 3-(N-morfolin)
propano sulfónico.
mRNA Acido ribonucleico
mensajero.
NIH National Institute of Health.
Orf Pauta abierta de lectura.p/v Relación peso / volumen.
PAGE Electroforesis en gel de
poliacrilamida.
pb Par(es) de base(s).
PCR Reacción en cadena de la
polimerasa.
PEG Polietilénglicol.
pI Punto isoeléctrico.
vi Abreviaturas
PIR Protein Identification
Resource.
R Base Púrica.
RBS Sitio de unión al ribosoma.
Rif Rifampicina.
RNA Acido ribonucleico.
RNAP σA-RNA polimerasa de
Bacillus subtilis.
RNasa Ribonucleasa.
rRNA Acido ribonucleico
ribosómico.
SD Desviación estandar.
SDS Sodio dodecilsulfato.
T Timina o timidina.
TA Temperatura de
anillamiento de los
oligonucleótidos.
TCA Acido Tricloroacético.
Tris 2-amino-2(hidroximetil)-
1,3-propanodiol.
tRNA Acido ribonucleico de
transferencia.
U Uracilo o uridina.
ufp Unidades formadoras de
placas.
UTP Uridina 5´-trifosfato.
UV Luz ultravioleta.v/v Relación volumen /
volumen.
Y Base pirimidínica.
Abreviaturas vii
ABREVIATURAS DE AMINOACIDOS
Ala Alanina A
Arg Arginina R
Asn Asparragina N
Asp Acido aspártico D
Cys Cisteína C
Gln Glutamina Q
Glu Acido glutámico E
Gly Glicina G
His Histidina H
Ile Isoleucina I
Leu Leucina L
Lys Lisina K
Met Metionina M
Phe Fenilalanina F
Pro Prolina P
Ser Serina S
Thr Treonina T
Trp Triptófano W
Tyr Tirosina Y
Val Valina V
Introducción 1
I.1. LAS BACTERIAS LACTICAS.
I.1.1. Características generales.
El término bacterias lácticas designa un grupo heterogéneo de bacterias
Gram positivas que presentan un metabolismo fermentativo de los azúcares, cuyo
principal producto final es el ácido láctico. Además comparten otros rasgos comunes
como ser microaerófilas, no forman esporas, no pigmentan y no reducen el nitrato
(Dellaglio y col., 1994).
El grupo se subdivide en bacterias homo y heterofermentativas. Las
primeras se caracterizan porque el único producto de la fermentación de los
carbohidratos es el ácido láctico, mientras que las heterofermentativas originan,
además, dióxido de carbono, etanol y/o ácido acético (Kandler, 1983). Dentro del
grupo se engloban los organismos pertenecientes a los géneros Lactococcus,
Vagococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Aerococcus, Alloiococcus,
Tetragenococcus, Streptococcus, Enterococcus, Lactobacillus, Carnobacterium,
Bifidobacterium y Propionibacterium. Todos ellos, excepto los correspondientes a
los dos últimos géneros pertenecen a la subdivisión Clostridium del grupo de
bacterias Gram positivas. Estos organismos presentan genomas con un contenido en
G + C inferior al 50% (Stackebrand y Teuber, 1988; Collins y col., 1991; Gasser y
col., 1994). Los géneros Bifidobacterium y Propionibacterium se adscriben a la
subdivisión Actinomyces, cuyos miembros se caracterizan por poseer genomas con
un contenido en G + C superior al 50%. Esta dicotomía se ha confirmado con los
datos de la comparación de la secuencia de los rRNA 16S (Schleifer y col., 1995).
Las bacterias lácticas son habitualmente saprofíticas, encontrándose en los
suelos fértiles y las partes aéreas de los vegetales. Adicionalmente algunas cepas,
sobre todo de especies pertenecientes al género Lactobacillus, son mutualistas,
encontrándose en los tractos digestivo y urogenital de los animales, incluido el
2 Introducción
hombre, donde protegen las mucosas de la colonización por microorganismos
indeseables. Por ello, es frecuente que contaminen los productos alimentarios
derivados de los vegetales y los animales, provocando en ellos la fermentación de
los azúcares, circunstancia que ha sido aprovechada como un método de
conservación, ya que la acidez resultante de la producción de ácido dificulta el
desarrollo de los microorganismos patógenos y de la microbiota causante de
alteraciones indeseables, fundamentalmente la putrefacción. Esta capacidad ha sido
explotada por la humanidad durante cientos de años como un método de
conservación de los alimentos, siendo las especies utilizadas de forma mas
generalizada las pertenecientes a los géneros Lactobacillus, Leuconostoc,
Lactococcus, Pediococcus, Streptococcus y Bifidobacterium, pudiendo encontrarse
en numerosos alimentos fermentados de consumo muy habitual como embutidos,
encurtidos, pan, conservas vegetales, derivados lácticos y bebidas (McKay y
Baldwing, 1990).
I.1.2. Importancia y aplicaciones a nivel industrial.
La gran variedad de productos fermentados que consumimos en la
actualidad ha originado un creciente interés por la investigación sobre las bacterias
lácticas. Los estudios sobre su fisiología y los procesos fermentativos en si mismos
han transformado algunas de las fermentaciones tradicionales, que se realizaban de
forma empírica, en procesos industriales cuidadosamente controlados, especialmente
en la industria láctea debido a la gran importancia económica de este sector. Hoy en
día se tiende a la sustitución de los cultivos iniciadores preexistentes en la materia
prima, generalmente constituidos por una mezcla compleja de microorganismos, por
otros diseñados en el laboratorio, que simplifiquen el control fisiológico del proceso,
aseguren la ausencia de microorganismos indeseables sin alterar las propiedades
finales del producto, y permitan su estandarización (Rose, 1982; McKay y Baldwin,
1990; Cuesta, 1996).
La tendencia actual en la investigación sobre las bacterias lácticas es la
identificación de los determinantes que dan lugar a las características típicas de los
alimentos fermentados. Así por ejemplo, en el caso de las leches fermentadas se ha
Introducción 3
comprobado que la textura viene determinada por la producción o no de cápsulas
exopolisacarídicas, y el aroma por compuestos como el diacetilo y el acetaldehido,
los cuales confieren el olor a mantequilla y yoghurt, respectivamente (Kandler,
1983; Cogan, 1995). Los avances en la biotecnología han permitido identificar y
caracterizar la base genética de estas propiedades en algunas cepas de los géneros
Lactococcus y Lactobacillus, además de estabilizar los genes responsables en cepas
de uso industrial (Smith y col., 1992). Esto ha conducido también a la manipulación
de las rutas de interés, con lo que se ha conseguido, por ejemplo, la sobreproducción
de enzimas exocelulares, de gran importancia en la maduración de alimentos
fermentados como el queso, la obtención de cepas de Lactococcus con alteraciones
en las rutas de degradación del piruvato, tendentes a dirigir el flujo metabólico hacia
la producción de diacetilo (Swindell y col., 1996) o el uso de bacterias lácticas con
capacidad de producción de compuestos antimicrobianos para una mejor
conservación de los alimentos (Piard y Desmazeaud, 1991 y 1992).
Adicionalmente, las bacterias lácticas están consideradas como organismos
GRAS (“General Regarded As Safe”) y ciertas cepas, generalmente pertenecientes
al género Lactobacillus, poseen la capacidad de regular la actividad de la microbiota
intestinal y vaginal, teniendo un papel activo en el desarrollo del sistema inmune, en
la cura de casos de diarrea, en la prevención de determinados tipos de cáncer y en la
reducción de los niveles de colesterol (González y col., 1990; Kaila y col., 1992;
Sanders, 1993; Salminen y col., 1996; Boris y col., 1998). Todo ello ha determinado
la aparición de diversos derivados lácteos como el Actimel® o el LC1®, que
promueven el uso probiótico de las bacterias lácticas. Por ultimo, se está ensayando
el uso de bacterias lácticas en la inmunización oral contra patógenos, mediante la
expresión directa de sus antígenos en las mucosas que colonizan (Bottazzi y
Mercenier, 1994; Medaglini y col., 1997; Maassen y col., 1999).
4 Introducción
I.2. LOS BACTERIOFAGOS DE LAS BACTERIAS LACTICAS.
I.2.1. El problema del desarrollo viral en la industria láctea.
El éxito de las fermentaciones alimentarias industriales depende de la
composición de la materia prima, del adecuado crecimiento de los cultivos
iniciadores y de la estabilidad genética de los caracteres que inducen la
transformación deseada en aquélla. Dichos procesos son realizados a gran escala,
por lo que un fallo en la fermentación tiene como consecuencia grandes pérdidas
económicas. Las infecciones por bacteriófagos, bien por contaminación de la
materia prima o por inducción de profagos presentes en el cultivo iniciador, son la
principal causa de fallos en las fermentaciones lácteas. Los fagos provocan la lisis de
las bacterias iniciadoras de forma que no se obtiene una acidificación adecuada y así
el producto no alcanza el pH final esperado y no adquiere las propiedades
sensoriales deseadas. Además, en estas condiciones pueden desarrollarse
microorganismos alterantes o patógenos (Klaenhammer y Fitzgerald, 1994).
El problema de la contaminación por fagos en la industria láctea se conoce
desde hace mucho tiempo (Whitehead y Cox, 1935) y se debe a que la materia prima
empleada, la leche, no se puede esterilizar ya que el calentamiento daña las micelas
de caseína, lo que afecta a la coagulación de la leche y a la textura y características
del producto final (Teuber, 1995). Por otro lado, la pasteurización no elimina la
totalidad de las bacterias ni, lo que es mas importante, los bacteriófagos presentes en
el material de partida (Chopin, 1980; Teuber, 1995). Para tratar de paliar o reducir la
incidencia de las infecciones fágicas, se han desarrollado diversas estrategias como
el crecimiento de los cultivos iniciadores en medios ricos en fosfato (que quela los
cationes divalentes) y pobres en calcio, o la obtención de mutantes resistentes a la
infección. Con estas estrategias no se ha tenido mucho éxito, debido a la alta tasa de
evolución de los bacteriófagos que hace que en poco tiempo aparezca una nueva
variante de los mismos capaz de infectar a la cepa que antes era resistente
(Klaenhammer, 1984; Sandine, 1989). Actualmente, la estrategia mas empleada en
las industrias es la rotación de los cultivos iniciadores. Sin embargo, esta estrategia
no siempre se puede realizar debido a la actual especialización de los mismos,
Introducción 5
muchos de ellos están constituidos por una o unas pocas cepas con características
diseñadas para conferir las propiedades específicas deseadas al producto fermentado
final. La poca variedad de cepas existentes en estos cultivos hace que si se produce
la infección fágica se elimine la mayor parte del cultivo iniciador, provocando daños
mayores que cuando se utilizaban iniciadores naturales con una composición
compleja y mas heterogénea (Sing y Klaenhammer, 1993). Un nuevo avance en la
estrategia de rotación se ha conseguido mediante la construcción de cepas
isogénicas, en las que se han introducido, mediante técnicas de ingeniería genética,
diferentes genes de resistencia a bacteriófagos (Moineau, 1999). Esta estrategia
parece prometedora y soluciona alguno de los problemas planteados por la rotación
clásica de cultivos. Sin embargo, al tratarse de bacterias modificadas genéticamente,
tiene limitaciones legales de uso en algunos países, además de un impacto negativo
en la aceptación por parte de los potenciales consumidores.
Dada la importancia del fenómeno y su alcance económico se han realizado
grandes esfuerzos para caracterizar los bacteriófagos que infectan bacterias lácticas,
para definir sus características genéticas y fisiológicas, y sobre todo los mecanismos
naturales mediante los cuales las bacterias se defienden de ellos.
I.2.2. Características estructurales.
La mayoría de los estudios se han realizado sobre bacteriófagos que
infectan a Lactococcus lactis, estando la investigación en el resto de géneros y
especies menos avanzada. Para el género Lactococcus se han aislado y descrito
cientos de bacteriófagos (Jarvis, 1989; Jarvis y col., 1991; Teuber, 1995). Dentro del
género Lactobacillus se han identificado bacteriófagos que infectan a especies
como: L. plantarum (Trevors y col., 1983; Caso y col., 1995), L. casei (Herrero y
col., 1994; Nakashima y col., 1994), L. gasseri (Fremaux y col., 1993) y L.
delbrueckii (Forsman y Alatossava, 1991; Dupont y col., 1995). En el resto de
géneros los estudios han sido mínimos (Klaenhammer y Fitzgerald, 1994),
identificándose diversos bacteriófagos que infectan a Streptococcus thermophilus
(Brüssow y col., 1998) o Leuconostoc oenos (Arendt y col., 1991). En todos los
casos se han descrito tanto bacteriófagos virulentos como temperados.
6 Introducción
Los fagos que infectan a Lactococcus lactis pueden presentar tanto cabezas
isométricas como alargadas, habiéndose clasificado por tanto dentro de las familias
Podoviridae y Siphoviridae respectivamente y, dentro de ésta ultima, en los
morfotipos B1 y B2 de Ackermann y Dubow (1987). Los bacteriófagos descritos
para el género Lactobacillus poseen en general cabezas isométricas, aunque la
morfología de la cola no es homogénea, se han descrito bacteriófagos tanto con
colas contráctiles como no contráctiles (Trevors y col., 1983; Caso y col., 1995),
siendo clasificados dentro del morfotipo B1 (Ackermann y Dubow, 1987).
Asimismo, se han observado diferencias en la longitud de la cola, así como en la
presencia de estructuras adicionales del tipo de placas basales, collares y fibras. Las
cápsidas virales están constituidas por una serie de proteínas, normalmente mas de
diez, de las que dos o tres son mayoritarias, por lo que se postula que serían los
componentes principales de cabezas y colas.
El genoma de los bacteriófagos de Lactobacillus, en los casos en que se
conoce, está constituido por una molécula lineal de dsDNA, oscilando su tamaño
entre 37 y 42 kb, aunque los fagos de L. plantarum B2 (Nes y col., 1988), LP1–A y
LP1–B (Caso y col., 1995) presentan tamaños mayores (73 – 80 kb). En el caso de
los fagos de Lactococcus el tamaño genómico oscila habitualmente entre 18 y 55 kb
(Jarvis y col., 1991), aunque pueden alcanzar las 130 kb (Prévots y col., 1990). La
mayoría de los genomas fágicos estudiados hasta ahora presentan extremos
cohesivos 3´ sobresalientes (Lillehaug y col., 1991; Lubbers y col., 1994; García y
col., 1997), aunque algunos poseen permutación circular con redundancias
terminales (Trautwetter y col., 1986; Arendt y col., 1994).
En la actualidad se conoce la secuencia completa de varios fagos de
Lactococcus: bIL67 (Schouler y col., 1994), bIL170 (Crutz – Le Coq y col., 1997),
c2 (Lubbers y col., 1995), r1t (van Sinderen y col., 1996), sk1 (Chandry y col.,
1997), Tuc2009 (van Sinderen, comunicación personal), de los fagos de
Streptococcus thermophilus φO1205 (Stanley y col., 1997), DT1 (Tremblay y
Moineau, 1999), φSfi19 (Desiere y col., 1998), φSfi11 (Lucchini y col., 1999a) y
φSfi21 (Lucchini y col., 1999b) y de los fagos de Lactobacillus: LL–H (Mikkonen y
col., 1996), φg1e (Kodaira y col., 1997) y φadh (Altermann y col., 1999). Todos
estos datos, además de las secuencias de diferentes porciones de otros genomas
Introducción 7
fágicos, han permitido realizar estudios comparativos entre regiones genómicas de
virus relacionados. Se ha visto que la organización de los genes es muy similar entre
todos los bacteriófagos analizados hasta ahora, independientemente de la especie
hospedadora (Lucchini y col., 1998). La comparación de estas secuencias con las
disponibles en las bases de datos, ha permitido la adscripción de funciones a alguno
de los genes encontrados. Además, se han realizado estudios funcionales que han
permitido corroborar alguna de estas funciones: se han identificado los genes que
codifican las proteínas estructurales (Mikkonen y Alatossava, 1994; Arendt y col.,
1994; Johnsen y col., 1996; van Sinderen y col., 1996), se han caracterizado diversas
integrasas (Fremaux y col., 1993; Kakikawa y col., 1997; Alvarez y col., 1998),
genes implicados en la replicación del DNA (van Sinderen y col., 1996; McGrath, y
col., 1999; Moscoso y Suárez, 2000), genes implicados en el empaquetamiento del
DNA en la partícula fágica (García y col., 1997) y genes implicados en la lisis del
hospedador, previa a la liberación de las partículas fágicas de nueva síntesis (Boizet
y col., 1990; Herrero, 1996; Oki y col., 1996).
Por otro lado, los datos disponibles han permitido estudiar las relaciones
filogenéticas, para tratar de entender la variabilidad natural de los bacteriófagos. Se
ha podido comprobar que la teoría de la evolución modular de los fagos postulada
por Botsein en 1980 para los fagos lambdoides, es válida para los bacteriófagos de
bacterias lácticas (Lucchini y col., 1999b). Sin embargo, se postula que para estos
bacteriófagos la unidad mínima considerada como módulo intercambiable es menor
de un gen, puesto que se han encontrado datos que avalan que se ha intercambiado
una porción monofuncional de genes que codifican proteínas multifuncionales
(Desiere y col., 1998). Siendo precisamente la recombinación entre módulos la
principal fuente de variabilidad que explica diferencias en ciclo de vida o rango de
hospedador (Lucchini y col., 1999a).
I.2.3. Desarrollo viral.
El rango de hospedador de los bacteriófagos que infectan a bacterias
lácticas es muy estrecho, en la mayoría de los casos sólo infectan a una especie o
8 Introducción
incluso a unas pocas cepas dentro de una especie (Relano y col., 1987; Caso y col.,
1995).
El primer paso en la infección se produce mediante la adsorción de la
partícula vírica a la pared de la célula huésped. Mediante estudios de microscopía
electrónica con fagos de lactococos se ha comprobado que éstos atacan a las células
en pequeños grupos y en puntos distribuidos simétricamente (Budde – Nieckel y
Teuber, 1987). La adsorción ha sido estudiada con mucho detalle para el
bacteriófago de Lactobacillus casei PL – 1. Esta se produce en dos etapas: la
primera es una unión reversible en la que parecen estar implicados residuos de
azúcares de la pared celular como ramnosa (Ishibasi y col., 1982). El segundo paso
es una unión irreversible al receptor de la membrana celular, denominado PIP
(“Phage Infection Protein”) que requiere la presencia de iones Ca2+. Posteriormente
se produce la penetración del DNA en el citoplasma, mediante un proceso que
requiere ATP y síntesis proteica (Watanabe y col., 1979 y 1991). Una vez que el
DNA fágico ha penetrado en el interior de la célula se produce el ciclo infectivo. En
el caso de los fagos temperados el desarrollo de este ciclo infectivo puede seguir dos
caminos alternativos, el ciclo lítico o el ciclo lisogénico, mientras que los fagos
virulentos solo realizan el ciclo lítico.
I.2.3.1. Ciclo lítico.
Se conoce poco sobre el desarrollo intracelular de los fagos en bacterias
lácticas, aunque se han caracterizado los ciclos líticos de algunos de ellos mediante
el análisis de las curvas de desarrollo en un paso. Los periodos de latencia varían
entre 40 y 150 minutos, siendo en general, mas largos para los bacteriófagos de
Lactobacillus que para los de Lactococcus (Klaenhammer y Fitzgerald, 1994;
Herrero y col., 1994). Los tamaños de explosión varían entre 10 y 400 partículas
fágicas liberadas por célula infectada. Mediante mapas de transcripción se ha visto
que existe una expresión secuencial y temporal de genes con funciones relacionadas
y que éstos están agrupados en operones (Beresford y col., 1993; Chandry y col.,
1994; Madsen y Hammer, 1998). Esta regulación es necesaria para asegurar que la
cantidad de DNA y del resto de componentes estructurales necesarios están
Introducción 9
presentes en el momento adecuado y, de esta forma, optimizar el número de fagos de
la progenie. En el fago φ31 de Lactococcus lactis, se detectó la presencia de DNA en
el citoplasma celular a los 5 min postinfección y la presencia de concatémeros entre
los 20 y 40 min (Hill y col., 1991).
Una vez que el DNA fágico se ha replicado comienza el proceso de síntesis
de las proteínas que constituirán la cápsida. La cápsida es una estructura compleja
formada por cientos de subunidades proteicas que protege el genoma del virus y que
tras encontrar un hospedador adecuado interaccionará con él inyectando el DNA en
su interior. Consta de dos estructuras diferenciadas: la cabeza, una estructura
icosaédrica que contiene el DNA del fago y la cola, que tiene forma de tubo y puede
presentar una diversidad de estructuras accesorias como fibras, collares, espinas, etc.
La cola puede ser mas o menos larga y en algunos bacteriófagos es contráctil. Al
final de la misma se encuentran las proteínas encargadas del reconocimiento del
hospedador.
El ensamblaje de la cápsida es un proceso secuencial que se caracteriza por
la interacción de las proteínas que la forman y factores de ensamblaje no
estructurales, como puedan ser proteasas encargadas de procesos de maduración
proteolítica (Ackermann, 1999). En general el proceso de morfogénesis consta de
varias etapas. En un primer momento la proteína portal o conectora forma un anillo
al que se unen la proteína de andamiaje y la proteína mayoritaria de la cápsida,
formando la procápsida. La proteína de andamiaje sale de esta estructura y por un
proceso de expansión y maduración proteolítica, simultaneo con la entrada del DNA
del bacteriófago en la misma, se forma la precabeza. De forma independiente se
fabrica la cola a partir de unas proteínas iniciadoras que constituirán la base de la
misma. Sobre esta base se agregan subunidades de la proteína mayoritaria,
formándose de esta manera la estructura tubular que posteriormente se unirá a la
cabeza a través de la proteína conectora.
Se conoce poco acerca del proceso de morfogénesis de los bacteriófagos de
bacterias lácticas, aunque se han caracterizado un buen número de genes que
codifican proteínas estructurales. Así, se conocen los correspondientes a los fagos
bIL67 (Schouler y col., 1994), c2 (Lubbers y col., 1995), F4–1 (Chung y col., 1991),
r1t (van Sinderen y col., 1996), sk1 (Chandry y col., 1997), TP901–1 (Johnsen y
10 Introducción
col., 1996) y Tuc2009 (Arendt y col., 1994) de Lactococcus. Dentro de los fagos que
infectan Streptococcus thermophilus se han descrito recientemente en DT1
(Tremblay y Moineau, 1999), φO1205 (Stanley y col., 1997), φSfi11 (Lucchini y
col., 1998) y φSfi21 (Desiere y col., 1999). Por último, dentro de los fagos de
Lactobacillus se han descrito los de φadh (Altermann y col., 1999), φgle (Kakikawa
y col., 1996), LL–H (Mikkonen y Alatossava, 1994) y mv4 (Vasala y col., 1993). En
general se ha visto que los genes que codifican las proteínas estructurales se
encuentran agrupados en el genoma y que existe una gran diversidad en cuanto al
número y tamaño de los genes, lo que concuerda con lo observado en el resto de
bacteriófagos (Casjens y Hendrix, 1988).
Tras la replicación del DNA y la síntesis de las proteínas estructurales, el
DNA se empaqueta en las cabezas de los viriones mediante dos mecanismos
posibles. El de los bacteriófagos tipo pac se produce mediante llenado de cabeza
dando lugar a genomas circularmente permutados (Trautwetter y col., 1986;
Alatossava y Klaenhammer, 1991; Arendt y col., 1994), aunque en la mayoría de los
casos ocurre por reconocimiento y corte de sitios cos (Lillehaug y col., 1991;
Lubbers y col., 1994; Boyce y col., 1995a). El enzima responsable, la terminasa, ha
sido caracterizado únicamente en el caso del fago A2 y genera extremos cohesivos
3´ sobresalientes (García y col., 1997).
Los viriones de la progenie se liberan al final del periodo de latencia
mediante la acción concertada de dos proteínas, la holina y la lisina. La primera se
inserta en la membrana plasmática generando poros, lo que permite el acceso a la
pared celular de la segunda proteína, que degrada la capa de peptidoglucano de la
célula hospedadora, provocando en último termino la lisis celular y la liberación al
medio de las nuevas partículas fágicas, las cuales podrán comenzar un nuevo ciclo
infectivo.
I.2.3.2. Ciclo lisogénico.
La lisogenia es un fenómeno muy frecuente en bacterias lácticas (Davidson
y col., 1990; Cuesta y col., 1995), apareciendo incluso cepas multilisogénicas
(Jarvis, 1992). Se han identificado lisógenos en Lactococcus (Relano y col., 1987),
Introducción 11
Lactobacillus (Caso y col., 1995), Streptococcus (Bruttin y col., 1997) y
Leuconostoc (Arendt y col., 1991). El interés del estudio de la lisogenia se debe, por
un lado, a la posibilidad del desarrollo de nuevas herramientas genéticas y por otro,
a que diversos autores postulan que las cepas lisogénicas podrían actuar como
reservorios de fagos líticos, derivados de los temperados, en las plantas procesadoras
(Shimizu–Kadota y col., 1983; Relano y col., 1987; Klaenhammer y Fitzgerald,
1994; Bruttin y Brüssow, 1996).
El ciclo lisogénico comienza tras la inyección del DNA fágico en el interior
de la célula hospedadora. A la penetración del DNA le sigue la expresión de los
genes tempranos, entre ellos los que codifican el represor del ciclo lítico y la
integrasa. Estos dos genes son necesarios para impedir la producción de nuevos
viriones y para que el DNA fágico se incorpore al genóforo de la célula hospedadora
mediante un mecanismo de recombinación sitio – específica. En este estado de
latencia, que se denomina profago, va a permanecer hasta que alguna señal
medioambiental dispare la expresión de los genes líticos. El profago se transmite de
forma pasiva a las células de la progenie conjuntamente con el genoma del
hospedador y les confiere resistencia a la infección por parte del mismo fago o de
fagos relacionados. Esta propiedad se denomina inmunidad a la superinfección y
está basada en la capacidad del represor del ciclo lítico, responsable del
mantenimiento del estado de profago, de actuar en trans sobre los genomas fágicos
entrantes en la célula.
1.2.4. Regulación de la decisión lisis / lisogenia.
La regulación, a nivel molecular, de la decisión de seguir uno u otro ciclo
de desarrollo está perfectamente caracterizada para el bacteriófago λ (revisado en
Ptashne, 1992). En este bacteriófago existen dos regiones tempranas (OR y OL) en
las que se localizan cuatro promotores (PL, PR, PRE y PRM) y seis repeticiones
invertidas de 16 a 18 pb denominadas operadores (OR1/L1 a OR3/L3) (Figura I.2). La
unión de las proteínas CI o Cro a estos operadores determina la decisión de seguir
uno u otro ciclo de desarrollo. Una vez que el DNA del fago ha penetrado en la
célula se produce la expresión de los genes inmediatos tempranos, N y cro, a partir
12 Introducción
de los promotores PR y PL que son reconocidos por la RNA polimerasa del
hospedador. El producto del gen N es un antiterminador de la transcripción, que
permite la expresión, entre otros genes tempranos, del gen cII a partir de PR y del
gen cIII a partir de PL. Los productos de estos dos genes son necesarios para la
expresión de cI, el gen responsable del mantenimiento de la lisogenia. CIII es una
proteína que protege a CII de la degradación por parte de una proteasa de
codificación celular. CII es necesaria para que la RNA polimerasa celular pueda
reconocer a los promotores PRE y PI. A partir de PRE, o promotor del establecimiento
de la lisogenia, se transcribe cI, mientras que el segundo gobierna la transcripción de
los genes necesarios para la integración del DNA viral en el genoma del hospedador
en forma de profago. El que el virus siga un ciclo u otro de desarrollo va a depender
de las concentraciones relativas de CI y Cro en la célula.
attP int xis cIII N cI cIIcro O P Q
PLOL PRM/R OR
OL1 OL2 OL3 OR3 OR2 OR1
PL PRMPR
PREPI
cIIcII
N N NcI cI cI
Figura 1: Esquema del interruptor genético del bacteriófago λ. El rectángulo blancorepresenta el DNA de lambda y las líneas onduladas los mRNA. Se indican los inicios detranscripción (flechas truncadas), los sitios de activación (flechas invertidas) y represión(flechas tachadas) de la transcripción y la proteína efectora en cada caso. Modificado deHendrix y col. (1983).
Introducción 13
Una vez que se ha expresado cI, y por lo tanto se ha establecido la
lisogenia, deja de transcribirse a partir de PRE y pasa a depender de PRM, o promotor
del mantenimiento de la lisogenia, y la regulación de la misma depende de las
concentraciones relativas de CI y Cro que haya en la célula, lo que a su vez
determina la ocupación de los tres operadores (OR1, OR2 y OR3) de la región OR.
Tanto CI como Cro tienen capacidad de unión a los tres, pero la afinidad por cada
uno de ellos es distinta, lo que permite de hecho la expresión diferencial de sus
respectivos genes. OR1 y OR3 solapan con las regiones –35 de PR y PRM
respectivamente, mientras que OR2 está situada entre ambos promotores. CI tiene
mayor afinidad por OR1 y menor afinidad por OR3, mientras que Cro tiene afinidades
inversas, siendo OR3 el operador por el que tiene una mayor afinidad. A baja
concentración de CI, éste se unirá a OR1 y a OL1, reprimiendo la transcripción a partir
de PR y PL, lo que detiene la síntesis de Cro y de N, respectivamente. Esto determina
la detención de la síntesis de CII y CIII. Si la concentración de CI es suficiente se
unirá a OR2, lo que provocará la interacción entre CI y la subunidad σ de la RNAP.
Esta interacción permite que la RNAP reconozca de forma eficiente el promotor PRM
y de esta forma se induce la transcripción de cI a partir de él. Al seguir aumentando
la concentración de CI, éste se unirá a OR3 reprimiendo su propia transcripción. Al
no haber síntesis de nuevas moléculas de CI su concentración en la célula bajará
hasta que quede libre OR3 y de nuevo se producirá la síntesis de la proteína. De esta
forma se consigue que haya una concentración constante de CI en el citoplasma. Así
pues, el represor del ciclo lítico, CI, es un regulador autónomo de su propia síntesis,
actuando como un activador a bajas concentraciones y como un represor a
concentraciones altas. Una vez que CI se ha unido a los operadores OL y OR todos
los promotores que transcriben genes implicados en el ciclo lítico quedan
inactivados y el estado de profago se mantiene de forma estable. Ahora bien, si se
produce una disminución de la concentración de CI por debajo de un valor crítico,
los promotores pueden reactivarse. Esto puede ocurrir por diversas causas, siendo la
mas estudiada la que corresponde a la respuesta SOS. Esta respuesta se induce al
producirse un daño en el DNA celular, lo que va a provocar, como un proceso
colateral, la degradación proteolítica de CI mediada por RecA. Esto dará lugar a la
activación de los genes líticos a partir de los promotores tempranos y el inicio del
14 Introducción
ciclo lítico. En esta situación, o bien si tras la penetración del DNA fágico en la
célula no se llega a expresar el gen cI, se produce la activación del ciclo lítico ya que
los niveles de Cro presentes en la célula serán suficientes para unirse a OR3, lo que
reprime la transcripción a partir de PRM, y en consecuencia la producción de CI. La
transcripción de cro continuará hasta que la concentración de Cro sea suficiente para
unirse a OR1, lo cual reprimirá su propia transcripción. Esto es necesario porque se
ha comprobado que una excesiva expresión de los productos de los genes tempranos
es tóxica para la célula e interfiere con el desarrollo del ciclo lítico (Friedman y
Gottesman, 1983). Mediante este interruptor genético se consigue una perfecta
regulación de los dos ciclos alternativos del desarrollo del bacteriófago λ.
Se conoce muy poco acerca de la regulación de la decisión de seguir el
ciclo lítico o el lisogénico para los fagos de bacterias del ácido láctico. El análisis de
las secuencias de los bacteriófagos de Lactococcus lactis r1t (Nauta y col., 1996),
BK5T (Boyce y col., 1995b) y Tuc2009 (van de Guchte y col., 1994) revela la
existencia de una región con dos genes divergentes que podrían ser los homólogos
funcionales de cI y cro de estos fagos. En el caso de r1t en esta región se localizan
dos posibles operadores de 21 pb con simetría invertida separados por 2 pb. Estos
operadores solapan con las regiones –35 de los dos presuntos promotores
divergentes, además de presentar un posible tercer operador O1 solapando con el
homólogo estructural de λ cro. Asimismo, se ha comprobado que el producto del
probable represor del ciclo lítico, Rro, tiene capacidad de unión a esta región
temprana (Nauta y col., 1996). En el caso de BK5T, en la probable región
reguladora se localizan tres secuencias con simetría invertida de 18 pb separadas
entre sí por 10 y 24 pb. Los posibles operadores O1 y O3 se encuentran solapando
con las regiones –35 de los promotores divergentes localizados en la región,
mientras que O2 se localiza en el espacio entre ambos (Boyce y col., 1995b).
En cuanto a los bacteriófagos de Lactobacillus, la región temprana sólo se
ha descrito con detalle para los fagos φg1e (Kodaira y col., 1997), φadh (Engel y
col., 1998) y A2 (presente memoria, García y col., 1999; Ladero y col., 1999). Este
último, es el único fago de bacterias lácticas para el que se ha caracterizado a nivel
molecular la región de decisión genética. En el caso del bacteriófago φg1e se han
identificado dos genes, cng y cpg, cuyos productos serían los homólogos funcionales
Introducción 15
de λ Cro y CI, respectivamente. Se ha visto que Cng tiene la capacidad de unirse a
esa región del DNA, en la cual se localizan dos presuntos promotores divergentes y
cinco repeticiones invertidas (Kakikawa y col., 1998). En el caso de φadh, se ha
identificado el represor, Rad, y se ha visto que es capaz de reprimir la transcripción
de dos promotores divergentes localizados en la posible región de decisión lisis –
lisogenia, donde además se localizan tres repeticiones invertidas, dos de ellas de 17
pb solapan con las regiones –35 de ambos promotores, mientras que la tercera de 77
pb se localiza entre ambas, estando separada por 14 y 43 pb de las otras dos (Engel y
col., 1998).
I.2.5. Aplicaciones biotecnológicas de los fagos de bacterias lácticas.
El estudio de los bacteriófagos de bacterias lácticas ha conducido al
desarrollo de diversas herramientas biotecnológicas de aplicación al estudio de las
bacterias lácticas empleadas como iniciadores industriales. Así, se han desarrollado
varios vectores de integración basados en la integrasa y el sitio attP de varios fagos
(Dupont y col., 1995; Auvray y col., 1997; Lillehaug y col., 1997; Alvarez y col.,
1997; Brønsdted y Hammer, 1999). Estos vectores permiten la estabilización en el
cromosoma bacteriano de genes de interés, que si fueran de codificación plasmídica
serían inestables. Mediante la utilización del origen de replicación y los extremos
cohesivos del bacteriófago φLC3 se ha logrado el desarrollo de un cósmido que
permite el empaquetamiento de grandes porciones de DNA que posteriormente se
pueden introducir en la célula (Birkeland y Holo, 1993).
Otro campo de interés es el de la expresión de genes de una forma
controlada, lo que se ha logrado mediante el desarrollo de sistemas de expresión
inducible basados en un mutante termosensible del represor del bacteriófago r1t
(Nauta y col., 1996 y 1997). Mediante éste, u otros sistemas de expresión similares,
se han conseguido realizar lisis controladas de los cultivos mediante la clonación de
lisinas y holinas fágicas. La expresión de ambos enzimas es capaz de provocar la
lisis celular del cultivo, lo que podría, por ejemplo, acelerar la maduración de
algunos quesos (Crow y col., 1995; Gasson, 1996; de Ruyter y col., 1997). Otras
aplicaciones derivadas del estudio de los bacteriófagos son los denominados
16 Introducción
sistemas PER (“Phage Encoded Resistance”), entre los que destaca la clonación, en
un vector de alto número de copias, del origen de replicación de un fago, lo que hace
a la célula portadora resistente a la infección (Hill y col., 1990; Moscoso y Suárez,
2000) o la inserción en el genoma bacteriano de forma estable del represor del ciclo
lítico (Ladero y col., 1998; Alvarez y col., 1999). Otro mecanismo de defensa frente
a la infección fágica, inducible por ésta, consiste en la clonación de genes que
provoquen la muerte celular bajo el control de promotores fágicos tardíos y por lo
tanto inducibles por la infección (O´Sullivan y col., 1996; Djordjevic y col., 1997).
I.3. El BACTERIOFAGO A2
El bacteriófago A2 se aisló a partir de muestras de suero de leche utilizada
en la fabricación de queso Gamonedo, un queso azul artesano de larga maduración
producido en Asturias (Herrero y col., 1994). Este fago infecta a cepas de
Lactobacillus casei y Lactobacillus paracasei, entre ellas a L. casei ATCC 393,
cepa de referencia y que se emplea en la maduración de quesos y en la elaboración
de leches fermentadas comerciales. Este bacteriófago es temperado, presenta
viriones desnudos compuestos de una cabeza isométrica y una cola larga, flexible,
no contráctil y que presenta en su extremo una placa basal (Figura 2A).
0 kb
coscos
44 kb
Lisis Módulo de replicación terter int
A)
B)
Figura 2: A) Micrografía electrónica del bacteriófago A2. B) Mapa del genoma delbacteriófago A2, las líneas verticales representan los sitios de restricción EcoRI, se indican
Introducción 17
los extremos cohesivos (cos), los genes de la terminasa (ter), la integrasa (int), los genesimplicados en la lisis y el módulo de replicación.
Pertenece por tanto a la familia Siphoviridae y se puede catalogar como
perteneciente al morfotipo B1 de la clasificación de Ackermann y Dubow (1987). Su
ciclo de desarrollo tiene periodos de eclipse y de latencia de 100 y 120 min,
respectivamente y su tamaño de explosión es de 180 ufp/célula. Su genoma esta
compuesto por una doble cadena de DNA de 44 kb que presenta extremos cohesivos
3´sobresalientes (Herrero y col., 1994; García y col., 1997). Se ha caracterizado la
integrasa y el sitio de integración attP y se ha visto que la integración se realiza por
recombinación sitio – específica en un gen que codifica el tRNALeu cuyo anticodón
es CAA (Alvarez y col., 1998). Así mismo, se han localizado y caracterizado otros
genes (Figura 2B), entre ellos la terminasa, que es el enzima encargado del corte de
los concatémeros de DNA y de su empaquetamiento dentro de la cápsida (García y
col., 1997). También se identificó el gen que codifica la proteína mayoritaria de la
cápsida (Herrero, 1996), la región de replicación (Moscoso y Suárez, 2000) y los
genes lisina y holina, cuyos productos están implicados en la lisis celular (Herrero,
1996).
I. 4. OBJETIVOS.
Diversos estudios (Núñez, 1978; González del Llano y col., 1992) han
demostrado que los lactobacilos mesófilos son las bacterias lácticas predominantes
en algunos quesos frescos y azules producidos de forma artesanal en Asturias. En la
actualidad existe una gran demanda de estos productos, por lo que existe un
creciente interés en las industrias lácteas por poner en marcha su producción a gran
escala, lo que conllevará una previsible estandarización de los cultivos iniciadores.
Por otra parte, determinadas cepas de lactobacilos se están utilizando como
iniciadores en la manufactura de embutidos y encurtidos y también en la fabricación
de leches fermentadas a las que se les atribuye un valor probiótico.
En nuestro laboratorio, entre otros temas, estamos interesados en el estudio
de los fagos que infectan a estas bacterias, especialmente a Lactobacillus plantarum
y Lactobacillus casei, como un paso previo al desarrollo de sistemas de resistencia a
la infección. El aislamiento y caracterización de bacteriófagos que infectan a
18 Introducción
lactobacilos mesófilos contribuirá, además, a lograr un mayor conocimiento de este
grupo de fagos poco estudiado. Al mismo tiempo, trataremos de desarrollar
herramientas genéticas aplicables en biotecnología.
En este trabajo nos hemos centrado en el bacteriófago A2, cuyas
características generales ya han sido descritas. Los objetivos concretos de esta Tesis
pueden resumirse en los tres siguientes:
1. Caracterización de la base estructural y funcional de la región genómica
que regula la decisión lisis – lisogenia.
2. Caracterización, a nivel funcional, de las proteínas implicadas en dicho
proceso de regulación.
3. Localización y caracterización de la región genómica que codifica las
proteínas estructurales que componen la cápsida viral.
Materiales y métodos 19
II.1. MICROORGANISMOS Y PLASMIDOS.
Para el desarrollo de este trabajo se utilizaron las cepas bacterianas y
bacteriófagos que se detallan en la Tabla 1.
Cepa / bacteriófago Genotipo / fenotipo relevante Referencia/Fuente
Lactobacillus casei
ATCC 393 Cepa hospedadora de A2 ATCC
393 Cepa curada de pLZ15 Dr. J. Kok. R U, Groningen
393-A2 Derivado lisogénico de A2 Herrero y col., 1994
Escherichia coli
XL-1 Blue F´ Tn10 pro A+B+ laqIq ∆(lacZ) M15/
recA1 endA1 gyrA96 (Nalr) thi hsdR17 (rk-
mk-) supE44 relA1 lac Bullock y col., 1987
DH10B F- mcrA ∆(mrr- hsd RMS- mcrBC) φ80d
lacZ ∆M15 ∆lacX74 endA1 recA1 deoR
∆(ara, leu)7697 araD139 galU galK nup6
rpsL λ- GIBCO BRL
BL21(DE3) F- hsdS (rB-mB
-) RNA polimerasa del fago
T7 bajo el control del promotor lac UV54 Studier y Moffatt, 1986
Bacteriófago
A2 Herrero y col., 1994
Tabla 1: Cepas bacterianas y bacteriófago.
En la Tabla 2 se detallan los vectores utilizados, sus características mas
relevantes, así como los plásmidos mas importantes construidos a partir de dichos
vectores durante el desarrollo del trabajo. La descripción de la construcción de estos
plásmidos, así como sus características mas importantes, se detalla en apartados
posteriores.
20 Materiales y métodos
Vector / plásmido Características relevantes Referencia/Fuente
Vectores
pEM40 EryR ApR Integrasa y attP del fago A2 Alvarez y col., 1998
pET11a ApR Vector de expresión inducible por
IPTG
Studier y col., 1990
pLys CmR Lisozima del fago T7 Studier, 1991
pUC18 ApR Selección por inactivación del gen
lacZ
Yanisch–Perron y col., 1985
Plásmidos
pEM40–cI Gen cI del fago A2 Apartado III.3
pET11a–cI Gen cI del fago A2 Apartado II.8.3
pET11a–cro Gen cro del fago A2 Apartado II.8.4
pUO183 pUC18 con la región intergénica entre
cI y cro del fago A2
Apartado II.9.1
Tabla 2: Vectores, y plásmidos generados a partir de estos, utilizados en el presente trabajo.
II.2. CONDICIONES DE CULTIVO Y CONSERVACION.
