de tesis para optar el grado acadÉmico de
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TECA D
E POSGRADO - U
NT
UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO
ESCUELA DE POSGRADO
UNIDAD DE POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
Eficiencia de la bioaumentación y bioestimulación en la
biodegradación de petróleo por bacterias nativas,
provincia de Talara, región Piura
TESIS
PARA OPTAR EL GRADO ACADÉMICO DE:
MAESTRA EN CIENCIAS
MENCIÓN:
GESTIÓN AMBIENTAL
Autora: Br. Baca Llontop, Katty Yesenia
Asesor: Dr. Gonzales Veintimilla, Federico
TRUJILLO - PERÚ
2019
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Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/
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JURADO EVALUADOR
_____________________________
Dr. Heber Robles Castillo
Presidente
_____________________________
Angelo Lujan Bulnes
Secretario
_____________________________
Federico Gonzales Veintimilla
Vocal / Miembro
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iii
DEDICATORIA
A mi esposo y compañero de vida Derson,
por su apoyo constante, por la paciencia,
motivación y gran soporte que me ha
brindado todo este tiempo, pero más que
nada, por su amor incondicional.
A mi hijo Derson Antonio, porque
es mi orgullo y mi principal motivo,
porque aun a su corta edad me ha
enseñado y me sigue enseñando
muchas cosas.
A mis padres Maritza y Antonio, por
haberme formado en la persona que soy,
por confiar en mí y brindarme su apoyo
para no rendirme en el trayecto de mi
formación personal y profesional.
A mi hermanas, Janira, Yuri y
Maryan, porque han estado a mi lado
siempre, y por incentivarme para
seguir adelante y alcanzar mis
objetivos.
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AGRADECIMIENTO
Gracias a Dios por la vida, porque su amor
y bondad no tiene fin, por iluminarme el
camino y darme sabiduría para permitir
cumplir esta meta en mi vida profesional.
A mi hijo Derson Antonio por ser
mi razón y ganas de seguir saliendo
adelante y por llenarme de amor y
alegría con solo mirarlo.
A mi esposo Derson por ser mi
complemento en la vida, por su amor y
comprensión y por incentivarme a culminar
esta tesis.
A mis padres Maritza y Antonio, por
ayudarme en todo momento de mi
formación académica; y a mis
hermanas, por estar presentes en cada
etapa importante en mi vida, y porque
en conjunto ustedes llenan mi vida de
orgullo.
A mi estimador asesor de Tesis, Dr.
Federico, por haber aceptado ser mi guía en
esta tesis, por su apoyo incondicional, su
confianza y disponibilidad que ha tenido en
todo momento.
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v
ÍNDICE
RESUMEN
ABSTRACT
I. INTRODUCCIÓN .............................................................................................................. 1
1.1. Realidad problemática ............................................................................................ 1
1.2. Antecedentes de la investigación ............................................................................ 3
1.3. Objetivos ................................................................................................................. 7
1.4. Hipótesis ................................................................................................................. 7
1.5. Justificación ............................................................................................................ 7
II. MARCO TEÓRICO ........................................................................................................... 8
2.1. Biodegradación del petróleo ................................................................................. 10
2.2. Biorremediación .................................................................................................... 13
2.3. Bioestimulación .................................................................................................... 15
2.4. Bioaumentación .................................................................................................... 17
2.5. Consorcio microbiano ........................................................................................... 18
III. MATERIAL Y MÉTODO ............................................................................................... 19
3.1. Material de estudio ................................................................................................ 19
3.1.1. Material biológico ................................................................................................. 19
3.2. Métodos y Técnicas .............................................................................................. 19
3.2.1. Población y muestra de estudio ........................................................................... 19
3.2.2. Variables en estudio .............................................................................................. 19
3.2.3. Tipo de estudio y diseño de contrastación de hipótesis .................................... 19
3.2.4. Reactivación de cultivos de bacterias hidrocarbonoclásticas ........................... 22
3.2.5. Primera fase: Cuantificación del tiempo de utilización del petróleo y número
de unidades de actividad emulsificante (UAE mL-1) ........................................................ 22
3.2.6. Segunda fase: Eficiencia de la bioaumentación y bioestimulación en la
biodegradación de petróleo .................................................................................................. 25
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a. Lugar de recolección del suelo experimental contaminado ............................. 25
b. Obtención del suelo experimental contaminado ................................................ 25
c. Caracterización del suelo experimental contaminado ....................................... 27
d. Acondicionamiento de suelo experimental contaminado en terrarios ............ 33
e. Propagación de bacterias para la bioaumentación ............................................. 33
f. Eficiencia de la bioaumentación y bioestimulación .......................................... 35
g. Análisis estadístico de los datos .......................................................................... 37
IV. RESULTADOS................................................................................................................. 38
4.1. Tiempo de utilización del petróleo y número de unidades de actividad
emulsificante .................................................................................................................... 38
4.2. Características químicas, microbiológicas y toxicidad del suelo experimental