Las cepas bacterianas se conservaron congeladas a –70ºC o a –20ºC en medio
de cultivo al que se le añadió glicerol a una concentración final del 20% (v/v). En el
momento de sembrarlas se descongelaron, incubándose en los medios
correspondientes a la temperatura adecuada para cada cepa bacteriana. Los medios
sólidos y semisólidos son los que se describen a continuación añadiéndoles 1´5% y
0´5% (p/v) de agar – agar, respectivamente.
II.2.1. Lactobacillus casei.
L. casei se cultivó en medio MRS (Oxoid), a 30ºC en estático, tanto en medio
líquido como sólido. La concentración de eritromicina (ery) para la selección de las
cepas transformantes fue de 5 µg/ml.
Materiales y métodos 21
II.2.2. Escherichia coli.
Las cepas de E. coli se incubaron a 37ºC en medio 2xTY (Sambrook y col.,
1989) con agitación forzada cuando el medio era líquido. La concentración de
antibiótico para la selección de las cepas transformantes fue de 150 µg/ml para ery,
100 µg/ml para ampicilina (ap) y 25 µg/ml para cloranfenicol (cm).
II.2.3. Bacteriófago.
Para la propagación del bacteriófago A2 se utilizó medio MCM (medio
MRS suplementado con MgSO4 10 mM y CaCl2 10 mM), tanto líquido como sólido.
En este último caso se empleó el método en doble capa de Adams (1959).
II.3. OBTENCION Y PURIFICACION DE LOS VIRIONES DE A2.
Para la obtención de suspensiones fágicas a pequeña escala se propagaron
los bacteriófagos en medio MCM sólido. La extracción de los viriones se llevó a
cabo según se ha descrito previamente (Suárez y Chater, 1981) mediante la
resuspensión de los fagos en tampón SM (Tris – HCl 20 mM, NaCl 100 mM,
Ca(NO3)2 10 mM y MgSO4 10 mM; pH 7´2) a partir de placas de Petri que
presentaban lisis semiconfluente. La suspensión se limpió por centrifugación a baja
velocidad seguida de una ultracentrifugación a 35.000 rpm en un rotor Beckman
42Ti durante 90 min a 4ºC. El precipitado se resuspendió en un pequeño volumen de
tampón SM. Estas suspensiones se esterilizaron por filtración a través de filtros de
nitrocelulosa de 0´45 µm ∅ de poro y se almacenaron a 4ºC.
Para la obtención de virus a gran escala la propagación se realizó en caldo
MCM inoculado con un cultivo de L. casei al 1%. El cultivo se incubó a 30ºC hasta
alcanzar una DO600 = 0´2. En este momento se infectó con el fago A2 a una
multiplicidad de infección (mdi) = 0´1 y la incubación se prolongó durante 12 horas.
Para la recuperación de los fagos se siguió el mismo protocolo descrito para la
obtención a pequeña escala.
22 Materiales y métodos
La purificación de los viriones se realizó mediante gradiente de CsCl. A las
suspensiones obtenidas se les añadió CsCl a una concentración final de 750 mg/ml y
se ultracentrifugaron en un rotor Beckman 75Ti (40.000 rpm) durante 24 h a 20ºC.
Tras la obtención de la banda correspondiente al fago esta se dializó frente a tampón
SM.
La visualización de los viriones se realizó por microscopía electrónica a
partir de las suspensiones purificadas. Se empleó una tinción negativa con acetato de
uranilo según el método descrito por Suárez y col. (1984). Las suspensiones se
depositaron sobre rejillas de cobre de malla fina recubiertas de Formvar y se
visualizaron en un microscopio electrónico JEOL 2000 EXII.
II.4. OBTENCION DE MUTANTES DE DELECIÓN DE A2.
Para la obtención de mutantes de deleción del bacteriófago A2 se partió de
suspensiones fágicas con un título de 5 x 109 ufp/ml. Estas suspensiones fueron
tratadas en rondas sucesivas con una solución 10 mM de pirofosfato sódico, pH 7´4,
a 37ºC durante 30 min, transcurridos los cuales se plaquearon las diluciones
apropiadas en medio MCM. Los bacteriófagos supervivientes se recogieron de
placas que mostraron una lisis semiconfluente. Se centrifugaron durante 2 h a 35.000
rpm en un rotor Beckman 42Ti. El precipitado se resuspendió en tampón SM y los
fagos presentes se sometieron a una nueva ronda de tratamiento. En cada ronda de
selección se hicieron diluciones para obtener placas aisladas. Se seleccionaron los
fagos de 25 placas, los cuales se propagaron, purificaron y guardaron para análisis
posteriores.
II.5. PROCEDIMIENTOS DE TRANSFORMACION GENICA.
La introducción de plásmidos en el interior de las cepas bacterianas se
realizó mediante electroporación con un equipo “Gene pulser” de Bio-Rad.
Las condiciones de los diferentes parámetros para E. coli fueron las
descritas por Dower y col. (1988). L. casei se transformó por electroporación
utilizando el método descrito por Lockman y col. (1994) con modificaciones. Las
Materiales y métodos 23
células de un cultivo de una noche en medio MRS con 1% de glicina se diluyeron
1:10 en el mismo medio y se incubaron a 37ºC durante una hora. Estas células se
recogieron por centrifugación, se lavaron tres veces con agua mili Q a 4ºC y se
resuspendieron en PEG 1500 al 30% (p/v) en 1/100 del volumen de cultivo. Después
se repartieron alícuotas de 50 µl en tubos eppendorf en hielo y etanol (-20ºC). A las
células se les añadió el DNA (0´05 – 4 µg) disuelto en 1 µl de agua mili Q. Las
condiciones para el pulso fueron: 25 µF, 2.500 V y 400 Ω. Las células se
resuspendieron en 600 µl de MRS y tras eliminar por centrifugación el PEG del
sobrenadante, se incubaron una hora a 30ºC y se sembraron en placas de MRS con el
antibiótico apropiado.
II.6. MANIPULACION Y ANALISIS DEL DNA.
II.6.1. Aislamiento del DNA.
La extracción de DNA plasmídico de E. coli se llevó a cabo mediante el
método del SDS alcalino (Birboim y Doly, 1979). En algunas ocasiones esta
extracción se realizó mediante el kit comercial “Plasmid MiniKit” de Quiagen. En el
caso de que el DNA plasmídico fuese posteriormente utilizado en secuenciación la
extracción se realizó mediante el kit “Wizard Plus SV Miniprep” de Promega. El
DNA empleado en los ensayos con proteínas se purificó por centrifugación en
gradiente de CsCl (Sambrook y col., 1989).
El DNA del bacteriófago A2 se extrajo según el método descrito por Suárez
y Chater (1981) siguiendo las modificaciones de Herrero y col. (1994).
II.6.2. Visualización del DNA.
Las moléculas de DNA se separaron en geles de agarosa siguiendo el
método de Meyers y col. (1976), utilizando tampón Tris-Borato (Tris 89 mM,
EDTA 2´5 mM y ácido bórico 8´9 mM; pH 8) como electrolito. Los geles se
prepararon con concentraciones variables de agarosa, en un rango entre 0´8% y
1´5% (p/v). Para la detección de fragmentos de DNA de pequeño tamaño se
24 Materiales y métodos
realizaron electroforesis en geles de poliacrilamida al 7% (p/v). En ambos casos el
DNA presente en el gel se visualizó por exposición a luz UV tras realizarse una
tinción con una solución acuosa de BrEt a una concentración final de 0´5 µg/ml.
Como patrones de tamaño se utilizaron los fragmentos de DNA del fago λ
(Pharmacia Biotech) generados por digestión con las endonucleasas de restricción
HindIII o PstI.
II.6.3. Tratamientos enzimáticos del DNA.
Las diferentes endonucleasas de restricción usadas fueron suministradas por
las casas comerciales Amersham, Boehringer Mannheim y Gibco BRL. Las
ligaciones se realizaron mediante el Kit “T4 DNA ligase – Ready to go” de
Pharmacia. Los enzimas fosfatasa alcalina, polinucleótido quinasa del fago T4 y
RNasa fueron suministradas por Boehringer Mannheim. En todos los casos se
utilizaron según las recomendaciones indicadas por las casas suministradoras. Para
el marcaje radiactivo de los fragmentos de DNA, este se incubó durante 15 min a
temperatura ambiente con el fragmento Klenow de la DNA polimerasa I de E. coli
(Amersham) en presencia de dATP, dGTP, dTTP y [α32P]dCTP (3.000 Ci/mmol,
Amersham). Tras la inactivación del enzima, los nucleótidos no incorporados se
eliminaron mediante filtración en una columna de Sephadex G – 25 (Pharmacia).
II.6.4. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Las reacciones de PCR se realizaron utilizando las DNA polimerasas
termoestables de Boehringer Mannheim Taq y Pwo, esta última en el caso de querer
clonar los fragmentos generados. En el caso de que los fragmentos de DNA a
generar fuesen de gran tamaño se utilizó el sistema “Expand” (Boehringer
Mannheim). Las amplificaciones se realizaron en un termociclador “Minicycler”
(MJ Research) en un volumen final de 50 µl según las indicaciones del fabricante.
Las temperaturas de anillamiento de los oligonucleótidos fueron entre 5 y 10ºC
inferiores a la TA calculada para ellos.
Materiales y métodos 25
II.6.5. Purificación de fragmentos de DNA.
La purificación de fragmentos de DNA procedentes de restricción con
endonucleasas o de amplificación por PCR se realizó por electroelución, tras
separación de los mismos en geles de agarosa o poliacrilamida (Sambrook y col.,
1989). Las tripas de diálisis utilizadas fueron suministradas por Sigma. En algunas
ocasiones los fragmentos de PCR se purificaron mediante el “PCR purification Kit”
de Quiagen siguiendo las instrucciones facilitadas por el fabricante, en este caso no
se procedió a la separación previa de los fragmentos por electroforesis.
II.6.6. Transferencia e hibridación del DNA.
La transferencia de fragmentos de DNA desde los geles de agarosa a
membranas de nylon “Hybond – N” (Amersham) se realizó según la técnica de
Southern (1975), siguiendo las indicaciones de Sambrook y col. (1989).
Posteriormente el DNA se fijó de forma irreversible a la membrana mediante
irradiación con luz UV durante 2 min.
Los oligonucleótidos usados como sondas se marcaron radiactivamente con
polinucleótido quinasa y [γ32P]dATP (3.000 Ci/mmol, Amersham). La sonda se
purificó mediante filtración en una columna de Sephadex G – 25 (Pharmacia). La
hibridación se realizó usando “Rapid Hybrid Buffer” (Amersham) siguiendo las
instrucciones del fabricante en cuanto a condiciones de prehibridación, hibridación y
lavados de la membrana. La detección de las bandas radiactivas se realizó por
exposición en películas “Hyperfilm MP” (Amersham).
II.6.7. Secuenciación del DNA.
La secuenciación del DNA se llevó a cabo por el método de los
dideoxinucleótidos (Sanger y col., 1977) de forma manual y automática. En el
primer caso se utilizó el kit de la “Sequenase 2.0” (Amersham) y [35S]dATP (1.200Ci/mmol; Amersham) para el marcaje. El DNA utilizado como molde fue el de los
distintos clones y subclones que se construyeron en el vector pUC18. Antes de
26 Materiales y métodos
iniciar la reacción de marcaje, el DNA en doble cadena se desnaturalizó siguiendo el
método de Hattori y Sakaki (1986). Como cebadores se utilizaron los
oligonucleótidos directo y reverso de pUC18 y, cuando fue necesario, se diseñaron
oligonucleótidos específicos para completar la secuencia. Los productos de la
reacción se separaron en geles de poliacrilamida al 6% en condiciones
desnaturalizantes (Sambrook y col., 1989) y se visualizaron, tras su secado, por
exposición en una película “Hyperfilm MP” de Amersham. La secuenciación
automática se llevó a cabo en un equipo “ALFexpress” (Pharmacia) realizándose los
marcajes con los kits de Pharmacia “Autocycle sequencing kit” y “Thermo
sequenase fluorescent labelled primer cycle sequencing kit”, utilizando como
marcaje en los oligonucleótidos el fluoróforo Cy5 (Pharmacia). La separación de las
reacciones se realizó en geles desnaturalizantes de poliacrilamida al 6%
(“Rapidgel”, Amersham; “Ready Mix”, “High resolution Reprogel” y “Long Read
Reprogel” de Pharmacia). Los resultados se analizaron con el programa ALFwin v.
1.1.
La secuenciación de fragmentos de PCR se realizó por los mismos
métodos, excepto que el fragmento a secuenciar se purificó previamente (ver
apartado II.6.5). En el caso de secuenciación directa del DNA del fago se siguió el
método descrito por Studier (1989).
II.6.8. Análisis de las secuencias de DNA.
El estudio, análisis y comparación de las secuencias de nucleótidos y
aminoácidos se realizó con ayuda del conjunto de programas GCG de la Universidad
de Wisconsin (Devereux y col., 1984) y con la ampliación del EMBL EGCG (Rice y
col., 1995): GELASSEMBLE se utilizó para la composición de las secuencias
obtenidas, HTH para la identificación del motivo “Hélice α – giro – Hélice α”,
PILEUP para realizar alineamientos de secuencias, FASTA se utilizó para la
comparación de las proteínas, BLAST se usó para la comparación de nucleótidos y
proteínas, éste último se utilizó desde GCG y desde el servidor del NIH a través de
internet. Se utilizaron las bases de datos del EMBL, Genbank, PIR y Swissprot.
Materiales y métodos 27
Las secuencias obtenidas se enviaron a la base de datos del EMBL y se les
asignó el número de acceso Y12813 y AJ251790.
II.7. MANIPULACION Y ANALISIS DEL RNA.
II.7.1. Obtención del RNA.
El RNA total de L. casei se obtuvo por el método de Chomczynski y Sacchi
(1987) con modificaciones. Los cultivos de L. casei se incubaron hasta alcanzar una
DO600 = 0´25, posteriormente se infectaron con el bacteriófago A2 a una mdi = 5 y
se tomaron muestras a distintos intervalos de tiempo. Las células se recogieron por
centrifugación, el sedimento se congeló rápidamente en un baño criogénico (hielo
seco y acetona) y se guardaron a –70ºC hasta su tratamiento. Las células se
rompieron por agitación en un vortex con bolas de vidrio de 106 µm ∅ (SIGMA) en
presencia de solución desnaturalizante (tiocianato de guanidina 4 M, citrato sódico
25 mM, 2β – mercaptoetanol 100 mM, sarcosil 0´5%). Tras centrifugar las muestras
(14.000 rpm, 2 min) se recogió el sobrenadante y se le añadió un volumen de AcNa
2 M, pH 4, se agitó en el vortex y se le añadió un volumen de fenol (saturado con
agua) y un volumen de cloroformo. Se dejó 15 min en hielo y se centrifugó durante
10 min a 4ºC, se recogió la fase acuosa y se precipitó con un volumen de
isopropanol a –70ºC. Para su utilización en experimentos posteriores se centrifugó
15 min a 4ºC, se lavó con etanol 70% (v/v) y se resuspendió en un volumen adecuado
de H2O – DEPC, tras lo que se trató con DNasa I (Boehringer). En el caso de las
cepas lisogénicas se realizó el mismo tratamiento omitiendo el paso de infección con
A2. Todo el material utilizado había sido previamente lavado con DEPC y
autoclavado. Todas las manipulaciones se realizaron en frío.
II.7.2. Visualización del RNA.
Tras el aislamiento, la visualización del RNA se realizó en geles de agarosa
1´5% (p/v) con formaldehído 2% (v/v) en tampón MOPS (MOPS 20 mM, acetato
sódico 5 mM y EDTA 1 mM; pH 7). Antes de cargar las muestras en el gel se
28 Materiales y métodos
mezclaron en una proporción 3:1 (v/v) con tampón de carga [formamida desionizada
50% (v/v), tampón MOPS 1% (v/v), formaldehído 6% (v/v), glicerol 10% (v/v) y azul
de bromofenol 0´5% (p/v)], se calentaron a 85ºC durante 2 min y se les añadió 1/5 de
volumen de BrEt (1mgr/ml). La electroforesis se realizó utilizando tampón MOPS a
pH 7 como electrolito y en presencia de formaldehído al 0´3% (v/v). El RNA
presente en el gel se visualizó por exposición a luz UV. Como marcadores de
tamaño de RNA se utilizaron los suministrados por GIBCO BRL.
II.7.3. Transferencia e hibridación del RNA.
La transferencia e hibridación del RNA se realizó mediante la técnica de
“Northern”. Tras la electroforesis, el gel se lavó dos veces con 10xSSC (Sambrook
y col., 1989). El RNA se transfirió a membranas de nylon “Hybond – N”
(Amersham) por capilaridad y posteriormente se fijó de forma irreversible mediante
irradiación con luz UV durante 2 min. Los fragmentos de DNA usados como sondas
se marcaron radiactivamente mediante la técnica del anillamiento al azar utilizando
[α32P]dCTP (3.000 Ci/mmol) y el kit “Rediprime” (Amersham). La sonda se purificó
mediante filtración en una columna de Sephadex G – 25 (Pharmacia). La hibridación
se realizó durante la noche a 42ºC en tampón de hibridación (1xDenhardt, 5xSSC,
formamida 50% (v/v), tampón fosfato sódico 50 mM, DNA de esperma de salmón
(SIGMA) 250 µgr/ml, DTT 10 mM; pH 6´5). Los lavados de la membrana tras la
hibridación fueron los recomendados por el fabricante. La detección de las bandas
radiactivas se realizó por exposición en películas “Biomax MS” (Kodak) utilizando
pantallas amplificadoras “Biomax MS” (Kodak).
II.8. PURIFICACION Y ANALISIS DE PROTEINAS.
II.8.1. Electroforesis de proteínas.
Las electroforesis analíticas de proteínas se realizaron en condiciones
desnaturalizantes y según un procedimiento discontinuo, en geles SDS – PAGE
(Laemmli, 1970) salvo que las proteínas a visualizar fuesen de pequeño tamaño, en
Materiales y métodos 29
cuyo caso se utilizaron geles de Tricina – SDS – PAGE (Schägger y Von Jagow,
1987). Las electroforesis se realizaron en un “Miniprotean II” (Bio-Rad). Las
proteínas se visualizaron por tinción con azul de Comassie R–250 (Swank y
Munkres, 1971) y/o por tinción con plata (Morrisey, 1981). Como marcadores de
peso molecular se emplearon los incluidos en “Low Molecular Weight Markers”
(Pharmacia) y “Kit for molecular weight 2.500 – 17.000” (Sigma).
II.8.2. Obtención de las proteínas estructurales del fago A2.
Para separar las cabezas de las colas los viriones purificados se calentaron a
70ºC durante 15 min. El DNA fágico se eliminó mediante la adición de DNasa I (1µg/ml) y MgSO4 (10 mM), incubándose la mezcla durante una hora a 37ºC.
Posteriormente la suspensión se sometió a un gradiente continuo de glicerol (5 –
30%) en tampón SM. Se centrifugó en un rotor Contron TST 41.14 (35.000 rpm, 90
min, 15ºC) y se recogieron fracciones de 600 µl del el fondo del tubo. Las fracciones
resultantes se analizaron por microscopía electrónica y electroforesis de proteínas.
La separación de las proteínas de la cápsida se realizó por electroforesis en
SDS – PAGE, tras someter suspensiones de viriones purificados a calentamiento y
eliminación del DNA.
Para la secuenciación del extremo aminoterminal de las proteínas
estructurales se siguió el método de degradación de Edman (Edman y Begg, 1967)
utilizando un secuenciador de fase gaseosa (Applied Biosystems, modelo 477A).
Para ello tras separar las proteínas por SDS – PAGE, se transfirieron por
electroforesis (80 V durante 2 h) a una membrana “Inmobilón P” (Millipore)
siguiendo la técnica de “Western” (Burnette, 1981), utilizando tampón CAPS
(metanol 10% (v/v), CAPS 10 mM; pH 11) como tampón de transferencia.
II.8.3. Purificación de CI.
Para conseguir la sobreexpresión de CI se construyó el plásmido pET11a–
cI y se introdujo en E. coli BL21(DE3)/pLys. La construcción de este plásmido se
describe a continuación:
30 Materiales y métodos
Los oligonucleótidos 5'–GAGGTGAGACATATGAAAAC–3', que incluye
el inicio de la traducción de cI, y 5'–CAGCTTTTAACGTGGATCCGGG–3', que
corresponde a una secuencia localizada a continuación del codón de parada, se
utilizaron para amplificar por PCR el gen cI. Estos oligonucleótidos se diseñaron
para introducir sitios de restricción para las endonucleasas NdeI y BamHI
respectivamente (subrayados). El segmento de DNA amplificado se purificó, se
digirió con los enzimas de restricción indicados y se ligó al vector pET11a digerido
con los mismos enzimas. La mezcla de ligación se transfirió a E. coli
BL21(DE3)/pLys por electroporación.
La sobreexpresión de CI se consiguió mediante la adición de IPTG 1 mM
(Boehringer Mannheim) a cultivos de E. coli BL21(DE3)/pLys con el plásmido
pET11a–cI a una DO580 = 1. Al cabo de 30 min se añadió Rifampicina (Rif) a una
concentración final de 200 µg/ml y las células se incubaron durante otros 90 min. Las
células se recogieron por centrifugación, se resuspendieron en 25 ml de tampón A
(Tris-HCl 50 mM, MgCl210 mM, DTT 1 mM, Tween 20 0´1%; pH 7´5) conteniendo
1 M NaCl por litro de cultivo, y se lisaron con una prensa hidráulica (French–press).
Todos los pasos de purificación se realizaron a 4ºC. Los extractos crudos, con una
concentración total de proteína de aproximadamente 20 mg/ml, se centrifugaron
(12.000 x g, 30 min). En estas condiciones mas del 95% de CI se encontraba
formando cuerpos de inclusión. Se descartó el sobrenadante y el precipitado se lavó
dos veces con 25 ml de tampón A conteniendo 1 M de NaCl. El sedimento
resultante, que contiene mayoritariamente la proteína CI, se resuspendió en el
mismo tampón hasta conseguir su completa disolución y posteriormente se diluyó 4
veces en tampón A para obtener una concentración final de NaCl de 250 mM. Esta
muestra se cargó en una columna de “Q – Sepharose” (Pharmacia) equilibrada con
tampón A sin DTT. La columna se lavó con 10 volúmenes de columna del mismo
tampón y se eluyó con un gradiente lineal de NaCl (250 mM - 1 M) en tampón A.
Las fracciones se analizaron por SDS – PAGE y las que contenían CI pura se
guardaron a –20°C en glicerol a una concentración final del 50% (v/v). La cantidad
de proteína presente en la muestra se cuantificó utilizando el kit “Protein Assay”
(Bio – Rad). La proteína CI se analizó por espectrometría de masas (MALDI/TOF)
utilizando ácido dihidroxibenzoico como matriz en un espectómetro de masas HP
Materiales y métodos 31
G2025A MALDI/TOF (Hewlett Packard). A las fracciones resultantes se les
secuenció el extremo amino terminal utilizando un secuenciador de péptidos HP
G1005A (Hewlett Packard).
II.8.4. Purificación de Cro
La sobreexpresión de Cro se realizó tras la introducción del plásmido
pET11a–cro en E. coli BL21(DE3)/pLys. Dicho plásmido se construyó como se
describe a continuación: los oligonucleótidos 5'-GGAGGCAATCATATGACAC-3',
que incluye el inicio de la traducción de cro, y 5'-
CATTGGATCCTTATCAACAACCAC-3', que corresponde a una secuencia
localizada detrás del codón de parada, se utilizaron para amplificar el gen cro. La
secuencia de estos oligonucleótidos fue diseñada para introducir sitios de
reconocimiento para las endonucleasas NdeI y BamHI respectivamente
(subrayados). El fragmento amplificado se purificó y se cortó con los enzimas de
restricción indicados. La mezcla de ligación se preparó con este fragmento y el
vector pET11a, cortado con los mismos enzimas, y posteriormente se transfirió a E.
coli BL21(DE3)/pLys.
La sobreexpresión de Cro se consiguió de modo similar a la descrita para
CI. Tras la inducción, las células se recogieron por centrifugación, se resuspendieron
en 25 ml de tampón B (Tris – HCl 50 mM, NaCl 50 mM, DTT 1 mM; pH 7´5) por
litro de cultivo y se rompieron con una prensa hidráulica (French – press). Los
extractos crudos, con una concentración de proteína total de aproximadamente 20mg/ml, se centrifugaron durante 30 min a 12.000 x g y el sobrenadante, conteniendo la
proteína Cro, se ultracentrifugó (100.000 x g, 1 h). El precipitado se desechó y el
sobrenadante se cargó en una columna de “Q – Sepharose” (Pharmacia) equilibrada
con tampón B. Cro eluyó de esta columna al lavarla con tampón B. La fracción
eluida en este lavado se trató con (NH4)2SO4 al 40% (concentración final), la mezcla
se agitó durante 1 h y se centrifugó a 12.000 x g durante 30 min. El sobrenadante se
sometió de nuevo a precipitación con (NH4)2SO4 al 80%. La muestra se centrifugó
(12.000 x g, 30 min), el precipitado se resuspendió en tampón C (tampón fosfato
sódico 50 mM; pH 7´5) y se cargó en una columna “Mono – S” (FPLC), equilibrada
32 Materiales y métodos
con el mismo tampón. Después del lavado las proteínas se eluyeron con un gradiente
lineal de NaCl (0´25 – 0´5 M) en tampón C. Las proteínas Cro y Cro*, un mutante
de deleción producido durante la sobreexpresión de Cro, eluyeron a una
concentración aproximada de NaCl de 0´3 M. Las fracciones que contenían ambas
proteínas se mezclaron y se diluyeron a una concentración final 0´1 M de NaCl en
tampón C. Para separar Cro de Cro* se realizó una nueva cromatografía en la misma
columna con un gradiente tendido de NaCl (0´25 M a 0´35 M). Las fracciones se
analizaron en geles de Tricina – SDS – PAGE y aquellas que contenían Cro o Cro*
puras se guardaron a –20ºC en glicerol al 50% (v/v) para su posterior utilización.
Todos los pasos seguidos durante la purificación se llevaron a cabo a 4ºC. La
concentración de proteína presente en las muestras se cuantificó utilizando el kit
“Protein Assay” de Bio-Rad. Las proteínas Cro y Cro* se analizaron por
espectrometría de masas (MALDI/TOF) utilizando ácido dihidroxibenzoico como
matriz en un espectrómetro de masas HP G2025A MALDI/TOF (Hewlett Packard).
A las fracciones resultantes se les secuenció el extremo amino terminal utilizando un
secuenciador de péptidos HP G1005A (Hewlett Packard).
II.9. ANALISIS DE LA INTERACCION DNA – PROTEINA.
Para la realización de los ensayos de unión DNA – proteína se utilizaron los
siguientes tampones:
- Tampón I: Tris – HCl 50 mM, MgCl2 10 mM, Tween 20 0´1%, NaCl
100 mM; pH 7´5. Se utilizó en los ensayos en los que estaba presente
CI.
- Tampón II: Tris – HCl 50 mM, NaCl 100 mM, Tween 20 0´1%; pH
7´5, Se utilizó en las reacciones en las que estaba presente Cro o Cro*.
II.9.1. Ensayos de retención en filtro.
El grado de formación de los complejos DNA – proteína se midió
básicamente como se describe en García y col. (1997). El DNA utilizado en las
reacciones fue el fragmento de 183 pb BamHI – HindIII del plásmido pUO183
Materiales y métodos 33
marcado con [α32P]dCTP (3.000 Ci/mmol). Este plásmido se obtuvo como sigue: la
región del bacteriófago A2 localizada entre los genes cI y cro se amplificó por PCR
utilizando los oligonucleótidos 5'–TGGATTGCCTCCTTTCGTTTC–3' y 5'–
ACCTCAAGAATGATTTTAACACCG–3'. El fragmento amplificado, de 153 pb,
se purificó y posteriormente se clonó en el sitio HincII de pUC18 para obtener
pUO183.
La reacción estándar se realizó a 30ºC durante 30 min y contenía 475 pgr
(81 pM) de DNA y 126 ngr (100 nM) de CI en un volumen de 50 µl de tampón I. La
reacción se paró al añadir 1 ml del mismo tampón. La mezcla de reacción se filtró
(Nitrocelulosa, 0´45µm ∅, Gelman Sciences) y se lavó varias veces con tampón I.
Los filtros se secaron y la radiactividad unida a ellos se cuantificó en un contador de
centelleo. La radiactividad específica del fragmento marcado se determinó como
DNA precipitable con TCA (15%). El DNA retenido en el filtro en presencia de
proteínas se corrigió con la cantidad de DNA retenido en ausencia de proteínas, lo
que representaba entre el 1 y el 3% de la radiactividad aplicada. Todas las muestras
se realizaron por duplicado.
II.9.2. Ensayos de retardo en gel.
El DNA utilizado en los ensayos de retardo en gel fue el mismo que el
empleado en los ensayos de retención en filtro.
El DNA (242 pgr, 81 pM) se incubó con concentraciones crecientes de
proteína (CI, Cro, Cro* y/o RNAP) en 25 µl del tampón correspondiente, I o II, a
30ºC durante 30 min, en presencia de poli (dI–dC) (Boehringer Mannheim) como
competidor inespecífico a una concentración final de 4 ngr/µl. Los productos de la
reacción se analizaron por electroforesis en gel no desnaturalizante de
poliacrilamida al 5% (p/v) (Sambrook y col., 1989), excepto si en la mezcla de
reacción estaba presente la RNAP, en cuyo caso el gel de poliacrilamida era del
4´5% (p/v). Los geles se corrieron en cubetas de electroforesis “Miniprotean II”
(Bio – Rad) a 100 V en tampón TAE (Tris – acetato 40 mM, EDTA 1 mM; pH 8) a
temperatura ambiente. Los geles se secaron al vacío y las bandas radiactivas se
visualizaron por autorradiografía en una película “Hyperfilm – MP” (Amersham).
34 Materiales y métodos
La cuantificación de los complejos DNA – proteína separados en los geles se realizó
en un analizador β de imagen “Instant Imager” (Packard).
II.9.3. Ensayos de protección frente a la digestión con DNasa I.
Los fragmentos XbaI – PstI o SmaI – HindIII obtenidos a partir de pUO183
se marcaron en los extremos HindIII (cadena superior) o XbaI (cadena inferior) con
[α32P]dCTP (3.000 Ci/mmol, Amersham). El DNA (81 pM) marcado en uno de sus
extremos se incubó durante 30 min a 30ºC en ausencia o presencia de CI, Cro, Cro*y/o RNAP en 25 µl del tampón apropiado conteniendo poli (dI-dC) a una
concentración final de 4 ngr/µl. A continuación se añadió DNasa I (Boehringer
Mannheim), diluida inmediatamente antes, para obtener una concentración del
enzima que produjese, por término medio, un corte por molécula de DNA. La
mezcla se incubó durante 5 min a 30ºC y la reacción se detuvo con la adición de 1
µl de EDTA 0´5 M, pH 8. El DNA resultante se precipitó y se resuspendió en
tampón de carga desnaturalizante (Maxam y Gilbert, 1980). La muestra se sometió a
electroforesis en un gel desnaturalizante de poliacrilamida al 6%. Los geles se
secaron al vacío y se analizaron por exposición a una película “Hyperfilm – MP”
(Amersham). Como marcadores de tamaño se utilizaron reacciones de secuencia de
purinas (Maxam y Gilbert, 1980) generadas por el protocolo rápido de Belikov y
Wieslander (1995). Si las proteínas Cro o Cro* estaban presentes en la mezcla de
reacción la DNasa I se diluyó en presencia de MgCl2 (a una concentración final de
10 mM).
II.10. TRANSCRIPCIÓN in vitro.
Los experimentos de transcripción in vitro se realizaron básicamente como
se describe en Monsalve y col. (1997). En estos, se utilizó como molde el plásmido
pUO183 linearizado por corte con ScaI. La reacción de transcripción se realizó en
un volumen final de 25 µl y contenía DNA 3 nM, 0´2 mM de ATP, CTP, GTP y
UTP, Tris – HCl 25 mM, MgCl2 10 mM, sulfato amónico 90 mM, DTT 2 mM, 7´5
unidades de “RNasin” (Promega) y RNAP 30 nM; pH 7´5. Después de 30 min de
Materiales y métodos 35
incubación a 30ºC, las reacciones se pararon mediante la adición de 1 µl de EDTA
0´5 M; pH 8. El RNA obtenido se precipitó a –20 ºC con etanol y se analizó por una
reacción de extensión del cebador (“primer extension”) como sigue: el precipitado
se resuspendió en 10 µl de una solución a pH 7´5, que contenía Tris – HCl 50 mM,
KCl 40 mM, acetato magnésico 7 mM, DTT 2 mM, 200 µM de dATP, dGTP y
dTTP, 25 nM [α32P]dCTP (3.000 Ci/mmol), 4 unidades de AMV transcriptasa reversa
(Promega), 10 unidades de “RNasin” (Promega) y 0´5 pmoles de los
oligonucleótidos 5'–CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGA–3' para el promotor PR y
5'–GCGGATAACAATTTCACACAGG–3' para el promotor PL. La mezcla de
reacción se incubó a 42ºC durante 60 min y se paró mediante la adición de 0´5 µl de
EDTA 0´5 M, pH 8 y 100 µl de tampón TE. Los nucleótidos no incorporados se
eliminaron mediante filtración en una columna de Sephadex G – 25 (Pharmacia).
Los cDNAs obtenidos se precipitaron para posteriormente resuspenderlos
en 6 µl de tampón TE y analizarlos mediante electroforesis en un gel de
poliacrilamida al 6% en condiciones desnaturalizantes. Las bandas resultantes se
visualizaron tras exposición del gel a una película “Hyperfilm – MP” (Amersham) y
pantallas amplificadoras “Hyperscreen – MP” (Amersham). Como marcadores de
tamaño se utilizaron reacciones de secuencia de purinas (Maxam y Gilbert, 1980)
generadas por el protocolo rápido de Belikov y Wieslander (1995).
Los experimentos de represión de la transcripción a partir del promotor PR
se realizaron del mismo modo, excepto que la mezcla de reacción se incubó 20 min
a 30ºC en presencia de cantidades crecientes de CI antes de la adición de la RNAP.
El análisis de represión del promotor PL, se llevó a cabo como se describe
para PR pero con ligeras modificaciones. Como molde se utilizó un fragmento de
390 pb obtenido a partir del plásmido pUO183 mediante amplificación por PCR
utilizando los oligonucleótidos mencionados en este mismo apartado. La reacción de
transcripción se realizó del mismo modo que para PR, pero en presencia de
[α32P]UTP (400 Ci/mmol). Después de 20 min de incubación a 30ºC en presencia de
Cro, se añadió la RNAP diluida en presencia de MgCl2 (concentración final de 10
mM). La reacción se detuvo mediante la adición de 0´5 µl de EDTA 0´5 M, pH 8 y
100 µl de tampón TE. Los nucleótidos no incorporados se eliminaron mediante
filtración en una columna de Sephadex G – 25 (Pharmacia). Los productos
36 Materiales y métodos
obtenidos en la reacción se precipitaron para posteriormente separarlos mediante
electroforesis en un gel de poliacrilamida al 6% en condiciones desnaturalizantes. El
análisis de los geles se llevó a cabo como se ha indicado anteriormente.
Resultados 37
III.1. LOCALIZACION DEL GEN DEL REPRESOR.
En los bacteriófagos temperados los represores son esenciales para el
establecimiento y mantenimiento del ciclo lisogénico, pero no para el ciclo lítico.
Por lo tanto, para localizar el gen del represor viral nos propusimos obtener mutantes
de deleción incapaces de lisogenizar, los cuales se reconocerán por su fenotipo placa
clara. Estos mutantes se seleccionaron teniendo en cuenta que al ser su DNA de
menor tamaño que el del fago silvestre, ejercerá una menor presión sobre las paredes
de las cápsidas. Y por tanto, se verán favorecidos en un medio en el que se induzca
una disminución de la cohesión de los capsómeros.
A)λλ
Pst
I
λλ P
stI
A2
Eco
RI
A2
Eco
RI
A2
Eco
RI
I II III
IV V VI
VII
VII
I
IX X
11´5
54´84´5
2´82´5
2´11´9
1´7
8´98´17´5
5´4
4´13´4
2´7
1´5
B)
( )( ) coscos
0 kb 44 kb
I II
2,3 2,7 1,5 5,4 7,5 4,1 8,1 8,9
Figura 3: A) Electroforesis en gel de agarosa de los fragmentos de DNA obtenidos tras ladigestión con EcoRI de los diez tipos de mutantes de deleción del fago A2 encontrados. Comomarcador de tamaños se empleó el DNA de λ digerido con PstI. B) Mapa de restricciónEcoRI de A2, se indica el tamaño de los fragmentos obtenidos, así como las dos regionesdispensables para el desarrollo lítico (líneas entre paréntesis).
38 Resultados
Para llevar a cabo el experimento se trataron partículas víricas de A2
purificadas con pirofosfato sódico, un agente quelante de iones divalentes que
desestabiliza las cápsidas debido a que toma el Ca2+ y el Mg2+ que mantienen los
capsómeros unidos. Se determinó en primer lugar la concentración mínima del
agente que mostró una tasa de selección compatible con una buena tasa de
supervivencia (7 x 10-4 supervivientes por ml). En sucesivas rondas de selección se
observó un aumento de la resistencia al pirofosfato hasta alcanzar una supervivencia
del 10% de los fagos en la suspensión. De las placas de lisis obtenidas en las rondas
4ª, 5ª y 6ª de tratamiento, se tomaron muestras que se reaislaron para un posterior
análisis. Se obtuvo el DNA de cada uno de los posibles mutantes y se comparó su
patrón de restricción con el correspondiente al del tipo silvestre. Todos los fagos
aislados presentaron alteraciones en el patrón de restricción, correspondientes a
deleciones en el genoma, que permitieron su clasificación en 10 fenotipos (Figura
3a). Las deleciones oscilaban entre 0´5 y 2´5 kb y mapearon en tres fragmentos
EcoRI del genoma de A2. Se localizaron así, dos regiones que no eran necesarias
para la realización del ciclo lítico, y que comprendían aproximadamente 8 kb de
DNA (Figura 3b).
Los mutantes que presentaban deleciones en la región II (Clases I a VI),
localizada en el brazo derecho del mapa, proporcionaron fácilmente derivados
lisogénicos de Lactobacillus casei 393, incluso de aquellos mutantes con las
mayores deleciones (Clase V; 2´5 kb de deleción). Todos ellos mostraban inmunidad
a la superinfección con A2 y liberaban partículas del fago en una tasa similar a la del
tipo silvestre. Tras la inducción con mitomicina C de estos cultivos se observaba una
lisis de los mismos (Ladero y col., 1998). Por el contrario, no se pudieron obtener
derivados lisogénicos a partir de los mutantes cuyas deleciones mapeaban en el
centro del genoma, clases VII a X. Además, todos ellos presentaban un fenotipo de
placa clara, típico de los fagos que desarrollan únicamente el ciclo lítico. De estos
datos, y de los derivados de otros estudios sobre el bacteriófago realizados en
nuestro laboratorio (Alvarez y col., 1998) se dedujo que el gen del represor debería
estar localizado en el centro del mapa del genoma de A2.
Resultados 39
III.2. ANALISIS DE LA SECUENCIA.
Una vez localizada una región concreta dentro del genoma en la que podría
estar localizado el gen del represor viral, se procedió a su análisis mediante
clonación y secuenciación. La secuencia obtenida, de 2.760 pb (Anexo I), presentaba
un contenido en G + C del 43%, un valor ligeramente inferior al obtenido para el
resto del genoma fágico conocido (45%). Este valor disminuye hasta el 36% si
consideramos sólo la tercera base de los codones de las regiones codificantes,
llegando al 17% al considerar la tercera base de los codones correspondientes a los
10 primeros aminoácidos de cada una de las pautas encontradas, una peculiaridad de
algunos de los genes de Lactobacillus (Pouwels y Leer, 1993).
crocI ATGGTA
PL PR
O1O2O3
-10 -35 -35 -10
lisis/lisogenia
coscos
0 kb 44 kb
attPantcrocIorfXxisint
A)
B)
C)
Figura 4: Representación esquemática del genoma de A2 mostrando la localización yorganización de la región de decisión lisis / lisogenia. A) Mapa de restricción EcoRI delgenoma de A2. B) Esquema de las orfs encontradas en la región central. Se indican con lazoslos terminadores de la transcripción. attP: sitio de integración del fago, int: integrasa, xis:excisionasa, cI: represor, ant: antirrepresor. C) Esquema de la región intergénica cI – cro. Semuestran los inicios de traducción y de transcripción (flechas truncadas), los operadores(barras rellenas) y las cajas –10 y –35.
En el segmento secuenciado se identificaron cuatro pautas abiertas de
lectura con capacidad de codificar polipéptidos de mas de 50 aminoácidos. En base a
sus analogías estructurales las denominamos: orfX, cI, cro y ant (Figura 4). Dos de
40 Resultados
ellas, cro y ant, transcriben hacia el extremo derecho del mapa del genoma, mientras
que las otras dos, cI y orfX, transcriben en dirección opuesta. Todas ellas presentan
posibles sitios de unión al ribosoma que tienen secuencias complementarias a la
secuencia del extremo 3´del rRNA 16S de Lactobacillus casei (Nakagawa y col.,
1995).
En la región intergénica entre cI y cro se localizan dos posibles promotores,
PL y PR, con orientación divergente, que muestran homología con la secuencia
consenso de los promotores de Lactobacillus (Pouwels y Leer, 1993).
El producto de cro es un polipéptido pequeño de 81 aminoácidos (Anexo I),
con un peso molecular estimado de 9.180 Da y con un pI básico (10´8). Presenta
homología en su secuencia de aminoácidos con un represor de la transcripción de un
pseudobacteriófago de Pseudomonas aeruginosa (Lee y col., 1999) y con una Orf
localizada en una posición similar en los bacteriófagos φSfi21 y TP–J34 de
Streptococcus thermophilus (Bruttin y col., 1997; Neve y col., 1998). En la proteína
Cro de A2 no se detecta un claro motivo hélice alfa – giro – hélice alfa, aunque
presenta alguno de los residuos esenciales presentes en homólogos de Cro y un pI
básico.
La pauta denominada ant codifica un polipéptido de 160 aminoácidos con
un peso molecular estimado de 17.844 Da y un pI de 5´39. El codón de inicio de ant
solapa con el codón de parada de cro en la secuencia ATGA (Anexo I), lo que
sugiere una traducción acoplada. La proteína que se deduce a partir de la secuencia
muestra homología con Orfs de otros bacteriófagos que infectan a bacterias lácticas,
como Orf266 de BK5–T (Boyce y col., 1995a), Orf5 de r1t (Nauta y col., 1996) y
Orf287 de φSfi21 (Bruttin y Brüssow, 1996). En estos bacteriófagos dichas Orfs
están localizadas en posiciones similares dentro del genoma, pero no se ha podido
determinar cual es su función. En φSfi21 la proteína correspondiente, Orf287,
presenta homología con el antirrepresor del fago P1 (Bruttin y Brüssow, 1996). Este
último fago codifica un represor primario, C1, que reprime las funciones del ciclo
lítico y un represor secundario, C4, que es un RNA antisentido que inhibe la síntesis
de un antirrepresor, ant, el cual es capaz de inactivar al represor C1 (Riedel y col.,
1993). Se postula por tanto, que ant podría codificar un antirrepresor en A2.