contaminado con petróleo ................................................................................................ 38
4.3. Eficiencia de la bioaumentación y bioestimulación en la biodegradación de
petróleo ............................................................................................................................ 41
V. DISCUSIÓN...................................................................................................................... 49
VI. CONCLUSIONES ............................................................................................................ 55
VII. RECOMENDACIONES .................................................................................................. 56
VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................... 57
IX. ANEXOS ........................................................................................................................... 66
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Índice de tablas
Tabla 1. Tiempo requerido para la utilización del petróleo como fuente de carbono y
energía por los cultivos de trabajo .................................................................... 39
Tabla 2. Unidades de actividad emulsificante alcanzadas por los cultivos de trabajo ... 40
Tabla 3. Contenido de hidrocarburos totales y número más probable de
microorganismos totales e hidrocarbonoclásticos en el suelo experimental
contaminado con petróleo ................................................................................. 40
Tabla 4. Nivel de toxicidad del suelo experimental contaminado con petróleo
determinado en la germinación de Raphanus sativus L., 2018......................... 41
Tabla 5. Número más probable de microorganismos totales (NMP g-1) durante la
biodegradación de petróleo en terrarios ............................................................ 43
Tabla 6. Número más probable de microorganismos hidrocarbonoclásticos (NMP g-1)
durante la biodegradación de petróleo en terrarios ........................................... 44
Tabla 7. Índice de germinación de Raphanus sativus L. durante la biodegradación de
petróleo en terrarios .......................................................................................... 45
Tabla 8. Nivel de toxicidad en el índice de germinación de Raphanus sativus L. durante
la biodegradación de petróleo en terrarios ........................................................ 46
Tabla 9. Características del suelo biodegradado con bioaumentación consorcio mixto +
bioestimulación durante 120 días ..................................................................... 48
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Índice de figuras
Figura 1. Vía principal en el metabolismo microbiano de los hidrocarburos aromáticos
policíclicos ........................................................................................................ 12
Figura 2. Diseño experimental completamente aleatorio para determinar la eficiencia de
la bioaumentación y bioestimulación en la biodegradación de petróleo en
suelos contaminados ......................................................................................... 21
Figura 3. Colonias características de las bacterias hidrocarbonoclásticas ....................... 23
Figura 4. Caldo Bushnell Haas - 1% de petróleo (50 µL) con indicador púrpura de
bromocresol ...................................................................................................... 23
Figura 5. Caldo extracto de levadura para la cuantificación del número de unidades
emulsificantes .................................................................................................. 24
Figura 6. Vista satelital del lugar de muestreo en el distrito de Puerto Eten, región
Lambayeque ...................................................................................................... 26
Figura 7. Muestra lista para la técnica de “cuarteo y amontonamiento” ......................... 28
Figura 8. Suspensión del suelo experimental contaminado ............................................. 28
Figura 9. Dilución de la submuestra de suelo experimental contaminado ....................... 29
Figura 10. Caldo nutritivo con microorganismos totales ................................................... 31
Figura 11. Caldo Bushnell con microorganismos hidrocarbonoclásticos .......................... 31
Figura 12. Prueba de germinación de semillas de Raphanus sativus L. ............................ 32
Figura 13. Semillas de rabanito en Placa conteniendo suelo humedecido .......................... 32
Figura 14. Medición de las radículas emergidas ................................................................ 34
Figura 15. Suelo contaminado distribuido en terrarios ...................................................... 34
Figura 16. Determinación del tiempo de utilización del petróleo (a) testigo (b) caldo
inoculado........................................................................................................... 39
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RESUMEN
El objetivo de la investigación fue determinar la eficiencia de la bioaumentación y
bioestimulación en la biodegradación de petróleo por bacterias nativas de la provincia de
Talara, región Piura. En la fase descriptiva, se cuantificó el tiempo de utilización del
petróleo y el número de unidades de actividad emulsificante (UAE) de cinco cultivos de
bacterias hidrocarbonoclásticas. En la fase explicativa, se determinaron las características
químicas, microbiológicas y toxicidad del suelo experimental, así como la eficiencia de la
bioaumentación y bioestimulación en la biodegradación de petróleo. Se determinó que las
bacterias hidrocarbonoclásticas utilizaron el petróleo en un tiempo de 60 y 80 horas, y la
cuantificación de UAE estuvo en un rango de 0,716 - 1,569 UAE mL-1. El suelo
experimental presentó un contenido de hidrocarburos totales (38 899 mg kg-1),
microorganismos totales (2,4x106 NMP g-1) e hidrocarbonoclásticos (1,5x105 NMP g-1) y
nivel de toxicidad severo según el índice de germinación del rabanito. La máxima
población de microorganismos totales e hidrocarbonoclásticos se alcanzó a los 60 y 90
días, respectivamente. Los índices de germinación incrementaron y los niveles de toxicidad
disminuyeron. Con el tratamiento bioaumentación consorcio mixto + bioestimulación se
alcanzó un nivel bajo de toxicidad a los 90 días y 78% de eficiencia en la biodegradación
de petróleo. Se demostró la eficiencia de la biodegradación de petróleo por bioaumentación
con un consorcio mixto más bioestimulación.
_________________________________________________________________
Palabras clave: Bioaumentación, bioestimulación, bacterias hidrocarbonoclásticas,
hidrocarburos.
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ABSTRACT
The objective of the research was to determine the efficiency of bioaugmentation and
biostimulation in the biodegradation of petroleum by bacteria native to the province of
Talara, Piura region. In the descriptive phase, the time of use of the petroleum and the
number of emulsifying activity units (EAU) of five cultures of hydrocarbonoclastic
bacteria were quantified. In the explanatory phase, the chemical, microbiological and
toxicity characteristics of the experimental soil were determined, as well as the efficiency
of the bioaugmentation and biostimulation in the petroleum biodegradation. It was
determined that the hydrocarbonoclastic bacteria used the oil in a time of 60 and 80 hours,
and the quantification of EAU was in a range of 0,716 – 1,569 EAU mL-1. The
experimental soil presented a total hydrocarbon content (38899 mg kg-1), total
microorganisms (2,4x106 NMP g-1) and hydrocarbonoclastic microorganisms (1,5x105
NMP g-1) and severe toxicity level according to the germination index of the radish. The
maximum population of total microorganisms and hydrocarbonoclastic was reached at 60
and 90 days, respectively. Germination rates increased and toxicity levels decreased. With
the bioaugmentation mixed consortium bioassay + biostimulation treatment, a low level of
toxicity was reached at 90 days and 78% efficiency in petroleum biodegradation. The
efficiency of the biodegradation of oil by bioaugmentation was demonstrated with a mixed
consortium plus biostimulation.
___________________________________________________________________
Key words: Bioaugmentation, biostimulation, hydrocarbonoclastic bacteria, hydrocarbons.
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I. INTRODUCCIÓN
1.1. Realidad problemática
Los hidrocarburos de petróleo (PH) son considerados como la principal fuente de
energía y materiales para la mayoría de industrias (Varjani & Upasani, 2016); los
contaminantes producto de la extracción e industrialización de estos combustibles fósiles
son compuestos recalcitrantes, los cuales son clasificados como prioritarios por la Agencia
para Sustancias Tóxicas y Registro de Enfermedades (ATSDR, 2011). Uno de los problemas
ambientales más importantes es la contaminación de ecosistemas terrestres y acuáticos por
derrames de hidrocarburos de petróleo y sus derivados. En el caso de los suelos, las
principales consecuencias ambientales son: la reducción o inhibición del desarrollo de la
cobertura vegetal en el lugar del derrame, cambios en la dinámica poblacional de la fauna,
de la biota microbiana y contaminación por infiltración a cuerpos de agua subterráneos.
Además del impacto ambiental negativo, los derrames de hidrocarburos generan impactos de
tipo económico, social y de salud pública en las zonas aledañas al lugar afectado (Díaz,
Alarcón, Ferrera, Almaraz y García, 2013; Pardo, Perdomo y Benavides, 2004).
Actualmente se hace uso de técnicas físico-químicas para la recuperación de áreas
contaminadas, tales como la extracción de hidrocarburos por vacío, lavado del suelo
contaminado con agua, incineración y recuperación electrocinética. Con algunas de estas
técnicas se han conseguido efectos positivos, pero su elevado costo económico constituye un
obstáculo para su empleo. Por ello, se ha optado por la búsqueda de alternativas viables que
sean ambientalmente correctas, simples y económicas para la eliminación de los
hidrocarburos contaminantes de los suelos. En este contexto, las técnicas de biorremediación
son una alternativa saludable frente al deterioro progresivo de la calidad del ambiente por el
derramamiento de crudos.
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La biorremediación consiste en el uso de plantas y microorganismos naturales o
modificados genéticamente para neutralizar sustancias tóxicas, disminuyendo o eliminando
su toxicidad para la salud humana y el ambiente. La biorremediación con microorganismos
es una tecnología muy competitiva, que permite reducir al mínimo los contaminantes,
recuperando en parte el suelo impactado, sin riesgos colaterales en la estabilidad de los
ecosistemas (Chávez, 2010). Los procesos de biorremediación pueden ser divididos
básicamente en tres clases. Primero, en atenuación natural, donde la concentración de
contaminantes es reducida por los microorganismos nativos del suelo. Segundo, la
bioestimulación, donde se adicionan nutrientes y un aceptor de electrones al sistema para
mejorar su efectividad y acelerar la biodegradación. Finalmente, la bioaumentación, en
donde se inocula el sistema con uno o varios microorganismos apropiados
La bioestimulación combinada con la bioaumentación es una estrategia para acelerar
el proceso de biorremediación y por ende la biodegradación de los contaminantes. La
aplicación de microorganismos nativos puede beneficiarse de la bioestimulación por la
adición de fuentes de energía y/o aceptores de electrones. El proceso convencional de la
biorremediación asume que el suelo contaminado contiene las especies de bacterias
necesarias para la degradación; sin embargo, la proliferación y la actividad puede ser
afectada por la población muy baja o por condiciones inadecuadas, como la elevada
concentración de metales.