Resultados 41
42 Resultados
El producto de la pauta que denominamos cI es un polipéptido de 224
aminoácidos (Anexo I), lo que corresponde a 25.277 Da y tiene un pI de 4´56. Su
secuencia de aminoácidos presenta homología con represores del ciclo lítico de otros
bacteriófagos como: CI de λ (Sauer y Andreg, 1978) y φ80 (Ogawa y col., 1988 a),
Rro del bacteriófago r1t de Lactococcus lactis (Nauta y col., 1996). También se
parece a los hipotéticos represores de BK5–T (Boyce y col., 1995b) y Tuc2009 (van
de Guchte y col., 1994), ambos fagos que infectan a Lactococcus lactis. Así mismo,
presenta homología con proteínas reguladoras implicadas en la respuesta SOS como
LexA (Horii y col., 1981) y DinR (Raymond – Denise y Guillen, 1991) de
Escherichia coli y Bacillus subtilis, respectivamente.
En la Figura 5 se muestra un alineamiento de CI con alguna de estas
proteínas. Cuando se analiza la secuencia de CI utilizando el programa “Helix – turn
– helix“ del paquete de programas para análisis de secuencias EGCG (Rice y col.,
1995) se obtiene un valor de 2.199 (+ 6´68 SD) para un grupo de 20 aminoácidos
situados en el extremo amino – terminal de la proteína (Figura 5). Esta región podría
estar implicada en la unión a secuencias específicas en el DNA (Anderson y col.,
1982; Sauer y col., 1982). En el extremo carboxi – terminal de CI se encuentra un
dominio de reconocimiento para la proteasa RecA, que comprende los residuos
conservados serina y lisina, y el motivo de corte alanina – glicina (marcados con
asteriscos en la Figura 5). En el represor de λ, el corte en este motivo AG es el
primer paso de la inducción del ciclo lítico del profago (Slilaty y Little, 1987).
Basándonos en las características descritas para CI y Cro postulamos que podrían ser
los homólogos funcionales de las proteínas homónimas de λ.
Inmediatamente detrás de cI existe una repetición invertida, que tiene un
∆G = –17 kcal/mol, (Tinoco y col., 1973), seguida de varias timinas que podría actuar
como un terminador de la transcripción independiente de rho (Anexo I y Figura 4).
Adyacente a ella se encuentra orfX, la cual codifica un polipéptido de
24.447 Da compuesto por 225 aminoácidos y con un pI de 4´4. La comparación de
la secuencia de aminoácidos deducida para OrfX con proteínas de las bases de datos,
sólo reveló una homología significativa (52% de identidad en 117 aminoácidos) con
dos proteínas (TXE3 y DTXA) de un operón policistrónico que codifica las
enterotoxinas A y B de Clostridium difficile (Dove y col., 1990). También se
Resultados 43
encontró homología con dos Orfs de función desconocida pero situadas en una
posición similar, a continuación del gen cI y antes de los genes de integración sitio –
específica, en dos bacteriófagos de bacterias lácticas: mv4 que infecta a
Lactobacillus delbrueckii (Dupont y col., 1995) y φLC3 de Lactococcus lactis
(Lillehaug y col., 1997).
III.3. EL GEN cI CONFIERE INMUNIDAD A LA SUPERINFECCION.
Una de las propiedades de los represores de los fagos temperados es la de
conferir a la cepa hospedadora inmunidad a la superinfección por parte del mismo
fago o de otros relacionados. Para verificar si el producto del gen cI confería esta
propiedad a las células de L. casei, optamos por introducirlo en copia única en el
genóforo de dicha cepa. Para ello amplificamos por PCR un fragmento de 0´8 kb,
que contenía el gen y el promotor PL, utilizando los oligonucleótidos: 5'–
CATCCGAATTCCCATGTGTC–3' y 5'–GTAGTTTCAGAATTCCCCTCC–3'. Estos
cebadores contienen sitios de restricción EcoRI (se muestran en cursiva) que se
utilizaron para la inserción del segmento amplificado en el vector pEM40 (Alvarez y
col., 1998). Este plásmido, diseñado en nuestro laboratorio, es un derivado de
pUC18 que contiene un gen de resistencia a eritromicina. Aunque no se replica en
bacterias gram positivas el gen eryr si se expresa, por lo que puede ser utilizado en la
selección de clones que contengan el plásmido. pEM40 porta el gen de la integrasa y
la secuencia attP del bacteriófago A2, las cuales median su inserción estable en el
genoma de L. casei, concretamente en el gen que codifica el tRNALeu (CAA). El
fragmento de DNA conteniendo cI se purificó, se digirió con EcoRI y se ligó a
pEM40 digerido con el mismo enzima para generar pEM40–cI (Figura 6).
Los transformantes de L. casei portadores de pEM40–cI resultaron ser
inmunes a la infección por el fago A2. En ningún caso se detectaron placas de lisis
tras la infección con una suspensión fágica que presentaba un título de 1010 ufp/ml.
Posteriormente se determinó que la inserción de pEM40–cI es estable y que confiere
resistencia a la infección durante la fermentación de leche por L. casei, lo que
confiere a estas cepas interés tecnológico (Alvarez y col., 1999). Este resultado es
consistente con la función de represor del ciclo lítico sugerida para el producto de cI.
44 Resultados
Figura 6: Esquema del plásmido pEM40-cI. Se indican los genes de resistencia a eritromicina(ery), ampicilina (bla), así como el sitio de recombinación del fago (attP) y los genes de laintegrasa (int) y el represor (cI) de A2.
III.4. CARACTERIZACION DE LOS PROMOTORES PL Y PR.
Mediante el análisis de la secuencia de la región intergénica cI – cro se
localizaron dos posibles promotores, que denominamos PL y PR tal y como se indica
en el apartado III.2 (Anexo I y Figura 4).
Los puntos de inicio de la transcripción de ambos promotores se
determinaron mediante transcripción in vitro utilizando la σA – RNA polimerasa de
Bacillus subtilis y el plásmido pUO183 como molde. Este plásmido contiene un
fragmento de 153 pb que comprende la región intergénica cI – cro (ver apartado
II.9.1). Sobre los productos obtenidos de la transcripción se realizó una reacción de
extensión del cebador a partir de la cual se obtuvieron dos bandas de cDNA de 84 y
100 nucleótidos (Figura 7), que corresponden a los transcritos de PL y PR,
respectivamente. La intensidad de estas bandas de cDNA parece indicar que la
transcripción a partir de PR sería unas diez veces mas abundante que a partir de PL.
En ambos promotores, la transcripción comienza en un residuo G, posiciones 12 y
130 de la Figura 8. En ambos casos, 7 pb por encima de los sitios de inicio de la
transcripción encontramos unas regiones –10 extendidas consenso, con el
dinucleótido TG en posición –16. Estas regiones están separadas por 14 pb de los
Resultados 45
hexámeros –35 consenso. En dirección 5´ de la región –35 de PR aparece un
elemento UP (Figura 8). Esta región, para la cual se ha definido recientemente la
secuencia consenso 5' – NNAAA (A/T) (A/T) T (A/T) TTTTNNAAAANNN – 3'
(Estrem y col., 1998), parece tener una gran importancia en la transcripción puesto
que el extremo carboxi – terminal de la subunidad α de la RNAP se une a ella
aumentando su afinidad por el promotor (Gross y col., 1992; Helmann, 1995). Los
promotores están separados por 81 pb, lo que implica que están situados en la misma
cara de la hélice del DNA (asumiendo 10 ± 1 pb por vuelta de hélice) y se
transcriben de forma divergente. La disposición divergente de ambos promotores y
su situación en la misma cara del DNA, permite que ambos puedan ser transcritos
simultáneamente tras la entrada del genoma fágico en la célula y por lo tanto ambos
reguladores estarían activos en la célula en el momento crítico de la decisión lisis /
lisogenia.
PL
PR
1 2 3 4
84
98
102
Figura 7: Localización de los inicios de transcripción mediante transcripción in vitro. Seindican las bandas correspondientes a los cDNAs específicos de cada promotor. Calle 1:marcador de tamaños.
46 Resultados
. . . . . . . . GTATCTCACCTCAAGAATGATTTTAACACCGTTCCCGATTGTGCACAATAGGGGCACTAAAAAGCAATATCTGAATATTT O3 cI CATAGAGTGGAGTTCTTACTAAAATTGTGGCAAGGGCTAACACGTGTTATCCCCGTGATTTTTCGTTATAGACTTATAAA * -10 -35
. -35 . . -10 * . . TTTTGAAATAATCGTTGACACATGGGAACACGGATGATATTCTTTAGATGTTCCCAAAAGGAAACGAAAGGAGGCAATCC cro O2 O1 AAAACTTTATTAGCAACTGTGTACCCTTGTGCCTACTATAAGAAATCTACAAGGGTTTTCCTTTGCTTTCCTCCGTTAGG
Figura 8: Secuencia de nucleótidos de la región intergénica cI – cro. Se indican los operadores(flechas enfrentadas), las regiones –10 y –35 (negrita), los inicios de transcripción (asteriscos)y el elemento UP (negrita y cursiva).
En esta misma región también se localizan tres repeticiones invertidas
imperfectas, de 20 pb (O1, O2 y O3) (Anexo I), que denominaremos operadores del
sistema por la similaridad de su disposición con la de los operadores del interruptor
genético del bacteriófago λ. O1 se localiza por debajo del promotor PR, mientras que
O2 y O3 solapan con las regiones –35 de, PR y PL, respectivamente (Figura 8). Entre
las secuencias de estas tres repeticiones se observan pequeñas diferencias pero, al
igual que sucede con el bacteriófago λ (Ptashne, 1992), se puede establecer un
alineamiento entre cada una de las mitades, obteniéndose la secuencia consenso
C4C5C5A3A4T4T3G6T5G2 (Figura 9).
O1
O2
O3
C4C5C5A3A4T4T3G6T5G2A1A1T1T2T2A1C2 G1T2T1 G1 G1A1 A1 C1
C C C G A T T G T GC C C T A T T G T G
A A T A A T C G T T C C C A T G T G T C
C C C A A A A G G A T C C T T T C G T T
Figura 9: Alineamiento de cada una de las mitades de las repeticiones invertidas encontradasen la región intergénica cI – cro y su secuencia consenso.
Resultados 47
Para profundizar en el conocimiento de ambos promotores y analizar la
expresión de los genes cI y cro, estudiamos el patrón de transcripción de los
mismos. Para ello se realizó una hibridación tipo “Northern”, a partir de RNA total
de L. casei 393 y de un derivado lisogénico. Para el análisis del promotor PL se
utilizó como sonda el gen cI, desde su ATG hasta el codón de parada, generada por
PCR y marcada radiactivamente.
7.45.32.81.9
11.6
7.45.32.81.9
11.6
A B
min
Figura 10: Análisis del patrón de transcripción del gen cI. A) RNA total de Lactobacilluscasei 393 sin infectar (calle 1) y de un derivado lisogénico de A2 (calle 2). B) RNA total deLactobacillus casei 393 extraído a distintos tiempos tras la infección con A2. En ambos“Northern” se indican la posición y tamaño (en kb) de los marcadores de peso molecular.
Como se observa en la Figura 10A, se detectaron dos transcritos de
aproximadamente 0´8 y 1´4 kb. El tamaño del menor de los transcritos corresponde
a la distancia entre el promotor PL y el probable terminador rho independiente
localizado al final del gen cI (Anexo I). El transcrito de mayor tamaño, 1´4 kb, podía
corresponder a la transcripción conjunta de los genes cI y orfX. Cuando esta
hibridación se realiza sobre RNA extraído de cultivos que han sido infectados con
A2 se observan estos mismos transcritos, pero sólo en las calles correspondientes a
los tiempos entre 15 y 25 minutos postinfección, desapareciendo posteriormente
(Figura 10B). Bajo las condiciones de propagación empleadas el periodo de eclipse
48 Resultados
del bacteriófago A2 es de 120 min (Herrero y col., 1994), por lo que los tiempos en
los que se detecta transcripción del gen cI se consideran tempranos.
Para estudiar la transcripción a partir del promotor PR, el RNA extraído de
cultivos de L. casei 393 infectados con A2 se hibridó con una sonda que comprendía
el gen cro desde el ATG hasta su codón de parada. En la Figura 11 se puede
observar la presencia de tres transcritos que aparecen a los 40 min postinfección y
que permanecen hasta el final del ciclo infectivo (120 min) creciendo en intensidad.
El menor de los transcritos, de 1´5 kb, podría comprender los genes cro y ant, que
como vimos anteriormente son solapantes. El transcrito de 2´5 kb correspondería al
anterior mas una zona adyacente donde se localizan dos pequeñas pautas con
función desconocida. El mRNA de mayor tamaño, 10 kb, comprendería además de
los genes anteriores la región del genoma de A2 implicada en replicación (Moscoso
y Suárez, 2000).
0 2010 40 60 75 120 min
0´2
1´3
2´4
4´4
7´59´5
105 140
Figura 11: Análisis del patrón de transcripción del gen cro durante el ciclo de infección de A2en Lactobacillus casei 393. Se indica la posición y tamaño (en kb) de los marcadores de pesomolecular.
Resultados 49
Con estos resultados se puede concluir que PR sería el responsable de la
transcripción del operón lítico temprano, incluyendo cro, ant y el bloque de
replicación, mientras que PL sería el responsable de la expresión del represor del
ciclo lítico, cI.
III.5. INTERACCION DE CI CON EL CONMUTADOR GENETICO DE A2
III.5.1. Purificación del represor.
La proteína CI se sobrexpresó en E. coli BL21/pLys después de insertar el
gen cI en el vector pET11a bajo la influencia del promotor P10 del bacteriófago T7
tal y como se describe en Materiales y Métodos. Bajo estas condiciones la mayor
parte de CI, que totalizaba un 2% de la proteína total de la célula, estaba en el
precipitado que se obtiene tras la centrifugación de los extractos crudos. Este hecho
permitió la eliminación de la mayoría de las proteínas coprecipitadas con CI
mediante el lavado de los agregados con tampón. La proteína se solubilizó en el
mismo tampón conteniendo 1 M de NaCl. Posteriormente, la muestra se diluyó y se
sometió a cromatografía de intercambio iónico (Q – Sepharosa). Las fracciones
resultantes del gradiente se analizaron por SDS – PAGE. Algunas contenían CI con
un nivel de pureza superior al 95% (Figura 12). CI pura migra, en condiciones
desnaturalizantes, como un polipéptido de aproximadamente 28.000 Da (recuérdese
que el peso deducido a partir de la secuencia de aminoácidos era de 25.277 Da). La
identidad de la proteína se comprobó mediante la determinación de la secuencia de
su extremo amino – terminal. La masa molecular en solución se obtuvo por un
análisis de espectrometría de masas MALDI/TOF y fue de 25.235 ± 13 Da. La
muestra analizada tenía una concentración nanomolar, lo que indica que CI es un
monómero en solución a la concentración utilizada.
III.5.2. CI se une de forma específica a la región intergénica cI – cro.
La organización genómica de la región temprana del bacteriófago A2 nos
permite postular que la decisión entre seguir el ciclo lítico o lisogénico dependerá de
50 Resultados
la capacidad de CI de actuar como represor del ciclo lítico del bacteriófago A2, es
decir de su capacidad de unirse a los posibles operadores localizados entre los
promotores PL y PR para bloquear la transcripción de los genes del ciclo lítico. Esta
hipótesis está basada en las similitudes encontradas entre CI y otros represores
(Ladero y col., 1998).
1 2 3 4 5 6
14
20
30
43
6794
Figura 12: Análisis por SDS – PAGE de los pasos de purificación de la proteína CI. Calle 2:extracto celular tras la sobrexpresión. Calle 3: fase insoluble. Calle 4: proteína solubilizada.Calle 5: proteína CI pura tras la elución de la matriz “Q – Sepharosa”. Calles 1 y 6 patronesde peso molecular (en kDa).
Para comprobarlo se realizaron ensayos de retención en filtro, inducida por
CI, de un fragmento de 183 pb que contiene la región intergénica cI – cro marcada
radioactivamente. Los complejos CI – DNA quedaron retenidos en los filtros de
nitrocelulosa, lo que se aprovechó para optimizar las condiciones de la reacción y
posteriormente cuantificar la afinidad entre sus componentes. La formación de los
complejos era dependiente de la presencia de Mg2+, con un óptimo a 10 mM del
catión (Figura 13A), mientras se ve reducida por concentraciones de NaCl
superiores a 150 mM (Figura 13B). La presencia de Tween 20 (0´1 – 1%) en la
reacción no tiene ningún efecto significativo (datos no mostrados). La unión de CI al
DNA es total al cabo de 20 min (al menos un 80% de la radiactividad quedaba
retenida en los filtros).
La especificidad de la unión entre CI y la región intergénica cI – cro se
determinó midiendo la capacidad de moléculas de DNA no marcadas
Resultados 51
radiactivamente de actuar como competidores. Cuando en la reacción estaba
presente DNA inespecífico, poli d(I-C), la unión sólo se inhibía parcialmente incluso
a concentraciones 400 veces superiores a la del fragmento cI – cro (Figura 13C). Sin
embargo, cuando el DNA que se añadía en la reacción era específico, es decir el
mismo fragmento de DNA sin marcaje radiactivo, se observaba un descenso
inmediato de la radiactividad retenida en los filtros que era directamente
proporcional a las cantidades relativas de moléculas marcadas y sin marcar presentes
en la reacción (Figura 13D).
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60 80 100
[MgCl 2] mM
% D
NA
ret
enid
o en
el f
iltro
0
20
40
60
80
100
0 100 200 300 400 500
[NaCl] mM%
DN
A r
eten
ido
en e
l filt
ro
0
20
40
60
80
100
0.01 1 100
poli d(I-C) ng
% D
NA
ret
enid
o en
el f
iltro
0
20
40
60
80
100
0 4 8 12 16 20
DNA no marcado ng
% D
NA
ret
enid
o en
el f
iltro
.
A) B)
C) D)
Figura 13: Parámetros implicados en la formación de complejos CI – DNA detectados porretención en filtro. El parámetro analizado en cada caso se indica bajo la gráfica.
III.5.3. CI se une cooperativamente a la región intergénica cI – cro.
Para determinar la tasa de formación del complejo CI – DNA en función de
la concentración de la proteína se realizó un ensayo de retención en filtro (Figura
14A). La constante aparente de equilibrio (Kapp) del complejo CI – DNA se estimó
en 80 nM a pH = 7´5 y 30ºC, mientras que la Kapp para el DNA inespecífico tiene un
52 Resultados
valor aproximado de 100 µM en las mismas condiciones (datos no mostrados). La
gráfica de retención del DNA es una curva sigmoidal, lo que significaría que CI se
une de forma cooperativa a la región intergénica cI – cro.
0
20
40
60
80
100
-8 -7 -6
log [CI ] M
% D
NA
ret
enid
o en
el f
iltro
0
20
40
60
80
100
-9 -8 -7 -6
log [CI ] M
% D
NA
ret
ard
ado
en
el g
el
0
500
1000
1500
0 5 10 15
1 / [ DNA t ]
[ CI ]
/ [
DN
Au
]
CI
I
II
DNAlibre
A) B)
C) D)
Figura 14: Determinación de la afinidad entre la proteína CI y el segmento intergénico cI –cro. A) Cantidad de DNA retenida en el filtro en presencia de concentraciones crecientes deCI. B) Análisis EMSA de los complejos formados en presencia de concentraciones crecientesde CI (0, 1, 2, 4, 6, 8, 10 y 50 nM). Se indica el DNA libre y los complejos I y II. C) Fracciónde DNA unido en presencia de concentraciones crecientes de CI obtenida por cuantificaciónde los datos mostrados en B. D) Unión de CI (7 nM) en presencia de concentracionescrecientes de DNA. [CI] concentración total de proteína, [DNAu] concentración de DNAunido a CI, [DNAt] concentración total de DNA.
Para conocer el tipo de complejos formados se realizaron ensayos de
retardo en gel (EMSA). CI se une de forma específica al fragmento de DNA
generando dos bandas con movilidad electroforética retardada, complejos I y II en la
Figura 14B, lo que nos indica la existencia de al menos dos sitios de unión para el
represor en la región intergénica cI – cro. El complejo I se forma preferentemente a
Resultados 53
concentraciones bajas de proteína, mientras que a concentraciones altas solo se
detecta el complejo II. La Kapp de formación del complejo CI – DNA en función de
la concentración de CI fue de 7 nM a pH = 7´5 y 30ºC (Figura 14C). La forma
sigmoidal de la curva es similar a la observada cuando la constante se calculó
mediante el ensayo de retención en filtro (Figura 14A), indicando de nuevo que debe
existir una unión cooperativa de CI al DNA, aunque el valor de la Kapp es unas 10
veces mayor en los ensayos de retención en filtro que el obtenido en los de retardo
en gel.
Para obtener otra medida equivalente a la Kapp calculamos la tasa de
disociación (KD). Para ello se estudió la cinética de formación del complejo CI –
DNA en presencia de una concentración constante de proteína, 7 nM, y variando la
concentración de DNA. Como se muestra en la Figura 14D los datos se
representaron como la concentración de proteína dividida de la concentración de
DNA unido, frente al inverso de la concentración total de DNA. La pendiente de la
recta nos da el valor de la constante de disociación para la unión de CI (KD = 10
nM), asumiendo que cada monómero tiene un sitio de unión al DNA. Este valor es
muy similar al obtenido para la Kapp en EMSA al variar las concentraciones de CI.
Para determinar cuantitativamente el grado de cooperatividad de la unión
CI – DNA se calculó el factor de cooperatividad de la reacción, τ, de acuerdo a la
ecuación τ = 4 (F)(2R)/(1R)2 (Wilson y col., 1993). La ventaja de este método es
que los datos necesarios para calcular τ se pueden obtener para cada una de las
calles de los geles de retardo, y por tanto nos da una serie de valores que han de ser
semejantes. Los valores de la ecuación se obtienen cuantificando la cantidad de
DNA libre (F), unido a una molécula de CI (1R) y unido a dos o más moléculas de
CI (2R). El factor de cooperatividad se define como el grado en el que la formación
del complejo con dos moléculas unidas excede a la formación del complejo con una
molécula unida. Teóricamente, un valor de τ mayor o menor de 1 indicaría una
cooperatividad positiva o negativa respectivamente, mientras que un valor próximo
a uno indicaría que no existe cooperatividad en la unión. El valor obtenido a partir
de los datos estimados para la Figura 14 b es de τ = 9´97 ± 0´59, lo que ratifica que
probablemente CI es una proteína que se une de forma cooperativa a sus sitios diana
en el segmento intergénico cI – cro.
54 Resultados
A B
O1
O1
O2
O3
O2
O3
CI CI
Figura 15: Análisis mediante ensayos de protección a la digestión por DNasa I de loscomplejos CI – DNA. A) El fragmento SmaI – HindIII (cadena superior) se incubó enpresencia de concentraciones crecientes de CI (3´5, 7, 14 y 28 nM). B) El fragmento XbaI –PstI (cadena inferior) se incubó en presencia de 3´5, 7, 14, 28 y 56 nM de CI. En losextremos de cada autorradiografía se presentan los mismos fragmentos incubados en ausenciade proteína. Se indica mediante barras la posición de los operadores.
Resultados 55
. . . . . . . . GTATCTCACCTCAAGAATGATTTTAACACCGTTCCCGATTGTGCACAATAGGGGCACTAAAAAGCAATATCTGAATATTT O3 cI CATAGAGTGGAGTTCTTACTAAAATTGTGGCAAGGGCTAACACGTGTTATCCCCGTGATTTTTCGTTATAGACTTATAAA * -10 - 35
. - 35. . -10 * . . . TTTTGAAATAATCGTTGACACATGGGAACACGGATGATATTCTTTAGATGTTCCCAAAAGGAAACGAAAGGAGGCAATCC cro O2 O1 AAAACTTTATTAGCAACTGTGTACCCTTGTGCCTACTATAAGAAATCTACAAGGGTTTTCCTTTGCTTTCCTCCGTTAGG
Figura 16: Esquema de las regiones protegidas por CI (barras) en la región intergénica cI –cro basado en los datos obtenidos en la Figura 15. Se indican los operadores (flechasenfrentadas), las regiones –10 y –35 (negrita), los inicios de transcripción (asteriscos), elelemento UP (negrita y cursiva) y los sitios de hipersensibilidad (flechas).
III.5.4. CI se une a los operadores del bacteriófago A2.
De los datos obtenidos en los ensayos de retardo en gel se deduce la
existencia de al menos dos sitios de unión para CI en la región intergénica cI – cro.
Para una localización mas precisa de las secuencias reconocidas por el represor
analizamos los complejos CI – DNA mediante ensayos de protección frente a la
digestión con DNasa I.
La cadena superior presenta tres dominios de protección por CI de un
tamaño de 22, 26 y 24 pb que solapan con las secuencias invertidas localizadas en
esta región (O1, O2 y O3). Estos dominios están separados entre sí por intervalos de
12 y 38 pb (Figuras 15A y 16). En las regiones espaciadoras entre los dominios de
protección se observan varios sitios de hipersensibilidad a la digestión con DNasa I.
Entre O1 y O2 se localiza uno, mientras que entre O2 y O3 hay varios que están
separados entre sí por 10 ± 1 nucleótidos, lo que significa aproximadamente una
vuelta de hélice, asumiendo 10´5 pb por vuelta en DNA de doble cadena. Estas
56 Resultados
anomalías periódicas en el patrón de digestión de la DNasa I implican una
deformación del DNA producida por la unión de CI (revisado en Schleif, 1992).
En la cadena inferior de nuevo podemos observar tres dominios de
protección de CI solapantes con las repeticiones invertidas (Figuras 15B y 16).
Nuevamente, estas regiones de protección están separadas por espacios en los que se
localizan varios sitios de hipersensibilidad a la digestión por DNasa I.
La cantidad de CI requerida para proteger todos los operadores es al menos
tres veces inferior que la requerida en los ensayos EMSA (3´5 frente a 10 nM). En
estas condiciones hay aproximadamente 40 monómeros de CI por cada molécula de
DNA.
Los datos expuestos hasta aquí indican que la región intergénica entre cI y
cro es el interruptor genético del bacteriófago A2, y que las repeticiones invertidas
encontradas en ella son los operadores del sistema de acuerdo a la nomenclatura de
λ (revisado en Ptashne, 1992).
III.5.5. CI reprime la transcripción a partir de PR.
El represor CI de los fagos lambdoides es capaz de reprimir la transcripción
de los genes líticos tempranos y estimular su propia transcripción al unirse a los
operadores de la región de decisión del desarrollo de estos fagos (revisado en
Ptashne, 1992). Por lo tanto, se espera que el represor de A2 sea capaz de reprimir la
transcripción a partir del promotor PR. Para verificar esta hipótesis decidimos
estudiar la transcripción de PR en presencia de cantidades crecientes de CI. Para ello
realizamos ensayos de transcripción in vitro utilizando la σΑ − RNAP de B. subtilis y
el plásmido pUO183 como molde. Como podemos observar en la Figura 17, CI
reduce, en un proceso dependiente de concentración, la transcripción a partir de PR
hasta bloquearla por completo. Una concentración de 7´4 nM de CI es suficiente
para detectar una reducción en los niveles de transcripción, lo que corresponde a 2´5
monómeros de CI por molécula de DNA, mientras que para bloquear completamente
el promotor se necesita alcanzar una concentración de CI en la reacción de 177 nM,
aproximadamente 60 monómeros por molécula de DNA.
Resultados 57
PR
CI
Figura 17: Inhibición de la transcripción a partir de PR por la presencia de concentracionescrecientes de CI (0, 3´7, 7´4, 30, 60, 118, 177, 237 y 474 nM). En la primera calle se presentaun marcador de tamaños.
Para descartar la posibilidad de que el efecto pudiera deberse a una unión
inespecífica de la proteína con el DNA o a la presencia de RNasas contaminantes en
la preparación de la proteína se incubaron concentraciones superiores a las
necesarias para reprimir la transcripción de PR (hasta 480 nM de CI) en ensayos de
transcripción con un promotor no relacionado [Promotor P1 del plásmido
pSM19035 de Streptococcus pyogenes (Rojo y Alonso, 1995)], no observándose
ningún efecto sobre los niveles de expresión del mismo (datos no mostrados).
III.5.6. CI recoloca la RNA polimerasa en la región intergénica cI – cro.
Debido al hecho de que O2 solapa con la región –35 de PR y que O1 está
localizado inmediatamente después de su inicio de transcripción (Figura 4), CI
podría reprimir la transcripción de PR bien por exclusión de la RNAP, impedimento
58 Resultados
estérico, o bien bloqueando el desplazamiento de la polimerasa situada sobre el
promotor, de tal modo que ésta no pudiera iniciar la transcripción. Para analizar cual
de estas dos posibilidades es la real realizamos un análisis de competición mediante
EMSA. Para ello, primero analizamos las características de unión de la RNAP a la
región intergénica. En la Figura 18 se puede observar que al incubar el fragmento de
DNA en presencia de concentraciones crecientes de RNAP se forman dos complejos
con movilidad electroforética retardada, RPI y RPII, formándose el complejo RPII
de manera preferente a concentraciones altas de proteína (Figura 18, calles 3 a 8).
Este resultado es el esperado si tenemos en cuenta que los dos promotores no
solapan. La Kapp para los complejos RNAP – DNA es de aproximadamente 20 nM a
pH 7´5 y 30ºC; este valor es tres veces superior al de la Kapp obtenida para los
complejos CI – DNA.
CIσσA-RNAP 22 nM σA-RNAP
RPII
II
RPII
RPI
II
I
II*
CI-RP
DNA libre
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Figura 18: Análisis mediante EMSA de la unión de CI y RNAP a la región intergénica. Elfragmento de DNA (calle 1) se incubó en presencia de 6 nM de CI (calle 2), concentracionescrecientes de RNAP (13, 17´5, 22, 26´5, 34 y 44 nM) (calles 3 a 8). En las calles 9 a 12 laconcentración RNAP se mantuvo constante (22 nM) y se añadieron concentracionescrecientes de CI (2´7, 5´6, 11 y 22 nM). Se indica la posición del DNA libre, de los complejosCI – DNA (I y II), RNAP – DNA (RPI y RPII) y de los complejos ternarios CI – RNAP –DNA (II* y CI – RP).
Una vez establecido el patrón de unión de CI y la RNAP a la región
intergénica se procedió a realizar los experimentos de competición para verificar una
Resultados 59
de las dos hipótesis de partida. Incubando el DNA con una concentración constante
de RNAP (22 nM) y concentraciones crecientes de CI podemos observar como la
cinética de formación de los complejos DNA – proteína se ve aumentada al añadir
CI, compárense las calles 2, 5 y 9 en la Figura 18. Incluso a concentraciones
inferiores a 3 nM de CI observamos la aparición de los complejos II y RPII, así
como la aparición de un nuevo complejo denominado CI – RP, que postulamos
estaría formado por el DNA + CI + 2 RNAP. A concentraciones de CI próximas a su
KD (Figura 18, calle 11) observamos el complejo CI – RP y los complejos difusos II,
formados por el complejo II y el II* de nueva aparición, que interpretamos como
DNA + CI + RNAP. Estos resultados se obtienen independientemente del orden de
adición de las proteínas e implican que CI y RNAP coexisten en la región
intergénica cI – cro.
Para profundizar en el conocimiento de los complejos formados por CI y la
RNAP con la región intergénica cI – cro se procedió al análisis de los mismos
mediante ensayo de protección frente a la digestión con DNasa I. La unión de CI al
DNA da un patrón de protección característico (Figura 15). La RNAP muestra un
patrón de protección extendido sobre la región donde solapan PR y O2, así como en
la región del elemento UP, mientras que sobre PL la protección es menor y sólo se
detecta a mayores concentraciones de RNAP y sobre todo en la cadena en la que se
sitúa el promotor (Figuras 19 y 20). Al igual que se hizo en el caso del análisis por
EMSA se procedió a estudiar los complejos proteína – DNA cuando CI y RNAP se
incuban juntas con el segmento intergénico cI – cro (Figuras 21 y 22). En presencia
de una concentración constante de RNAP (31 nM) y concentraciones crecientes de
CI se observa un patrón de protección que difiere de los observados al incubar cada
una de las proteínas por separado con el DNA (Figura 21). La RNAP no altera el
patrón de protección de CI en la región correspondiente a O1 y O2, lo que indica que
es desplazada del promotor PR incluso a bajas concentraciones de represor (3´5 nM).
Sin embargo, la polimerasa compite con CI en la región correspondiente a O3 y a PL,
lo que se puede deducir por el cambio en el patrón de protección de CI en presencia
de RNAP. Para recuperar este patrón en O3 se requiere una concentración 8 veces
mayor (28 nM) que cuando la RNAP no está presente (Figuras 21 y 22).
60 Resultados
σσA-RNAP σσA-RNAP
PL
PR
UP
PL
UP
PR
A B
Figura 19: Análisis mediante ensayos de protección a la digestión por DNasa I de loscomplejos RNAP – DNA. A) El fragmento SmaI – HindIII (cadena superior) se incubó enpresencia de concentraciones crecientes de RNAP (3´9, 7´8, 15´5, 31 y 62 nM). B) Elfragmento XbaI – PstI (cadena inferior) se incubó en presencia de 31, 62, y 124 nM deRNAP. En los extremos de cada autorradiografía se presentan los mismos fragmentosincubados en ausencia de proteína. Se indica la posición de los promotores (flechas) y delelemento UP (barra).
Resultados 61
. . . . . . . . GTATCTCACCTCAAGAATGATTTTAACACCGTTCCCGATTGTGCACAATAGGGGCACTAAAAAGCAATATCTGAATATTT O3 cI CATAGAGTGGAGTTCTTACTAAAATTGTGGCAAGGGCTAACACGTGTTATCCCCGTGATTTTTCGTTATAGACTTATAAA * -1 0 - 35
. - 35. . -10 * . . . TTTTGAAATAATCGTTGACACATGGGAACACGGATGATATTCTTTAGATGTTCCCAAAAGGAAACGAAAGGAGGCAATCC cro O2 O1 AAAACTTTATTAGCAACTGTGTACCCTTGTGCCTACTATAAGAAATCTACAAGGGTTTTCCTTTGCTTTCCTCCGTTAGG
Figura 20: Esquema de las regiones protegidas por la RNAP (barras) en la región intergénicacI – cro basado en los datos obtenidos en la Figura 19. Se indican los operadores (flechasenfrentadas), las regiones –10 y –35 (negrita), los inicios de transcripción (asteriscos), elelemento UP (cursiva) y los sitios de hipersensibilidad (flechas verticales).
La combinación de los datos obtenidos mediante EMSA y los ensayos de
protección frente a DNasa I parecen indicar que en ausencia de CI la RNAP
interaccionaría primero con PR para formar el complejo RPI, y al ir aumentando la
concentración de RNAP, ésta se uniría a los dos promotores formando RPII (Figura
18). Sin embargo, en presencia de bajas concentraciones de CI (2´7 nM), la RNAP
es desplazada de PR debido a la mayor afinidad del represor por O1 y O2. Como
consecuencia de este desplazamiento la transcripción a partir del promotor del ciclo
lítico, PR, desaparece. Sin embargo, la RNAP parece interaccionar con CI y
reposicionarse para interactuar con PL por un mecanismo no identificado, originando
el complejo CI – RP (Figura 18), lo que probablemente implicaría un aumento de la
transcripción a partir de PL, es decir del gen que codifica el represor. Finalmente, si
la concentración de CI sigue aumentando la proteína se uniría a O3 lo que implicaría
el desplazamiento de la RNAP de PL y por lo tanto un bloqueo de la transcripción a
partir de ambos promotores.
62 Resultados
A B C
CI
σA-RNAPCI31 nM σA-RNAP
Figura 21: Efecto de la presencia de CI sobre la unión de la RNAP a la región intergénica cI –cro analizado mediante el ensayo de protección a la digestión por DNasa I. El fragmento SmaI– HindIII (cadena superior) se incubó en presencia de 3´5, 7, 14 y 28 nM de CI (A), 3´9, 7´8,15´5, 31 y 62 nM de RNAP (B) y de 31 nM RNAP mas 3´5, 7, 14 y 28 nM de CI (C). En esteúltimo caso la RNAP y el DNA se incubaron durante 15 min tras los que se añadió CI.
Resultados 63
. . . . . . . . GTATCTCACCTCAAGAATGATTTTAACACCGTTCCCGATTGTGCACAATAGGGGCACTAAAAAGCAATATCTGAATATTT O3 cI CATAGAGTGGAGTTCTTACTAAAATTGTGGCAAGGGCTAACACGTGTTATCCCCGTGATTTTTCGTTATAGACTTATAAA * -1 0 - 35
. - 35. . -10 * . . . TTTTGAAATAATCGTTGACACATGGGAACACGGATGATATTCTTTAGATGTTCCCAAAAGGAAACGAAAGGAGGCAATCC cro O2 O1 AAAACTTTATTAGCAACTGTGTACCCTTGTGCCTACTATAAGAAATCTACAAGGGTTTTCCTTTGCTTTCCTCCGTTAGG
Figura 22: Esquema de las regiones protegidas por CI (barras blancas) y RNAP (barrasralladas) en la región intergénica cI – cro basado en los datos obtenidos de las Figuras 15 y19. Se indican los operadores (flechas enfrentadas), las regiones –10 y –35 (negrita), losinicios de transcripción (asteriscos), el elemento UP (cursiva) y los sitios de hipersensibilidad(flechas verticales). La barra negra indica la región protegida por la RNAP en presencia debajas concentraciones de CI (obtenido de la Figura 21).
III.6. INTERACCIÓN DE CRO CON EL CONMUTADOR GENETICO DEL
CICLO
III.6.1. Purificación de Cro.
El interruptor genético del fago lambda consta de dos proteínas principales,
CI y Cro, siendo la unión de estas dos proteínas a los operadores del sistema lo que
permite la decisión de seguir el ciclo lisogénico o lítico (revisado en Ptashne, 1992).
En el bacteriófago A2 hemos visto la existencia de una disposición estructural
similar a la del fago λ, por lo que postulamos que funcionalmente la organización
también será similar. Para confirmarlo, nos decidimos a abordar el estudio de las
interacciones de la proteína Cro con el segmento cI – cro y determinar si también
64 Resultados
ella estaba implicada en la regulación de los ciclos de desarrollo fágico. El primer
paso en este estudio fue la purificación de la proteína.
a b c d e f
1714.410.68.1
Figura 23: Análisis por SDS – PAGE de los pasos de purificación de las proteínas Cro y Cro*.Calle a: sobrenadante tras la ultracentrifugación. Calle b: fracción eluída de la matriz “Q –Sepharosa”. Calle c: proteína tras la precipitación con sulfato amónico. Calle d: fraccióneluída de la columna “Mono – S”. Calle e: proteína Cro pura. Calle f: proteína Cro* pura. Seindica la posición y tamaño (en kDa) de los patrones de peso molecular.
El producto del gen cro se sobrexpresó en E. coli BL21/pLys después de
insertar el gen en el vector pET11a como se describe en Materiales y Métodos.
Sorprendentemente en los sobrenadantes de los extractos crudos de estos cultivos se
detectaron dos polipéptidos de tamaño aproximado al deducido de la secuencia de
Cro que en su conjunto constituían aproximadamente un 2% del contenido total de
proteína de la célula (Figura 23). Dichos sobrenadantes se pasaron por una columna
de intercambio iónico (“Q – Sepharosa”) con el fin de eliminar de la muestra las
proteínas con un pI ácido que quedarían retenidas en la misma, mientras que Cro
debería pasar libremente a través de la matriz debido a que tiene un pI de 10´8,
curiosamente ambos polipéptidos se comportaron del mismo modo. Las proteínas
que eluyeron de la columna se concentraron mediante precipitación fraccionada con
sulfato amónico. El precipitado resultante se resuspendió y se sometió a un paso de
cromatografía en FPLC a través de una columna “Mono – S”. Las dos proteínas
sobrexpresadas eluyeron prácticamente juntas a una concentración muy parecida de
Resultados 65
NaCl, por lo que se realizó un nuevo paso de cromatografía en la misma columna
pero con un gradiente escalonado muy tendido lo que permitió separarlas y
obtenerlas con una pureza de al menos el 95% (Figura 23).
Las proteínas purificadas migran en condiciones desnaturalizantes como
polipéptidos de 9.500 y 7.500 Da. Para determinar su identidad se analizó su
secuencia amino – terminal, comprobándose que en ambos casos coincidía con la
deducida a partir de la secuencia de nucleótidos del gen cro, por lo que las
denominamos Cro y Cro*. Mediante un análisis de espectrometría de masas
MALDI/TOF se obtuvo la masa molecular en solución de ambas proteínas. En el
caso de la mayor se obtuvieron dos picos que correspondían a masas moleculares de
9.180 (75%) y 9.048 (25%) Da; estos valores se corresponden con los esperados
para Cro con y sin la formil – metionina inicial. La muestra correspondiente a Cro*
presentó una mezcla de polipéptidos con masas moleculares de 7.887 (25%), 7.766
(35%) y 7.607 (40%). La secuenciación de dichos péptidos reveló que los sitios de
corte proteolítico que los generarían se localizan entre los residuos Asn – 70 y Asn –
71 (con pesos moleculares de 7.766 y 7.607 Da que corresponderían a polipéptidos
con y sin la metionina inicial, respectivamente) y entre los aminoácidos Asn – 71 y
Val – 72 (masas moleculares de 7.887 y 7.766 Da con y sin la metionina inicial,
respectivamente). Cro* resultó ser un derivado delecionado de la proteína Cro, al
que le faltan 11 o 12 residuos del extremo carboxi – terminal. En todos los casos las
muestras fueron analizadas a concentración nanomolar, lo que nos indica que, a esta
concentración, ambas proteínas son monómeros en solución. Mediante experimentos
de filtración en gel realizados a concentraciones proteicas mayores, rango
micromolar, pudimos comprobar que Cro* se encuentra en forma de monómeros,
mientras que Cro se encuentra en forma de dímeros y tetrámeros. Es decir, a baja
concentración de proteína Cro es monomérica, pero a medida que aumenta su
concentración en solución es capaz de formar dímeros y tetrámeros, mientras que
Cro* se encuentra en forma de monómero a cualquier concentración de proteína.
66 Resultados
III.6.2. Cro se une de forma específica a la región intergénica cI – cro.