En el distrito de Puerto Eten, región Lambayeque existen grandes áreas de suelo
contaminadas con hidrocarburos de petróleo; sin embargo, no se cuenta con estudios previos
de biorremediación sobre esta zona. La presente investigación permitirá evaluar la eficiencia
de la bioaumentación y bioestimulación en la biodegradación del petróleo por cepas
bacterianas con potencial hidrocarbonoclástico, aisladas y seleccionadas de suelos
contaminados con hidrocarburos de la provincia de Talara, región Piura. Por lo expuesto, se
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planteó el siguiente problema: ¿Cuál es la eficiencia de la bioaumentación y bioestimulación
en la biodegradación de petróleo por bacterias nativas de la provincia de Talara, región
Piura?
1.2. Antecedentes de la investigación
Para determinar la eficiencia de biorremediación de suelos contaminados con
petróleo se realizó un estudio con bacterias nativas. Las muestras de suelo a biorremediar
fueron enriquecidas en caldo Bushnell Haas y las bacterias se aislaron en agar nutritivo,
King B y Mac Conkey, obteniendo 104 aislados de los que 92,31% fueron Gram negativos,
necesitaron 2 – 10 días para utilizar el petróleo como fuente de carbono y energía y
alcanzaron 0,010 – 0,924 unidades de actividad emulsificante. Para la biorremediación del
suelo contaminado (23 570 mg/kg TPH), se aplicó bioestimulación y bioaumentación, para
lo cual diez bacterias nativas seleccionadas se incrementaron e inocularon (10%)
independientemente y en consorcios en terrarios con 4 kg de suelo, se aplicó nitrógeno y
fósforo en la proporción C:N:P de 100:10:1. Durante 90 días el pH fue de 7,3 – 8,3; con
1,2x103 – 1,7x107 UFC/ml de bacterias heterótrofas y 1x103 – 9 x 103 NMP/ml de bacterias
hidrocarbonoclásticas. Se obtuvo 45,3% en la eficiencia de la biorremediación frente a los
testigos con N-P y absoluto con 39,6 y 22,7%, respectivamente (Llanos, 2012).
Se evaluó el efecto de la bioaumentación y bioestimulación en sedimentos
contaminados con hidrocarburos de la Estación de Servicio de Combustible INTEGRA de
Dosquebradas, Risaralda, Colombia. Para esta investigación se utilizaron ocho mesocosmos,
compuestos por canastas de polietileno de alta densidad (57x37x15 cm), estos estaban
conformados, primero, solo los sedimentos contaminados de la Estación de Servicio,
segundo se tomaron sedimentos contaminados y se les adicionó urea como nutriente, tercero
se tomaron 40% de suelos con microorganismos adaptados, más 60% de sedimentos
contaminados y cuarto se tomó nuevamente 40% de suelos con microorganismos adaptados,
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más 60% de sedimentos contaminados y se le adicionó urea como nutriente, a cada
mesocosmo se les realizó una réplica. Se realizaron mediciones a lo largo de los
experimentos una vez al mes, con una duración total de 23 semanas. Concluyendo que los
mesocosmos presentaron tasas de degradación entre el 87,32 mg de Hidrocarburos totales de
petróleo (HTP)/kg de suelo seco y 105,41 mg de HTP/kg de suelo seco, con porcentajes de
reducción de contenido de hidrocarburo entre 79,7% y 95,1%; donde las dos estrategias de
biorremediación, la bioestimulación y bioaumentación, no presentaron diferencias
estadísticamente significativas (Ñustez, 2012).
Los factores que favorecen el rendimiento de la biorremediación de los
Hidrocarburos Totales de Petróleo (HTP) en suelo contaminado con petróleo crudo se
investigaron en condiciones de laboratorio y observaciones de campo. Para la
bioaumentación se utilizado consorcios microbianos locales (MC1, MC2 y MC3) y en la
bioestimulación, nutrientes en una relación CNPK de 100:10:1:3 y aire mejorado con
compuesto liberador de oxígeno (ORCTM). La investigación de laboratorio se realizó en
microcosmos con dos diseños experimentales, en tanques de vidrio y suelo dispuesto en
columnas de PVC, mientras que la prueba de campo se realizó en parcelas de prueba. En el
experimento de microcosmos en tanques de vidrio, la combinación de bioaumentación (10%
de inóculo MC3) y bioestimulación produjo la mayor degradación (79%) de HTP. En los
microcosmos en columnas, la degradación de HTP en el suelo superior fue mayor con la
combinación de bioaumentación y bioestimulación, mientras que en el suelo inferior, la
degradación fue mayor con bioaumentación, bioestimulación y aire mejorado. En la prueba
de campo, se cuantificó el 97% de degradación de HTP en el suelo bioaumentado con el
consorcio MC2. El estudio de análisis cinético indicó que el mejor método de tratamiento es
la combinación de bioaumentación con el consorcio MC3 (Acinetobacter sp. y
Pseudomonas sp.) y bioestimulación (Suja et al., 2014).