Aunque la función de Cro sería la de unirse a los operadores y de esta
forma impedir que el ciclo lisogénico se lleve a cabo, el análisis de su secuencia de
aminoácidos no reveló un claro motivo de unión a DNA, aunque si presenta alguno
de los residuos esenciales y el polipéptido tiene pI básico.
0
20
40
60
80
100
0 100 200 300 400 500
[NaCl] mM
% D
NA
ret
arda
do e
n el
gel
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60 80 100
[MgCl2 ] mM
% D
NA
ret
arda
do e
n el
gel
0
20
40
60
80
100
0 10 20 30 40 50
DNA no marcado ng
% D
NA
ret
arda
do e
n el
gel
0
20
40
60
80
100
1 100 10000poli d(I-C) ng%
DN
A r
etar
dad
o en
el g
el
A) B)
C) D)
Figura 24: Parámetros implicados en la formación de complejos Cro – DNA detectados porretardo en gel. El parámetro analizado en cada caso se indica bajo la gráfica.
Como un primer paso para profundizar en el análisis de la función de Cro
estudiamos su capacidad de unión al DNA. Para ello incubamos un fragmento de
DNA de 183 pb que contenía la región temprana de control del fago A2, con la
proteína Cro pura en diferentes condiciones experimentales, analizando
posteriormente la mezcla mediante EMSA, para optimizar la reacción, conocer el
tipo de complejos formados y cuantificar la afinidad entre los componentes. La
formación de los complejos se ve inhibida por la presencia de Mg2+ en
Resultados 67
concentraciones superiores a 1 mM (Figura 24A). De igual forma, la reacción se ve
parcialmente inhibida por concentraciones de NaCl superiores a 150 mM (Figura
24B). Por el contrario, la presencia de Tween 20 al 0´1% tiene un efecto positivo en
la formación de los complejos (datos no mostrados).
I
II
DNAlibre
0 5 10 30 60 min
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60 80 100
tiempo (min)
% D
NA
ret
arda
do e
n e
l ge
l
A) B)
Figura 25: Estabilidad de los complejos Cro – DNA en el tiempo. El fragmento intergénico cI– cro (81 pM) se incubó en presencia de Cro (20 nM) durante 15 min (tiempo 0), tras los quese añadió el mismo DNA sin marcar (un exceso de 50 veces). A) Análisis EMSA de lasalícuotas tomadas a distintos tiempos. B) Gráfica de la estabilidad de los complejos en eltiempo.
La especificidad de la unión de Cro a la región intergénica cI – cro se
comprobó determinando la capacidad de moléculas de DNA no marcadas de actuar
como competidores. DNA inespecífico, poli d(I – C), sólo es capaz de inhibir
parcialmente la formación de complejos, incluso a concentraciones que exceden en
4.000 veces la del segmento intergénico (Figura 24C). Sin embargo, cuando el DNA
utilizado en la reacción de competición es específico, es decir, el fragmento de 183
pb sin marcaje radiactivo, se observa rápidamente una reducción de la formación de
los complejos Cro – DNA (Figura 24D). Una concentración 5 veces superior del
competidor específico inhibe totalmente la formación de los complejos. Para
determinar la estabilidad de los complejos Cro – DNA en el tiempo, se realizó una
reacción en condiciones estándar durante 15 min, transcurridos los cuales se añadió
a la mezcla de reacción un exceso de 50 veces de DNA específico no marcado,
incubando esta nueva mezcla durante diferentes tiempos y analizándola mediante
EMSA. La mayor parte de Cro permanece unida al DNA incluso transcurridos 70
68 Resultados
min desde de la adición del competidor no marcado. Sin embargo, existe
aproximadamente un 15% de los complejos inicialmente formados que son
inestables y tienen una vida media inferior a 5 min (Figura 25).
Cro
I
II
DNAlibre
A)
B)
0
20
40
60
80
100
-9 -8 -7 -6
log [Cro] M
% D
NA
ret
arda
do e
n el
gel
Figura 26: Determinación de la afinidad entre la proteína Cro y el segmento intergénico cI –cro. A) Análisis EMSA de los complejos formados en presencia de concentraciones crecientesde Cro (0, 1, 2, 4, 8, 10, 15, 20, 25 y 50 nM). Se indica el DNA libre y los complejos I y II. B)Fracción de DNA unido en presencia de concentraciones crecientes de Cro obtenida porcuantificación de los datos mostrados en A.
La unión de Cro a la región intergénica cI – cro origina dos complejos con
movilidad electroforética retardada (I y II en la Figura 26A). El complejo I se forma
a concentraciones bajas de Cro, mientras que el complejo II se forma
preferentemente a concentraciones mayores de la proteína. Para medir la afinidad de
Cro por sus sitios de unión en el DNA se determinó la tasa de formación del
complejo Cro – DNA en función de la concentración de Cro (Figura 26B). La
gráfica de formación de dichos complejos es lineal, lo que parece indicar que la
unión de Cro a la región intergénica cI – cro no es cooperativa. Para corroborar este
Resultados 69
hecho calculamos el factor de cooperatividad τ, de acuerdo con la ecuación de
Wilson y col. (1993). El valor estimado para la unión Cro – DNA a partir de los
datos de la Figura 26A es de τ = 0´8 ± 0´3, lo que confirma que Cro probablemente
se une al segmento de DNA de forma no cooperativa. De los datos obtenidos por
cuantificación del gel presentado en la Figura 26A se deduce una Kapp de 6 nM a pH
7´5 y 30ºC.
Cro*
I
DNAlibre
0
20
40
60
80
100
-8 -7 -6
log[Cro*] M
% D
NA
ret
arda
do e
n el
gel
A)
B)
Figura 27: Determinación de la afinidad entre la proteína Cro* y el segmento intergénico cI –cro. A) Análisis EMSA de los complejos formados en presencia de concentraciones crecientesde Cro* (0, 1, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 500 y 1000 nM). Se indica el DNA libre y el complejoI. B) Fracción de DNA unido en presencia de concentraciones crecientes de Cro* obtenida porcuantificación de los datos mostrados en A.
Al igual que para la proteína Cro, se determinó la afinidad de Cro* por el
segmento de DNA que contiene la región intergénica cI – cro en función de su
concentración. En este caso únicamente se observa la formación de un complejo
Cro* – DNA con movilidad electroforética retardada (I en la Figura 27A), incluso a
altas concentraciones de proteína (hasta 1 µM). De la gráfica obtenida se puede
deducir una Kapp de 25 nM a pH 7´5 y 30ºC (Figura 27B).
70 Resultados
O1
O2
O3
Cro
O3
O2
O1
Cro
A B
Figura 28: Análisis mediante ensayos de protección a la digestión por DNasa I de loscomplejos Cro – DNA. A) El fragmento SmaI – HindIII (cadena superior) se incubó enpresencia de concentraciones crecientes de Cro (50, 100, 150, 200, 250 y 300 nM). B) Elfragmento XbaI – PstI (cadena inferior) se incubó en presencia de 12´5, 25, 50, 100, 150, 200y 250 nM de Cro. En los extremos de cada autorradiografía se presentan los mismosfragmentos incubados en ausencia de proteína. Se indica mediante barras la posición de losoperadores.
Resultados 71
. . . . . . . . GTATCTCACCTCAAGAATGATTTTAACACCGTTCCCGATTGTGCACAATAGGGGCACTAAAAAGCAATATCTGAATATTT O3 cI CATAGAGTGGAGTTCTTACTAAAATTGTGGCAAGGGCTAACACGTGTTATCCCCGTGATTTTTCGTTATAGACTTATAAA * -10 -35
. -35 . . -10 * . . TTTTGAAATAATCGTTGACACATGGGAACACGGATGATATTCTTTAGATGTTCCCAAAAGGAAACGAAAGGAGGCAATCC cro O2 O1 AAAACTTTATTAGCAACTGTGTACCCTTGTGCCTACTATAAGAAATCTACAAGGGTTTTCCTTTGCTTTCCTCCGTTAGG
Figura 29: Esquema de las regiones protegidas por Cro (barras) en la región intergénica cI –cro basado en los datos obtenidos en la Figura 28. Se indican los operadores (flechasenfrentadas), las regiones –10 y –35 (negrita), los inicios de transcripción (asteriscos), elelemento UP (cursiva) y los sitios de hipersensibilidad (flechas verticales).
III.6.3. Cro se une a los operadores del sistema.
Para localizar de una forma precisa la secuencia de nucleótidos de la región
intergénica cI – cro a la que se une la proteína Cro, analizamos los complejos
proteína – DNA mediante un análisis de protección frente a la digestión con DNasa
I. En la cadena superior podemos observar diversas zonas de protección mediada por
Cro, pero básicamente se detectan tres dominios que coinciden con la secuencia de
los operadores O1, O2 y O3 (Figura 28A). En las regiones espaciadoras entre los
operadores se observan varios sitios de hipersensibilidad a la digestión con DNasa I,
especialmente entre O2 y O3, así como en el centro de los operadores. En la cadena
inferior también se observan diferentes zonas de protección que definen los tres
dominios que corresponden a los operadores, separados por sitios de
hipersensibilidad a la digestión con DNasa I (Figura 28B). Los sitios de
hipersensibilidad entre los operadores O2 y O3 están separados por unas 10 ± 1 pb, lo
que corresponde aproximadamente a una vuelta de hélice de DNA en doble cadena
72 Resultados
(Figura 29). Al igual que ocurría con CI, esto significa que el DNA está deformado
debido a la unión de Cro (revisado en Schleif, 1992).
La cantidad de Cro necesaria para la ocupación de los tres sitios de unión es
unas 3 veces mayor que la que se necesita cuando se realizan ensayos de retardo en
gel (150 versus 50 nM). Esto podría ser debido a que la estabilidad de los complejos
Cro – DNA se ve negativamente afectada por el Mg2+, que sin embargo es
absolutamente requerido como cofactor de la DNasa I. En ambas cadenas se observa
una afinidad creciente de Cro por cada uno de los operadores, así en O3 se observa
unión a una concentración de 50 nM, determinada por la aparición del sitio de
hipersensibilidad en el centro del operador, mientras que en O2 se observa este
patrón a 100 nM y en O1 a 150 nM de Cro.
También se analizaron los complejos formados por Cro* con el segmento
de DNA correspondiente a la región intergénica cI – cro, mediante el ensayo de
protección frente a la digestión con DNasa I. En ambas cadenas se observa el mismo
patrón que cuando la proteína presente es Cro, sin embargo la cantidad de Cro*
necesaria para proteger cada uno de los operadores es mayor, 75 nM para proteger
O3, 150 nM para O2 y 225 nM para O1 (datos no mostrados).
III.6.4. Cro inhibe la transcripción a partir de PL.
Como vimos en el apartado III.5.5 el represor CI era capaz de inhibir la
transcripción de cro, y por tanto de reprimir el ciclo lítico, mediante su unión al
operador O2, lo que resultaba en el desplazamiento de la RNAP de la región –35 del
promotor PR. El papel de Cro en los fagos lambdoides es el de reprimir la
transcripción del gen del represor uniéndose a los operadores del sistema. Por lo
tanto, si la proteína codificada por el gen cro del bacteriófago A2 fuese el
antagonista de CI, o lo que es lo mismo el represor del ciclo lisogénico, además de la
capacidad de unión a la región intergénica cI – cro tendría que ser capaz de reprimir
la transcripción de cI a partir del promotor PL mediante su unión a O3.
Para verificar esta hipótesis analizamos la expresión a partir de PL en
presencia de concentraciones crecientes de Cro. Para ello realizamos ensayos de
transcripción in vitro utilizando la σΑ − RNAP de B. subtilis y empleando como
Resultados 73
molde un fragmento de DNA de 390 pb que contiene la región intergénica cI – cro.
En la Figura 30 se puede observar como al aumentar la concentración de Cro
presente en la reacción se produce un descenso progresivo en la transcripción, hasta
que al llegar a una concentración de 2 µM se observa el bloqueo total de la misma.
Cro
PL
Figura 30: Inhibición de la transcripción a partir de PL en presencia de concentracionescrecientes de Cro (0, 250, 500, 1000, 1500 y 2000 nM).
Para descartar la posibilidad de que el efecto pudiera deberse a una unión
inespecífica de la proteína con el DNA o a la presencia de RNasas contaminantes en
la preparación de la proteína, se incubaron concentraciones superiores a las
necesarias para reprimir la transcripción de PL (hasta 4 µM de Cro) en ensayos de
transcripción con un promotor no relacionado [Promotor P1 del plásmido
pSM19035 de Streptococcus pyogenes (Rojo y Alonso, 1995)], no observándose
ningún efecto sobre los niveles de expresión del mismo (datos no mostrados).
74 Resultados
III.6.5. Cro desplaza a la RNAP del promotor PL en la región intergénica cI –
cro.
Puesto que Cro es capaz de reprimir la transcripción de PL mediante la
unión a los operadores de la región intergénica, y teniendo en cuenta que O3 solapa
con la región –35 de PL podría ser que Cro reprimiera la transcripción excluyendo a
la RNAP, mediante impedimento estérico, o bien bloqueando a la polimerasa situada
sobre el promotor de tal modo que ésta no pudiera iniciar la transcripción. Para
comprobar cual de estas dos hipótesis era cierta, realizamos ensayos de competición
entre Cro y la RNAP analizando los complejos resultantes mediante EMSA. Como
se vio en apartados anteriores, la RNAP forma dos complejos con movilidad
electroforética retardada, RPI y RPII (Figura 18).
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Cro31 nM σA-RNAP
RPII
RPI
DNAlibre
II
I
RPI*
I*
Figura 31: Análisis mediante EMSA de la unión de la RNAP a la región intergénica enpresencia de concentraciones crecientes de Cro. El fragmento (calle 1) se incubó en presenciade 31 nM de RNAP (calle 2), 20 nM de Cro (calle 3) y con una concentración de 31 nM deRNAP y concentraciones crecientes de Cro (30, 50, 75, 100, 125 y 150 nM) (calles 4 a 9). Seindica la posición del DNA libre y de los complejos Cro – DNA (I y II), RNAP – DNA (RPIy RPII) y de los posibles complejos ternarios Cro – RNAP – DNA (I* y RPI*).
El ensayo de competición se realizó manteniendo constante la
concentración de RNAP (31 nM) e incrementando la concentración de Cro. A una
concentración aproximada de 30 nM de Cro se observa que disminuye la intensidad
de la banda correspondiente al complejo RPII y se produce un aumento en la
Resultados 75
intensidad de la banda del complejo RPI. Este aumento de intensidad en presencia
de Cro presente en la reacción, podría deberse a la aparición de una nueva banda
(RPI*) correspondiente al complejo ternario DNA – Cro – RNAP que migraría a una
altura similar en el gel a la del complejo RPI. Al seguir aumentando la
concentración de Cro en la reacción se obtienen las bandas correspondientes a los
complejos I y II de Cro. Sin embargo el desplazamiento de la RNAP no es total, ya
que incluso a las mayores concentraciones de Cro empleadas se observa una banda
tenue que correspondería al complejo RPI o RPI*. Además se detecta la aparición de
un nuevo complejo difuso I* con movilidad electroforética intermedia entre los
complejos I y II formados por Cro. Estos resultados se obtienen independientemente
del orden de adición de las proteínas (Figura 31).
Para corroborar la hipótesis de que al aumentar la concentración de Cro en
la reacción se produce un desplazamiento de la RNAP de uno de los promotores,
con la consiguiente aparición del nuevo complejo RPI*, se realizaron nuevas
reacciones de competición las cuales, se analizaron mediante el ensayo de
protección frente a la digestión con DNasa I (Figura 32). El patrón de protección de
la RNAP y Cro se muestra en las Figuras 19 y 28, respectivamente. Al realizar el
ensayo en presencia de una concentración constante de RNAP (31 nM) y
concentraciones crecientes de Cro se observa un patrón de protección que difiere del
obtenido para cada una de las proteínas por separado. A bajas concentraciones de
Cro, la RNAP no altera su patrón de protección en la región en la que se localiza PR,
la cual solapa con el operador O2, sin embargo Cro compite con la RNAP en la
unión al operador O3, que solapa con PL, desplazándola de este promotor. Al
aumentar progresivamente la concentración de Cro presente en la reacción se
observa como la RNAP es desplazada incluso del promotor PR, lo que se pone de
manifiesto por la aparición del patrón característico de hipersensibilidades
originadas por la unión de Cro a los operadores y la desaparición del patrón de la
RNAP (Figura 32). Sin embargo, se aprecia la aparición de nuevas
hipersensibilidades a la digestión con DNasa I en la región espaciadora entre los
operadores, que implicarían que se está produciendo una distorsión en el DNA que
podría estar generada por un nuevo complejo Cro – RNAP – DNA (Figuras 32 y
33).
76 Resultados
Croç 31 nM σA-RNAPèA B C D
PL
UP
PR
O1
O2
O3
Figura 32: Efecto de la presencia de Cro sobre la unión de la RNAP a la región intergénica cI– cro analizado mediante el ensayo de protección a la digestión por DNasa I. El fragmentoXbaI – PstI (cadena inferior) se incubó en presencia de 31 nM RNAP y de concentracionescrecientes de Cro ( 50, 100, 150, 200, 250, 300 y 500 nM). En las calles A y D se presenta elpatrón de protección de RNAP (31 nM) y Cro (500 nM) respectivamente. Calles B y C: Elfragmento se incubó en ausencia de proteínas.
Resultados 77
. . . . . . . . GTATCTCACCTCAAGAATGATTTTAACACCGTTCCCGATTGTGCACAATAGGGGCACTAAAAAGCAATATCTGAATATTT O3 cI CATAGAGTGGAGTTCTTACTAAAATTGTGGCAAGGGCTAACACGTGTTATCCCCGTGATTTTTCGTTATAGACTTATAAA * -10 -35
. -35 . . -10 * . . TTTTGAAATAATCGTTGACACATGGGAACACGGATGATATTCTTTAGATGTTCCCAAAAGGAAACGAAAGGAGGCAATCC cro O2 O1 AAAACTTTATTAGCAACTGTGTACCCTTGTGCCTACTATAAGAAATCTACAAGGGTTTTCCTTTGCTTTCCTCCGTTAGG
Figura 33: Esquema de las regiones protegidas por Cro en la región intergénica cI – cro enausencia de RNAP (barras blancas). Con flechas rojas se indican los nuevos sitios dehipersensibilidad detectados en presencia de RNAP y altas concentraciones de Cro basado enlos datos obtenidos en la figura 32. Se indican los operadores (flechas enfrentadas), lasregiones –10 y –35 (negrita), los inicios de transcripción (asteriscos), el elemento UP(cursiva) y los sitios de hipersensibilidad (flechas verticales negras).
Los datos combinados del ensayo de retardo en gel y de protección a la
digestión con DNasa I sugieren que en ausencia de Cro la RNAP interacciona con el
DNA de la región intergénica cI – cro para dar los complejos RPI y RPII. A bajas
concentraciones interaccionaría con PR para dar el complejo RPI para
posteriormente, al ir aumentando la concentración de la proteína, interaccionar con
ambos promotores y formar RPII (Figuras 18 y 19). Sin embargo, en presencia de
bajas concentraciones de Cro la RNAP es desplazada de PL, debido a la mayor
afinidad de Cro por O3, lo que originaría una represión de la transcripción a partir de
este promotor. En esta situación se puede observar una coexistencia de ambas
proteínas en el DNA permaneciendo unido Cro al operador O3 y la RNAP al
promotor PR (Figura 32). Finalmente, si la concentración de Cro continúa
aumentando se produce la unión de la proteína a los otros dos operadores, O1 y O2,
lo que originaría un desplazamiento de la RNAP de PR y consecuentemente una
represión de la transcripción del mismo.
78 Resultados
III.7. IDENTIFICACION DEL OPERON DE LAS PROTEINAS
ESTRUCTURALES DEL FAGO A2.
III.7.1. Composición proteica de los viriones.
Por trabajos previos realizados en nuestro laboratorio (Herrero, 1996) se
determinó que la cápsida del bacteriófago A2 presenta 4 proteínas mayoritarias,
observables tras su separación en SDS – PAGE y posterior tinción con Azul de
Coomasie (Figura 34A), y al menos siete minoritarias que se pusieron de manifiesto
al teñir los geles con plata (Figura 34B). Los tamaños de estas proteínas oscilan
entre 18 y 93 kDa y se denominaron gpA – gpK (Tabla 3).
A B
14
20
30
43
6794
gpA
gpBgpCgpDgpEgpF
gpGgpHgpIgpJgpK
Figura 34: Composición proteica de los viriones del bacteriófago A2. A) Tinción con Azul deCoomasie. B) Tinción con plata. Los patrones de peso molecular se indican en kDa.
Resultados 79
De ellas gpD, gpE y gpF se presentaban en mayor proporción que el resto,
por lo que se postuló que serían las proteínas mayoritarias de la cabeza y la cola de
los viriones.
ProteínaPeso molecularestimado (kDa)
Secuencia amino terminal
gpA 18gpB 22gpC 25gpD 28 ADTAVTTNKKLAKFGASAFEYgpE 35 AVPTDASDAVNAGVKgpF 42 AVPTDASgpG 51 AVPTDASDAVNAGVKgpH 52 GLATEVDPHWADHLLgpI 80 ANLIFGGHKIGSSFLgpJ 90 MKPFYFVDRSLgpK 93
Tabla 3: Composición proteica de las partículas de A2.
Para localizar los genes responsables de la síntesis de estas proteínas se
decidió proceder a la secuenciación de sus extremos amino – terminales, como paso
previo a la generación de sondas específicas. Previamente se purificaron las
partículas virales en gradientes de ClCs y, después de dializar las suspensiones
fágicas, se sometieron a ruptura por un tratamiento de calor (70ºC, 15 min). La
expulsión del DNA de las cabezas provocó la gelificación de la suspensión, que se
licuó de nuevo mediante tratamiento con DNasa I. Las proteínas resultantes se
separaron por SDS – PAGE, se transfirieron a membranas “Inmobilón P”, que se
tiñeron con Azul de Coomasie y las bandas correspondientes a cada polipéptido se
recortaron y se enviaron para realizar la secuenciación de sus extremos amino –
terminales (Tabla 3). De las once proteínas detectadas se pudo obtener la secuencia
de siete. Sorprendentemente, se observó que tres de ellas, (gpE, gpF y gpG),
presentaban el mismo extremo, aunque tuvieran tamaños diferentes, indicando que
80 Resultados
probablemente existía un procesamiento diferencial en su extremo carboxi –
terminal antes o durante su integración en la cápsida o bien constituían formas
multiméricas de la proteína no disociables por el tratamiento con SDS en caliente
mas β – Mercaptoetanol previo a la electroforesis.
A B C
Figura 35: Micrografías electrónicas del bacteriófago A2. A) El bacteriófago A2 antes deltratamiento con calor y DNasa I. B) Fracción enriquecida en cabezas. C) Fracción enriquecidaen colas.
III.7.2. Localización de las proteínas mayoritarias de la cápsida.
La observación al microscopio electrónico de las suspensiones de fagos
tratadas con calor reveló que este tratamiento no destruye las cápsidas, sino que
separa cabezas y colas permitiendo la liberación al medio del DNA empaquetado en
las cabezas. Así pues, nos planteamos separar ambas estructuras y para ello
realizamos un gradiente continuo de glicerol que permitió la obtención de fracciones
relativamente puras de cabezas (Figura 35B), y fracciones conteniendo
mayoritariamente colas, aunque contaminadas con restos de cabezas (Figura 35C).
Resultados 81
El análisis mediante SDS – PAGE de estas fracciones reveló la presencia
mayoritaria de las proteínas gpE y gpF y la desaparición de gpD en las
preparaciones conteniendo cabezas, mientras que en las fracciones que contenían
mayoritariamente colas gpD aparecía en mayor proporción (Figura 36). Estos
resultados parecen indicar que gpD sería el componente principal de las colas
mientras que gpE y gpF serían las proteínas mayoritarias de la cabeza.
A B C D E F
gpDgpE
gpF
Figura 36: Análisis por SDS – PAGE de las fracciones, obtenidas por gradiente de glicerol,conteniendo mayoritariamente colas (calles A y B) y cabezas (calles C y D). Calle E: Patronesde peso molecular. Calle F: Patrón de proteínas de la cápsida de A2.
III.7.3. Localización de los genes estructurales en el genoma del fago.
A partir de los extremos amino – terminales de las proteínas de la cápsida,
se obtuvieron una serie de oligonucleótidos específicos correspondientes a las
diferentes posibilidades de codificación en el DNA para la secuencia de aminoácidos
conocida para la proteína gpH (5’ – GCIACIGARGTIGAYCCICA – 3’) y para las
proteínas gpE, gpF y gpG (5’ – GAYGCITCIGAYGCIGTIAAYGG – 3’). La
mezcla de oligonucleótidos sintética se marcó radiactivamente y se utilizó como
sonda para hibridar con el DNA del fago A2 digerido con diversos enzimas de
restricción. Este DNA digerido se separó en un gel de agarosa (Figura 37A) y se
transfirió a membranas de Nylon. De este modo se localizaron los segmentos
82 Resultados
codificantes para ellas, de tal forma que durante su secuenciación y la de las
regiones genómicas adyacentes pudieron detectarse los genes responsables de la
síntesis de las proteínas estructurales del fago.
Así por ejemplo, la proteína de 28 kDa, gpD, está codificada por un gen
localizado en un fragmento EcoRI de 5´4 kb (Herrero, 1996; Figura 38). Mientras
que la sonda correspondiente a la proteína gpH dio una señal que correspondió al
fragmento EcoRI de 2´7 kb (Figura 37B). Basándonos en estos resultados y en la
localización de otras proteínas en el genoma fágico decidimos secuenciar la región
comprendida entre el extremo izquierdo del genoma (fragmento EcoRI 2´7 kb) y el
centro del mismo (fragmento EcoRI 7´5 kb) y de esta forma completar las
secuencias parciales que ya conocíamos en esta región (García y col., 1997; Herrero,
1996; Figura 2).
A B
Bam
HI
Bgl
II
Xho
I
Eco
RV
Eco
RI
Bam
HI
Bgl
II
Xho
I
Eco
RV
Eco
RI
8´98´17´5
5´4
4´13´4
2´7
Figura 37: Localización del gen responsable de la síntesis de gpH. A) Gel de agarosa en elque se separaron los fragmentos correspondientes a la digestión del genoma de A2 con lasendonucleasas de restricción BamHI, BglII, XhoI, EcoRV y EcoRI. Junto a los fragmentosgenerados por esta última se indican sus tamaños (en kb). B) Resultado de la hibridación deloligonucleótido diseñado para gpH sobre los fragmentos de DNA transferidos desde el gelmostrado en A.
Resultados 83
84 Resultados
Para la obtención de la secuencia correspondiente a esta región se procedió
a la clonación y subclonación en pUC18 de fragmentos generados con diferentes
endonucleasas de restricción. En aquellos casos en los que fue necesario se
diseñaron oligonucleótidos específicos, se amplificaron fragmentos de DNA
mediante PCR que fueron secuenciados directamente, o se secuenció el DNA del
fago de forma directa, especialmente para confirmar la continuidad de la secuencia
en los casos de clones adyacentes no solapantes. El ensamblaje de las secuencias
obtenidas mediante el programa “Gelassamble” permitió obtener una secuencia
continua en ambas cadenas de 16.908 pb (Anexo 2), que abarca desde el sitio EcoRI
adyacente a los extremos cohesivos (fragmento EcoRI de 2´7 kb) hasta el sitio
EcoRI solapante con los genes del sistema lítico, localizados previamente en el
fragmento EcoRI de 7´5 kb (Herrero, 1996; Figura 38).
III.7.4. Análisis de la secuencia de nucleótidos.
El análisis de la secuencia mediante el programa “Frame” reveló la
presencia de 16 pautas abiertas de lectura, tomando como indicador de la presencia
de una pauta regiones que codificaran para polipéptidos de un tamaño mínimo de 50
aminoácidos, la existencia de un codón de inicio (ATG o GTG) y la presencia de
hipotéticos sitios de unión al ribosoma. Todas las orfs encontradas bajo estos
criterios se localizaban en la misma cadena. Las posibles pautas abiertas de lectura
se denominaron en función de que correspondiesen a una de las proteínas
estructurales a las que se había secuenciado el extremo amino – terminal, o en
función del número de aminoácidos que codificaban (Tabla 4).
El contenido total de G + C de la secuencia es de un 45´4%, lo que está de
acuerdo con el valor obtenido para el resto del genoma de A2 conocido (45%). Este
valor es ligeramente menor si consideramos la tercera posición de los codones en las
regiones codificantes (41´3%).
Las principales características de la secuencia se reflejan en la Tabla 4. En
todas las pautas abiertas de lectura el codón de inicio es un ATG, excepto en el caso
de orfI que es un GTG. Por delante de todos ellos se localiza una secuencia rica en
purinas, parcialmente complementaria al extremo 3´ – OH del rRNA 16S de
Resultados 85
86 Resultados
Lactobacillus casei (Nakagawa y col., 1995; Tabla 4) que podría actuar como un
posible sitio de unión al ribosoma, a una distancia de 6 ± 2 nucleótidos. El codón de
parada menos frecuente fue TAG (2 ocasiones), mientras que los codones TAA y
TGA se encontraron en 7 ocasiones cada uno de ellos. El 88% de la secuencia total
es codificante, encontrándose varias orfs que podrían tener un acoplamiento
traduccional al detectarse un solapamiento entre el codón de parada de una de ellas y
el codón de inicio o el RBS de la siguiente. De esta forma las pautas abiertas de
lectura orf146, orf128 y orf114 por un lado, y orf563, orf486, orfI y orf156 por otro,
se traducirían de forma coordinada. Existe además un caso, orfH y orf209, en el que
las pautas solapan en 15 aminoácidos (Figura 38, Tabla 4 y Anexo II).
III.7.5. Análisis de la secuencia de aminoácidos.
El análisis de las secuencias aminoacídicas deducidas a partir de la
secuencia de nucleótidos de las diferentes orfs permitió la localización de los
extremos amino – terminales obtenidos por secuenciación de las proteínas gpD, gpE,
gpF, gpG, gpH, gpI y gpJ. De esta forma, se pudo adscribir a estas pautas abiertas de
lectura la codificación de dichas proteínas estructurales. En los casos de gpD, gpI y
gpJ la metionina inicial se encuentra ausente, lo que indica que sufre un
procesamiento post – traduccional. Las proteínas gpE, gpF y gpG están codificadas
por el mismo gen, orfEFG, localizándose el extremo amino terminal de las mismas
en el codón 123 de dicho gen, lo que implica la existencia de un proceso proteolítico
de maduración. Este gen codificaría una proteína de 400 aminoácidos que se
procesaría para dar lugar a dos polipéptidos. El menor de ellos correspondería al
extremo amino de la misma, tendría un peso molecular estimado de 13´9 kDa y un
pI de 6´31, mientras que el extremo carboxi – terminal correspondería a un
polipéptido de 277 residuos con un peso molecular estimado de 29´7 kDa y un pI de
4´85. Este último polipéptido correspondería a la proteína mayoritaria de la cabeza.
La masa molecular estimada a partir de los geles de poliacrilamida para las proteínas
gpE, gpF y gpG (35, 42 y 51 kDa, respectivamente) indicaría que la primera
correspondería al monómero y que gpF y gpG serían multímeros de aquella. El
extremo amino terminal de la proteína gpH se localizó a cinco aminoácidos del
Resultados 87
inicio de traducción de orfH, lo que nuevamente indica la existencia de un
procesamiento proteolítico de maduración.
Se intentó adscribir una función a cada uno de los productos génicos
codificados por el resto de las orfs mediante el análisis de los posibles motivos
encontrados en las mismas, y la búsqueda de homologías con otras proteínas ya
caracterizadas y depositadas en las bases de datos utilizando los programas BLAST
y FASTA.
Los productos de las pautas orf146, orf128, orf73, orf156, orf107 y orf116 no
presentaron homología significativa con ninguna de las proteínas depositadas en las
bases de datos. El producto de orf114 presentó homología (49% similaridad) con la
Orf32, de función desconocida del bacteriófago φ105 de Bacillus subtilis
(Kobayashi y col., 1998). Las principales homologías encontradas para el resto de
las Orfs se describen a continuación:
- gpH: mostró homologías significativas con las proteínas portales o
conectoras de los bacteriófagos φPVL de Staphylococcus aureus (47% de
similaridad) (Kaneko y col., 1998), DT1 de Streptococcus thermophilus (42% de
similaridad) (Tremblay y Moineau, 1999), HK97 de E. coli (42% de similaridad)
(Duda y col., 1995a) y D3 de Pseudomonas aeruginosa (41% de similaridad)
(Gilakjan y Kropinski, 1999).
- Orf209: presentó homología con proteínas fágicas de función desconocida,
siendo la mas importante de éstas (48% de identidad) con la Orf26 del bacteriófago
φ105 de B. subtilis (Kobayashi y col., 1998). También presentó homología (32% de
identidad) con una posible proteasa del bacteriófago φC31 de Streptomyces (Smith y
col., 1999).
- OrfEFG: Como se ha indicado anteriormente el producto de orfEFG, se
procesa proteolíticamente para dar lugar a dos péptidos, el correspondiente al
extremo amino – terminal tiene un tamaño de 123 aminoácidos, mientras que el
correspondiente al extremo carboxi – terminal tiene un tamaño de 277 aminoácidos.
Este último polipéptido correspondería a la proteína mayoritaria de la cabeza. La
región amino – terminal, que se liberaría por el proceso de proteolisis, presenta una
estructura en forma de hélice alfa en la que se localiza un dominio de cremallera de
leucinas (“Leucine zipper”). Este extremo presenta una gran abundancia de residuos
88 Resultados
cargados (49 de 123) especialmente si consideramos la región de la molécula con
estructura de hélice alfa (35 de 75) y en ambos casos las cargas se reparten al 50%
entre positivas y negativas. Este polipéptido no presentó homología con ningún otro
presente en las bases de datos. Basándonos en sus propiedades estructurales, además
de en el orden funcional de los genes implicados en el ensamblaje de la cabeza,
donde la proteína de andamiaje precede a la mayoritaria de la cabeza en la mayoría
de los genomas de los fagos de dsDNA estudiados hasta ahora (Georgopoulos y col.,
1983; Eppler y col., 1991; Hatfull y Sarkis, 1993) o se origina, por un corte
proteolítico, a partir de la misma (Duda y col., 1995 a, b y c; Desiere y col., 1999),
postulamos que éste polipéptido podría constituir la proteína de andamiaje del
bacteriófago A2. La proteína mayoritaria de la cabeza mostró homologías con
proteínas estructurales fágicas, incluyendo la proteína mayoritaria de la cabeza de
los bacteriófagos DT1, 22% de identidad, (Tremblay y Moineau, 1999), y φSfi21,
22% de identidad, (Desiere y col., 1998) de Streptococcus thermophilus y el
bacteriófago φadh de Lactobacillus gasseri, 24% de identidad, (Altermann y col.,
1999). En estos dos últimos fagos la homología se obtiene con la proteína madura,
ya que en ambos la proteína mayoritaria de la cabeza sufre un proceso de
maduración por corte proteolítico en el que se libera el extremo amino – terminal.
- gpD: La secuencia de esta proteína ya se había obtenido anteriormente
(Herrero, 1996), comprobándose que correspondía a gpD y que la metionina inicial
es procesada para dar una proteína madura de 201 aminoácidos. Esta proteína resultó
ser la proteína mayoritaria de la cola y presentó homología en las bases de datos con
proteínas de función desconocida de los bacteriófagos φ105 y φPVL.
- Orf465: La proteína deducida a partir de la secuencia de esta orf presentó
homología con la proteína gpT, 23% de identidad, del bacteriófago P2 de E. coli.
Dicha proteína se encuentra en la cola del virión de P2 y está posiblemente
implicada en la determinación de la longitud de la misma (Christie y col., 1998).
Igualmente se parece a la proteína G, 22% de identidad, componente estructural de
la cola del bacteriófago φ186 de E. coli (Xue y Egan, 1995).
- Orf563: Su secuencia aminoacídica presentó homología con proteínas
minoritarias de la cápsida de distintos bacteriófagos y con la proteína H del
bacteriófago lambda, 21% identidad, que es un determinante de longitud de la cola,
Resultados 89
además de iniciar la polimerización de las mismas (Casjens y Hendrix, 1988). Por
otro lado, mostró homología con las cadenas pesadas de la miosina de diferentes
organismos.
- Orf486: Este polipéptido presentó homología, 26% de identidad, con un
componente estructural, Orf15, de la cola del bacteriófago DT1 de S. thermophilus
(Tremblay y Moineau, 1999).
- gpI: Presentó homología con proteínas estructurales minoritarias de la cola
de los bacteriófagos φSfi11 (26% de identidad en 100 aminoácidos) y DT1 (30% de
identidad en 85 aminoácidos) de S. thermophilus (Lucchini y col., 1998; Tremblay y
Moineau, 1999).
- gpJ: Presentó homología con proteínas estructurales de diversos
bacteriófagos, muchas de ellas identificadas como componentes de la cola,
incluyendo la Orf18 del bacteriófago DT1, 24% de identidad, posiblemente
implicada en la especificidad de huésped (Tremblay y Moineau, 1999) y un probable
anti – receptor del bacteriófago φSfi21, 30% de identidad en 689 aminoácidos
(Desiere y col., 1999). En la región central de esta proteína destaca la presencia de
13 repeticiones de un motivo similar al colágeno de la forma (Gly – X – Y)n
distribuidas en 3 segmentos. La presencia de este tipo de secuencias ha sido descrita
en los genes implicados en la especificidad de hospedador de varios bacteriófagos
(Smith y col., 1998) y aunque no está establecida su función se cree que podría jugar
un papel en la generación aleatoria de diversidad por recombinación (Lucchini y
col., 1999b).
La baja homología, a nivel de secuencia, detectada para la mayoría de los
productos codificados por genes fágicos ha hecho que diversos autores postulen la
realización de un análisis comparativo entre genomas fágicos basándose en la
posición, tamaño y punto isoeléctrico de dichos productos como una herramienta
eficaz a la hora de determinar la posible función de los diferentes genes identificados
(Chandry y col., 1997; Altermann y col., 1999), debido a que estas propiedades
suelen estar mejor conservadas que la secuencia de nucleótidos e incluso que la de
aminoácidos (Casjens y col., 1992). Para realizar este análisis comparativo de la
región génica que codifica las proteínas estructurales en el bacteriófago A2 se
90 Resultados
seleccionaron las regiones equivalentes de tres bacteriófagos (Figura 39). El
bacteriófago λ (Hendrix y col., 1983) se seleccionó debido a que es el sistema
biológico mejor estudiado. Dentro de los fagos de bacterias lácticas se seleccionaron
los fagos φSfi21 (Desiere y col., 1999) y φadh (Altermann y col., 1999) debido a que
sobre el primero se han realizado múltiples estudios comparativos de su genoma con
el de otros fagos relacionados y el segundo por ser uno de los pocos fagos, que
infectan a lactobacilos, que han sido secuenciados en su totalidad. Al analizar el
alineamiento de los genomas vemos que existe una gran similitud en la región
correspondiente a las proteínas de la cabeza y las implicadas en la unión cabeza cola
(Figura 39), tanto en número de genes como en el tamaño y punto isoeléctrico de los
localizados en posiciones similares. Sin embargo, esta correlación disminuye al
comparar la región correspondiente a las proteínas de la cola. De esta forma se
corrobora la posible función asignada por homología de secuencia para la proteína
portal (codificada por orfH), la proteasa (orf209) y la proteína mayoritaria de la
cabeza (orfEFG). Por otro lado, los productos correspondientes a orf146, orf128 y
orf114, que no habían mostrado homología con otras proteínas, serían los
responsables de la unión cabeza – cola en la partícula fágica madura. Dentro de las
proteínas de la cola parece corroborarse la implicación de gpJ en la especificidad del
hospedador, o al menos, en el reconocimiento de alguna estructura necesaria para el
inicio de la infección, puesto que si bien el tamaño es algo menor que el de las
proteínas correspondientes de los bacteriófagos λ y φSfi21, los puntos isoeléctricos y
la posición en los genomas son similares (Figura 39). Las dos orfs que mostraron
homología con determinantes de longitud de la cola de diferentes fagos se
encuentran en una posición equivalente y tienen unos valores parecidos de pI a los
de la proteína H del bacteriófago lambda, por lo podrían estar implicadas en dicho
proceso. Para el resto de las proteínas estructurales no se puede asignar una función
concreta, exceptuando claro está a la proteína mayoritaria de la cola gpD.
Resultados 91
92 Resultados
1209060300
11´61´92´8
5´37´4
min
Figura 40: Análisis mediante "Northern" del patrón de transcripción del gen orfEFG duranteel ciclo de infección de A2 en Lactobacillus casei 393. Se indica la posición y tamaño (en kb)de los marcadores de peso molecular.
III.7.6. Expresión de los genes estructurales.
Para profundizar en el conocimiento de los genes estructurales analizamos
su patrón de expresión dentro del ciclo de infección de A2. Para ello realizamos
diversas hibridaciones tipo “Northern” utilizando como sondas fragmentos de DNA
correspondientes a las pautas orfEFG, orfD, orf563 y orfJ. Todas ellas hibridaron
con un mRNA de un tamaño aproximado de 17 kb. Este transcrito se detecta a los 60
minutos post – infección y permanece hasta el final del ciclo lítico (Figura 40). El
extremo 5´ de este mRNA debería iniciarse por encima del gen que codifica para la
subunidad pequeña de la terminasa, orf3, ya que al utilizar este gen como sonda se
obtiene un transcrito de igual tamaño y que se expresa a los mismos tiempos (García
Resultados 93
y col., 1997). Estos resultados parecen indicar que los genes estructurales se
transcriben de forma conjunta como un único operón y que el mRNA resultante
atravesaría la región correspondiente a los extremos cohesivos, por lo que se debe
producir cuando el genoma fágico esté circularizado y/o formando concatémeros.
Discusión 95
IV. DISCUSION.
La contaminación por bacteriófagos representa el mayor problema con el
que se enfrentan las empresas que producen derivados lácteos para llevar a cabo
fermentaciones eficaces. Uno de los principales métodos que se utilizan para limitar
el desarrollo de los fagos en la fabricación comercial es la rotación de las cepas que
constituyen los cultivos iniciadores. Sin embargo, en la actualidad esta estrategia
presenta problemas debido a que las rotaciones prolongadas en las que participan
varias cepas incrementan el nivel y la diversidad de fagos contaminantes en la planta
procesadora y, por tanto, el potencial genético para que puedan emerger nuevos
fagos por recombinación. En los casos de cultivos monocepa se aumenta la
probabilidad de pérdida total de la producción en caso de infección fágica (Sing y
Klaenhammer, 1993). La aplicación de nuevos conocimientos sobre la genética y el
desarrollo de los bacteriófagos y de las cepas hospedadoras servirá para minimizar
las pérdidas de fabricación causadas por éstos. En el futuro, nuestra capacidad de
utilizar en la industria alimentaria cepas muy especializadas dependerá de la
disponibilidad de estrategias de defensa frente a los fagos, que puedan protegerlas de
forma continuada y a largo plazo. El estudio del ciclo de desarrollo de los
bacteriófagos desde un punto de vista molecular podría tener una repercusión
importante en la mejora de las fermentaciones industriales. La secuenciación de
diversos genomas pertenecientes a bacteriófagos que infectan bacterias del ácido
láctico, pertenecientes a géneros muy diferentes entre si, ha contribuido a un avance
en el conocimiento de su biología, así como a la comprensión de las relaciones
filogenéticas existentes entre ellos. El fago A2, aislado a partir de suero del queso
artesano Gamoneu, se eligió como objeto de estudio debido a que es temperado y
posee extremos cohesivos, propiedades interesantes para el posible desarrollo de
herramientas genéticas derivadas del mismo. Además, el fago infecta a
Lactobacillus casei ATCC 393, cepa de referencia en la industria por su capacidad
acidificante y por ser productora de diacetilo.