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Una investigación a nivel de laboratorio se realizó para determinar el efecto de la
bioaumentación y la bioestimulación en la eficiencia de biorremediación de un suelo
contaminado con hidrocarburos de petróleo crudo liviano. La muestra de suelo (HTP
21 200 – 22 900 mg kg-1), presentaron una población de microorganismos totales de 4,6x106
– 1,1x107 NMP g-1, hidrocarbonoclásticos de 1,5x104 – 4,3x104 NMP g-1 y un nivel de
toxicidad severo en el índice de germinación de Raphanus sativus L. “rabanito”. Para el
aislamiento de las bacterias se usó agar Plate Count y MacConckey, seleccionando aquellos
que utilizaron el petróleo en 40 horas y los que alcanzaron 1,254 – 2,007 UAE mL-1. Se
identificaron Acinetobacter, Bacillus, Enterobacter y Pseudomonas. La bioaumentación y
bioestimulación con úrea y fosfato diamónico (relación C:N:P de 100:10:1) incrementaron la
población microbiana y disminuyeron la toxicidad de los contaminantes. Con el tratamiento
de bioaumentación + bioestimulación se alcanzó 75% de eficiencia de biorremediación,
demostrándose que la reintroducción de microorganismos tiene mayor efectividad en la
biorremediación con la aplicación de fertilizantes inorgánicos (Cabanillas y Pissani, 2015).
En experimentos de microcosmos se evaluó el potencial de biotransformación de
residuos de hidrocarburos en suelo de dos refinerías de petróleo (suelo A y B). El suelo A
había sido sometido previamente a biorremediación in situ y el suelo B no había sido
sometido a ningún tratamiento. Se aplicó bioaumentación con bacterias
hidrocarbonoclásticas, bioestimulación con nutrientes en forma de nitrato de amonio y
ortofosfato de potasio para obtener una proporción 100:10:1 de C:N:P y la molienda del
suelo. La concentración de hidrocarburos se determinó durante 112 días. Los microcosmos
tratados con bioestimulación (BS) y bioestimulación / bioaumentación (BS+BA) mostraron
las reducciones más significativas en las fracciones de hidrocarburos alifáticos y aromáticos.
Se demostró que la molienda del suelo reduce la efectividad de un tratamiento con nutrientes
en 25% y 20% para las fracciones de alifáticos y aromáticos, respectivamente; esto
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probablemente se deba a la alteración de la comunidad microbiana autóctona en el suelo.
Los ensayos ecotoxicológicos con semillas de Brassica alba “mostaza” y ensayos de
Microtox, mostraron que la reducción de la concentración de HTP no fue directamente
proporcional a la reducción de la toxicidad. El monitoreo de la HTP por sí solo no es
suficiente para evaluar el riesgo ambiental de un sitio contaminado después de la
remediación (Jiang et al., 2016).
Un estudio de microcosmos se realizó para determinar el impacto de la
bioaumentación con Acinetobacter SZ-1 cepa KF453955 y la bioestimulación en la
eficiencia de degradación de HTP y la dinámica de la comunidad microbiana durante la
biorremediación de un suelo contaminado con petróleo; se usaron nutrientes en forma de
(NH4)2SO4 y KH2PO4 para obtener la proporción C:N:P de 100:10:1. Los suelos (HTP 44
600 mg kg-1) se incubaron sin agitación a temperatura ambiente durante 10 semanas y se
determinó la eficiencia de degradación de HTP, actividad de catalasa, población de bacterias
hidrocarbonoclásticos y diversidad de la comunidad bacteriana. La bioestimulación y
bioaumentación promovieron 60% y 34% de degradación, respectivamente, después de seis
semanas de incubación. La actividad de la catalasa y las poblaciones de
hidrocarbonoclásticos fueron mayores con la bioestimulación, la diversidad bacteriana no
aumentó para el tratamiento con bioestimulación. Las poblaciones de hidrocarbonoclásticos
se relacionaron positivamente con la eficiencia de la degradación de HTP (Wu et al., 2016).
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1.3. Objetivos
El objetivo general fue determinar la eficiencia de la bioaumentación y
bioestimulación en la biodegradación de petróleo por bacterias nativas de la provincia de
Talara, región Piura.
Los objetivos específicos fueron: Cuantificar el tiempo de utilización del petróleo y
número de unidades de actividad emulsificante de los cultivos hidrocarbonoclásticos,
determinar las características químicas, microbiológicas y toxicidad del suelo experimental,
determinar el efecto de la bioaumentación y bioestimulación en la población microbiana,
toxicidad de los contaminantes y concentración de hidrocarburos totales de petróleo, HTP.
1.4. Hipótesis
La hipótesis planteada fue: La eficiencia de la bioaumentación y bioestimulación en
la biodegradación de petróleo por bacterias nativas de la provincia de Talara es mayor al
50%.
1.5. Justificación
La eficacia y efectividad de la biodegradación de petróleo se incrementa con la
investigación y selección de microorganismos autóctonos que puedan ser incrementados y
reintroducidos en ambientes contaminados. La capacidad catabólica de estas bacterias para
crecer bajo las condiciones fisicoquímicas y de estrés a las que están sometidas, supera los
problemas de toxicidad por metales, sales o condiciones inadecuadas, que afectan
negativamente la actividad degradadora de microorganismos foráneos.
Desde el punto de vista económico, la utilización de microorganismos para la
biorremediación de suelos contaminados con petróleo es una técnica de bajos costos de
operación, no implica gastos de equipo, materiales, productos y maquinaria necesarios para
los tratamientos físicos y químicos y pueden aplicarse en el mismo sitio de la contaminación
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sin requerir el desplazamiento de los suelos contaminados. Estas características compensan
el tiempo que demanda la recuperación biológica del suelo.
En el contexto social, los lugares contaminados con petróleo en el distrito de Puerto
Eten tienen una diversidad biológica que no ha sido investigada, para la búsqueda de
bacterias degradadoras de petróleo, adaptadas a las condiciones ecológicas y por lo tanto,
eficaces eficientes. Se presenta una importante oportunidad para obtener bacterias que
posteriormente puedan formar parte de un paquete tecnológico propio, permitiendo la
disminución de la dependencia técnica – económica del país y el desarrollo de las
capacidades de la población peruana.
En el contexto ambiental, el suelo y las aguas subterráneas soportan el impacto
negativo de los derrames de hidrocarburos. La utilización de microorganismos para la
biorremediación es una tecnología muy competitiva, que permite reducir al mínimo los
contaminantes, recuperando el suelo afectado sin riesgos colaterales en la estabilidad de los
ecosistemas.
La investigación considera la tecnología de biorremediación con las estrategias de
bioestimulación y bioaumentación, que se pueden llevar a cabo dentro de cualquier área,
contribuyendo así a la disminución de los impactos negativos a los recursos naturales.
El crecimiento y manejo adecuado de los microorganismos autóctonos de los sitios con
derrames de petróleo permitirá su aplicación en las áreas impactadas; validando tecnologías
propias de biorremediación efectivas, para la recuperación de áreas contaminadas,
disminuyendo los riesgos para la salud de los humanos y seres vivos en general.
II. MARCO TEÓRICO
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Los contaminantes orgánicos pueden ser transformados de manera física, química y
biológica. El proceso de transformación más importante es el biológico o biodegradación
(Viñas, 2005). Algunos contaminantes solo son transformados parcialmente, condición que
implica la eliminación o reducción de su peligrosidad. Por esta razón, se consideran,
biotransformaciones primarias, parciales y totales. En la biodegradación primaria, un cambio
menor en una molécula es suficiente para eliminar su toxicidad, ejemplo: la deshalogenación
de los insecticidas clorados. En la degradación parcial se lleva a cabo una fragmentación del
contaminante, tal que la estructura original de la molécula aún se mantiene en los
fragmentos, ejemplo, la hidrólisis de la celulosa a glucosa. Por otra parte, en la
biodegradación completa, total o mineralización, un contaminante orgánico pasa a su estado
más oxidado o inorgánico (Carreño, Mendoza y Villanueva, 2009; Buendía, 2012).
La eficacia y efectividad de la biodegradación de petróleo se incrementa con la
investigación y selección de microorganismos autóctonos que puedan ser incrementados y
reintroducidos en ambiente contaminados. La capacidad catabólica de estas bacterias para
crecer bajo las condiciones fisicoquímicas y de estrés a las que están sometidas, supera los
problemas de toxicidad por metales, sales o condiciones inadecuadas, que afectan
negativamente la actividad degradadora de microorganismos foráneos.
La teoría de Infalibilidad Microbiana, sostiene que todo compuesto orgánico
biológicamente sintetizado puede ser descompuesto por los microorganismos (Alexander,
1994). En este contexto, la comunidad microbiana desempeña un papel importante en el
flujo de energía, transformación de nutrientes y reciclaje de elementos en el ambiente16 y los
contaminantes como el petróleo, pueden ser degradados por los entes biológicos hasta
dióxido de carbono y agua (Filip, 2002).
En un suelo con contaminación recurrente o con episodios previos de contaminación,
generalmente las poblaciones microbianas autóctonas se seleccionan en favor de la
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metabolización del contaminante. Por esta razón, la bioestimulación de la población
microbiana autóctona, puede acelerar el proceso de biodegradación de los contaminantes,
siempre y cuando, éstos no sean recalcitrantes, en cuyo caso se requiere la bioaumentación o
inoculación de microorganismos con capacidad degradativa especializada, propios del sitio
contaminado e incrementados en el laboratorio (Viñas, 2005; Ortega, 2012). La
bioinoculación es la incorporación de microorganismos comerciales en un lugar, para
biodegradar un contaminante. Este proceso es una técnica de biorremediación; no obstante,
la falta de adaptación de las poblaciones microbianas exógenas, no garantiza su
supervivencia, por lo que se prefiere la bioaumentación. Con esta técnica, los
microorganismos autóctonos son aislados, caracterizado e incrementados en laboratorio y
luego reintroducidos en los ambientes contaminados (Carreño et al., 2009; Ortega, 2012).