En esta Tesis se ha abordado el estudio de dos regiones del genoma del
fago A2, con la intención de diseñar estrategias futuras de defensa frente a la
96 Discusión
infección. Así, se han conseguido transformantes totalmente resistentes mediante la
expresión estable del represor del ciclo lítico en cepas previamente sensibles.
Ciertamente, las construcciones descritas en la presente memoria necesitaban un
cierto refinamiento, tendente a eliminar las secuencias procedentes de bacterias no
GRAS y los genes de resistencia a antibióticos de los vectores antes de poder ser
utilizadas como iniciadores en fermentaciones alimentarias. Los primeros pasos en
esta dirección ya han sido dados, mediante la introducción del sistema de la
resolvasa en los vectores integrativos que portan el gen cI y que tras su inserción en
el genoma del hospedador eliminan todas las secuencias que no pertenecen a A2
(Martín y col., 2000). Igualmente el estudio de la región correspondiente al operón
de las proteínas estructurales esperamos que nos permita localizar el promotor
responsable de la expresión tardía, como paso previo a la generación de sistemas
inducibles de suicidio celular.
IV.1 EL CONMUTADOR DE CICLO DEL BACTERIOFAGO A2.
Un bacteriófago temperado puede existir en uno de dos estados: como
parásito intracelular activo llevando a cabo el ciclo lítico o atenuado como profago,
en un ciclo lisogénico. En el caso de los colifagos del tipo lambda, la decisión de
seguir y/o permanecer en uno u otro ciclo depende de un conmutador transcripcional.
El paso a estado de profago, y su posterior estabilización, requieren que el
conmutador esté posicionado en el modo lisogénico, mediante la represión de los
genes líticos mediada por el represor CI. Contrariamente, la proteína Cro permite la
transcripción de los genes del ciclo lítico al reprimir la transcripción del represor a
partir del promotor PRM, posicionando de este modo el interruptor transcripcional en
modo lítico (Johnson y col., 1981).
Para determinar si en el fago A2 existía un mecanismo de regulación
semejante se intentó localizar el gen del represor del ciclo lítico basándonos en dos
propiedades generales de estas proteínas: no son necesarias para seguir el ciclo lítico
y son indispensables para el ciclo lisogénico. Así pues, los mutantes con este gen
delecionado podrán propagarse pero no lisogenizar a la cepa hospedadora. Estas dos
Discusión 97
características eran compartidas por los mutantes cuyas deleciones se localizaban en
la región central del genoma de A2 (Figura 3B).
La secuencia de dicha zona reveló que presentaba un porcentaje de G + C
del 43%, es decir está dentro del rango de los genes secuenciados en especies de
Lactobacillus, que va desde el 36% de Lactobacillus acidophilus hasta el 50% de
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, situándose en un 46% para
Lactobacillus casei (Kandler y col., 1986). Este porcentaje se reduce al analizar el
contenido G + C en la tercera posición de los codones de las regiones codificantes
(36%), llegando a un 17% si consideramos la tercera posición de los 10 primeros
codones de cada orf. Este fenómeno es común a todas las especies de Lactobacillus y
podría interpretarse como un mecanismo para evitar la formación de estructuras
secundarias en las regiones 5´ de los mRNA, que podrían dificultar el inicio de la
traducción (Pouwels y Leer, 1993).
La organización estructural de la región presentaba similitudes evidentes
con la correspondiente al conmutador de ciclo del fago λ (Patshne, 1992). Así,
aparecían pautas de lectura con orientaciones divergentes de transcripción. Los
productos de los genes cI y cro mostraban homologías significativas con los
represores homónimos de otros fagos, así como un tamaño (224 y 81 aminoácidos,
respectivamente) semejante al de aquellos. Adicionalmente, los promotores de la
región intergénica presentaban tres repeticiones invertidas semejantes (de 20 pb cada
una) en un segmento de DNA relativamente corto (161 pb), lo que recuerda a los
operadores descritos para el conmutador de lambda. Aparte de los genes anteriores,
se encontraron dos nuevas pautas de lectura, orfX y ant, localizadas inmediatamente
detrás de los genes cI y cro, respectivamente, que se transcribían en conjunción con
ellos y además en el caso de ant solapaba con el final de cro. Aunque no se ha hecho
ningún estudio sobre la función de los hipotéticos productos de estos dos genes, las
características indicadas, la semejanza de su localización respecto a los genes
auxiliares de otros bacteriófagos, como BK5–T o φSfi21 (Boyce y col., 1995a;
Bruttin y Brüssow, 1996), y la homología entre Ant y el antirrepresor del
bacteriófago P1 (Riedel y col., 1993) podrían indicar que juegan algún papel en la
decisión lisis / lisogenia del bacteriófago A2.
98 Discusión
Los dos promotores divergentes de la región intergénica que denominamos
PL y PR son funcionales simultáneamente como se pudo comprobar mediante
experimentos de transcripción “in vitro”. Al contrario de lo observado en el fago
lambda (Ptashne, 1992), el promotor localizado por delante del gen cI, PL, no
necesita la presencia de la proteína CI para transcribirse, sino que es constitutivo,
aunque presenta una transcripción que es al menos 10 veces menor que la observada
en las mismas condiciones para el promotor del ciclo lítico PR. La localización de los
puntos de inicio de la transcripción, el análisis de la secuencia de estas regiones
promotoras y los estudios de protección de la digestión con DNasa I por la σA –
RNA polimerasa de Bacillus subtilis nos ha permitido identificar las regiones
consenso típicas de los promotores vegetativos procariotas en cada uno de ellos,
ambos tienen unas regiones –10 y –35 canónicas separadas por una región
espaciadora de 17 pb. En esta región se detectó la presencia del dinucleótido TG
separada por una base del elemento –10. Este motivo, región –16, está presente en
algunos promotores de E. coli, formando los denominados promotores –10
extendidos, que se caracterizan porque carecen de una región –35 consenso. En estos
promotores es suficiente la presencia de este dinucleótido para permitir la
transcripción (Belyaeva y col., 1993; Voskuil y col., 1995). En bacterias gram
positivas, a diferencia de lo observado en E. coli, además del motivo TG aparece la
región –35 consenso, y en este grupo de bacterias parece tener importancia en la
determinación de los niveles de transcripción (Jensen y Hammer, 1988; Voskuil y
Chambliss, 1998). Esta región –16 se ha detectado en aproximadamente el 45% de
los promotores de B. subtilis, y sería importante para modular la actividad
transcripcional e indispensable para asegurar la correcta expresión de estos genes
(Helmann, 1995; Voskuil y Chambliss, 1998). En el promotor PR está presente,
además, el denominado elemento UP. Este elemento, al cual se une la subunidad α
de la RNAP, se ha localizado en promotores con altos niveles de transcripción,
como son los correspondientes a los genes que codifican los RNA ribosomales,
habiéndose demostrado que es precisamente este elemento el que confiere la
capacidad de transcribir a altas tasas (Ross y col., 1993; Busby y Ebright, 1994;
Fredrick y col., 1995; Ross y col., 1998). Recientemente se ha descrito una
secuencia consenso para este elemento UP (Estrem y col., 1998), la cual se
Discusión 99
encuentra en el promotor PR. Esta podría ser la explicación a la diferencia observada
en los niveles de expresión entre los promotores PR y PL, ya que para el resto de las
regiones importantes en la modulación de la transcripción (regiones –10, –16,
espaciadora y –35) los dos se ajustan bien a las secuencias consenso descritas y no
existen grandes diferencias entre ellos.
Mediante análisis “Northern” pudimos comprobar que PL es el promotor
del ciclo lisogénico al ser responsable de la transcripción del gen del represor, cI, y
de orfX, mientras que PR sería el promotor temprano del ciclo lítico al transcribir los
genes cro, ant y el módulo de replicación del fago. Estos datos se complementan con
los que indican que CI reprime la transcripción de PR, mientras Cro hace lo mismo
con PL. Al analizar la presencia de transcritos específicos en función de los datos
obtenidos de la curva de desarrollo en un paso del fago, eclipse 100 min y latencia
120 min (Herrero y col., 1994), vemos que cro y el resto de los genes
correspondientes al operón comienzan a expresarse a tiempos tempranos, y que, el
mRNA resultante del mismo permanece en la célula hasta el final del ciclo infectivo.
Este resultado sorprende un poco, puesto que está descrito que los productos de los
genes tempranos interfieren en el desarrollo de las fases tardías del ciclo infectivo,
por lo que suele existir un mecanismo de represión de dichos promotores tempranos
(Friedman y Gottesman, 1983), que se activa coincidiendo con el cambio de fase en
el ciclo lítico y que se une a une vida media corta de los mRNA tempranos
(Rodríguez y col., 1988; Suárez y col., 1992). En el caso del bacteriófago A2 este
mecanismo no parece existir, ya que los genes de replicación se expresan a lo largo
de todo el ciclo lítico. Sin embargo, este fenómeno no es un hecho aislado, puesto
que se ha detectado en el bacteriófago r1t que infecta a Lactococcus lactis (Franke –
Fayard y col., 1999).
Ambos promotores dan lugar a varios transcritos, entre los genes cI y orfX
se encontró un posible terminador de la transcripción, lo que podría explicar la
generación de los dos transcritos a partir de PL e implica que dicho terminador no es
lo bastante eficiente como para detener la transcripción completamente. La
existencia de terminadores ineficientes permite una mayor versatilidad de expresión
y regulación génica, especialmente en los bacteriófagos, ya que a partir de un único
promotor se pueden transcribir varias proteínas de forma coordinada, pero variando
100 Discusión
las proporciones de cada una de ellas. En este caso vemos como tanto a partir de PL
como de PR se produce este hecho obteniéndose mas cantidad de mRNA susceptible
de ser traducido de los genes reguladores tempranos, cI y cro, que del resto de genes
transcritos (por ejemplo las proteínas de replicación).
El concepto de interruptor transcripcional se emplea en situaciones en las
que dos o mas promotores comparten una región reguladora de forma que la
expresión de uno de ellos reprime la actividad de los otros o viceversa (Pérez –
Martín y col., 1994). Los promotores implicados en el interruptor pueden estar
organizados de forma divergente o en tandem. La disposición divergente de los
promotores es una estrategia muy común de regulación de la transcripción tanto en
bacterias como en sus bacteriófagos (revisado en Beck y Warren, 1988), ya que
permite una regulación diferencial de los niveles de expresión, especialmente en el
caso de que las proteínas que se originen a partir de la traducción de los genes
correspondientes actúen como moduladores de su expresión, convirtiéndose
entonces en un interruptor genético altamente sensible. El caso mas conocido de esta
organización es el conmutador de ciclo del bacteriófago lambda (Johnson y col.,
1981; Ptashne, 1992).
En todos los sistemas de este tipo descritos en procariotas los promotores se
localizan en caras diferentes del DNA o bien tienen un cierto grado de solapamiento
(Reznikoff y col., 1987). En general, la curvatura inducida por una proteína
represora en su sitio diana tiene un sentido opuesto al que necesitaría la RNAP unida
al promotor para formar un complejo activo transcripcionalmente (Zwieb y col.,
1989). Así pues, la disposición estructural hace que la curvatura inducida por el
represor le ayude a bloquear la transcripción a partir del promotor antagonista. Sin
embargo, en el caso del bacteriófago A2 no puede existir un mecanismo que
implique una curvatura en el DNA para ayudar a la represión de uno de los dos
promotores, puesto que ambos se localizan en la misma cara del DNA, y la
curvatura inducida será por tanto en la misma dirección que necesitaría la RNAP
para transcribir. Por otro lado, hay que recordar que los promotores no son
solapantes. Estos dos hechos hacen peculiar al conmutador genético del bacteriófago
A2 y por tanto lo dotan de un gran interés biológico.
Discusión 101
Las tres repeticiones invertidas espaciadas entre los promotores PR y PL se
corresponden con los operadores del conmutador genético y los denominamos O1,
O2 y O3 por su analogía con los operadores del bacteriófago lambda. La secuencia de
cada uno de ellos, de 20 pb con un eje central de simetría, difiere ligeramente de la
del resto (Figura 9). Este hecho es importante, ya que nuevamente por analogía con
el bacteriófago lambda, estas diferencias podrían explicar los distintos grados de
afinidad de CI y Cro por cada operador, constituyendo así un elemento básico para
el correcto funcionamiento del conmutador de ciclo (Ptashne, 1992).
De todo lo anterior se deduce que la organización general del conmutador
genético del bacteriófago A2 es muy similar, a pesar de las diferencias a nivel de
transcripción, a la encontrada en bacteriófagos bien estudiados como lambda o P22
(Jonhnson y col., 1981; Poteete y Ptashne, 1982), aunque en estos fagos en
particular los operadores están distribuidos de forma uniforme. Sin embargo, se han
caracterizado sistemas similares en otros bacteriófagos en los que, al igual que en
A2, los operadores se encuentran espaciados de forma asimétrica como ocurre con
HK022 o φ80 (Carlson y Little, 1993; Ogawa y col., 1988 b). Otra peculiaridad del
conmutador genético de A2 es que las distancias relativas entre los diferentes
elementos que lo componen son mucho mayores que en los fagos lambdoides
caracterizados, así la región intergénica cI – cro tiene 161 pb, mientras que en
lambda es de 100 pb (Figura 41). El tamaño de la región intergénica es posible que
sea aun mayor en otros bacteriófagos de bacterias lácticas, como BK5–T o φadh
(véase capítulo I.2.3.2 de la Introducción) en los que es de 257 y 436 pb
respectivamente (Boyce y col., 1995 b; Engel y col., 1998) aunque en estos
bacteriófagos no se ha caracterizado la funcionalidad del conmutador genético y su
naturaleza es solo hipotética.
IV.2. CARACTERISTICAS Y FUNCION DE CI.
La proteína codificada por el gen cI presentó las características
estructurales y funcionales típicas de los represores de bacteriófagos, es decir
homología de secuencia con represores de otros bacteriófagos, un motivo hélice α –
giro – hélice α de unión a DNA en su extremo amino – terminal, un motivo de corte
102 Discusión
para la proteasa RecA, en su extremo carboxi – terminal y su patrón de
transcripción. El gen cI se transcribe durante el periodo temprano del ciclo lítico y
en derivados lisogénicos. Ahora bien, la prueba definitiva de que CI es el represor
del ciclo lítico del fago A2, vino dada por su capacidad de conferir resistencia a la
superinfección por A2 a clones de Lactobacillus casei en los que se introdujo el gen
cI. Dichos clones constituyen una primera generación de cepas que han mostrado su
aptitud tecnológica. Así, son capaces de coagular la leche en presencia del
bacteriófago A2 dando lugar a una cuajada con las mismas características de
elasticidad y capacidad de desuerado que la que produce la cepa parental o la que
contiene únicamente el vector integrativo pEM40 en ausencia de fago (Alvarez y
col., 1999).
croPR
cIPRM
-3 5 -3 5-10 -10
OR3 OR1OR2
17 17 17
24 25
42
6 7
OR3 OR1OR2
PRM PR
-10 -10
O3 O1O2
cI
cro-35 -35
PL
PR
33 25
20 2020
53.5 46.5O3 O2 O1
76PL PR
Figura 41. Esquema de los conmutadores de ciclo de los bacteriófagos λ (arriba) y A2 (abajo).Se indican las distancias relativas entre los distintos elementos, la posición de las cajas –10 y–35, los operadores (cajas grises), así como los inicios de transcripción (flechas truncadas).
La proteína CI se une específica y cooperativamente a los operadores del
conmutador de ciclo aunque con mayor afinidad por O1 y O2 que por O3. La
organización simétrica de los operadores sugiere que CI, que es un monómero en
solución, podría dimerizar al unirse a cada uno de los brazos de las repeticiones. A
bajas concentraciones CI forma dos complejos con movilidad electroforética
Discusión 103
retardada, mientras que a altas concentraciones sólo se observa un complejo DNA –
proteína. El análisis de esta unión mediante la técnica de protección a la digestión
por DNasa I permitió determinar que la unión de CI a los operadores provoca una
curvatura en el DNA que se manifiesta por la gran cantidad de sitios de
hipersensibilidad a la DNasa I detectados entre los operadores. La distancia entre los
centros de simetría de los operadores O1 y O2 es de 46´5 pb (Figura 41), es decir
están separados por 4´5 vueltas de hélice. Por lo tanto, hay que asumir que la hélice
del DNA debe sufrir un giro para permitir la unión cooperativa de CI a ambos.
Actualmente, desconocemos el coste energético que tendría un giro de estas
características. Por otro lado, O2 y O3 están situados en la misma cara del DNA, la
distancia entre sus centros de simetría es de 53´5 pb lo que constituye
aproximadamente 5 vueltas de hélice (Figura 41). Esto favorecería la curvatura en el
DNA tras la unión de CI, como se deduce de los sitios de hipersensibilidad
detectados entre estos operadores que se presentan aproximadamente cada 10 pb, es
decir una vuelta de hélice. (Figuras 15 y 16).
La organización de los operadores y los promotores detectados en el
conmutador genético de A2 sugerían la posibilidad de que, al igual que sucede en el
fago lambda, CI regulara la transcripción del promotor lítico PR. Lo que se observó
fue que CI desplazaba a la RNAP del promotor PR, cuya región –35 solapa con O2,
por el cual CI presenta una gran afinidad. Esto resultaba en la represión de la
transcripción de los genes que conducen al bacteriófago hacia el ciclo lítico.
Asimismo, se observó que la RNAP resultaba desplazada de su posición normal
hacia el promotor PL a bajas concentraciones de CI. Este desplazamiento podría
significar que CI sería capaz de promover su propia transcripción al igual que sucede
con el represor del bacteriófago lambda. Igualmente, si se sigue aumentando la
concentración de CI se observa que la RNAP resulta desplazada completamente de
ambos promotores, lo que resultará en una represión de la transcripción de ambos
genes tempranos. CI por tanto se comportaría como un regulador autógeno de su
propia transcripción siendo capaz de estimularla cuando se encuentra en
concentraciones bajas y de inhibirla si la concentración de la proteína aumenta por
encima de un determinado nivel. Sin embargo, aunque los efectos finales de la
interacción CI – Interruptor son semejantes en λ y A2, los mecanismos por los que
104 Discusión
esto se consigue han de ser forzosamente distintos. En el caso del bacteriófago λ CI
estimula su propia transcripción debido a la interacción física entre el represor y la
subunidad σ de la RNAP. Esta interacción es posible por la proximidad que existe
entre el operador OR2 y el promotor PRM (Patshne, 1992; Kundell y Hochschild,
1994; Li y col., 1994). Recientemente se ha demostrado, usando construcciones
artificiales, que CI unido al operador OR2 alejado 20 pb del promotor PRM, es incapaz
de estimular la transcripción a partir del mismo debido a que es incapaz de contactar
con la subunidad σ de la RNAP (Dove y col., 1997). En el caso de lambda OR2
solapa parcialmente con el promotor PRM, mientras que en A2 la distancia entre O2 y
la región –35 de PL es de unos 40 pb (Figura 41), por lo que no es posible una
interacción directa del represor y la subunidad σ de la RNAP. Por lo tanto, la posible
activación de la transcripción a partir de PL mediada por CI en el bacteriófago A2
debe de estar causada por una interacción entre esta proteína y la subunidad α de la
RNAP. Resultados preliminares realizados en nuestro laboratorio sugieren que éste
es el mecanismo por el que el represor actúa.
IV.3. CARACTERISTICAS Y FUNCION DE CRO.
En el fago lambda la proteína Cro es la encargada de mantener activo el
ciclo lítico a través del bloqueo de la transcripción del gen del represor, cI, a partir
del promotor PRM (Johnson y col., 1981). La disposición del gen cro del bacteriófago
A2 respecto del gen cI, las características estructurales de la proteína y las
homologías de secuencia encontradas, parecían indicar que se trataba del homólogo
funcional de lambda cro. La confirmación de su papel se obtuvo determinando que
la proteína Cro se unía específicamente a la región intergénica cI – cro y que era
capaz de reprimir la transcripción a partir del promotor PL. La casualidad de que al
sobrexpresar Cro apareciera además una forma truncada de la proteína, Cro*, a la
que le faltaban los últimos 11 aminoácidos, nos permitió definir los dominios
funcionales de la misma. Así, ambas proteínas presentaban un mismo patrón de
protección de los operadores, lo que indica que el dominio de unión a DNA está
situado en la porción amino – terminal de la molécula. Por otro lado, las diferencias
observadas en la formación de los complejos con el DNA entre ambas proteínas nos
Discusión 105
permite concluir que el extremo carboxi – terminal de Cro estaría implicado en la
estabilidad del complejo DNA – proteína, en la formación de los dímeros de Cro al
unirse al DNA y en el tipo de complejos formados, puesto que la Kapp de Cro* es al
menos 4 veces mayor que la estimada para Cro y en los ensayos de retardo en gel
Cro* solo forma un complejo con movilidad electroforética retardada, mientras Cro
da lugar a dos.
Estos datos se ven corroborados por los experimentos de filtración en gel,
los cuales muestran que Cro*, al contrario que Cro, es incapaz de dimerizar, al
menos en el rango de concentraciones empleadas. Estos datos sugieren que la
estructura de Cro es similar a la de su homologo en el bacteriófago lambda. En el
extremo carboxi – terminal de esta última proteína se localiza un lazo antiparalelo
(residuos 54 – 56 y 54´ – 56´) que forma parte de la región implicada en la
dimerización y que está cercano a la región de interacción con el DNA (Anderson y
col., 1981; Albright y Matthews, 1998). Este extremo carboxi – terminal permite una
conexión flexible entre los monómeros y es un factor crítico en la afinidad de la
proteína por el DNA (Hubbard y col., 1990).
Integrando todos estos datos postulamos que el complejo I detectado en
EMSA se formaría por la unión de la proteína al DNA, mientras que la formación
del complejo II vendría mediada por un cambio en la forma del DNA. Este complejo
se estabilizaría mediante las interacciones entre los extremos carboxi – terminales de
Cro al dimerizar sobre el DNA. Si esta hipótesis fuera cierta, el complejo II no se
detectaría en los ensayos EMSA en los que estuviera presente Cro* ya que este no
dimeriza y además los complejos serían menos estables. Por otro lado, también
explicaría que no se detectaran diferencias en los ensayos de protección a la
digestión con DNasa I entre ambas proteínas, ya que al realizarse estos en presencia
de Mg2+, necesario para la actuación de la DNasa I, se desestabilizarían las
interacciones entre los dímeros de Cro y por tanto los cambios conformacionales en
el DNA, obteniéndose una imagen semejante a la que da Cro*.
Al igual que para CI la unión de Cro a los operadores provoca una
curvatura en el DNA a juzgar por la aparición de múltiples sitios de
hipersensibilidad al corte por DNasa I localizados entre los operadores y en el centro
de los mismos. Ahora bien, esta unión no es cooperativa. La afinidad de Cro por la
106 Discusión
región de DNA en la que se localiza el conmutador genético es similar a la de CI
(Kapp = 6 nM frente a Kapp = 7 nM). Sin embargo, difieren en la afinidad relativa por
cada operador, siendo ésta mayor para O3 en el caso de Cro y mayor por O1 y O2
para CI. Estos datos unidos al hecho de que el operador O3 solapa con la región – 35
del promotor PL sugiere que Cro podría actuar como un represor del ciclo lisogénico
y los resultados obtenidos mediante ensayos de transcripción in vitro confirman este
hecho.
Igualmente, los datos obtenidos in vitro predicen que la acumulación de
Cro conllevaría una represión del promotor PR al solapar el operador O2 con la
región – 35 del mismo y situarse O1 por delante del inicio de transcripción, lo que
podría bloquear el avance de la RNAP. Sin embargo, los estudios de transcripción
realizados in vivo parecen indicar que la represión de PR no tiene lugar ya que, en los
experimentos “Northern”, el mRNA correspondiente se mantiene durante todo el
ciclo lítico. Esto podría explicarse porque los transcritos resultantes de la expresión
tuviesen una vida media excepcionalmente larga, lo que corroboraría la primera
hipótesis o bien que en la célula nunca se alcanzaran los niveles de Cro necesarios
para que se una a los operadores O2 y O1. Alternativamente, Cro unido a O3 podría
estabilizar la RNAP sobre el promotor PR, lo que impediría la unión de Cro a los
operadores O1 y O2. A este respecto, al aumentar la concentración de Cro en los
ensayos de competición entre Cro y la RNAP de B. subtilis analizados mediante
EMSA (Figura 31) se observa la aparición de un nuevo complejo DNA – proteína, al
que denominamos I*. De igual modo, en los mismos experimentos de competición,
analizados mediante ensayos de protección frente a la DNasa I (Figura 32) al
aumentar la concentración de Cro se produce un desalojo de la RNAP de los
promotores y la recuperación del patrón de protección de Cro. Pero, al mismo
tiempo, se observa la aparición de nuevas bandas de hipersensibilidad indicando,
posiblemente, que la RNAP no se desplaza completamente del DNA, si bien este
extremo no a podido ser comprobado y requiere posteriores estudios.
Los datos obtenidos del estudio de las proteínas CI y Cro, y de los
elementos que constituyen el conmutador de ciclo del bacteriófago A2 sugieren que
inmediatamente después de la entrada de una molécula del genoma de A2 en la
célula hospedadora se producirá una transcripción temprana a partir de los
Discusión 107
promotores PR y PL. Este hecho conllevaría la síntesis de moléculas de Cro y de CI
que se unirían a los operadores O3 y O2 – O1 respectivamente. La unión de Cro a O3
induciría la represión del promotor lisogénico PL y llevaría el desarrollo del fago
hacia el ciclo lítico. En cambio, la unión de CI a los operadores O1 y O2 provocaría
la represión del promotor lítico PR y, en un primer momento una mayor
transcripción de su propio gen, cI, lo que conduciría al bacteriófago infectante hacia
un ciclo lisogénico y a permanecer en el estado de profago. El que el fago siga una
vía de desarrollo u otra sería una cuestión de azar, probablemente influida por las
condiciones del ambiente celular que podrían modular la expresión relativa de un
promotor respecto al otro.
Los resultados obtenidos nos muestran que en general la regulación de la
decisión de seguir el ciclo lítico o lisogénico en el bacteriófago A2 se rige por
principios similares a los descritos para los fagos lambdoides, aunque con claras
diferencias. Por un lado las distancias relativas entre los distintos elementos del
sistema de decisión, son mayores en el caso de A2, además de la especial
disposición estructural de ambos promotores situados sobre la misma cara del DNA,
implican que algunos de los mecanismos empleados por las proteínas para llevar a
cabo su función sean diferentes. El patrón de transcripción de los promotores
también es diferente, ya que PL puede transcribirse de forma constitutiva sin
necesidad de un activador y PR probablemente no ve detenida su expresión en el
periodo tardío del desarrollo lítico, sino que continúa transcribiéndose hasta el final
del ciclo. A pesar de estas diferencias parece claro que el sistema del conmutador de
ciclo se encuentra tanto en los colifagos como en los virus que infectan a las
bacterias gram positivas, lo que indica que es tan eficiente que se ha distribuido por
todo el reino Bacteria, a pesar de los diferentes hábitats de los hospedadores y por
tanto de la diferente presión selectiva a la que han estado sometidos.
IV.4. EL OPERON DE LAS PROTEINAS ESTRUCTURALES.
El ensamblaje de las cápsidas de los bacteriófagos de dsDNA es un proceso
complejo que implica la unión de cientos de subunidades de diferentes proteínas
estructurales de una forma ordenada para generar en un primer momento la cabeza
108 Discusión
de la partícula vírica. En la estructura icosaédrica debe introducirse de forma
compacta una molécula de DNA genómico, generalmente a través del poro formado
por una estructura proteica denominada portal o conectora. La entrada del DNA en
el interior de la cabeza viene acompañada de un proceso de expansión de la misma.
El proceso de formación de la cola también es secuencial, a una serie de proteínas
iniciadoras se une la proteína mayoritaria de la cola, que forma una estructura
tubular básica. Una vez formadas la cabeza y la cola se produce la unión de ambas, a
través del conector, para generar la partícula vírica madura. Esta estructura protege
al DNA genómico del virus de las agresiones del medio ambiente y está preparada
para liberarlo al encontrar un hospedador adecuado.
Los genes que codifican las proteínas estructurales del bacteriófago A2 se
encuentran agrupados en el brazo izquierdo del mapa genómico, en una región de
aproximadamente 16 kb localizada entre los genes de la terminasa y los del sistema
lítico. Este dato concuerda con los obtenidos para la mayoría de los fagos
estudiados, donde los genes de las proteínas morfogenéticas se localizan muy cerca
unos de otros y se expresan de forma coordinada (Casjens y Hendrix, 1988).
El contenido en G + C del segmento morfogenético es de un 45,4%, una
proporción semejante a la del resto del genoma de A2, 45%, y de Lactobacillus
casei, 46%, (Kandler y col., 1986). Curiosamente no se observa una reducción
sustancial en el % de G + C, típico de la mayoría de los genes de Lactobacillus,
cuando se analiza únicamente el tercer nucleótido de cada codón. Se ha sugerido
(Pouwels y Leer, 1993; Pouwels y Leunissen, 1994) que este mantenimiento del %
G + C en la tercera posición es peculiar de los genes que presentan una expresión
muy activa, como puedan ser los genes que codifican las proteínas de la capa S, los
cuales constituyen entre un 5 y un 10% del contenido de proteína total en la célula
(Vidgrén y col., 1992). En este sentido los genes de las proteínas estructurales de los
bacteriófagos, también tienen una expresión muy activa, puesto que se necesita un
número suficiente de copias de sus productos para asegurar un correcto desarrollo de
las cápsidas y obtener la producción de una progenie lo mas numerosa posible.
La región morfogenética presenta una alta densidad génica, mas del 80% de
la misma es codificante, detectándose solapamientos entre los codones de inicio y
parada de algunas orfs e incluso un solapamiento parcial entre dos de ellas. Estos
Discusión 109
solapamientos indican que puede haber acoplamiento traduccional y sugiere que la
región se expresa como un único operón. De hecho, los resultados obtenidos en los
estudios de transcripción indican que todos los genes estructurales se transcriben a
partir de un único promotor que genera un mRNA de mas de 17 kb, cuyo final se
encuentra inmediatamente antes del operón lítico del fago, lo que implica que dicho
promotor se localizaría en el brazo derecho del genoma del fago, concretamente en
la porción proximal del segmento EcoRI de 8´9 kb (Figura 2). Así pues, dicho RNA
incluiría los genes correspondientes a la terminasa, cuyos dos componentes se
encuentran a ambos lados de los extremos cohesivos (García y col., 1997), mas
todos los genes estructurales. La transcripción del operón se produce a partir del
minuto 60 post – infección y se mantiene hasta la lisis celular. Parece por tanto que
la expresión es inducible y probablemente lo sea por factores virales que se
sintetizan durante el periodo temprano del ciclo lítico, lo cual está de acuerdo con lo
descrito para la mayoría de los fagos estudiados, donde las proteínas estructurales se
sintetizan de forma coordinada en la etapa tardía de la infección (Casjens y Hendrix,
1988).
En el caso de las bacterias lácticas, en aquellos fagos que se ha investigado,
se ha encontrado una situación similar. Así por ejemplo, en el caso del bacteriófago
TP901–1 se ha visto que las proteínas estructurales se traducen desde un único
mRNA que se sintetiza a partir de un promotor tardío (Plate) que necesita la presencia
de un activador transcripcional (Orf27), codificado por el mismo fago, para ser
activo (Brønsted y Hammer, 1998; Madsen y Hammer, 1998). Alternativamente, en
el bacteriófago λ las proteínas estructurales se sintetizan a partir de un único
promotor PR´ que genera un mRNA de al menos 21 kb que atraviesa los extremos
cohesivos y que incluye además de los genes de la cápsida los genes necesarios para
la lisis celular. El promotor PR´ es constitutivo, aunque genera un mRNA muy corto
debido a la presencia de un terminador a 0´5 kb. La síntesis del mRNA tardío
necesita la acción previa del antiterminador Q (Friedman y Gottesman, 1983).
La función de las diferentes proteínas codificadas en la región
morfogenética se dedujo bien experimentalmente, caso de las mayoritarias de la
cabeza (gpE, gpF y gpG) y de la cola (gpD) o bien por analogía con otras,
depositadas en las bases de datos, con las que presentaban homología de secuencia.
110 Discusión
Así, gpH presentó homología con proteínas del conector, mientras que Orf209
podría ser la proteasa responsable del procesamiento post – traduccional de la
proteína mayoritaria de la cabeza y/o de gpH. El resto de las proteínas que
presentaron homologías significativas, lo hicieron con componentes minoritarios de
la cola. Así Orf465 y Orf563 podrían ser determinantes de la longitud de la misma
por su parecido con gpT del bacteriófago P2 (Christie y col., 1998) y con la proteína
H del fago lambda (Casjens y Hendrix, 1988), respectivamente. Es interesante
indicar que Orf563 presentó homología con las cadenas pesadas de la miosina.
Aunque en principio este parecido podría resultar sorprendente, en realidad
respondería a una función común que es la de mediar en la autopolimerización de
estructuras tubulares como puedan ser las moléculas de miosina del músculo y las
colas de los bacteriófagos.
La proteína gpJ presentó homología en las bases de datos con la proteína
Orf1276 del bacteriófago φSfi21de Streptococcus thermophilus y la proteína J del
fago λ (Desiere y col., 1998; Hendrix y col., 1983) que podrían estar implicadas en
el reconocimiento del hospedador, encontrándose en una posición equivalente en el
genoma al de ellas y presentando además un tamaño y pI similares (Figura 39).
Al comparar la secuencia aminoacídica del extremo amino – terminal de
aquellas proteínas estructurales en las que fue posible obtenerla, con la secuencia
deducida a partir de las orfs correspondientes se puede observar que en tres de ellas
falta la formilmetionina inicial. Para las proteínas gpD y gpI, los resultados están de
acuerdo con la regla general de que la metionina inicial se procesa cuando el
segundo aminoácido es alanina (Ben–Bassat y Bauer, 1987). También se ha descrito
que la probabilidad del procesamiento aumenta cuanto menor es el tamaño del
segundo aminoácido (Hirel y col., 1989) como sucede en el caso de gpJ.
Resulta llamativa la diferencia observada entre las masas moleculares de las
proteínas estructurales calculadas a partir de las correspondientes orfs y los
estimados a partir de los geles SDS – PAGE. Sin embargo, esta diferencia se ha
descrito en otros bacteriófagos, como puede ser el caso de F4–1 de Lactococcus
lactis (Kim y Batt, 1991). Esta discrepancia podría ser una peculiaridad de las
proteínas acídicas en los geles SDS – PAGE (See y Jackowski, 1989). Este podría
ser el caso de las proteínas estructurales gpD, gpH y gpI de A2 ya que todas ellas
Discusión 111
tienen un peso estimado en gel mayor que el calculado a partir de sus
correspondientes orfs, y todas presentan un pI menor de 5 (Tabla 4).
Asimismo, también se observó que dos de los genes, orfEFG y orfH, daban
lugar a proteínas que sufrían un proceso de maduración por corte proteolítico. En el
primer caso (proteína mayoritaria de la cabeza) se produce la liberación de un
péptido de 123 aminoácidos, mientras que en el segundo (proteína portal) se liberan
los 5 aa amino – terminales, un proceso que se ha observado también en las
proteínas portales de λ y φC31 (Catalano y col., 1995; Smith y col., 1999) aunque en
estos casos se liberan 22 aa.
El procesamiento proteolítico de las proteínas que participan en la
morfogénesis viral es un fenómeno generalizado que tiene lugar en muchos virus
animales y bacterianos (Dougherty y Semler, 1993). En el caso de los bacteriófagos
se ha descrito con detalle el procesamiento de las proteínas de los bacteriófagos T4,
lambda y P22 (Casjens y Hendrix, 1988). Mas recientemente, se ha publicado para
los bacteriófagos HK97 (Duda y col., 1995 b y c) y PR4 (Myung y col., 1994),
aunque hay evidencias de procesamiento en otros muchos fagos que infectan
hospedadores muy heterogéneos como c2 que infecta a Lactococcus lactis (Lubbers
y col., 1995), LL–H que se propaga sobre Lactobacillus delbrueckii (Mikkonen y
Alatossava, 1994), φg1e que ataca a Lactobacillus casei (Kakikawa y col., 1996),
φadh que se desarrolla sobre Lactobacillus gasseri (Altermann y col., 1999), φC31
que infecta a Streptomyces (Suárez y col., 1984), φSfi21 que afecta a Streptococcus
thermophilus (Desiere y col., 1999) o Cp–1 que se propaga sobre Streptococcus
pneumoniae (Martin y col., 1998).
Se ha sugerido que el procesamiento provoca la irreversibilidad del proceso
de ensamblaje y que su importancia en dicho proceso se debe a que provoca los
cambios conformacionales necesarios para un correcto desarrollo del mismo. En
muchos casos esta actividad proteolítica está codificada por el propio fago pudiendo
ser incluso un proceso autocatalítico (Casjens y Hendrix, 1988).
El gen orfEFG da lugar a tres proteína estructurales gpE, gpF y gpG, como
se deduce de su extremo amino – terminal común. Dichas proteínas corresponderían
al monómero en el primer caso (orfEFG tiene capacidad para codificar un
polipéptido de 29 kDa y gpE migra en geles de SDS – PAGE como una proteína de
112 Discusión
35 kDa) y a multímeros en los otros dos. Este dato implica que las uniones entre los
monómeros en gpF y gpG deben ser resistentes al tratamiento con SDS en caliente y
en presencia de β – Mercaptoetanol. El fenómeno de una unión covalente entre las
subunidades de la proteína mayoritaria de la cabeza para formar una cabeza madura
fue descrito por primera vez por Poppa y colaboradores (1991) para el bacteriófago
HK97. Sin embargo, en la actualidad se conocen otros fagos en los que se da este
proceso como son L5, que infecta a Mycobacterium spp. (Hatfull y Sarkis, 1993), y
c2 y r1t de Lactococcus lactis (Lubbers y col., 1995; van Sideren y col., 1996), por
lo que parece que la formación de enlaces cruzados entre las distintas subunidades
de la cabeza es un fenómeno ampliamente distribuido entre grupos muy diversos de
bacteriófagos. Recientemente Duda (1998) ha propuesto un modelo de organización
de las proteínas de la cabeza del fago HK97 basado en una estructura de cota de
malla. Los monómeros de la proteína mayoritaria de la cápsida que forman la cabeza
se unen entre si para formar hexámeros y pentámeros mediante enlaces amida entre
los residuos lisina – 169 y asparragina – 356 (Duda y col., 1995c) y a su vez, estas
subunidades quedarían unidas formando anillos en una estructura semejante a las
cotas de malla de los caballeros medievales para formar la cabeza icosaédrica de la
partícula viral (Duda, 1998). En el caso de la proteína mayoritaria de la cabeza de
A2 se localiza un residuo lisina en la posición 165 y uno de asparragina en la
posición 357 (Anexo II), teniendo en cuenta además la similitud de tamaños entre
ambas proteínas, 400 aa la de A2 frente a 385 aa la de HK97, estos residuos podrían
estar implicados en la formación de enlaces amida que resultarían en la aparición de
multímeros, aunque esta implicación deberá ser corroborada de forma experimental.
Ninguna de las Orfs encontradas en A2 presentó homología con proteínas
de andamiaje de otros bacteriófagos, sin embargo, esto no es un hecho extraño,
puesto que habitualmente estas proteínas solo presentan homología a nivel de
estructura secundaria (Casjens y Hendrix, 1988). En general todas ellas presentan un
extremo amino – terminal rico en estructura hélice alfa y una gran abundancia de
residuos cargados; en el caso del bacteriófago φ29 un 46% de los residuos están
cargados y en los fagos T4 y T7 un 30% (Eppler y col., 1991). Ambas características
tienen una gran importancia en la funcionalidad de la proteína, como ha quedado
Discusión 113
demostrado en el caso de la proteína de andamiaje del bacteriófago P22. Esta
proteína presenta una estructura en hélice alfa en su extremo amino – terminal que
forma una estructura de hélice superenrollada, “Coiled coil”, que le permite la
dimerización y de esta forma interactuar con las subunidades de la proteína
mayoritaria de la cabeza estabilizando, mediante interacciones electrostáticas entre
residuos cargados, las uniones entre los pentámeros y hexámeros para formar las
procabezas antes de la entrada del DNA en las mismas (Parker y Prevelige, 1998).
En el caso del bacteriófago HK97 no existe ningún gen que codifique para la
proteína de andamiaje, sino que se cree que funcionaría como tal el extremo amino –
terminal de la proteína mayoritaria de la cabeza una vez liberado tras un corte
proteolítico (Duda y col., 1995b). Esta suposición se basa en las características
estructurales de dicho péptido, ya que presenta un dominio en su región amino –
terminal con una alta probabilidad de formar una estructura de hélice superenrollada.
Al igual que para este bacteriófago se ha descrito una situación similar para el
bacteriófago φSfi21 (Desiere y col., 1999). En el bacteriófago A2 el extremo amino
– terminal de la proteína mayoritaria de la cabeza, liberado por proteolisis como un
péptido de 123 aa, presenta características estructurales similares a las de las
proteínas de andamiaje, como son una gran cantidad de residuos cargados (40%) y
una región amino – terminal rica en estructura hélice alfa y con un dominio de
cremallera de leucinas que mediaría su dimerización en forma de hélice
superenrollada. Así pues, al igual que ocurre en el caso de HK97 y φSfi21
proponemos que el gen orfEFG codifica un polipéptido que por un proceso
proteolítico de maduración generaría dos proteínas que funcionarían como proteína
de andamiaje y mayoritaria de la cabeza. El hecho de que un polipéptido, codificado
por un gen, pueda generar por procesamiento proteolítico dos o mas proteínas con
función diferente no es un hecho aislado y es probablemente una estrategia viral para
condensar su información genética, como es el caso del bacteriófago PR4, que
infecta a E. coli y Salmonella, donde el polipéptido precursor de la proteína
mayoritaria de la cabeza se procesa para dar lugar a ésta y otras dos proteínas de la
cápsida, con lo que a partir de un único gen se originan tres proteínas diferentes
(Myung y col., 1994).