2.1. Biodegradación del petróleo
El crudo de petróleo es una mezcla de compuestos que se pueden separar en cuatro
fracciones SARA: saturados, aromáticos, resinas y asfáltenos (Pernía, Demey, Inojosa y
Naranjo; 2012). El petróleo, es biodegradado en aerobiosis con mayor eficiencia, pero
también en anaerobiosis. Los contaminantes, que pueden ser degradados o transformados
por los seres vivos son susceptibles de ser eliminados mediante procesos de biorremediación
cuyo fundamento está en la serie de reacciones de óxido-reducción que se producen en la
cadena respiratoria o transportadora de electrones de la célula. La cadena la inicia el
compuesto hidrocarbonado como donador de electrones, de modo que la actividad
metabólica de la célula lo consume y degrada. Los aceptores son el oxígeno, los nitratos,
hierro III, sulfatos y dióxido de carbono en procesos respiratorios y anaerobios,
respectivamente (Braibant, 2014; Ponce, 2014).
Los alcanos lineales son los hidrocarburos del petróleo más biodegradables debido a
la simplicidad de su estructura molecular, sin embargo, altas concentraciones de alcanos con
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5-10 carbonos inhiben la degradación de muchos hidrocarburos, porque como solventes
rompen la membrana lipídica de los microorganismos. A su vez, alcanos con 20-40 carbonos
tienen muy baja solubilidad en agua, lo cual interfiere en la biodegradación. En los alcanos
las monooxigenasas incorporan un átomo de oxígeno en el extremo terminal metilo y se
forma un hiperóxido. El NADPH2 dona sus electrones y reduce el átomo de oxígeno que
quedó libre, formándose agua más un alcohol primario, que posteriormente es oxidado hasta
acetaldehído, a su vez éste es oxidado hasta ácido graso, que finalmente es degradado por β-
oxidación sucesiva (Loya, 2012; Ramírez, 2014).
La degradación bacteriana de los hidrocarburos aromáticos (Figura 1) de forma
aeróbica se lleva a cabo mediante la oxidación o dihidroxilación del anillo aromático por parte
de mono o dioxigenasas para formar cis-dihidrodiol. Estos dihidrodioles son dehidrogenados,
formando intermediarios dihidroxilados precursores de la ruptura del anillo, la escisión puede
ocurrir intradiol u orto para originar ácido mucónico y extradiol o meta para formar el
derivado de hidroxi-muconaldehídico, estos derivados entraran al metabolismo centra,
degradandose hasta CO2 y agua. Por su parte, algunas bacterias pueden catalizar la
degradación de HAPs a trans-dihidrodioles, mediante la acción del enzima citocromo P450
monooxigenasa. Los sustitutos alifáticos de los compuestos aromáticos, posteriormente son
oxidados para formar ácidos grasos que son utilizados por los microorganismos en la síntesis
celular y producción de energía (Lladó, 2012; Loya, 2013).
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Figura 1. Vía principal en el metabolismo microbiano de los hidrocarburos aromáticos policíclicos (Lladó, 2012).
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2.2. Biorremediación
En el tratamiento biológico o biorremediación la actividad metabólica de plantas,
hongos, algas, bacterias naturales o modificadas genéticamente, en condiciones controladas,
degradan, transforman o remueven los contaminantes a productos inocuos (Arrieta, 2011;
Loya, 2013).
El fundamento bioquímico de la biorremediación está en la serie de reacciones de
óxido-reducción que se producen en la cadena respiratoria o transportadora de electrones de
la célula. La cadena lo inicia el sustrato orgánico o compuesto hidrocarbonado que actúa
como dador de electrones, de modo que la actividad metabólica de la célula consume y
degrada el compuesto hidrocarbonado. Los aceptares más comúnmente usados son el
oxígeno, pero también, los nitratos, hierro III, sulfatas y dióxido de carbono en procesos
respiratorios y anaerobios, respectivamente (Ponce, 2014).
Las técnicas de remediación más importantes son degradación natural,
biorremediación in situ y ex situ. En la biorremediación in situ se incluye la bioaumentación,
bioestimulación y bioventing. En la biorremediación ex situ se consideran landfarming,
biopilas y compostaje. En la degradación natural o atenuación, las fracciones volátiles se
evaporan con rapidez, quedando los componentes alifáticos y aromáticos de cadena más
larga, los cuales son oxidados por los microorganismos nativos del suelo hasta dióxido de
carbono. La bioaumentación consiste en la adición controlada de microorganismos de acción
dirigida, especialmente formulados y de ocurrencia natural para ayudar a los que se
encuentran naturalmente y promover la biodegradación. La bioestimulación es la activación
de los microorganismos autóctonos degradadores de hidrocarburos, mediante la adición de
nutrientes y aceptares de electrones al entorno contaminado, en función de las deficiencias.
Por su parte, en el bioventing o bioventeo se suministra aire al terreno, para promover la
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actividad de los microorganismos presentes y degradar los hidrocarburos (Cando, 2011;
Ñustez, 2012).
La técnica ex situ de landfarming es la más antigua y consiste en tratar el suelo
contaminado previamente excavado y trasladado en grandes superficies abiertas, protegido
en una base impermeable, donde se voltea y airea para favorecer la actividad de las bacterias
nativas. A su vez, con la técnica de biopilas o bioceldas se forman montones de dimensiones
variables con una mezcla de suelo contaminado y materia orgánica y se airean de forma
activa o pasiva. Por su parte, en el compostaje el suelo contaminado se mezcla con paja,
astillas de madera u otro agente que le proporcione porosidad, para permitir un mejor flujo
de aire y el material es degradado en aerobiosis bajo condiciones controladas de humedad y
temperatura (Cando, 2011; Loya, 2013).