114 Discusión
Recientemente Ackermann y col. (1995) han sugerido un origen común
para los fagos con cola, en base a una serie de características comunes como son la
estructura de la cabeza y de la cola, el genoma en forma de dsDNA, la presencia de
grupos de genes con función relacionada y la maduración de las cabezas por
proteolisis. Esta hipótesis se ve reforzada por la conservación de la disposición
estructural de los genes en módulos como puede ser el de las proteínas estructurales
(Botsein, 1980). Mas aun, también se observa que los genes que codifican las
proteínas de empaquetamiento de DNA, estructurales de la cabeza, de ensamblaje y
de la cola forman subgrupos adyacentes conservando ese orden preciso (Figura 39).
En el caso del bacteriófago A2 esta organización modular se conserva, y con la
particularidad de que atraviesa los extremos cohesivos del fago, es decir, únicamente
aparece una vez la molécula de DNA infectante se ha circularizado. Esta es una
prueba mas de la conveniencia biológica de presentar los genes implicados en la
morfogénesis en una disposición determinada. Aún podemos descender el último
peldaño en el nivel de organización común, que es el de las proteínas individuales
dentro de cada subgrupo. Así por ejemplo, las proteínas implicadas en el
empaquetamiento del DNA, la proteína portal, la proteasa responsable del
procesamiento de la proteína mayoritaria de la cabeza, la proteína de andamiaje y la
de la cabeza se presentan en este orden. Nuevamente resulta llamativo que esta
organización sea común a bacteriófagos que infectan hospedadores muy
heterogéneos, como puedan ser bacterias gram negativas y gram positivas y, dentro
de éstas, con contenidos G + C tan dispares como Streptomyces y Lactobacillus
(Figura 42).
En general, esta conservación del orden de los genes de los fagos con
dsDNA no se mantiene a nivel de su secuencia o la de sus productos, aunque si a
nivel de estructura tridimensional y funcionalidad de los mismos (Ackermann,
1999). Las razones que se aducen para la conservación de los agrupamientos de
genes son de dos tipos: por un lado resulta conveniente que genes con funciones
relacionadas o que deban interactuar entre si estén regulados conjuntamente. Por
otro lado, la organización modular favorece la generación de diversidad fágica, ya
que aumenta la probabilidad de que al producirse una recombinación entre dos fagos
individuales que infecten a un mismo hospedador, ésta resulte en la generación de
Discusión 115
dos individuos recombinantes que conserven todas las funciones necesarias para un
correcto desarrollo de su ciclo infectivo (Casjens y col., 1992).
A2
PortalTerminasa Proteasa CabezaAnd
amiaj
e
φC31
PortalTerminasa Proteasa CabezaAnd
amiaj
e
HK97
PortalTerminasa Proteasa CabezaAndam
iaje
φPVL
PortalTerminasa Proteasa Cabeza
Lambda
PortalTerminasa Cabeza
Andamiaje
Cabeza
Figura 42: Esquema de la organización de los genes implicados en la morfogénesis de lacabeza de diversos bacteriófagos.
Por otro lado, se ha observado que en ocasiones se presenta homología de
secuencia entre genes de bacteriófagos que infectan a hospedadores poco
relacionados filogenéticamente, lo cual apunta a la existencia de una transferencia
horizontal de la información genética que también se beneficiaría de la distribución
estructural común (Hendrix y col., 1999). Por tanto, podría pensarse que existe un
fondo genético común accesible a las diversas entidades que conocemos como fagos
116 Discusión
dsDNA, que constituiría un mecanismo evolutivo formidable en estos seres que
carecen de la versatilidad mutacional de los virus con RNA y de los procesos
sexuales y parasexuales de los organismos celulares.
Conclusiones 117
1ª) Se localizó la región genómica implicada en el control de la decisión
lisis/lisogenia. En ella se encontraron cuatro pautas abiertas de lectura orfX, cI,
cro y ant, estando las dos primeras situadas en dirección opuesta al resto. En el
espacio intergénico se sitúan tres repeticiones invertidas imperfectas, O1, O2 y
O3, que constituyen los operadores del sistema e interespaciados con éstas dos
promotores divergentes, PL y PR.
2ª) El gen cI se expresa a partir del promotor PL en tiempos tempranos
postinfeción y en lisógenos de Lactobacillus casei. La inserción de forma
estable del gen cI en el genoma de Lactobacillus casei 393, le confiere
resistencia a la superinfección por el bacteriófago A2. Este gen codifica una
proteína, CI, de 25 kDa que se une cooperativa y específicamente a los
operadores del sistema y que fue identificada como el represor del ciclo lítico.
3ª) La proteína CI reprime específicamente al promotor del ciclo lítico PR al
desplazar a la RNA polimerasa vegetativa de Bacillus subtilis de dicho
promotor recolocándola sobre el promotor PL en un proceso dependiente de
concentración.
4ª) El operón lítico temprano, que se expresa a partir del promotor PR durante todo
el ciclo infectivo esta constituido por los genes cro, ant y los correspondientes
al módulo de replicación.
5ª) El gen cro codifica una proteína de 9 kDa, Cro, que se une de forma específica
a los operadores del sistema. Mediante el estudio de un mutante de deleción se
determinó que la proteína Cro consta de dos dominios funcionales, una región
amino – terminal de unión a DNA y un extremo carboxi – terminal implicado
en la dimerización de la proteína.
6ª) La proteína Cro es capaz de reprimir al promotor lisogénico temprano PL al
desplazar, en un proceso dependiente de concentración, a la RNA polimerasa
vegetativa de Bacillus subtilis de dicho promotor.
118 Conclusiones
7ª) Se localizó la región genómica del bacteriófago A2 responsable de la
morfogénesis. En ella se localizaron dieciséis pautas abiertas de lectura, cinco
de las cuales codificaban para alguna de las proteínas estructurales
identificadas en geles SDS – PAGE, incluyendo las correspondientes a la
proteína mayoritaria de la cola y de la cabeza. Esta última proteína sufre un
proceso de maduración por corte proteolítico y se encuentra en forma de
multímeros.
8ª) Los genes que codifican las proteínas estructurales del bacteriófago A2 están
agrupados en su genoma, formando módulos funcionales con la ordenación:
empaquetamiento, morfogénesis de la cabeza y de la cola.
9ª) El operon de las proteínas estructurales se expresa como un único mRNA
tardío que atraviesa los extremos cohesivos del genoma fágico e incluye los
genes de la terminasa.
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Zwieb, C., Kim, J. y S. Adhya. (1989). DNA bending by negative regulatory
proteins: Gal and Lac repressors. Genes Dev. 3: 602-611.
Anexo I
. . . . . . TCACTTTGGTCGGTGGGGTAGGCGCTTTTTATTTTGTATCCAGCCCCACTCTCCGGCTTG 1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 60 AGTGAAACCAGCCACCCCATCCGCGAAAAATAAAACATAGGTCGGGGTGAGAGGCCGAAC
. . . . . . CACGGGGACGCCGCTTGCGTGGGGGAAGGAACTAGTCACCATAGTCGTCGGGAGCAGTTC 61 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 120 GTGCCCCTGCGGCGAACGCACCCCCTTCCTTGATCAGTGGTATCAGCAGCCCTCGTCAAG * D G Y D D P A T
. . . . . . CGGCGTCATCAATCTTCTTGGCCAAAGCCAATGGAACTGTGATTTTGCCACCCATAGTTG 121 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 180 GCCGCAGTAGTTAGAAGAACCGGTTTCGGTTACCTTGACACTAAAACGGTGGGTATCAAC G A D D I K K A L A L P V T I K G G M T
. . . . . . ACTTGTAAGTGGTGGTACCCAAGCTTTCAGCATAGAAGGTGATCTTGTCATTTTCTAGAA 181 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 240 TGAACATTCACCACCATGGGTTCGAAAGTCGTATCTTCCACTAGAACAGTAAAAGATCTT S K Y T T T G L S E A Y F T I K D N E L
. . . . . . TTCGAGAGCCGTTCATAATATCTGGATCATAACCGACCATAACTATATTGTCATAGTTGC 241 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 300 AAGCTCTCGGCAAGTATTATAGACCTAGTATTGGCTGGTATTGATATAACAGTATCAACG I R S G N M I D P D Y G V M V I N D Y N
. . . . . . CGTCGACAGCAACACGCAAATCATTTTCATCGTCACCCTCAACGACTTGAATAACTTTGC 301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 360 GCAGCTGTCGTTGTGCGTTTAGTAAAAGTAGCAGTGGGAGTTGCTGAACTTATTGAAACG G D V A V R L D N E D D G E V V Q I V K
. . . . . . CCGTTAGAGTAATGTTCTTGCCTTTGTAGTCGTCTGGAGTCCGTGCCAACTGTTCATAAG 361 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 420 GGCAATCTCATTACAAGAACGGAAACATCAGCAGACCTCAGGCACGGTTGACAAGTATTC G T L T I N K G K Y D D P T R A L Q E Y
. . . . . . TGATGCCAGTGTTGTAGTCAGCTGCGTTGAATGCTTCAGTGCTCGATGATTCCTCACTAT 421 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 480 ACTACGGTCACAACATCAGTCGACGCAACTTACGAAGTCACGAGCTACTAAGGAGTGATA T I G T N Y D A A N F A E T S S S E E S
. . . . . . CTGAATCGTCACTATCAGATTCTCCATAACTGTCATCATCTTCTTGCGACGATTTTGACC 481 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 540 GACTTAGCAGTGATAGTCTAAGAGGTATTGACAGTAGTAGAAGAACGCTGCTAAAACTGG D S D D S D S E G Y S D D D E Q S S K S
. . . . . . TTTGACGATTCAGCTTTGAAGACGAACTAGACGCAGCTGACCTGTTGCTTTCTCCCGAGT 541 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 600 AAACTGCTAAGTCGAAACTTCTGCTTGATCTGCGTCGACTGGACAACGAAAGAGGGCTCA R Q R N L K S S S S S A A S R N S E G S
Anexo I
. . . . . . AGGTGCCAATCCAAAAAAAGATTGCAATAAATGCTACCGCCGACAATGCGGTAATAATAA 601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 660 TCCACGGTTAGGTTTTTTTCTAACGTTATTTACGATGGCGGCTGTTACGCCATTATTATT Y T G I W F F I A I F A V A S L A T I I
. . . . . . GGTTCCGCTTTAGTTTTCTCGGATCCTTTCTTTGAACTATAGACAATGTGCCAAATATTG 661 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 720 CCAAGGCGAAATCAAAAGAGCCTAGGAAAGAAACTTGATATCTGTTACACGGTTTATAAC L N R K L K R P D K R Q V I S L T G F I
. . . . . . CAGCCAATAGGAGCGATCCTAAAAAGGCAATTAAGATAAGTAGTTTCATTATTCCCCTCC 721 ---------+---------+---------+---------+---------+------RBS+ 780 GTCGGTTATCCTCGCTAGGATTTTTCCGTTAATTCTATTCATCAAAGTAATAAGGGGAGG A A L L L S G L F A I L I L K M çç orfX
. . . . . . AAAAAAATCCAGCTTTTAACGTCGATCAGGGTTTGGACGTATTATTTTTATAAAACTACC 781 ---- ----+---------+---------+ 840 TTTTTTTAGGTCGAAAATTGCAGCTAGTCCCAAACCTGCATAATAAAAATATTTTGATGG * L V V
. . . . . . GTGTATACGACAACCCTGCCAATGATCTTGATGTTCTCTTCTTCAAGGTCTTCGTAGGTG 841 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 900 CACATATGCTGTTGGGACGGTTACTAGAACTACAAGAGAAGAAGTTCCAGAAGCATCCAC T Y V V V R G I I K I N E E E L D E Y T
. . . . . . TACATGATGGGACTAAATCTTTTGTCAGTTGAATCTGGAATGAAGGTAACAATCTGCTTT 901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 960 ATGTACTACCCTGATTTAGAAAACAGTCAACTTAGACCTTACTTCCATTGTTAGACGAAA Y M I P S F R K D T S D P I F T V I Q K
. . . . . . TGACGATCATTATAGAAATATTTGACTGCGTAGTCACCATCATCTGCAAAGACAACTATG 961 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1020 ACTGCTAGTAATATCTTTATAAACTGACGCATCAGTGGTAGTAGACGTTTCTGTTGATAC Q R D N Y F Y K V A Y D G D D A F V V I
. . . . . . TCACCGTCTTTAAGGTCTTGAATGTCGTTGTACTGTTTGACTGCTATTAAAGAGCCATCA1021 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1080 AGTGGCAGAAATTCCAGAACTTACAGCAACATGACAAACTGACGATAATTTCTCGGTAGT D G D K L D Q I D N Y Q K V A I L S G D
. . . . . . GGAATTGTTTGGTTCATTGATTCGCCGTTTATATGCATCATCAATATGCTGCTGTCTCCA1081 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1140 CCTTAACAAACCAAGTAACTAAGCGGCAAATATACGTAGTAGTTATACGACGACAGAGGT P I T Q N M S E G N I H M M L I S S D G
. . . . . . GCATATCTTCCCATAACGCTATCTGGTAGTTGAATCGTTTCAACGTCATCTGAAGTTAGC1141 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1200 CGTATAGAAGGGTATTGCGATAGACCATCAACTTAGCAAAGTTGCAGTAGACTTCAATCG A Y R G M V S D P L Q I T E V D D S T L
Anexo I
. . . . . . GGATCGACATTGCACAGGATTCCAGCCGATATCTCAGCGGGAATGTATGGATAAGAGTGA1201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1260 CCTAGCTGTAACGTGTCCTAAGGTCGGCTATAGAGTCGCCCTTACATACCTATTCTCACT P D V N C L I G A S I E A P I Y P Y S H
. . . . . . ACATTTAGTTTTTTGACTTTAAAAGGATCTACAGGAGAAACTCCTATTAGGCTTTCCGGA1261 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1320 TGTAAATCAAAAAACTGAAATTTTCCTAGATGTCCTCTTTGAGGATAATCCGAAAGGCCT V N L K K V K F P D V P S V G I L S E P
. . . . . . GTTGTGTGTAAAGCACTTGCAAATTTATCAACATAGTTTAATGGAAACTCACGTGTTCCA1321 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1380 CAACACACATTTCGTGAACGTTTAAATAGTTGTATCAAATTACCTTTGAGTGCACAAGGT T T H L A S A F K D V Y N L P F E R T G
. . . . . . TTGAAATAGCGAGACACAGACGATTTTGCCATGTCAACACGGCGTGCTAGTTCACTGATT1381 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1440 AACTTTATCGCTCTGTGTCTGCTAAAACGGTACAGTTGTGCCGCACGATCAAGTGACTAA N F Y R S V S S K A M D V R R A L E S I
. . . . . . GAAATCCCTTCACGGTTGCGAAGATCATTTAAAGTCTTGATTATTTCATCATTTGTTTTC1441 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1500 CTTTAGGGAAGTGCCAACGCTTCTAGTAAATTTCAGAACTAATAAAGTAGTAAACAAAAG S I G E R N R L D N L T K I I E D N T K
. . . . . . ATGTATCTCACCTCAAGAATGATTTTAACACCGTTCCCGATTGTGCACAATAGGGGCACT1501 --------- RBS ----+---------+- O3 ----+ 1560 TACATAGAGTGGAGTTCTTACTAAAATTGTGGCAAGGGCTAACACGTGTTATCCCCGTGA M ç cI * -10 -35
. Elemento UP . -35 . . AAAAAGCAATATCTGAATATTTTTTTGAAATAATCGTTGACACATGGGAACACGGATGAT1561 ---------+---------+---- O2 +---------+ 1620 TTTTTCGTTATAGACTTATAAAAAAACTTTATTAGCAACTGTGTACCCTTGTGCCTACTA
-10 . * . RBS . . . ATTCTTTAGATGTTCCCAAAAGGAAACGAAAGGAGGCAATCCAATGACACTAAATTTAAA1621 ---------+- O1 ---+---------+---------+ 1680 TAAGAAATCTACAAGGGTTTTCCTTTGCTTTCCTCCGTTAGGTTACTGTGATTTAAATTT cro èè M T L N L K
. . . . . . ACGTCTTCGCGCTGAACGTATCGCAAAAGGAATGAACCAAGATGAAATGGCGAAAGCTAT1681 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1740 TGCAGAAGCGCGACTTGCATAGCGTTTTCCTTACTTGGTTCTACTTTACCGCTTTCGATA R L R A E R I A K G M N Q D E M A K A M
. . . . . . GGGATGGCATACCCGCTCTTCGTATGCTAAGCGTGAGAATGGTATTACAACAATCAGCGC1741 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1800 CCCTACCGTATGGGCGAGAAGCATACGATTCGCACTCTTACCATAATGTTGTTAGTCGCG G W H T R S S Y A K R E N G I T T I S A
Anexo I
. . . . . . TACCGAATTAGTAAAAATGGCCAGCATTTTGGGGTATGGCACCAATCAACTTGACCTTTT1801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1860 ATGGCTTAATCATTTTTACCGGTCGTAAAACCCCATACCGTGGTTAGTTGAACTGGAAAA T E L V K M A S I L G Y G T N Q L D L F
. . . RBS . . . TTTTACAAATAACGTTCCCGATAGAGAACGAAAGGGGATGACGGTATGAACGAATTACAG1861 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1920 AAAATGTTTATTGCAAGGGCTATCTCTTGCTTTCCCCTACTGCCATACTTGCTTAATGTC F T N N V P D R E R K G M T V * ant è M N E L Q
. . . . . . CATTTTGATTTTAAAGGTCGGCAAGTAAGAACTGTGGTTGTTGATAATGAACCAATGTTT1921 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1980 GTAAAACTAAAATTTCCAGCCGTTCATTCTTGACACCAACAACTATTACTTGGTTACAAA H F D F K G R Q V R T V V V D N E P M F
. . . . . . GTCGGTAAGGACATTGCAGAAGTGCTGGGATATAGTAAGCCAGCTAACGCAGTAAACAAA1981 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2040 CAGCCATTCCTGTAACGTCTTCACGACCCTATATCATTCGGTCGATTGCGTCATTTGTTT V G K D I A E V L G Y S K P A N A V N K
. . . . . . TATGTACCCGATAAATTCAAAGGGGTCACCAAATTGATGACCCCCGGTGGAAAACAGGAT2041 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2100 ATACATGGGCTATTTAAGTTTCCCCAGTGGTTTAACTACTGGGGGCCACCTTTTGTCCTA Y V P D K F K G V T K L M T P G G K Q D
. . . . . . TTCGTTGTTATTGCCGAACCCGGGCTTTATAAATTAGTTTTCAAATCTGATATGCCAAAC2101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2160 AAGCAACAATAACGGCTTGGGCCCGAAATATTTAATCAAAAGTTTAGACTATACGGTTTG F V V I A E P G L Y K L V F K S D M P N
. . . . . . GCAGATGAATTTACAGATTGGGTAGCAGAGAAAGTTCTCCCATCAATCCGCAAGCATGGT2161 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2220 CGTCTACTTAAATGTCTAACCCATCGTCTCTTTCAAGAGGGTAGTTAGGCGTTCGTACCA A D E F T D W V A E K V L P S I R K H G
. . . . . . GCCTACATGACGCCTGAAACGATTGAGAAGGCCATCTATAATCCAGACTTCATTATCAAT2221 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2280 CGGATGTACTGCGGACTTTGCTAACTCTTCCGGTAGATATTAGGTCTGAAGTAATAGTTA A Y M T P E T I E K A I Y N P D F I I N
. . . . . . CTGGCAACGCAGCTAAAGGACGAACAAGCAAAAACAGCGGAACTTACGGCTGATAACGAA2281 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2340 GACCGTTGCGTCGATTTCCTGCTTGTTCGTTTTTGTCGCCTTGAATGCCGACTATTGCTT L A T Q L K D E Q A K T A E L T A D N E
. . . . . . ACAATGAAGCCTAAAGCGTTGTTTGCAGACGCGGTAGCCACAAGTTAAACAACCATCTTG2341 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2400 TGTTACTTCGGATTTCGCAACAAACGTCTGCGCCATCGGTGTTCAATTTGTTGGTAGAAC T M K P K A L F A D A V A T S *
Anexo I
. . . . . . GTCGGTGATCTTGCCAAGGTGATCAAACAGAACGGCGTTGACATTGGTGCCAAGCGGTTG2401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2460 CAGCCACTAGAACGGTTCCACTAGTTTGTCTTGCCGCAACTGTAACCACGGTTCGCCAAC
. . . . . . TTCGCCTGGCTACGTGAGCAAGGCTATTTGATCAAACGGATTGGTGCCGACTATAACTCG2461 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2520 AAGCGGACCGATGCACTCGTTCCGATAAACTAGTTTGCCTAACCACGGCTGATATTGAGC
. . . . . . CCGACACAACGCGCGATGGAGCTAGGCTTGTTCGAGGTCAAGGAAACGGCGATCAGTCAC2521 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2580 GGCTGTGTTGCGCGCTACCTCGATCCGAACAAGCTCCAGTTCCTTTGCCGCTAGTCAGTG
. . . . . . TCGGACGGCCATGTAACAGTTCAGAAGACCCCAAAGGTGACCGGCAAAGGCCAGCAGTAT2581 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2640 AGCCTGCCGGTACATTGTCAAGTCTTCTGGGGTTTCCACTGGCCGTTTCCGGTCGTCATA
. . . . . . TTTATCAACAAGTTTCTACAAAAGGAGGCTGTCTAAATGAACGGACGCACACAGGAAAAA2641 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2700 AAATAGTTGTTCAAAGATGTTTTCCTCCGACAGATTTACTTGCCTGCGTGTGTCCTTTTT
. . . . . . CTAGAAAATGCCGTTGCAGAATTTGTTGTTGCTCAACTGAAGAACAAAGGAAAAAGCCCC2701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2760 GATCTTTTACGGCAACGTCTTAAACAACAACGAGTTGACTTCTTGTTTCCTTTTTCGGGG
Anexo I: Secuencia de nucleótidos de la región de decisión lisis / lisogenia del bacteriófagoA2. Bajo la secuencia de nucleótidos de cada gen se representa la correspondiente traduccióna aminoácidos. Se señalan las regiones promotoras (n), el elemento UP (n), los inicios detranscripción (*), el terminador (–¡–), los sitios de unión al ribosoma (RBS) y los operadores(èç). Esta secuencia se encuentra depositada en la base de datos del EMBL con losnúmeros de acceso Y12813 y AJ251789.
Anexo II
EcoRI . . . . . . GAATTCTTGGCGCAAATATGGCTGGAATTGCCACTGTTTTAGGCTTCATTTTAGCTGGAT 1---------+---------+---------+---------+---------+---------+60 CTTAAGAACCGCGTTTATACCGACCTTAACGGTGACAAAATCCGAAGTAAAATCGACCTA
. . . . . . ATGGGGCTTTTTTGATCAATAGGCCTACTGGATTCATGGTTTGCGGCGGCTTGTTGTTTG 61---------+---------+---------+---------+---------+---------+120 TACCCCGAAAAAACTAGTTATCCGGATGACCTAAGTACCAAACGCCGCCGAACAACAAAC
. . . RBS . . TTCTCGCCTTTATTCTGCTGCTTCCTGATAACGAAGGGAGGTGAGATTAATGAAGCTATT 121---------+---------+---------+---------+---------+---------+180 AAGAGCGGAAATAAGACGACGAAGGACTATTGCTTCCCTCCACTCTAATTACTTCGATAA orfH è M K L F
. . . . . . TCGAGGATTGGCAACCGAAGTGGACCCTCACTGGGCAGATCATTTGCTTGATTCTGGGGT 181---------+---------+---------+---------+---------+---------+240 AGCTCCTAACCGTTGGCTTCACCTGGGAGTGACCCGTCTAGTAAACGAACTAAGACCCCA R G L A T E V D P H W A D H L L D S G V gpH . . . . . . AATCCCATCATTTCGAGGCGGGTATCTTGGCATTTCTGCCCTACGGAACTCTGACGTGCT 241---------+---------+---------+---------+---------+---------+300 TTAGGGTAGTAAAGCTCCGCCCATAGAACCGTAAAGACGGGATGCCTTGAGACTGCACGA I P S F R G G Y L G I S A L R N S D V L
. . . . . . TACGGCTGTATCGATTGTTTCGGGTGATGTTAGTCGGTTTCCGCTAGTAATCACGGACAG 301---------+---------+---------+---------+---------+---------+360 ATGCCGACATAGCTAACAAAGCCCACTACAATCAGCCAAAGGCGATCATTAGTGCCTGTC T A V S I V S G D V S R F P L V I T D S
. . . . . . CTCAACCGATGAAGTTATTGACTTAGCCAATATTGAATACTTGATGAATACAAAGGTAAA 361---------+---------+---------+---------+---------+---------+420 GAGTTGGCTACTTCAATAACTGAATCGGTTATAACTTATGAACTACTTATGTTTCCATTT S T D E V I D L A N I E Y L M N T K V N
. . . . . . CAAGCGGCTGTCGGCTTATCAGTGGAAATTTCCCATGATGGTCAATGCAATTTTGACTGG 421---------+---------+---------+---------+---------+---------+480 GTTCGCCGACAGCCGAATAGTCACCTTTAAAGGGTACTACCAGTTACGTTAAAACTGACC K R L S A Y Q W K F P M M V N A I L T G
. . . . . . CAACGCTTATTCGCGTATTGTGCGCGATCCGATAACCAACGAACCAGCTATGTTTGAGTT 481---------+---------+---------+---------+---------+---------+540 GTTGCGAATAAGCGCATAACACGCGCTAGGCTATTGGTTGCTTGGTCGATACAAACTCAA N A Y S R I V R D P I T N E P A M F E F
. . . . . . CTATGCCCCATCACAGACGCAGGTGGACACAAGCGACCCCGATAACATCATCTACCGTTT 541---------+---------+---------+---------+---------+---------+600 GATACGGGGTAGTGTCTGCGTCCACCTGTGTTCGCTGGGGCTATTGTAGTAGATGGCAAA Y A P S Q T Q V D T S D P D N I I Y R F
Anexo II
. . . . . . CACGCCTTACAACTCTAGCATGCAAAAAGTATGTGGATTTGAGGACGTCATTCACTGGAA 601---------+---------+---------+---------+---------+---------+660 GTGCGGAATGTTGAGATCGTACGTTTTTCATACACCTAAACTCCTGCAGTAAGTGACCTT T P Y N S S M Q K V C G F E D V I H W K
. . . . . . GTTTTTCTCATACGACACAATCATGGGGCGCTCACCGCTTTTGTCGCTTGGTGATGAGAT 661---------+---------+---------+---------+---------+---------+720 CAAAAAGAGTATGCTGTGTTAGTACCCCGCGAGTGGCGAAAACAGCGAACCACTACTCTA F F S Y D T I M G R S P L L S L G D E I
. . . . . . TGGACTGCAGGAGTCAGGTGTTTCAACGTTGCAGAAGTTCTTCAAGAGCGGCTTGAAAGG 721---------+---------+---------+---------+---------+---------+780 ACCTGACGTCCTCAGTCCACAAAGTTGCAACGTCTTCAAGAAGTTCTCGCCGAACTTTCC G L Q E S G V S T L Q K F F K S G L K G
. . . . . . CTCAATTATCAAAGCAAAGGAGAGTCGCCTGTCCGCCGAAGCACGCCAGAAGATTCGTGA 781---------+---------+---------+---------+---------+---------+840 GAGTTAATAGTTTCGTTTCCTCTCAGCGGACAGGCGGCTTCGTGCGGTCTTCTAAGCACT S I I K A K E S R L S A E A R Q K I R E
. . . . . . AGATTTTGAAAGGGCACAGGCAGGTGCTGATGCTGGATCGCCAATTATAGTTGACGCAAC 841---------+---------+---------+---------+---------+---------+900 TCTAAAACTTTCCCGTGTCCGTCCACGACTACGACCTAGCGGTTAATATCAACTGCGTTG D F E R A Q A G A D A G S P I I V D A T
. . . . . . GATGGATTATCAGCCGTTGGAAGTTGATACCAATGTTCTTAATCTGATTAACAGCAATAA 901---------+---------+---------+---------+---------+---------+960 CTACCTAATAGTCGGCAACCTTCAACTATGGTTACAAGAATTAGACTAATTGTCGTTATT M D Y Q P L E V D T N V L N L I N S N N
. . . . . . CTATTCAACAGCGCAGATTGCTAAGGCTTTGCGGGTGCCAGCGTATCGATTAGCCCAAAA 961---------+---------+---------+---------+---------+---------+1020 GATAAGTTGTCGCGTCTAACGATTCCGAAACGCCCACGGTCGCATAGCTAATCGGGTTTT Y S T A Q I A K A L R V P A Y R L A Q N
. . . . . . TAGTCCTAACCAGTCTGTTAAACAGCTTGCTGATGACTATATTCGCAATGATCTTCCATT 1021---------+---------+---------+---------+---------+---------+1080 ATCAGGATTGGTCAGACAATTTGTCGAACGACTACTGATATAAGCGTTACTAGAAGGTAA S P N Q S V K Q L A D D Y I R N D L P F
. . . . . . TTACTTTGAACCGATTACAAGTGAGTTTGAACTAAAGCTGCTTGATGACGCGCAACGGCA 1081---------+---------+---------+---------+---------+---------+1140 AATGAAACTTGGCTAATGTTCACTCAAACTTGATTTCGACGAACTACTGCGCGTTGCCGT Y F E P I T S E F E L K L L D D A Q R H
. . . . . . CCAATATTGCATAGGATTCGACACAAAATCAGTAAACGGATTGCCGATTGCTGACGTAAA 1141---------+---------+---------+---------+---------+---------+1200 GGTTATAACGTATCCTAAGCTGTGTTTTAGTCATTTGCCTAACGGCTAACGACTGCATTT Q Y C I G F D T K S V N G L P I A D V N
Anexo II
. . . . . . TACAGCAGTCAATGGCGGACTGTGGACTGGAAACGAGGGACGTGCGGAGCTTGGAAAGAA 1201---------+---------+---------+---------+---------+---------+1260 ATGTCGTCAGTTACCGCCTGACACCTGACCTTTGCTCCCTGCACGCCTCGAACCTTTCTT T A V N G G L W T G N E G R A E L G K K
. . . . . . ACCGTTAAAAGACCCGAACATGGATCGTATTCAGTCGACACTTAACACAGTATTTCTTGA 1261---------+---------+---------+---------+---------+---------+1320 TGGCAATTTTCTGGGCTTGTACCTAGCATAAGTCAGCTGTGAATTGTGTCATAAAGAACT P L K D P N M D R I Q S T L N T V F L D
. . . . RBS . . TCAAAAGGAAGCTTATCAAGCTGAGCATGCAGCAGAATTGAAGGGAGGTGATACTAATGC 1321---------+---------+---------+---------+---------+---------+1380 AGTTTTCCTTCGAATAGTTCGACTCGTACGTCGTCTTAACTTCCCTCCACTATGATTACG Q K E A Y Q A E H A A E L K G G D T N A orf209 è M P . . . . . . CAAAGGAAATCAGAATGGCAGCGGCACCAATGCAAATTCGTGATGGTGATGATGATCATC 1381---------+---------+---------+---------+---------+---------+1440 GTTTCCTTTAGTCTTACCGTCGCCGTGGTTACGTTTAAGCACTACCACTACTACTAGTAG K G N Q N G S G T N A N S * K E I R M A A A P M Q I R D G D D D H P
. . . . . . CTGCCGTTATTGAGGGCTATGCCCTTAAGTTCGACAGGCAATCCGAGATTATGGGCAGTG 1441---------+---------+---------+---------+---------+---------+1500 GACGGCAATAACTCCCGATACGGGAATTCAAGCTGTCCGTTAGGCTCTAATACCCGTCAC A V I E G Y A L K F D R Q S E I M G S G
. . . . . . GTGAGCTGAGTTTCCGCGAACACATTGACCCACACGCACTGGACAATGCGGACATGAGTA 1501---------+---------+---------+---------+---------+---------+1560 CACTCGACTCAAAGGCGCTTGTGTAACTGGGTGTGCGTGACCTGTTACGCCTGTACTCAT E L S F R E H I D P H A L D N A D M S N
. . . . . . ACGTTGTTGCGCTATTTAATCATGACCAGAACCAAGTGTTAGGCCGCACGGGAGTCAATT 1561---------+---------+---------+---------+---------+---------+1620 TGCAACAACGCGATAAATTAGTACTGGTCTTGGTTCACAATCCGGCGTGCCCTCAGTTAA V V A L F N H D Q N Q V L G R T G V N L
. . . . . . TAGAGCTGACGGTTGATGAAACGGGGCTCAAATATACGTTGACACCTCCAGATACACAGC 1621---------+---------+---------+---------+---------+---------+1680 ATCTCGACTGCCAACTACTTTGCCCCGAGTTTATATGCAACTGTGGAGGTCTATGTGTCG E L T V D E T G L K Y T L T P P D T Q L
. . . . . . TTGGGCGTGATTTGTTAGAAAACGTTCGTCGGGGAATTATCAGCCAATCAAGTTTTGCAT 1681---------+---------+---------+---------+---------+---------+1740 AACCCGCACTAAACAATCTTTTGCAAGCAGCCCCTTAATAGTCGGTTAGTTCAAAACGTA G R D L L E N V R R G I I S Q S S F A F
. . . . . . TCACGATTGCACCAGACAAAGATGCACAGAAGTGGCAAAAATCTAATGAACGTGGTGTGA 1741---------+---------+---------+---------+---------+---------+1800 AGTGCTAACGTGGTCTGTTTCTACGTGTCTTCACCGTTTTTAGATTACTTGCACCACACT T I A P D K D A Q K W Q K S N E R G V K
Anexo II
. . . . . . AGTATGACCGCACTATCAACAATATTGATCATTTGTTTGATGTCTCTCCAGTAACCACGC 1801---------+---------+---------+---------+---------+---------+1860 TCATACTGGCGTGATAGTTGTTATAACTAGTAAACAAACTACAGAGAGGTCATTGGTGCG Y D R T I N N I D H L F D V S P V T T P
. . . . . . CAGCATATCCGGATACTGAGGTAAAGGTCGGAGCACGATCGTTGGAACAGATAAAAGCGC 1861---------+---------+---------+---------+---------+---------+1920 GTCGTATAGGCCTATGACTCCATTTCCAGCCTCGTGCTAGCAACCTTGTCTATTTTCGCG A Y P D T E V K V G A R S L E Q I K A L
. . . . . . TAGATCAGCCGCCAGAATGGGAACTTAAGCGGTGTAAGATGCTTTATCAATTGAATAAAG 1921---------+---------+---------+---------+---------+---------+1980 ATCTAGTCGGCGGTCTTACCCTTGAATTCGCCACATTCTACGAAATAGTTAACTTATTTC D Q P P E W E L K R C K M L Y Q L N K E
. . . . . RBS . AGGACTTGCTCAAAGACATCGAATAATCGGTGCCTATTTTTATACAAAAAATAAGGAGGG 1981---------+---------+---------+---------+---------+---------+2040 TCCTGAACGAGTTTCTGTAGCTTATTAGCCACGGATAAAAATATGTTTTTTATTCCTCCC D L L K D I E *
. . . . . . TCACTAGATGACTTTAGATGAAAAATTAGCTGCTGTTAAAAAGCAACTTGATGAAAAGCG 2041---------+---------+---------+---------+---------+---------+2100 AGTGATCTACTGAAATCTACTTTTTAATCGACGACAATTTTTCGTTGAACTACTTTTCGCorfEFG è M T L D E K L A A V K K Q L D E K R Cremallera de leucinas . . . . . . TTCAGCGTTGCCAGCTATGAAGACAGAACTTCGTTCTTTACTTGAAGGTGAAGATTCCGA 2101---------+---------+---------+---------+---------+---------+2160 AAGTCGCAACGGTCGATACTTCTGTCTTGAAGCAAGAAATGAACTTCCACTTCTAAGGCT S A L P A M K T E L R S L L E G E D S E
. . . . . . GGAAAACCTGAAGAAGGCAGAAGGCGTTCGTGCCAAGTATGATAAAGCTGGCAAAGAGAT 2161---------+---------+---------+---------+---------+---------+2220 CCTTTTGGACTTCTTCCGTCTTCCGCAAGCACGGTTCATACTATTTCGACCGTTTCTCTA E N L K K A E G V R A K Y D K A G K E I
. . . . . . CAAAGATCTTGAAGAAAAACGTGACTTATACGAGGCTGCGTTGAAAGGCAATGAACAGTC 2221---------+---------+---------+---------+---------+---------+2280 GTTTCTAGAACTTCTTTTTGCACTGAATATGCTCCGACGCAACTTTCCGTTACTTGTCAG K D L E E K R D L Y E A A L K G N E Q S
. . . . . . GAGTGGGAAGAAGCCCGATCATCCGGAAGAGCATAGCTATCGCGATGCACTGAATGCTTA 2281---------+---------+---------+---------+---------+---------+2340 CTCACCCTTCTTCGGGCTAGTAGGCCTTCTCGTATCGATAGCGCTACGTGACTTACGAAT S G K K P D H P E E H S Y R D A L N A Y
. . . . . . TTTGCATACTCGTGGTCGTAATACTGATGGCGTCAATTTTGAAAAGACTGATGTTGGCAC 2341---------+---------+---------+---------+---------+---------+2400 AAACGTATGAGCACCAGCATTATGACTACCGCAGTTAAAACTTTTCTGACTACAACCGTG L H T R G R N T D G V N F E K T D V G T
Anexo II
. . . . . . ATTTGCAGTTTTACGAGCTGTTCCTACTGATGCCAGTGATGCGGTAAATGCCGGTGTCAA 2401---------+---------+---------+---------+---------+---------+2460 TAAACGTCAAAATGCTCGACAAGGATGACTACGGTCACTACGCCATTTACGGCCACAGTT F A V L R A V P T D A S D A V N A G V K gpE gpF gpG . . . . . . GGCTGCAGACGCGGCCTCGACCATTCCAGAAACTATTAGCAATACACCACAGCGTGAATT 2461---------+---------+---------+---------+---------+---------+2520 CCGACGTCTGCGCCGGAGCTGGTAAGGTCTTTGATAATCGTTATGTGGTGTCGCACTTAA A A D A A S T I P E T I S N T P Q R E L
. . . . . . GCAGACTGTTGTTGATCTGAAACCTTTCACGAACGTATTCCAAGCCTCTACACAAAAGGG 2521---------+---------+---------+---------+---------+---------+2580 CGTCTGACAACAACTAGACTTTGGAAAGTGCTTGCATAAGGTTCGGAGATGTGTTTTCCC Q T V V D L K P F T N V F Q A S T Q K G é . . . . . . TACTTACCCAACAGTTGCAAATGCCACAACCAAGATGGTCACTGTCGCCGAGTTGGAAAA 2581---------+---------+---------+---------+---------+---------+2640 ATGAATGGGTTGTCAACGTTTACGGTGTTGGTTCTACCAGTGACAGCGGCTCAACCTTTT T Y P T V A N A T T K M V T V A E L E K
. . EcoRI . . . . GAACCCAGCAATGGCAAAACCAGAATTCAAGCCGGTCAACTGGTCTGTTGAAACGTATCG 2641---------+---------+---------+---------+---------+---------+2700 CTTGGGTCGTTACCGTTTTGGTCTTAAGTTCGGCCAGTTGACCAGACAACTTTGCATAGC N P A M A K P E F K P V N W S V E T Y R
. . . . . . TCAGGCGTTACCAGTATCGCAGGAGTCAATTGACGACTCTGCGATTGATTTGGTTGGCCT 2701---------+---------+---------+---------+---------+---------+2760 AGTCCGCAATGGTCATAGCGTCCTCAGTTAACTGCTGAGACGCTAACTAAACCAACCGGA Q A L P V S Q E S I D D S A I D L V G L
. . . . . . GATTGCCCAGAACGGACAACAGATTAAGGTCAATACGACTAACGGTGCTGTTGCAACTCT 2761---------+---------+---------+---------+---------+---------+2820 CTAACGGGTCTTGCCTGTTGTCTAATTCCAGTTATGCTGATTGCCACGACAACGTTGAGA I A Q N G Q Q I K V N T T N G A V A T L
. . . . . . GCTGAAAGGCTTCACTGCCAAGACAATCTCTAGCGTTGATGATTTGAAGCATATCAATAA 2821---------+---------+---------+---------+---------+---------+2880 CGACTTTCCGAAGTGACGGTTCTGTTAGAGATCGCAACTACTAAACTTCGTATAGTTATT L K G F T A K T I S S V D D L K H I N N
. . . . . . CGTTGATTTAGATCCTGCATATTCTCGTGTAATTATTGCTTCACAGAGTTTCTACAATTT 2881---------+---------+---------+---------+---------+---------+2940 GCAACTAAATCTAGGACGTATAAGAGCACATTAATAACGAAGTGTCTCAAAGATGTTAAA V D L D P A Y S R V I I A S Q S F Y N F
. . . . . . CTTGGACACAGTTAAAGATGGCAATGGTCGCTACTTGCTACAAGATAGCATCTTGACCCC 2941---------+---------+---------+---------+---------+---------+3000 GAACCTGTGTCAATTTCTACCGTTACCAGCGATGAACGATGTTCTATCGTAGAACTGGGG L D T V K D G N G R Y L L Q D S I L T P
Anexo II
. . . . . . GTCTGGCAAGAGCGTTCTTGGTATGCCGATTGCTGTTGTATCTGATGATACTTTGGGTGC 3001---------+---------+---------+---------+---------+---------+3060 CAGACCGTTCTCGCAAGAACCATACGGCTAACGACAACATAGACTACTATGAAACCCACG S G K S V L G M P I A V V S D D T L G A
. . . . . . AGCAGGCGAAGCACACGCCTTTTTGGGTGACATCAAGCGGGCAATTCTGTTTGCTAACCG 3061---------+---------+---------+---------+---------+---------+3120 TCGTCCGCTTCGTGTGCGGAAAAACCCACTGTAGTTCGCCCGTTAAGACAAACGATTGGC A G E A H A F L G D I K R A I L F A N R é . . . . . . CGCAGACTTCATGGTTCGCTGGGTTGATGATCAGATTTACGGCCAATTCTTGCAAGCAGG 3121---------+---------+---------+---------+---------+---------+3180 GCGTCTGAAGTACCAAGCGACCCAACTACTAGTCTAAATGCCGGTTAAGAACGTTCGTCC A D F M V R W V D D Q I Y G Q F L Q A G
. . . . . . AATGCGCTTTGGTGTATCTGTTGCTGACGAAAAGGCTGGCTACTTCCTCACATACACCCC 3181---------+---------+---------+---------+---------+---------+3240 TTACGCGAAACCACATAGACAACGACTGCTTTTCCGACCGATGAAGGAGTGTATGTGGGG M R F G V S V A D E K A G Y F L T Y T P
. . . . . . AAAAGCGTAACGCCTGACGGAGTGACTTTGAGCCAGAAAACGCTCACGGGTGCTGTCGGT 3241---------+---------+---------+---------+---------+---------+3300 TTTTCGCATTGCGGACTGCCTCACTGAAACTCGGTCTTTTGCGAGTGCCCACGACAGCCA K A *
. . . . . . TCCACAAAAGACATCACGGTGACAGTCACTCCTGATGGCGCTCCTCAAGCAGTCGAAGCT 3301---------+---------+---------+---------+---------+---------+3360 AGGTGTTTTCTGTAGTGCCACTGTCAGTGAGGACTACCGCGAGGAGTTCGTCAGCTTCGA
. . . . . . GTGTCGAGCGATGAAAGTGTCGCTACGGTTGTTAAGAAGTCCGATGGTGTTTACACCATT 3361---------+---------+---------+---------+---------+---------+3420 CACAGCTCGCTACTTTCACAGCGATGCCAACAATTCTTCAGGCTACCACAAATGTGGTAA
. . . . . . ACCAATCTGGCAGCGGGTGCAGCGACAATCACATTTAGCACTAATGGCATCAGATCAACA 3421---------+---------+---------+---------+---------+---------+3480 TGGTTAGACCGTCGCCCACGTCGCTGTTAGTGTAAATCGTGATTACCGTAGTCTAGTTGT
. . . . . . CTTGCCGTTACTGTTAACGCCGGGTAGGTGATTACTCTTGGCAGATACTACGCTTGACAA 3481---------+---------+---------+---------+---------+---------+3540 GAACGGCAATGACAATTGCGGCCCATCCACTAATGAGAACCGTCTATGATGCGAACTGTT
. . . . . . AAGCCCACTGACTGATGAACAGTTTCAGGTTCTGAAAATGTACTTGAAAGTTGATCAGAC 3541---------+---------+---------+---------+---------+---------+3600 TTCGGGTGACTGACTACTTGTCAAAGTCCAAGACTTTTACATGAACTTTCAACTAGTCTG
. . . . . . AATCGAAGACCCAATGATTATGCAACTGGTGAATGACGCTTGTGGTGAAATCAGTTCGGC 3601---------+---------+---------+---------+---------+---------+3660 TTAGCTTCTGGGTTACTAATACGTTGACCACTTACTGCGAACACCACTTTAGTCAAGCCG
Anexo II
. . . . . . TATTAGTTTTGGATCAAATCCGGAACAATTTCTAAGCAATCCAGAAACTCGGGATCGTTT 3661---------+---------+---------+---------+---------+---------+3720 ATAATCAAAACCTAGTTTAGGCCTTGTTAAAGATTCGTTAGGTCTTTGAGCCCTAGCAAA
. . RBS . . . . CTTCACAGCGCTCATGAAGCAAGTGAAGGAAGACTATGACTACCGAGGTATGGGTGCTGA 3721---------+---------+---------+---------+---------+---------+3780 GAAGTGTCGCGAGTACTTCGTTCACTTCCTTCTGATACTGATGGCTCCATACCCACGACT orf146 è M T T E V W V L K
. . . . . . AGTCATGCGCTTTCCGTTGCAAACATCAACCACAAATATTATCAATCAGCTTCGCTCAGA 3781---------+---------+---------+---------+---------+---------+3840 TCAGTACGCGAAAGGCAACGTTTGTAGTTGGTGTTTATAATAGTTAGTCGAAGCGAGTCT S C A F R C K H Q P Q I L S I S F A Q N
. . . . . . ATTGCCGGAAGAGGATGGTGATTCTGATGCGAATTAATCGAATGACTGAGAGAATTGCGT 3841---------+---------+---------+---------+---------+---------+3900 TAACGGCCTTCTCCTACCACTAAGACTACGCTTAATTAGCTTACTGACTCTCTTAACGCA C R K R M V I L M R I N R M T E R I A F
. . . . . . TCGTCAGCTATGAGTCAAAAAAGGTTAACGGAGTTCCGGTTGATGGTGTGATCGTTAAGC 3901---------+---------+---------+---------+---------+---------+3960 AGCAGTCGATACTCAGTTTTTTCCAATTGCCTCAAGGCCAACTACCACACTAGCAATTCG V S Y E S K K V N G V P V D G V I V K H
. . . . . . ATATGACGGTTTGGGCGGAAGTTCCTAAGGTACCAATCAGAGAAGCAAATGATCCACAGA 3961---------+---------+---------+---------+---------+---------+4020 TATACTGCCAAACCCGCCTTCAAGGATTCCATGGTTAGTCTCTTCGTTTACTAGGTGTCT M T V W A E V P K V P I R E A N D P Q T
. . . . . . CGAAGTTGGGCACTCGCAAAGACAGCCCGACTTTTTTAGTGCGATTTTTGACCGCAGAGG 4021---------+---------+---------+---------+---------+---------+4080 GCTTCAACCCGTGAGCGTTTCTGTCGGGCTGAAAAAATCACGCTAAAAACTGGCGTCTCC K L G T R K D S P T F L V R F L T A E E
. EcoRI . . . . AAATCCAACCAACTTGGAGAATTCAATGGCGTGGTAATGAATATCAAATCACGGGTCTTG 4081---------+---------+---------+---------+---------+---------+4140 TTTAGGTTGGTTGAACCTCTTAAGTTACCGCACCATTACTTATAGTTTAGTGCCCAGAAC I Q P T W R I Q W R G N E Y Q I T G L D
. . . . RBS . . ATCCCGATTACGAGAGGCGCGATCTGACAACGATTACGGCAAAGGCGGTGAGCTGATGGG 4141---------+---------+---------+---------+---------+---------+4200 TAGGGCTAATGCTCTCCGCGCTAGACTGTTGCTAATGCCGTTTCCGCCACTCGACTACCC P D Y E R R D L T T I T A K A V S * orf128 è M G
. . . . . . CGTAAAAGTCACAGGGGATGCTGAACTGCTCGCTAATCTTAACAAACTTCAATTTGGGGT 4201---------+---------+---------+---------+---------+---------+4260 GCATTTTCAGTGTCCCCTACGACTTGACGAGCGATTAGAATTGTTTGAAGTTAAACCCCA V K V T G D A E L L A N L N K L Q F G V
Anexo II
. . . . . . TGCAAAAGAAGCTCGAGCGGCTGTCCGAGATGGTGCACAGAAGTTTGCCGACAAACTGAA 4261---------+---------+---------+---------+---------+---------+4320 ACGTTTTCTTCGAGCTCGCCGACAGGCTCTACCACGTGTCTTCAAACGGCTGTTTGACTT A K E A R A A V R D G A Q K F A D K L K
. . . . . . AAGCAATACGCCTGAGTGGGACGGCGAGACTGATATGAGCGGACATCTGAGAGATGACAT 4321---------+---------+---------+---------+---------+---------+4380 TTCGTTATGCGGACTCACCCTGCCGCTCTGACTATACTCGCCTGTAGACTCTCTACTGTA S N T P E W D G E T D M S G H L R D D I
. . . . . . CAAGCTTTCAAGTGTCCGTGAAACGAGCGGATTAACAGAAGTAGACGTTGGATATGGTAA 4381---------+---------+---------+---------+---------+---------+4440 GTTCGAAAGTTCACAGGCACTTTGCTCGCCTAATTGTCTTCATCTGCAACCTATACCATT K L S S V R E T S G L T E V D V G Y G K
. . . . . . AGATACCGGATGGCGAGCCCACTTTCCAAACTCGGGCACTTCAATGCAGGACCCGCAACA 4441---------+---------+---------+---------+---------+---------+4500 TCTATGGCCTACCGCTCGGGTGAAAGGTTTGAGCCCGTGAAGTTACGTCCTGGGCGTTGT D T G W R A H F P N S G T S M Q D P Q H
. . . . . . TTTCATTGAAGAAACCCAAGAAATCATGCGGCCAGTTGTTATCGCTGCTTTCCTAAGCCA 4501---------+---------+---------+---------+---------+---------+4560 AAAGTAACTTCTTTGGGTTCTTTAGTACGCCGGTCAACAATAGCGACGAAAGGATTCGGT F I E E T Q E I M R P V V I A A F L S H
RBS . . . . . CTTGAAGGAAGGCGGGATGTAATGGCGCCTGAAAAACGTGTTTATGACATCCTGTCAGCC 4561---------+---------+---------+---------+---------+---------+4620 GAACTTCCTTCCGCCCTACATTACCGCGGACTTTTTGCACAAATACTGTAGGACAGTCGG L K E G G M * orf114 è M A P E K R V Y D I L S A
. . . . . . AATTTGGATATTGCTGACAAGGTGTATATAGGTACCCCGAACTTCAATAACCAGACTAGC 4621---------+---------+---------+---------+---------+---------+4680 TTAAACCTATAACGACTGTTCCACATATATCCATGGGGCTTGAAGTTATTGGTCTGATCG N L D I A D K V Y I G T P N F N N Q T S
. . . . . . GCAACTCCCGAGAGTCTAGCTCCATGGGTGAGAATCACTTATTTGCCCGGTGATGCTGCT 4681---------+---------+---------+---------+---------+---------+4740 CGTTGAGGGCTCTCAGATCGAGGTACCCACTCTTAGTGAATAAACGGGCCACTACGACGA A T P E S L A P W V R I T Y L P G D A A
. . . . . . GACTATGCTGACGATTCTAGGATTCTAGAGTATCCGAAAGTACAAGTAGATTTTTGGGTG 4741---------+---------+---------+---------+---------+---------+4800 CTGATACGACTGCTAAGATCCTAAGATCTCATAGGCTTTCATGTTCATCTAAAAACCCAC D Y A D D S R I L E Y P K V Q V D F W V
. . . . . . GGTATAACGGACTGGGATCAACAAGAAAAGATAGAAACACAGATATATCAAGCACTACAC 4801---------+---------+---------+---------+---------+---------+4860 CCATATTGCCTGACCCTAGTTGTTCTTTTCTATCTTTGTGTCTATATAGTTCGTGATGTG G I T D W D Q Q E K I E T Q I Y Q A L H
Anexo II
. . . . . . GCGGCTGACTGGGAAAGGTATTATCGCAACTCCTACGTTGATGGGATACCCCAGCCCTTC 4861---------+---------+---------+---------+---------+---------+4920 CGCCGACTGACCCTTTCCATAATAGCGTTGAGGATGCAACTACCCTATGGGGTCGGGAAG A A D W E R Y Y R N S Y V D G I P Q P F
. . . . . . GCATGACAACAGGATACTTTCAGTTTCAAGGACTGCCGATTGGCTAGTCCTTTTTAATTT 4921---------+---------+---------+---------+---------+---------+4980 CGTACTGTTGTCCTATGAAAGTCAAAGTTCCTGACGGCTAACCGATCAGGAAAAATTAAA A *
RBS . . . . . CCTAAAGGAGGATTTTTAATATGGCAGATACTGCTGTAACAACTAATAAGAAGTTAGCAA 4981---------+---------+---------+---------+---------+---------+5040 GGATTTCCTCCTAAAAATTATACCGTCTATGACGACATTGTTGATTATTCTTCAATCGTT orfD è M A D T A V T T N K K L A K gpD . . . . . . AATTTGGGGCTTCGGCCTTTGAATACGGGTTGGTCGGTGATGACGACTTTGGTCTAAGCA 5041---------+---------+---------+---------+---------+---------+5100 TTAAACCCCGAAGCCGGAAACTTATGCCCAACCAGCCACTACTGCTGAAACCAGATTCGT F G A S A F E Y G L V G D D D F G L S T
. . . . . . CACGAAAGATGCAAGGCTTATCTAGTGTGAAATTGGATATTAAAACAGAGCAAAAGACCC 5101---------+---------+---------+---------+---------+---------+5160 GTGCTTTCTACGTTCCGAATAGATCACACTTTAACCTATAATTTTGTCTCGTTTTCTGGG R K M Q G L S S V K L D I K T E Q K T L
. . . . . . TGTCCGCTGATGATGGCCCGTACTTGATTCTTTCTGGTGGTATCACAGAAGCAACCGAAA 5161---------+---------+---------+---------+---------+---------+5220 ACAGGCGACTACTACCGGGCATGAACTAAGAAAGACCACCATAGTGTCTTCGTTGGCTTT S A D D G P Y L I L S G G I T E A T E T
. . . . . . CAATCGAAATGTACGATGTTGATTCCGTTATGAAGTCTGATTTATTTGGCATTAAGGTTG 5221---------+---------+---------+---------+---------+---------+5280 GTTAGCTTTACATGCTACAACTAAGGCAATACTTCAGACTAAATAAACCGTAATTCCAAC I E M Y D V D S V M K S D L F G I K V V
. . . . . . TTAATGGGGTTGAAGTATATCCAAAGAACCTTAGCCCTAATTACGCCGCAACTTTGTTCC 5281---------+---------+---------+---------+---------+---------+5340 AATTACCCCAACTTCATATAGGTTTCTTGGAATCGGGATTAATGCGGCGTTGAAACAAGG N G V E V Y P K N L S P N Y A A T L F R
. . . . . . GCACGAAGCTTTCAAATGGCAAGTACGTTTGGGTTGGTATGCTCAAGGGAATGTTCTCAC 5341---------+---------+---------+---------+---------+---------+5400 CGTGCTTCGAAAGTTTACCGTTCATGCAAACCCAACCATACGAGTTCCCTTACAAGAGTG T K L S N G K Y V W V G M L K G M F S L
. . . . . . TTCCGGGCGTTGATACCAAGACTGTTGACGGCACACCAGATCCAAGTGCTGACAGTATCG 5401---------+---------+---------+---------+---------+---------+5460 AAGGCCCGCAACTATGGTTCTGACAACTGCCGTGTGGTCTAGGTTCACGACTGTCATAGC P G V D T K T V D G T P D P S A D S I E
Anexo II
. . . . . . AAGGCTCATTTATTCCTCGAGGTGACCAAGACACTGGCAATGTTGTGTTGATTGGTCGTG 5461---------+---------+---------+---------+---------+---------+5520 TTCCGAGTAAATAAGGAGCTCCACTGGTTCTGTGACCGTTACAACACAACTAACCAGCAC G S F I P R G D Q D T G N V V L I G R E
. . . . . . AAGACAACGATGGATTCGATTTTGATAAGTTCCACGGATATGTATTCCCTAAGACTGCTG 5521---------+---------+---------+---------+---------+---------+5580 TTCTGTTGCTACCTAAGCTAAAACTATTCAAGGTGCCTATACATAAGGGATTCTGACGAC D N D G F D F D K F H G Y V F P K T A E
. . . . . . AAGACGCGACTATTGCCCCAAAAGCGTAGTCGGTGTCAGCTTTGAGAACAGCTCGATTAA 5581---------+---------+---------+---------+---------+---------+5640 TTCTGCGCTGATAACGGGGTTTTCGCATCAGCCACAGTCGAAACTCTTGTCGAGCTAATT D A T I A P K A *
. . . . . . CCTTGCGGTTGGCGCATCTACAGTGCTAAAAGTGCAAATTAATCCGGCTGATGCCGCAAA 5641---------+---------+---------+---------+---------+---------+5700 GGAACGCCAACCGCGTAGATGTCACGATTTTCACGTTTAATTAGGCCGACTACGGCGTTT
. . . . . . TAAACAAGTTGCTTTCAAAACGTCAGATCCTACCGTTGCCACCGTTTCCAGTGATGGAAC 5701---------+---------+---------+---------+---------+---------+5760 ATTTGTTCAACGAAAGTTTTGCAGTCTAGGATGGCAACGGTGGCAAAGGTCACTACCTTG
. . . . . . TGTGGCTGGTGTAAAGGCAGGGTCTGCAACTGTAACAGTCACAACTGACGATGGTGGTAA 5761---------+---------+---------+---------+---------+---------+5820 ACACCGACCACATTTCCGTCCCAGACGTTGACATTGTCAGTGTTGACTGCTACCACCATT
. . . . . . AACTGCCACCGCAACTGTAACTGTGGCTTAGCAATGAACTCCGTCGCCTTGTAAATGCAC 5821---------+---------+---------+---------+---------+---------+5880 TTGACGGTGGCGTTGACATTGACACCGAATCGTTACTTGAGGCAGCGGAACATTTACGTG
. . RBS . . . AATACGCGAACAGCGGGCGGCTTATACCTAAGGAGATTAAGCATGGCATATCAAATTAAA 5881---------+---------+---------+---------+---------+---------+5940 TTATGCGCTTGTCGCCCGCCGAATATGGATTCCTCTAATTCGTACCGTATAGTTTAATTT orf73 è M A Y Q I K
. . . . . . CTAAATATCAAAGGCGAAACGTGTGTGTTCACACGAAATGGAGAGCCAACATTACGTGAT 5941---------+---------+---------+---------+---------+---------+6000 GATTTATAGTTTCCGCTTTGCACACACAAGTGTGCTTTACCTCTCGGTTGTAATGCACTA L N I K G E T C V F T R N G E P T L R D
. . . . . . ACCACGAATGCCTTGAAAGTGCAGCAACAACAGCTGCGCATGCTAAACCGAAAAGATGGC 6001---------+---------+---------+---------+---------+---------+6060 TGGTGCTTACGGAACTTTCACGTCGTTGTTGTCGACGCGTACGATTTGGCTTTTCTACCG T T N A L K V Q Q Q Q L R M L N R K D G
. . . . . . CCTTCAAACGATGATTACGATGATAACGAGAAAAACTTAGCCAAATTTTCGGTTGATTTC 6061---------+---------+---------+---------+---------+---------+6120 GGAAGTTTGCTACTAATGCTACTATTGCTCTTTTTGAATCGGTTTAAAAGCCAACTAAAG P S N D D Y D D N E K N L A K F S V D F
Anexo II
. . . . . . TGGAAAAACCAGTTTACCCGATGATGTTTAATTGATGGCTCATCTATTTCTTTGAAATCG 6121---------+---------+---------+---------+---------+---------+6180 ACCTTTTTGGTCAAATGGGCTACTACAAATTAACTACCGAGTAGATAAAGAAACTTTAGC W K N Q F T R *
. . . . . . CTGGATTCAATCAATGATGCCATTGCGATTCTCTAAGCGATGCGAAGAGGATAAGAAGGA 6181---------+---------+---------+---------+---------+---------+6240 GACCTAAGTTAGTTACTACGGTAACGCTAAGAGATTCGCTACGCTTCTCCTATTCTTCCT
. . . . . . CACAGCAAAAAAATCACCGAAGCGGACGTCAAAGAAGCCATTAGCAACCTTGACGACTTC 6241---------+---------+---------+---------+---------+---------+6300 GTGTCGTTTTTTTAGTGGCTTCGCCTGCAGTTTCTTCGGTAATCGTTGGAACTGCTGAAG
. . . . . . TACAAAGCAAGGCTCTCTGAAGGCTACCGATTAGCTGACGTTGATGCTATGACGCTCCGC 6301---------+---------+---------+---------+---------+---------+6360 ATGTTTCGTTCCGAGAGACTTCCGATGGCTAATCGACTGCAACTACGATACTGCGAGGCG
. . . . . . GATATTGAAAAACTTAACCAGATTTACGAGGAACGGGAGACCACGATCGACAAGGCCTTT 6361---------+---------+---------+---------+---------+---------+6420 CTATAACTTTTTGAATTGGTCTAAATGCTCCTTGCCCTCTGGTGCTAGCTGTTCCGGAAA
. . RBS . . . CCGTTCCTTTTCTAGTTCTATGAAAGGAGGTAAAACATGTTAGGAAATCTCGGACAAATT 6421---------+---------+---------+---------+---------+---------+6480 GGCAAGGAAAAGATCAAGATACTTTCCTCCATTTTGTACAATCCTTTAGAGCCTGTTTAA orf465 è M L G N L G Q I
. . . . . . GCGGCTACCGTAAGCTTGAACATTGATCCGTTTCAAGTAAGCCAGCGAGTTTTGAACTCT 6481---------+---------+---------+---------+---------+---------+6540 CGCCGATGGCATTCGAACTTGTAACTAGGCAAAGTTCATTCGGTCGCTCAAAACTTGAGA A A T V S L N I D P F Q V S Q R V L N S
. . . . . . TCAATTAAAGCAACTGCCGCTGAGTTGCGGGCTCAAGATGCTGCGTTTAAGGGCTCTGAA 6541---------+---------+---------+---------+---------+---------+6600 AGTTAATTTCGTTGACGGCGACTCAACGCCCGAGTTCTACGACGCAAATTCCCGAGACTT S I K A T A A E L R A Q D A A F K G S E
. . . . . . AAGTCTATCAACAACATGCGTTCAACCTATGACACATTGAGCCGCCAGTCAAAGAACTAC 6601---------+---------+---------+---------+---------+---------+6660 TTCAGATAGTTGTTGTACGCAAGTTGGATACTGTGTAACTCGGCGGTCAGTTTCTTGATG K S I N N M R S T Y D T L S R Q S K N Y
. . . . . . CAAGCTCAGCTTCAGAAACAGCGAGAACAGTATGATGAAAATTCGAAAGCGGTTGAAAAA 6661---------+---------+---------+---------+---------+---------+6720 GTTCGAGTCGAAGTCTTTGTCGCTCTTGTCATACTACTTTTAAGCTTTCGCCAACTTTTT Q A Q L Q K Q R E Q Y D E N S K A V E K
. . . . . . CTTAATAAAAGTGAGACTGCATCGCAGGAAGAAATTAATCGTGCGACAAAACTGCAAGCT 6721---------+---------+---------+---------+---------+---------+6780 GAATTATTTTCACTCTGACGTAGCGTCCTTCTTTAATTAGCACGCTGTTTTGACGTTCGA L N K S E T A S D Q Q I N R A T K L Q A
Anexo II
. . . . . . AATGCTGCATCACAGTATAATCGGACTGCTGCCGCTGCTGCTCAAAATGAAAATCGAATG 6781---------+---------+---------+---------+---------+---------+6840 TTACGACGTAGTGTCATATTAGCCTGACGACGGCGACGACGAGTTTTACTTTTAGCTTAC N A A S Q Y N R T A A A A A Q N E N R M
. . . . . . GCGGCCTTACGCAAAGAGATTGCGCTGCAAAGTGACGGCTGGACTAAAGTATCAAACGGT 6841---------+---------+---------+---------+---------+---------+6900 CGCCGGAATGCGTTTCTCTAACGCGACGTTTCACTGCCGACCTGATTTCATAGTTTGCCA A A L R K E I A L Q S D G W T K V S N G
. . . . . . GCATCAAAGTTTGCATCTGTTACCGAAAAGACAAGCTCTAAGCTAACCAGTTTCGGATCA 6901---------+---------+---------+---------+---------+---------+6960 CGTAGTTTCAAACGTAGACAATGGCTTTTCTGTTCGAGATTCGATTGGTCAAAGCCTAGT A S K F A S V T E K T S S K L T S F G S
. . . . . . ACGATGACAAGGGCGGTAACTGCTCCAATTGCCATTGGATTTGTAGCAGCCGCTAAATCT 6961---------+---------+---------+---------+---------+---------+7020 TGCTACTGTTCCCGCCATTGACGAGGTTAACGGTAACCTAAACATCGTCGGCGATTTAGA T M T R A V T A P I A I G F V A A A K S
. . . . . . GCCATTGATTTCAACAGCCAGATTCAAGCAATGGGACCTTTGCTAACAAATGGGGGTGCG 7021---------+---------+---------+---------+---------+---------+7080 CGGTAACTAAAGTTGTCGGTCTAAGTTCGTTACCCTGGAAACGATTGTTTACCCCCACGC A I D F N S Q I Q A M G P L L T N G G A
. . . . . . ATTACTGCCAAGTATCGTGCGCAACTTGATCAACTAGCATCAGCATCTAAAAAGTGGTCG 7081---------+---------+---------+---------+---------+---------+7140 TAATGACGGTTCATAGCACGCGTTGAACTAGTTGATCGTAGTCGTAGATTTTTCACCAGC I T A K Y R A Q L D Q L A S A S K K W S
. . . . . . GTTGAATATGGCGTTTCCACGGCTGCAATTAACGACGGCATGTCAGAAATGATCAAACGT 7141---------+---------+---------+---------+---------+---------+7200 CAACTTATACCGCAAAGGTGCCGACGTTAATTGCTGCCGTACAGTCTTTACTAGTTTGCA V E Y G V S T A A I N D G M S E M I K R
. . . . . . GGCTATACCGCTGCGCAAACATTAGGCGCAATGCCTGCAGTTCTCAATGCGGCAAAAGCG 7201---------+---------+---------+---------+---------+---------+7260 CCGATATGGCGACGCGTTTGTAATCCGCGTTACGGACGTCAAGAGTTACGCCGTTTTCGC G Y T A A Q T L G A M P A V L N A A K A
. . . . . . TCTGGCGATGACTTCAACGATGTTATGCATGTTTCTACATCCGTTTTGGAGCAATTTGGT 7261---------+---------+---------+---------+---------+---------+7320 AGACCGCTACTGAAGTTGCTACAATACGTACAAAGATGTAGGCAAAACCTCGTTAAACCA S G D D F N D V M H V S T S V L E Q F G
. . . . . . CTAAAGACAGAATCAACAACGGGCATGCTTAAAAACACGTCTCGCGTTACAGATACTCTT 7321---------+---------+---------+---------+---------+---------+7380 GATTTCTGTCTTAGTTGTTGCCCGTACGAATTTTTGTGCAGAGCGCAATGTCTATGAGAA L K T E S T T G M L K N T S R V T D T L
Anexo II
. . . . . . ACCTATATTGCGAACGCTACTGCAGCAGGGTTCCAAGATATGGGCGAGGCAATGACGTAT 7381---------+---------+---------+---------+---------+---------+7440 TGGATATAACGCTTGCGATGACGTCGTCCCAAGGTTCTATACCCGCTCCGTTACTGCATA T Y I A N A T A A G F Q D M G E A M T Y
. . . . . . GTCGGACCTTCTGCTCATGCTGCTGGTATTTCACTCGAAGAAACAGCGGCTGCTATTGGC 7441---------+---------+---------+---------+---------+---------+7500 CAGCCTGGAAGACGAGTACGACGACCATAAAGTGAGCTTCTTTGTCGCCGACGATAACCG V G P S A H A A G I S L E E T A A A I G
. . . . . . ATTATGAGCAACAAAGGGATTGAAGGATCAGTTGCTGGCACAGCGTTACGTGGTGCTTTA 7501---------+---------+---------+---------+---------+---------+7560 TAATACTCGTTGTTTCCCTAACTTCCTAGTCAACGACCGTGTCGCAATGCACCACGAAAT I M S N K G I E G S V A G T A L R G A L
. . . . . . ACAAGACTGTTGAAGCCTTCTAAGCAAAATCTTCAAGGATTTAATGAATTAGGCATATCT 7561---------+---------+---------+---------+---------+---------+7620 TGTTCTGACAACTTCGGAAGATTCGTTTTAGAAGTTCCTAAATTACTTAATCCGTATAGA T R L L K P S K Q N L Q G F N E L G I S
. . . . . . GTTGCTGATTTTAAAAAAGGAACTCTAACTCTTCCAGAGATTCTTGACAAAATCAAGAAT 7621---------+---------+---------+---------+---------+---------+7680 CAACGACTAAAATTTTTTCCTTGAGATTGAGAAGGTCTCTAAGAACTGTTTTAGTTCTTA V A D F K K G T L T L P E I L D K I K N
. . . . . . AACACTAAGGGGTGGACAGATCAGCAACGTGCTTCTGCAGTAGCGTTGGCTTTTGGCACT 7681---------+---------+---------+---------+---------+---------+7740 TTGTGATTCCCCACCTGTCTAGTCGTTGCACGAAGACGTCATCGCAACCGAAAACCGTGA N T K G W T D Q Q R A S A V A L A F G T
. . . . . . GAAGCGCAATCCGGCATGAATGCCTTAATTAGTGCAGGTGGCGGTGAGCTACCAAATATA 7741---------+---------+---------+---------+---------+---------+7800 CTTCGCGTTAGGCCGTACTTACGGAATTAATCACGTCCACCGCCACTCGATGGTTTATAT E A Q S G M N A L I S A G G G E L P N I . . . . . . CCAGTGAAGCTGAGCATGCTAGCGGAACAACTGCCAAAATTGCTAACCAGTTAAACAATA 7801---------+---------+---------+---------+---------+---------+7860 GGTCACTTCGACTCGTACGATCGCCTTGTTGACGGTTTTAACGATTGGTCAATTTGTTAT P V K L S M L A E Q L P K L L T S *
. . . . . . CGGATGCCGCCAAATTGAAGAGATTTCAAGAGTCGATTCATGTTTTAGGAATTGAAGTAG 7861---------+---------+---------+---------+---------+---------+7920 GCCTACGGCGGTTTAACTTCTCTAAAGTTCTCAGCTAAGTACAAAATCCTTAACTTCATC
. . . . . . GTCCACAAAGCTTCTACCGACGCTGACTCCTCTTATCAAAACAGCAACCGATGTTGTCAA 7921---------+---------+---------+---------+---------+---------+7980 CAGGTGTTTCGAAGATGGCTGCGACTGAGGAGAATAGTTTTGTCGTTGGCTACAACAGTT
. . . . . . TGCCTTTACAAAAATGGACAGTGGTACGCAACAAACCATTATTAAATTTGCAGCGTTTGC 7981---------+---------+---------+---------+---------+---------+8040 ACGGAAATGTTTTTACCTGTCACCATGCGTTGTTTGGTAATAATTTAAACGTCGCAAACG
Anexo II
. . . . . . GGCAGTTGTAGGGCCAGTGAGTTCTCTTATCGGTGGAGCTCTTAAGCCTGTTACTGCTTT 8041---------+---------+---------+---------+---------+---------+8100 CCGTCAACATCCCGGTCACTCAAGAGAATAGCCACCTCGAGAATTCGGACAATGACGAAA
. . . . . . GAGCAAAGGAATATCTGGAATTGCGGGAGTCATTGGGCGAGCATCTGCAGCTGCAAAGCT 8101---------+---------+---------+---------+---------+---------+8160 CTCGTTTCCTTATAGACCTTAACGCCCTCAGTAACCCGCTCGTAGACGTCGACGTTTCGA
RBS . . . . . . CGGCGGAACTGCAATGGATGTGCTCAAGTCTGGCTTTAGTAAGACAGCCTTTGAAGCATT 8161---------+---------+---------+---------+---------+---------+8220 GCCGCCTTGACGTTACCTACACGAGTTCAGACCGAAATCATTCTGTCGGAAACTTCGTAA orf563 è M D V L K S G F S K T A F E A L
. . . . . . GAAGGTTGCACCAGCCGCAGCAGCGGCGGCAGAAGGCACTTCTGGAATGGGAGCAGCATG 8221---------+---------+---------+---------+---------+---------+8280 CTTCCAACGTGGTCGGCGTCGTCGCCGCCGTCTTCCGTGAAGACCTTACCCTCGTCGTAC K V A P A A A A A A E G T S G M G A A W
. . . . . . GGCGGACGCAGCGAGCGGAACAGGATTACTAGCGGCATTGGGGCCAATCGTCCCAGTTGT 8281---------+---------+---------+---------+---------+---------+8340 CCGCCTGCGTCGCTCGCCTTGTCCTAATGATCGCCGTAACCCCGGTTAGCAGGGTCAACA A D A A S G T G L L A A L G P I V P V V
. . . . . . TTTAGGTGTAACAGCAGTCGTCGGTGGTGCCGGTGTAGCCATCTGGGAATTGTGGGGCAA 8341---------+---------+---------+---------+---------+---------+8400 AAATCCACATTGTCGTCAGCAGCCACCACGGCCACATCGGTAGACCCTTAACACCCCGTT L G V T A V V G G A G V A I W E L W G K
. . . . . . AAAGGCTCTTGAGTCTGCCGACAGAACTTCACGATGGGGTACTGATATTGGTGCCGATGC 8401---------+---------+---------+---------+---------+---------+8460 TTTCCGAGAACTCAGACGGCTGTCTTGAAGTGCTACCCCATGACTATAACCACGGCTACG K A L E S A D R T S R W G T D I G A D A
. . . . . . CGACCGATCTGCTTCCAAAATGAAAGATGCCTCTGGGGCAATTTCTGGTGCTTTTGATGA 8461---------+---------+---------+---------+---------+---------+8520 GCTGGCTAGACGAAGGTTTTACTTTCTACGGAGACCCCGTTAAAGACCACGAAAACTACT D R S A S K M K D A S G A I S G A F D D
. . . . . . TACAAACCACACAGTCGAGCAAAATAGCAAAACCATCAAAAAAGGCTTTGATGATATTAC 8521---------+---------+---------+---------+---------+---------+8580 ATGTTTGGTGTGTCAGCTCGTTTTATCGTTTTGGTAGTTTTTTCCGAAACTACTATAATG T N H T V E Q N S K T I K K G F D D I T
. . . . . . GAAGGCCGCTAAAGAATCGTCCAAAAATACCCAAACCGCACTCGACAAGTTGGCGAAGCA 8581---------+---------+---------+---------+---------+---------+8640 CTTCCGGCGATTTCTTAGCAGGTTTTTATGGGTTTGGCGTGAGCTGTTCAACCGCTTCGT K A A K E S S K N T Q T A L D K L A K Q
Anexo II
. . . . . . AGTCGGTGGATCGACTGCTGATCAGATTCATAAAGACGCAGCAGAAATGAAGAAGGCCGA 8641---------+---------+---------+---------+---------+---------+8700 TCAGCCACCTAGCTGACGACTAGTCTAAGTATTTCTGCGTCGTCTTTACTTCTTCCGGCT V G G S T A D Q I H K D A A E M K K A D
. . . . . . CGATGCACGCATCAAGCAAATTGAGGCTAATGCCAAACAAGCTAAGTCAATTACTGAATC 8701---------+---------+---------+---------+---------+---------+8760 GCTACGTGCGTAGTTCGTTTAACTCCGATTACGGTTTGTTCGATTCAGTTAATGACTTAG D A R I K Q I E A N A K Q A K S I T E S
. . . . . . TGCCAGCAAAGAACATGCCGAATTTACTCGAGATCAAATTCAGATTCTGGATAATTTGCG 8761---------+---------+---------+---------+---------+---------+8820 ACGGTCGTTTCTTGTACGGCTTAAATGAGCTCTAGTTTAAGTCTAAGACCTATTAAACGC A S K E H A E F T R D Q I Q I L D N L R
. . . . . . CAAGAGCAGTGCAGCCGAGGCCGTTAAGACACTTAGAATTTCCGGTACCCAACAAGCGAA 8821---------+---------+---------+---------+---------+---------+8880 GTTCTCGTCACGTCGGCTCCGGCAATTCTGTGAATCTTAAAGGCCATGGGTTGTTCGCTT K S S A A E A V K T L R I S G T Q Q A N
. . . . . . TGTCTTAAAAGCTATTAATGGCGAAAAGATTCGGATGAGTCAAGCAGCGGCTAAGGAACA 8881---------+---------+---------+---------+---------+---------+8940 ACAGAATTTTCGATAATTACCGCTTTTCTAAGCCTACTCAGTTCGTCGCCGATTCCTTGT V L K A I N G E K I R M S Q A A A K E Q
. . . . . . GTACAGCCAGATGCAACAGACATTTGCTGACGAAACTGATACTTATGGCAAACATTATGC 8941---------+---------+---------+---------+---------+---------+9000 CATGTCGGTCTACGTTGTCTGTAAACGACTGCTTTGACTATGAATACCGTTTGTAATACG Y S Q M Q Q T F A D E T D T Y G K H Y A
. . . . . . TGCCATTAAAAACTCTGCTGAGTTGAGTACGGCTCAAAAGAATAAAGATCTTGAAAAGCT 9001---------+---------+---------+---------+---------+---------+9060 ACGGTAATTTTTGAGACGACTCAACTCATGCCGAGTTTTCTTATTTCTAGAACTTTTCGA A I K N S A E L S T A Q K N K D L E K L
. . . . . . GGAAAAAGATCATCAAAGCAACATGAGCGTGATTTATGCGGGTGCGATCCAAGCAATGAA 9061---------+---------+---------+---------+---------+---------+9120 CCTTTTTCTAGTAGTTTCGTTGTACTCGCACTAAATACGCCCACGCTAGGTTCGTTACTT E K D H Q S N M S V I Y A G A I Q A M K
. . . . . . AGCGCAAGGACTATCCAACAAGACGATTCAAGAACAACTTCAAACAGAGTTTGGTGCGAC 9121---------+---------+---------+---------+---------+---------+9180 TCGCGTTCCTGATAGGTTGTTCTGCTAAGTTCTTGTTGAAGTTTGTCTCAAACCACGCTG A Q G L S N K T I Q E Q L Q T E F G A T
. . . . . . GGCGTCTCAAGCTAAAAAAGCAATGAGCGCTTATTCAGAGGCGATGAGCAAGGGGGTTAA 9181---------+---------+---------+---------+---------+---------+9240 CCGCAGAGTTCGATTTTTTCGTTACTCGCGAATAAGTCTCCGCTACTCGTTCCCCCAATT A S Q A K K A M S A Y S E A M S K G V K
Anexo II
. . . . . . GGACACAAAGCAGTTTGCCGCCGCTGTATCAGATGGAATGAGCAAGAACGTCAAGAAAGC 9241---------+---------+---------+---------+---------+---------+9300 CCTGTGTTTCGTCAAACGGCGGCGACATAGTCTACCTTACTCGTTCTTGCAGTTCTTTCG D T K Q F A A A V S D G M S K N V K K A
. . . . . . TGGCAACGATTGGAACAAGCTAGTTCTTGATCCAAAAACAGGCAAAGTTATCACGAATCT 9301---------+---------+---------+---------+---------+---------+9360 ACCGTTGCTAACCTTGTTCGATCAAGAACTAGGTTTTTGTCCGTTTCAATAGTGCTTAGA G N D W N K L V L D P K T G K V I T N L
. . . . . . TCCGGAGGTGTTGCACGATACAGCTAATACCAAAGAAGGGTGGAAGCGTCTAACCTTTGA 9361---------+---------+---------+---------+---------+---------+9420 AGGCCTCCACAACGTGCTATGTCGATTATGGTTTCTTCCCACCTTCGCAGATTGGAAACT P E V L H D T A N T K E G W K R L T F D
. . . . . . CTTAAAAAATGCAAAGATTAGCACTAATGCAAAAGAAACAATTGCCATAGCACTGGCATC 9421---------+---------+---------+---------+---------+---------+9480 GAATTTTTTACGTTTCTAATCGTGATTACGTTTTCTTTGTTAACGGTATCGTGACCGTAG L K N A K I S T N A K E T I A I A L A S
. EcoRI . . . . . AACTGATAAGTGGAATTCGCTTAGCGTCGATGAGAAGAACGCAATCATCAAAGAGACTGG 9481---------+---------+---------+---------+---------+---------+9540 TTGACTATTCACCTTAAGCGAATCGCAGCTACTCTTCTTGCGTTAGTAGTTTCTCTGACC T D K W N S L S V D E K N A I I K E T G
. . . . . . CCGAAAAGATTTGGCTGATCTTATGAAGCGCATGGTTTCTTGGAATGATTTAACGCTTGA 9541---------+---------+---------+---------+---------+---------+9600 GGCTTTTCTAAACCGACTAGAATACTTCGCGTACCAAAGAACCTTACTAAATTGCGAACT R K D L A D L M K R M V S W N D L T L E
. . . . . . ACAGCAGCAGGCGGTTGTCAAAGGAGACTATGCACCGCTGATTGACGCGATTATTCAAGC 9601---------+---------+---------+---------+---------+---------+9660 TGTCGTCGTCCGCCAACAGTTTCCTCTGATACGTGGCGACTAACTGCGCTAATAAGTTCG Q Q Q A V V K G D Y A P L I D A I I Q A
. . . . . . TGGTACATGGAATCAACTAGATGTGGAAGACAAGCAAGTCTTGGTAAAAGACAAGGCTAA 9661---------+---------+---------+---------+---------+---------+9720 ACCATGTACCTTAGTTGATCTACACCTTCTGTTCGTTCAGAACCATTTTCTGTTCCGATT G T W N Q L D V E D K Q V L V K D K A N
. . . . . . CATTCCGTTGGTTGATGCACTCGTTAATTCTGGTCGGTGGAACAAGCTTGACCTCAAGAC 9721---------+---------+---------+---------+---------+---------+9780 GTAAGGCAACCAACTACGTGAGCAATTAAGACCAGCCACCTTGTTCGAACTGGAGTTCTG I P L V D A L V N S G R W N K L D L K T
. . . . . . TCAAAATGCGCTTCTACAAGCAAAGGGCAAAAAAGATTTAGAGATGTTTTGTTCAATATG 9781---------+---------+---------+---------+---------+---------+9840 AGTTTTACGCGAAGATGTTCGTTTCCCGTTTTTTCTAAATCTCTACAAAACAAGTTATAC Q N A L L Q A K G K K D L E M F C S I W
Anexo II
RBS . . . . . GGGCTTTGGAACAGCCTCGACATGAATGAGAAATATGCCCAACTAAAGGCAATAGGTAAA 9841---------+---------+---------+---------+---------+---------+9900 CCCGAAACCTTGTCGGAGCTGTACTTACTCTTTATACGGGTTGATTTCCGTTATCCATTT G F G T A S T * orf486 è M N E K Y A Q L K A I G K
. . . . . . ACGGATTTAGCTGACATGATTGATCAGCTAGGACTGTGGGACACTATCACTCCTAAGCAA 9901---------+---------+---------+---------+---------+---------+9960 TGCCTAAATCGACTGTACTAACTAGTCGATCCTGACACCCTGTGATAGTGAGGATTCGTT T D L A D M I D Q L G L W D T I T P K Q
. . . . . . ATGGAGGCTGCAGTTAAAGGGGACTACAGTCAACTAACGGCGGCAATTGATCAGGTTCAT 9961---------+---------+---------+---------+---------+---------+10020 TACCTCCGACGTCAATTTCCCCTGATGTCAGTTGATTGCCGCCGTTAACTAGTCCAAGTA M E A A V K G D Y S Q L T A A I D Q V H
. . . . . . GGCTGGAATCAACTTGATACAAAGCAATTAGAGGCAATAGTTCAGGATAAAGCAACTGTT10021---------+---------+---------+---------+---------+---------+10080 CCGACCTTAGTTGAACTATGTTTCGTTAATCTCCGTTATCAAGTCCTATTTCGTTGACAA G W N Q L D T K Q L E A I V Q D K A T V
. . . . . . CCGCTGATTCAGGCAATGATTCAAAATCAAAAGTGGAATGGCCTTTCGGTTGAAGAAAAG10081---------+---------+---------+---------+---------+---------+10140 GGCGACTAAGTCCGTTACTAAGTTTTAGTTTTCACCTTACCGGAAAGCCAACTTCTTTTC P L I Q A M I Q N Q K W N G L S V E E K
. . . . . . AATGCAATTCTGAAAACTAAAGGCATGCCAGAATTAGCTGACATGGTTGTCAAATATGGC10141---------+---------+---------+---------+---------+---------+10200 TTACGTTAAGACTTTTGATTTCCGTACGGTCTTAATCGACTGTACCAACAGTTTATACCG N A I L K T K G M P E L A D M V V K Y G
. . . . . . TCATTTGATAGTTTACCGGATTCGACAAAACGATTGTTGATAAATGATGACGATGCCAGG10201---------+---------+---------+---------+---------+---------+10260 AGTAAACTATCAAATGGCCTAAGCTGTTTTGCTAACAACTATTTACTACTGCTACGGTCC S F D S L P D S T K R L L I N D D D A R
. . . . . . CAAAAGCTGATTGCTGCTGGAGTCAACATGGATAAATATAATGTCGATGTTAATCCCGAT10261---------+---------+---------+---------+---------+---------+10320 GTTTTCGACTAACGACGACCTCAGTTGTACCTATTTATATTACAGCTACAATTAGGGCTA Q K L I A A G V N M D K Y N V D V N P D
. . . . . . GCCAAAATTTTAAAGGGAGATAGCAGTCCACTATTAGCCGAAACAATTAAAGCCAAAGAA10321---------+---------+---------+---------+---------+---------+10380 CGGTTTTAAAATTTCCCTCTATCGTCAGGTGATAATCGGCTTTGTTAATTTCGGTTTCTT A K I L K G D S S P L L A E T I K A K E
. . . . . . GTAATCGCTGACTATGCAACCGTGTTACCTGATAAAAAGCAGTTCGGCGGAAACTCTAGC10381---------+---------+---------+---------+---------+---------+10440 CATTAGCGACTGATACGTTGGCACAATGGACTATTTTTCGTCAAGCCGCCTTTGAGATCG V I A D Y A T V L P D K K Q F G G N S S
Anexo II
. . . . . . GGCGTTACCAATGCAGCCAAATCTGGCGAAGGAAGCATCGGGCATTACGATACAGTTCTT10441---------+---------+---------+---------+---------+---------+10500 CCGCAATGGTTACGTCGGTTTAGACCGCTTCCTTCGTAGCCCGTAATGCTATGTCAAGAA G V T N A A K S G E G S I G H Y D T V L
. . . . . . CCGGGACTTAAGCTGTTTATCGGTGATTCAAGCAGCGTGACAAATCATGCTGAAAAAGGT10501---------+---------+---------+---------+---------+---------+10560 GGCCCTGAATTCGACAAATAGCCACTAAGTTCGTCGCACTGTTTAGTACGACTTTTTCCA P G L K L F I G D S S S V T N H A E K G
. . . . . . AAGGGCGAAGTCAACAGTTTCAATGGAACTAACCCATCAATGCGTTACTTCATGGGTAAT10561---------+---------+---------+---------+---------+---------+10620 TTCCCGCTTCAGTTGTCAAAGTTACCTTGATTGGGTAGTTACGCAATGAAGTACCCATTA K G E V N S F N G T N P S M R Y F M G N
. . . . . . GCTTCAAGCGTTGTGGGGGCTTCCGGATCTGGTAAAAACAGTATCGGAAGTTTTAATGGA10621---------+---------+---------+---------+---------+---------+10680 CGAAGTTCGCAACACCCCCGAAGGCCTAGACCATTTTTGTCATAGCCTTCAAAATTACCT A S S V V G A S G S G K N S I G S F N G
. . . . . . ACAAATCCGGGAGATAAATATTTCAAAGGCCATGATAATACGACAGGACCCGCAAGTGCT10681---------+---------+---------+---------+---------+---------+10740 TGTTTAGGCCCTCTATTTATAAAGTTTCCGGTACTATTATGCTGTCCTGGGCGTTCACGA T N P G D K Y F K G H D N T T G P A S A
. . . . . . GCCAAACGTGCAGTTAGCGCATTTGGTGGGAATGAAGTCATCACGAAGACTTTCAATTTT10741---------+---------+---------+---------+---------+---------+10800 CGGTTTGCACGTCAATCGCGTAAACCACCCTTACTTCAGTAGTGCTTCTGAAAGTTAAAA A K R A V S A F G G N E V I T K T F N F
. . . . . . GTGGCTAATATTTCGGACAGTATTCGGAAGCTTCTTCACTTGCAGCACGGAACTAATGAT10801---------+---------+---------+---------+---------+---------+10860 CACCGATTATAAAGCCTGTCATAAGCCTTCGAAGAAGTGAACGTCGTGCCTTGATTACTA V A N I S D S I R K L L H L Q H G T N D
. . . . . . CTCCGAACGAGTTCACTGGCGATGGTTAATGATGCCTCCGGATCTAACTATCAAGAGCCT10861---------+---------+---------+---------+---------+---------+10920 GAGGCTTGCTCAAGTGACCGCTACCAATTACTACGGAGGCCTAGATTGATAGTTCTCGGA L R T S S L A M V N D A S G S N Y Q E P
. . . . . . ATTATCACTCCTAATGGCAACATGTTTATGTTCAAAGAACGAAATGTGGTTTTTCCGCTT10921---------+---------+---------+---------+---------+---------+10980 TAATAGTGAGGATTACCGTTGTACAAATACAAGTTTCTTGCTTTACACCAAAAAGGCGAA I I T P N G N M F M F K E R N V V F P L
. . . . . . GCTCGTCACTCAATGGTTATTCCTGCTGATAAGGCTCGTCGAATGAACATTCCACGTTTT10981---------+---------+---------+---------+---------+---------+11040 CGAGCAGTGAGTTACCAATAAGGACGACTATTCCGAGCAGCTTACTTGTAAGGTGCAAAA A R H S M V I P A D K A R R M N I P R F
Anexo II
. . . . . . GCTGGTGGCACCACAGACTTCGGAGGCGCTGCTAATAGAATAAACCAATTGAATCCGCAA11041---------+---------+---------+---------+---------+---------+11100 CGACCACCGTGGTGTCTGAAGCCTCCGCGACGATTATCTTATTTGGTTAACTTAGGCGTT A G G T T D F G G A A N R I N Q L N P Q
. . . . . . ACCTTTGTTACCAGCATTTCTAGTGGTAGCAATAGTCGTGTTGAGGATTTGCTAGCAAGA11101---------+---------+---------+---------+---------+---------+11160 TGGAAACAATGGTCGTAAAGATCACCATCGTTATCAGCACAACTCCTAAACGATCGTTCT T F V T S I S S G S N S R V E D L L A R
. . . . . . CTGATCGAATTAACAACTTATAAGATTAGTAACCCGTCTGTTCCTGAAGGCAAGGTTGTT11161---------+---------+---------+---------+---------+---------+11220 GACTAGCTTAATTGTTGAATATTCTAATCATTGGGCAGACAAGGACTTCCGTTCCAACAA L I E L T T Y K I S N P S V P E G K V V
. . . . . . CTCGACAATGGGCGTGAAGTAGGACGGTGGCTGTATCCAACAATAAATAAATTGAAAAAC11221---------+---------+---------+---------+---------+---------+11280 GAGCTGTTACCCGCACTTCATCCTGCCACCGACATAGGTTGTTATTTATTTAACTTTTTG L D N G R E V G R W L Y P T I N K L K N
. . RBS . . . AGGGACATCATTATGAGTAATAGAAGAAGGGGGATTTTCTAAGTGGCAAATTTAATATTT11281---------+---------+---------+---------+---------+---------+11340 TCCCTGTAGTAATACTCATTATCTTCTTCCCCCTAAAAGATTCACCGTTTAAATTATAAA R D I I M S N R R R G I F * orfI è M A N L I F gpI . . . . . . GGAGGTCATAAGATTGGCAGTTCCTCTCTTCAATTCAGTGCAGCCCGCGGCGTTTTTTCT11341---------+---------+---------+---------+---------+---------+11400 CCTCCAGTATTCTAACCGTCAAGGAGAGAAGTTAAGTCACGTCGGGCGCCGCAAAAAAGA G G H K I G S S S L Q F S A A R G V F S
. . . . . . GAAGTTGAGAATACAACCCAGCCTGTCGGTGCCGGAGACGGAGAAATGCTGGTTCGAAGC11401---------+---------+---------+---------+---------+---------+11460 CTTCAACTCTTATGTTGGGTCGGACAGCCACGGCCTCTGCCTCTTTACGACCAAGCTTCG E V E N T T Q P V G A G D G E M L V R S
. . . . . . CACCTTAAGTCTAGAATCATTCCAGTGACTTATGATTTTGTGGCGCTATCTCGTCGTGAA11461---------+---------+---------+---------+---------+---------+11520 GTGGAATTCAGATCTTAGTAAGGTCACTGAATACTAAAACACCGCGATAGAGCAGCACTT H L K S R I I P V T Y D F V A L S R R E
. . . . . . TTTGAACGACAGTTAGCGCCATTGCTTTATAGCTCGGATGTTCAGAAACTAATCATTGAT11521---------+---------+---------+---------+---------+---------+11580 AAACTTGCTGTCAATCGCGGTAACGAAATATCGAGCCTACAAGTCTTTGATTAGTAACTA F E R Q L A P L L Y S S D V Q K L I I D
. . . . . . GATCGTCCTGATGAGTTTTGGTATGCAAAAGTTGACGGTAAGATTGATATGGACCGGGCT11581---------+---------+---------+---------+---------+---------+11640 CTAGCAGGACTACTCAAAACCATACGTTTTCAACTGCCATTCTAACTATACCTGGCCCGA D R P D E F W Y A K V D G K I D M D R A
Anexo II
. . . . . . TATTTTCTTGGCACTGGCACTATTAATTTTCTTGTCCCCGATGGCATCGCGCACTCGGTA11641---------+---------+---------+---------+---------+---------+11700 ATAAAAGAACCGTGACCGTGATAATTAAAAGAACAGGGGCTACCGTAGCGCGTGAGCCAT Y F L G T G T I N F L V P D G I A H S V
. . . . . . GCCACGCAGACGGCTGACAACATGCCATATAAGGACGTTCCTGTTAATCTACTTAAGGGA11701---------+---------+---------+---------+---------+---------+11760 CGGTGCGTCTGCCGACTGTTGTACGGTATATTCCTGCAAGGACAATTAGATGAATTCCCT A T Q T A D N M P Y K D V P V N L L K G
. . . . . . AGCGGCGAACCGCAAACAGTTGCGGCCCAGGTGTGGGGAGACGATCCACATTTATCTTTA11761---------+---------+---------+---------+---------+---------+11820 TCGCCGCTTGGCGTTTGTCAACGCCGGGTCCACACCCCTCTGCTAGGTGTAAATAGAAAT S G E P Q T V A A Q V W G D D P H L S L
. . . . . . GACACAAGCAGCCTAAAAATAGGCGATACTGTTTCTTTTCAAGTCAAAGTCGATGGGGTT11821---------+---------+---------+---------+---------+---------+11880 CTGTGTTCGTCGGATTTTTATCCGCTATGACAAAGAAAAGTTCAGTTTCAGCTACCCCAA D T S S L K I G D T V S F Q V K V D G V
. . . . . . AAAGATACCAATGTTTTTGTTGGTCTTAACAGCCAAAAAATATCTCCCTTATTTTCAAAT11881---------+---------+---------+---------+---------+---------+11940 TTTCTATGGTTACAAAAACAACCAGAATTGTCGGTTTTTTATAGAGGGAATAAAAGTTTA K D T N V F V G L N S Q K I S P L F S N
. . . . . . GGAATGGAGACTTTTGCAATCACATGGACAAAAGACTTGTCCGAGTTGCCTTTGCCAATT11941---------+---------+---------+---------+---------+---------+12000 CCTTACCTCTGAAAACGTTAGTGTACCTGTTTTCTGAACAGGCTCAACGGAAACGGTTAA G M E T F A I T W T K D L S E L P L P I
. . . . . . AAATTTTCAGTTAAGCCATCAGCGCTAACAGATGAATACACTTGGAGTCAGGCTAAAGCA12001---------+---------+---------+---------+---------+---------+12060 TTTAAAAGTCAATTCGGTAGTCGCGATTGTCTACTTATGTGAACCTCAGTCCGATTTCGT K F S V K P S A L T D E Y T W S Q A K A
. . . . . . GAGATTGGCACCACCGCTTCTCCATGGTCGCCTAACCCAGCTGATCCTGAATATTATACC12061---------+---------+---------+---------+---------+---------+12120 CTCTAACCGTGGTGGCGAAGAGGTACCAGCGGATTGGGTCGACTAGGACTTATAATATGG E I G T T A S P W S P N P A D P E Y Y T
. . . . . . GACACCATCACAGTGCCGAATGCTGGGACGTATCCATCTGAACCAGTTATCACGGCTACT12121---------+---------+---------+---------+---------+---------+12180 CTGTGGTAGTGTCACGGCTTACGACCCTGCATAGGTAGACTTGGTCAATAGTGCCGATGA D T I T V P N A G T Y P S E P V I T A T
. . . . . . ATCAACGGTGATAACGGCGTACTAACTGCCATTAATGATCAGGGCAGTGTACTACAGTTT12181---------+---------+---------+---------+---------+---------+12240 TAGTTGCCACTATTGCCGCATGATTGACGGTAATTACTAGTCCCGTCACATGATGTCAAA I N G D N G V L T A I N D Q G S V L Q F
Anexo II
. . . . . . GGCTCTCCCGATGAGACTGATGGCTTTGTGAAACAAAAGTCTGAACGCGTTTATCATCTC12241---------+---------+---------+---------+---------+---------+12300 CCGAGAGGGCTACTCTGACTACCGAAACACTTTGTTTTCAGACTTGCGCAAATAGTAGAG G S P D E T D G F V K Q K S E R V Y H L
. . . . . . GATTTCAATCAGACGCCGACAGGGTCACGCTCAATAATGGGGTTACGGATTTTCCTTACT12301---------+---------+---------+---------+---------+---------+12360 CTAAAGTTAGTCTGCGGCTGTCCCAGTGCGAGTTATTACCCCAATGCCTAAAAGGAATGA D F N Q T P T G S R S I M G L R I F L T
. . . . . . ATGAGCATGGCAATGATGCCAACGTACAGTCGGGACCGTTTGGCTATAAAGATGGTATTG12361---------+---------+---------+---------+---------+---------+12420 TACTCGTACCGTTACTACGGTTGCATGTCAGCCCTGGCAAACCGATATTTCTACCATAAC M S M A M M P T Y S R D R L A I K M V L
. . . RBS . . CCTACCCGTCCACTGAACGAACTGCTGCCAATCACTGGAATGGGCCTTCAATGAGCGGCA12421---------+---------+---------+---------+---------+---------+12480 GGATGGGCAGGTGACTTGCTTGACGACGGTTAGTGACCTTACCCGGAAGTTACTCGCCGT P T R P L N E L L P I T G M G L Q * orf156 è M S G T
. . . . . . CCATTCCGAAAAATTCGAATGGATCTAACACGGCTAATTTTCAGTTTGTCAATCGTATCA12481---------+---------+---------+---------+---------+---------+12540 GGTAAGGCTTTTTAAGCTTACCTAGATTGTGCCGATTAAAAGTCAAACAGTTAGCATAGT I P K N S N G S N T A N F Q F V N R I N
. . . . . . ATGTTGGAACGAATGCCGCAGAAGTAGGCCGTTTCGAGTTCAATTTGACGTATCAAGGCA12541---------+---------+---------+---------+---------+---------+12600 TACAACCTTGCTTACGGCGTCTTCATCCGGCAAAGCTCAAGTTAAACTGCATAGTTCCGT V G T N A A E V G R F E F N L T Y Q G K
. . . . . . AGATTGTCGCTTCTCTTGCGCTGTTTGATGATAGTGCTTCAAACGACCAGTGGGTTTTTT12601---------+---------+---------+---------+---------+---------+12660 TCTAACAGCGAAGAGAACGCGACAAACTACTATCACGAAGTTTGCTGGTCACCCAAAAAA I V A S L A L F D D S A S N D Q W V F S
. . . . . . CAGGCACAGTCTATGATGGCCGCCAAGCACAGATGATATTTTGGGACTTACTGCCACGCA12661---------+---------+---------+---------+---------+---------+12720 GTCCGTGTCAGATACTACCGGCGGTTCGTGTCTACTATAAAACCCTGAATGACGGTGCGT G T V Y D G R Q A Q M I F W D L L P R N
. . . . . . ATTACTATCGTGACGGCAACTACAATGCTGTTATCACAAAAATGGGTGATCAGTTAACCT12721---------+---------+---------+---------+---------+---------+12780 TAATGATAGCACTGCCGTTGATGTTACGACAATAGTGTTTTTACCCACTAGTCAATTGGA Y Y R D G N Y N A V I T K M G D Q L T F
. . . . . . TCCGTTTGGATCGTCTTGATTTAGGCGATGGTGGTATTGAGACACGGACAATATCAGGCT12781---------+---------+---------+---------+---------+---------+12840 AGGCAAACCTAGCAGAACTAAATCCGCTACCACCATAACTCTGTGCCTGTTATAGTCCGA R L D R L D L G D G G I E T R T I S G F
Anexo II
. . . . . . TCTCTAGTGTGCCAATTGATGGCTGGACAGCTTGGTCCCCGGATTCTCCGATCAACGTGG12841---------+---------+---------+---------+---------+---------+12900 AGAGATCACACGGTTAACTACCGACCTGTCGAACCAGGGGCCTAAGAGGCTAGTTGCACC S S V P I D G W T A W S P D S P I N V V
. . . . . . TTGGTCAATTAACTGGCAAGATAGCTACTTTGAGTGGATAAACGTTGATTACTGGGACGA12901---------+---------+---------+---------+---------+---------+12960 AACCAGTTAATTGACCGTTCTATCGATGAAACTCACCTATTTGCAACTAATGACCCTGCT G Q L T G K I A T L S G *
. . . . . . TATTCCTAACCGGTTTAAAGACGGTGACGTTGTGAAAATTGATGTTGCTAATCGGCGTGT12961---------+---------+---------+---------+---------+---------+13020 ATAAGGATTGGCCAAATTTCTGCCACTGCAACACTTTTAACTACAACGATTAGCCGCACA
. . . . . . CCTTGTTAACGGCTTTGAAGATCGAACACTGCAAACAATCGGCAATGATTGGGGTGGCTT13021---------+---------+---------+---------+---------+---------+13080 GGAACAATTGCCGAAACTTCTAGCTTGTGACGTTTGTTAGCCGTTACTAACCCCACCGAA
. . . . . . CAAGATACATCCCAGGTAATAACACTATTCGCTTGCTCACATCACATTGGGCAAAGCAGT13081---------+---------+---------+---------+---------+---------+13140 GTTCTATGTAGGGTCCATTATTGTGATAAGCGAACGAGTGTAGTGTAACCCGTTTCGTCA
. . RBS . . . . GTAAGGCTGAAGTATCTTGGCAGGAGGCATGGCTATGAAAGATTTTTATTTTGTGGATAG13141---------+---------+---------+---------+---------+---------+13200 CATTCCGACTTCATAGAACCGTCCTCCGTACCGATACTTTCTAAAAATAAAACACCTATC orfJ è M K D F Y F V D R gpJ . . . . . . ATCATGGCATCTGCTCGGTATTGCAACTGCTGGAGGTGGTGGGAAAATCCACATTGTCGA13201---------+---------+---------+---------+---------+---------+13260 TAGTACCGTAGACGAGCCATAACGTTGACGACCTCCACCACCCTTTTAGGTGTAACAGCT S W H L L G I A T A G G G G K I H I V D
. . . . . . TGATACTGATGATCAGCTTATCTCAGCAGGTGCTCGCACCTATTCAGGAACCATTCTGTT13261---------+---------+---------+---------+---------+---------+13320 ACTATGACTACTAGTCGAATAGAGTCGTCCACGAGCGTGGATAAGTCCTTGGTAAGACAA D T D D Q L I S A G A R T Y S G T I L F
. . . . . . CACCCCCGAACTGTCTTCTAAGGTTCAAACGATGGCAGCACGTGGCAATTACATTTTGTA13321---------+---------+---------+---------+---------+---------+13380 GTGGGGGCTTGACAGAAGATTCCAAGTTTGCTACCGTCGTGCACCGTTAATGTAAAACAT T P E L S S K V Q T M A A R G N Y I L Y
. . . . . . TATGGATGAGCGAAATAAGGCAGTCTTTATGACAATTATGGAATCAAGTCATGATCCACT13381---------+---------+---------+---------+---------+---------+13440 ATACCTACTCGCTTTATTCCGTCAGAAATACTGTTAATACCTTAGTTCAGTACTAGGTGA M D E R N K A V F M T I M E S S H D P L
Anexo II
. . . . . . TGCTGGTGAGGAGACATTCACTGCTGAAGATGCTGGTATTGATTTGATTAACGAAACCGT13441---------+---------+---------+---------+---------+---------+13500 ACGACCACTCCTCTGTAAGTGACGACTTCTACGACCATAACTAAACTAATTGCTTTGGCA A G E E T F T A E D A G I D L I N E T V
. . . . . . TGGCCCCTATAAAGCTCCACAAGCAATGAGCATCGCCGATTATATTAGCCTATTCACGAA13501---------+---------+---------+---------+---------+---------+13560 ACCGGGGATATTTCGAGGTGTTCGTTACTCGTAGCGGCTAATATAATCGGATAAGTGCTT G P Y K A P Q A M S I A D Y I S L F T N
. . . . . . TGACTCAGGTTTTGAAATCGGTCTTAACGAGATCCCTGATTTGAAGCGAACGCTTGAATG13561---------+---------+---------+---------+---------+---------+13620 ACTGAGTCCAAAACTTTAGCCAGAATTGCTCTAGGGACTAAACTTCGCTTGCGAACTTAC D S G F E I G L N E I P D L K R T L E W
. . . . . . GACTGGCGAGTCTGACACCACTTTAAATCGTATTCTATCTGTTGCGACTCAGTTTGATAA13621---------+---------+---------+---------+---------+---------+13680 CTGACCGCTCAGACTGTGGTGAAATTTAGCATAAGATAGACAACGCTGAGTCAAACTATT T G E S D T T L N R I L S V A T Q F D N
. . . . . . TGCTGAACTGGACTTTAGCTTCGATGTGTCAGGGACAACGGTTGTGCGCCGCTTAATCAA13681---------+---------+---------+---------+---------+---------+13740 ACGACTTGACCTGAAATCGAAGCTACACAGTCCCTGTTGCCAACACGCGGCGAATTAGTT A E L D F S F D V S G T T V V R R L I N
. . . . . . CATTCATAAGCGCATCGGTGCTGATAGGAATATCACGCTGTATGTGGATAAAGACATCAA13741---------+---------+---------+---------+---------+---------+13800 GTAAGTATTCGCGTAGCCACGACTATCCTTATAGTGCGACATACACCTATTTCTGTAGTT I H K R I G A D R N I T L Y V D K D I N
. . . . . . TAAGATTGTGACGTCCGACAGTATTTATGATCTTTATACTGCCGTTACACCGACAGGTGG13801---------+---------+---------+---------+---------+---------+13860 ATTCTAACACTGCAGGCTGTCATAAATACTAGAAATATGACGGCAATGTGGCTGTCCACC K I V T S D S I Y D L Y T A V T P T G G
. . . . . . CACACCTGAAAGCAAAGATGGCGAGACCGTTGATCAGCAGCCAATCACACTTGAAGGTTA13861---------+---------+---------+---------+---------+---------+13920 GTGTGGACTTTCGTTTCTACCGCTCTGGCAACTAGTCGTCGGTTAGTGTGAACTTCCAAT T P E S K D G E T V D Q Q P I T L E G Y
. . . . . . TCAGTGGACAGATCCCGATGGTCGTTACGTGTTAACGAAAGAGGGTGTTTTGCTTGACCC13921---------+---------+---------+---------+---------+---------+13980 AGTCACCTGTCTAGGGCTACCAGCAATGCACAATTGCTTTCTCCCACAAAACGAACTGGG Q W T D P D G R Y V L T K E G V L L D P
. . . . . . AGTTGCCAACCAAACATGGAGCAGACTTTTGGCTAAGGGTGGTGCACCGAGTGTCAATGC13981---------+---------+---------+---------+---------+---------+14040 TCAACGGTTGGTTTGTACCTCGTCTGAAAACCGATTCCCACCACGTGGCTCACAGTTACG V A N Q T W S R L L A K G G A P S V N A
Anexo II
. . . . . . AGCGTATATCAATCGTGTTGTCACTTATACGGCTACTTCGCAAGCAACCTTGCTTCAATC14041---------+---------+---------+---------+---------+---------+14100 TCGCATATAGTTAGCACAACAGTGAATATGCCGATGAAGCGTTCGTTGGAACGAAGTTAG A Y I N R V V T Y T A T S Q A T L L Q S
. . . . . . TGCGCTCTCTGACCTAAAGACGCACAACCATGAAGCTGTCAATTATGAGACTGACATTGC14101---------+---------+---------+---------+---------+---------+14160 ACGCGAGAGACTGGATTTCTGCGTGTTGGTACTTCGACAGTTAATACTCTGACTGTAACG A L S D L K T H N H E A V N Y E T D I A
. . . . . . TGTGCTGCCACAAAATATCAACATTGGTGACACAATTCATTTAGCTGACGAGGATGAACA14161---------+---------+---------+---------+---------+---------+14220 ACACGACGGTGTTTTATAGTTGTAACCACTGTGTTAAGTAAATCGACTGCTCCTACTTGT V L P Q N I N I G D T I H L A D E D E H
. . . . . . CTTGTATCTGTCGGCTCGCTTGCTCGAGCTCAAATCAAGCTATTCGATGGATACACACAC14221---------+---------+---------+---------+---------+---------+14280 GAACATAGACAGCCGAGCGAACGAGCTCGAGTTTAGTTCGATAAGCTACCTATGTGTGTG L Y L S A R L L E L K S S Y S M D T H T
. . . . . . AGCAACTTTGGGAGACTACCTTATTGAACATGATCAGGTAGCAGCCCAATATCGGCAACT14281---------+---------+---------+---------+---------+---------+14340 TCGTTGAAACCCTCTGATGGAATAACTTGTACTAGTCCATCGTCGGGTTATAGCCGTTGA A T L G D Y L I E H D Q V A A Q Y R Q L
. . . . . . TGCTGAACAAATTAAGAACATCCCCAAAACAATCCAATACTACCCATGGCTTCGCTATGC14341---------+---------+---------+---------+---------+---------+14400 ACGACTTGTTTAATTCTTGTAGGGGTTTTGTTAGGTTATGATGGGTACCGAAGCGATACG A E Q I K N I P K T I Q Y Y P W L R Y A
. . . . . . CGATGATGACAAGGGCACCAACATGAGTGCTTTGCCAGCTGGCAAGAAGTATATGGCGGT14401---------+---------+---------+---------+---------+---------+14460 GCTACTACTGTTCCCGTGGTTGTACTCACGAAACGGTCGACCGTTCTTCATATACCGCCA D D D K G T N M S A L P A G K K Y M A V
. . . . . . TGTATACAGCAACAAGTCATCCGTGCCAAGTGACAATCCGGCTGATTACGCCGGCAAGTG14461---------+---------+---------+---------+---------+---------+14520 ACATATGTCGTTGTTCAGTAGGCACGGTTCACTGTTAGGCCGACTAATGCGGCCGTTCAC V Y S N K S S V P S D N P A D Y A G K W
. . . . . . GGCATTGATTCAGGGACCAAAAGGTGACAACGGTGTGGGTGTGCCGGGCCCTAAGGGAGC14521---------+---------+---------+---------+---------+---------+14580 CCGTAACTAAGTCCCTGGTTTTCCACTGTTGCCACACCCACACGGCCCGGGATTCCCTCG A L I Q G P K G D N G V G V P G P K G A
. . . . . . TGATGGCAAAACTAGCTACTTTCATACAGCCTATGCTAACAGCATTGATGGGAAACAAGG14581---------+---------+---------+---------+---------+---------+14640 ACTACCGTTTTGATCGATGAAAGTATGTCGGATACGATTGTCGTAACTACCCTTTGTTCC D G K T S Y F H T A Y A N S I D G K Q G
Anexo II
. . . . . . ATTTTCAACCACAAATGGCAATGGTAAGTCTTATTTCGGCCAATATGTTGACCAGACCAA14641---------+---------+---------+---------+---------+---------+14700 TAAAAGTTGGTGTTTACCGTTACCATTCAGAATAAAGCCGGTTATACAACTGGTCTGGTT F S T T N G N G K S Y F G Q Y V D Q T K
. . . . . . AGCGGATAGTACCGATCCCACAAAATACTCATGGGCATTGTTCAAAGGTACTGATGGTCG14701---------+---------+---------+---------+---------+---------+14760 TCGCCTATCATGGCTAGGGTGTTTTATGAGTACCCGTAACAAGTTTCCATGACTACCAGC A D S T D P T K Y S W A L F K G T D G R
. . . . . . TGACGGCAAAGATGGTAGCGATAATGTGCCAGTCATTACTGTTGGTGCAGCGTATCCATC14761---------+---------+---------+---------+---------+---------+14820 ACTGCCGTTTCTACCATCGCTATTACACGGTCAGTAATGACAACCACGTCGCATAGGTAG D G K D G S D N V P V I T V G A A Y P S
. . . . . . AGGCCCCAAAAAGGGGGATATGCATTGGCTGACTGATAGCAGCGGTGTTGTAACGGGATA14821---------+---------+---------+---------+---------+---------+14880 TCCGGGGTTTTTCCCCCTATACGTAACCGACTGACTATCGTCGCCACAACATTGCCCTAT G P K K G D M H W L T D S S G V V T G Y
. . . . . . TTATACCTATGATGGGACTAAATGGAACCCTTATAAAATCGACGCTAAGATTCTTTCGGC14881---------+---------+---------+---------+---------+---------+14940 AATATGGATACTACCCTGATTTACCTTGGGAATATTTTAGCTGCGATTCTAAGAAAGCCG Y T Y D G T K W N P Y K I D A K I L S A
. . . . . . AGAAACATTTAACGGCATGACCTTCAACGGGGTTACATTTACCGGGTCTAAGTTCATTTC14941---------+---------+---------+---------+---------+---------+15000 TCTTTGTAAATTGCCGTACTGGAAGTTGCCCCAATGTAAATGGCCCAGATTCAAGTAAAG E T F N G M T F N G V T F T G S K F I S
. . . . . . TTCATTTAAAGGTGTCAAACCCGATGGCGTTGCTGACTATACCGTCCACGGGACAACCAC15001---------+---------+---------+---------+---------+---------+15060 AAGTAAATTTCCACAGTTTGGGCTACCGCAACGACTGATATGGCAGGTGCCCTGTTGGTG S F K G V K P D G V A D Y T V H G T T T
. . . . . . AATGGCCGATGGCAAGATCGTCACAGATACGTATTCGGATACTGACAACAGTCAGGTGAC15061---------+---------+---------+---------+---------+---------+15120 TTACCGGCTACCGTTCTAGCAGTGTCTATGCATAAGCCTATGACTGTTGTCAGTCCACTG M A D G K I V T D T Y S D T D N S Q V T
. . . . . . GCATACCGAACTCAGCCAATTTGGCTTGCTAAGTCAAATTTATAACAAAGGCACGCTGAT15121---------+---------+---------+---------+---------+---------+15180 CGTATGGCTTGAGTCGGTTAAACCGAACGATTCAGTTTAAATATTGTTTCCGTGCGACTA H T E L S Q F G L L S Q I Y N K G T L M
. . . . . . GGATAGTGCGCAACTATCGTTAGGTATGTTAACGCTAAGCGGCAACTATCAAACTGCCAG15181---------+---------+---------+---------+---------+---------+15240 CCTATCACGCGTTGATAGCAATCCATACAATTGCGATTCGCCGTTGATAGTTTGACGGTC D S A Q L S L G M L T L S G N Y Q T A S
Anexo II
. . . . . . TAACAAGCCGTTGGAGTGGATCACCAGCAGCTTAGATGCTTTAAGAGTCTTGCAATTAAC15241---------+---------+---------+---------+---------+---------+15300 ATTGTTCGGCAACCTCACCTAGTGGTCGTCGAATCTACGAAATTCTCAGAACGTTAATTG N K P L E W I T S S L D A L R V L Q L T
. . . . . . AAATAATAACTTGCTTGTTTGGCATGGCGCTTTCTATCCGCAATCTGGAGATACTGCAAC15301---------+---------+---------+---------+---------+---------+15360 TTTATTATTGAACGAACAAACCGTACCGCGAAAGATAGGCGTTAGACCTCTATGACGTTG N N N L L V W H G A F Y P Q S G D T A T
. . . . . . AATATCGACGCCACTTTCAAAGACTTTATCTGGATGGTTAATTGCATGGAGCTATTATCA15361---------+---------+---------+---------+---------+---------+15420 TTATAGCTGCGGTGAAAGTTTCTGAAATAGACCTACCAATTAACGTACCTCGATAATAGT I S T P L S K T L S G W L I A W S Y Y Q
. . . . . . AAACGGATCACCAACGTATAACAACTATGCGTTCACGCTGTTACCAAAGGCCGCTTTGAT15421---------+---------+---------+---------+---------+---------+15480 TTTGCCTAGTGGTTGCATATTGTTGATACGCAAGTGCGACAATGGTTTCCGGCGAAACTA N G S P T Y N N Y A F T L L P K A A L I
. . . . . . TTATAACACGACTGGTGCTAACTATTTAAGAGTGACCTTCACAATGAAGGATGTTGGAAC15481---------+---------+---------+---------+---------+---------+15540 AATATTGTGCTGACCACGATTGATAAATTCTCACTGGAAGTGTTACTTCCTACAACCTTG Y N T T G A N Y L R V T F T M K D V G T
. . . . . . CATCTTCAAAGTTCTGTGGTATGACGACACACATATTGTTGGCACGGCTGAGAACAATAC15541---------+---------+---------+---------+---------+---------+15600 GTAGAAGTTTCAAGACACCATACTGCTGTGTGTATAACAACCGTGCCGACTCTTGTTATG I F K V L W Y D D T H I V G T A E N N T
. . . . RBS . GGGCTCGTTATCAAAGGCGGTTATGACTGAGGTATACGCAGTTTAGGAGGCTGTTATGGA15601---------+---------+---------+---------+---------+---------+15660 CCCGAGCAATAGTTTCCGCCAATACTGACTCCATATGCGTCAAATCCTCCGACAATACCT G S L S K A V M T E V Y A V * orf107 è M E
. . . . . . AGCTGACAAAGTAAAAGCAATTTTTAACACTGATGAAGATGGCTATATCACTGGCTACCA15661---------+---------+---------+---------+---------+---------+15720 TCGACTGTTTCATTTTCGTTAAAAATTGTGACTACTTCTACCGATATAGTGACCGATGGT A D K V K A I F N T D E D G Y I T G Y Q
. . . . . . GCAGGAGTTTTGGGACGGCAGTCAGTGGCAAACGCCATTCGATGATGAGAAAGCCATTCT15721---------+---------+---------+---------+---------+---------+15780 CGTCCTCAAAACCCTGCCGTCAGTCACCGTTTGCGGTAAGCTACTACTCTTTCGGTAAGA Q E F W D G S Q W Q T P F D D E K A I L
. . . . . . GATTGCACCGGAAGAACTGAAAAAGATTGCCATTGGCGCCTCAAAGCTGGCTGATGACGG15781---------+---------+---------+---------+---------+---------+15840 CTAACGTGGCCTTCTTGACTTTTTCTAACGGTAACCGCGGAGTTTCGACCGACTACTGCC I A P E E L K K I A I G A S K L A D D G
Anexo II
. . . . . . TACTGTTGTAATAGATACCGATAAGCAAGCAGCGCTAGAAAAAGCGGCTAATCAAGTGAA15841---------+---------+---------+---------+---------+---------+15900 ATGACAACATTATCTATGGCTATTCGTTCGTCGCGATCTTTTTCGCCGATTAGTTCACTT T V V I D T D K Q A A L E K A A N Q V K
. . . . . . ACCGACCGGAGAACAGATGCTACTCGCAAATTTAACTCTCGAAGTAGCACAGCTGAAGGC15901---------+---------+---------+---------+---------+---------+15960 TGGCTGGCCTCTTGTCTACGATGAGCGTTTAAATTGAGAGCTTCATCGTGTCGACTTCCG P T G E Q M L L A N L T L E V A Q L K A
. . . . . . GGCGAAATCAAGTGACTAATTATGATCAGTGTGCACTACTTTACAGTTGGGGGATTGATT15961---------+---------+---------+---------+---------+---------+16020 CCGCTTTAGTTCACTGATTAATACTAGTCACACGTGATGAAATGTCAACCCCCTAACTAA A K S S D *
. . . . . RBS . TAACACCTTATGTACCGGTAATGATCACTCCAGATCAATACAAGCAAATTACAGGCAGTG16021---------+---------+---------+---------+---------+---------+16080 ATTGTGGAATACATGGCCATTACTAGTGAGGTCTAGTTATGTTCGTTTAATGTCCGTCAC
. . . . . . ACTATGTCGCCAGCAAAAGCTAGCGGCTATTTTTATGGAAGGAAGTATAAAGATGTGGAT16081---------+---------+---------+---------+---------+---------+16140 TGATACAGCGGTCGTTTTCGATCGCCGATAAAAATACCTTCCTTCATATTTCTACACCTA
orf116 è M S P A K A S G Y F Y G R K Y K D V D
. . . . . . TTCAAGAGTTGGATAGATATGTTTGTGGAGTTGGGTGGTGGAGCTTTGTTTGGTTGGTTT16141---------+---------+---------+---------+---------+---------+16200 AAGTTCTCAACCTATCTATACAAACACCTCAACCCACCACCTCGAAACAAACCAACCAAA F K S W I D M F V E L G G G A L F G W F
. . . . . . GCAAGCCAATGGCGCATGCATCGAAAGCATGGAAAGGCAATTGATTCAGGCCTTGTCGGT16201---------+---------+---------+---------+---------+---------+16260 CGTTCGGTTACCGCGTACGTAGCTTTCGTACCTTTCCGTTAACTAAGTCCGGAACAGCCA A S Q W R M H R K H G K A I D S G L V G
. . . . . . TTGCTTCATCATGAGGTTTACATGCTGTGTAACCATCATATCGAGGTGGGGTATATCAGC16261---------+---------+---------+---------+---------+---------+16320 AACGAAGTAGTACTCCAAATGTACGACACATTGGTAGTATAGCTCCACCCCATATAGTCG L L H H E V Y M L C N H H I E V G Y I S
. . . . . . ACGGACGACTTGGACGATCTTAATTACCTTTTCCGCAGCTACAAAGCACTGGGCGGTAAC16321---------+---------+---------+---------+---------+---------+16380 TGCCTGCTGAACCTGCTAGAATTAATGGAAAAGGCGTCGATGTTTCGTGACCCGCCATTG T D D L D D L N Y L F R S Y K A L G G N
. . . . . . GGAACGGGCGAAGCGCTATATAACAAAGTTTTGCAACTTCGGATTAAAAACTGAAAGGAA16381---------+---------+---------+---------+---------+---------+16440 CCTTGCCCGCTTCGCGATATATTGTTTCAAAACGTTGAAGCCTAATTTTTGACTTTCCTT G T G E A L Y N K V L Q L R I K N *
Anexo II
. . . . . . TGTTCAGTATGAAGATTAATTGGAAAGTACGAGTATTAAGCGTCAAATTCTGGCTGGCAT16441---------+---------+---------+---------+---------+---------+16500 ACAAGTCATACTTCTAATTAACCTTTCATGCTCATAATTCGCAGTTTAAGACCGACCGTA holina è M K I N W K V R V L S V K F W L A L
. . . . . . TAGTGCCGGCAGCTTTGTTGGTTGTACAAACAGCGGCAGCGGTTTTCGGTTACAACTGGG16501---------+---------+---------+---------+---------+---------+16560 ATCACGGCCGTCGAAACAACCAACATGTTTGTCGCCGTCGCCAAAAGCCAATGTTGACCC V P A A L L V V Q T A A A V F G Y N W D
. . . . . . ATTTTGCCAACTTGGGCAAGGAGCTCACCGCAGTGATCAATGCAGTATTTGCACTGTTGA16561---------+---------+---------+---------+---------+---------+16620 TAAAACGGTTGAACCCGTTCCTCGAGTGGCGTCACTAGTTACGTCATAAACGTGACAACT F A N L G K E L T A V I N A V F A L L T
. . . . . . CCATTGTGGGGGTTGCCGTTGACCCAACCACAGAGGGCGTCAGCGACAGCCAACAGGCGT16621---------+---------+---------+---------+---------+---------+16680 GGTAACACCCCCAACGGCAACTGGGTTGGTGTCTCCCGCAGTCGCTGTCGGTTGTCCGCA I V G V A V D P T T E G V S D S Q Q A L
. . . . . . TAGCTTACCCGGCACTCATTACCACCAAGGCAGCTAAGATCAAGTCCTTAGAGGACCAGA16681---------+---------+---------+---------+---------+---------+16740 ATCGAATGGGCCGTGAGTAATGGTGGTTCCGTCGATTCTAGTTCAGGAATCTCCTGGTCT A Y P A L I T T K A A K I K S L E D Q I
. . . . . . TTAAGGCACTGCAAGCAGATAAAGCGGCTGATCAGGCAACTTCTGCTGCTAGTGAAGTGG16741---------+---------+---------+---------+---------+---------+16800 AATTCCGTGACGTTCGTCTATTTCGCCGACTAGTCCGTTGAAGACGACGATCACTTCACC K A L Q A D K A A D Q A T S A A S E V V
. . . . . . TTCCAGAGACGTCTTCTGCAGCACCGGCGGAGTCAGCTCCGGAATCTGTTGCTCCAGTAG16801---------+---------+---------+---------+---------+---------+16860 AAGGTCTCTGCAGAAGACGTCGTGGCCGCCTCAGTCGAGGCCTTAGACAACGAGGTCATC P E T S S A A P A E S A P E S V A P V A
. . . . EcoRI CTAGTGAGGAGGTAAAATAGTATGAGTTATACCATCAACAAAGAATTC16861---------+---------+---------+---------+--------16908 GATCACTCCTCCATTTTATCATACTCAATATGGTAGTTGTTTCTTAAG S E E V K * lisina è M S Y T I N K E F
Anexo II: Secuencia de nucleótidos de la región de morfogénesis del bacteriófago A2. Bajo lasecuencia de nucleótidos de cada gen se presenta la correspondiente traducción aaminoácidos. Se señalan los sitios de unión al ribosoma (RBS), el extremo amino – terminalen aquellas proteínas de las que fue posible obtenerlo (n), el motivo de cremallera de leucinas(n), las repeticiones (Gly – X – Y)n, y la posición de la lisina y asparragina que podrían estarimplicados en la formación de enlaces amida (é). Esta secuencia se encuentra depositada enla base de datos del EMBL con los números de acceso Y09454 y AJ251790.
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