La implementación de una tecnología de biorremediación requiere de etapas: i)
investigación del emplazamiento en relación con los contaminantes, el tipo de suelo y el
entorno, es decir caracterización físico-química del suelo, estudio geotécnico e
hidrogeológica y análisis de riesgos, ii) desarrollo de ensayos de tratabilidad a escala de
laboratorio, iii) desarrollo de ensayos a escala piloto e iv) implementación de la tecnología
de biorremediación seleccionada. Los ensayos de tratabilidad se definen como un conjunto
de experimentos a escala de laboratorio previos a la implementación de cualquier tecnología
de biorremediación. Su objetivo es determinar si un tratamiento es apropiado para la
descontaminación, requiriéndose caracterizar las poblaciones microbianas y la
biodegradabilidad de los contaminantes del suelo, así como también, se debe investigar la
influencia de los parámetros físico-químicos y biológicos que afectan la biodegradación
(Viñas, 2005).
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Los ensayos de tratabilidad o conjunto de experimentos a escala de laboratorio,
previos a la implementación de cualquier tecnología de biorremediación representan una
parte muy pequeña de los costos totales de recuperación de cualquier emplazamiento; sin
embargo, la información que proporcionan es fundamental para aumentar la posibilidad de
éxito. Primero se realiza una caracterización físico-química y microbiológica, se cuantifica
la población microbiana degradadora de los contaminantes y su proporción respecto a la
heterótrofa del suelo contaminado. Asimismo, se investiga si la población microbiana es
metabólicamente activa o es activable en condiciones de bioestimulación. Una vez
caracterizado el suelo, los contaminantes y la población microbiana, es necesario determinar
la biodegradabilidad mediante ensayos rápidos y en caso afirmativo investigar los factores
físicos-químicos y biológicos que afectan la biodegradación (Fase II) en ensayos de
microcosmos (Ponce, 2014).
En la fase I de los ensayos de tratabilidad se investiga la presencia de poblaciones
microbianas, la actividad metabólica real y potencial y la biodegradabilidad de los
contaminantes presentes en el suelo. En la fase II se optimizan las condiciones físico-
químicas (húmedas, aireación, nutrientes inorgánicos) y biológicas (posibilidad de inocular
poblaciones microbianas alóctonas) que pueden condicionar el proceso de biodegradación
durante la biorremediación de suelos contaminados. La información obtenida en la fase I
permite decidir en un corto intervalo si es factible la aplicación de la biorremediación. La
fase II permite establecer las condiciones óptimas de biorremediación en procesos aerobios
(Arrieta, 2011; Ponce, 2014).
2.3. Bioestimulación
Es una técnica de biorremediación in situ con la que se modifica el medio
contaminado, facilitando la proliferación y actividad de los microorganismos autóctonos a
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través de la adición de nutrientes, aceptores de electrones o surfactantes (Singh, Parmar,
Kuhad, & Ward, 2011). Nutrientes como el fósforo, nitrógeno, oxígeno y carbono, en la
mayoría de casos están disponibles en cantidades lo suficientemente bajas como para
restringir la actividad microbiana (Adams, Fufeyin, Okoro, & Ehinomen, 2015).
Se suministra oxígeno para estimular la actividad microbiana y mejorar las tasas de
biodegradación aeróbica cuando el O2 es considerado como un factor limitante. El
suministro de oxígeno puede ser por labranza o arado, aireación forzada y métodos
químicos; el primer método es efectivo cuando las zonas contaminadas son superficiales. La
aireación forzada es la inyección de agua rica en oxígeno u oxígeno puro, en una técnica útil
en suelos y cuerpos de agua subterráneos. Los métodos químicos implican la adición de
fuentes alternativas de oxígeno, como los compuestos liberadores de oxígeno ORC®, u otros
agentes como el permanganato de potasio, peróxido de hidrógeno y O3 (Zawierucha &
Malina, 2011).
La aplicación de fertilizantes orgánicos e inorgánicos favorece la degradación de
hidrocarburos de petróleo en los suelos contaminados mediante la mejora de la relación
C:N:P (Pardo et al., 2004; Sarkar, Ferguson, Datta & Birnbaum, 2005). Según Crawford &
Crawford (2005), se requiere aproximadamente 150 mg de nitrógeno y 30 mg de fósforo
para la conversión de 1 g de hidrocarburo en materiales celulares; en base a esto, la relación
molar óptima C:N:P recomendada para mejorar la remoción de hidrocarburos es de
100:10:1.
Un punto crítico en la biorremediación de suelos contaminados con petróleo es la
disponibilidad limitada de los contaminantes para los microorganismos debido a su
solubilidad en el agua (Menéndez et al., 2007). Los microorganismos con capacidad
hidrocarbonoclástica producen biosurfactantes, estos son tensioactivos que mejoran la
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solubilidad y disponibilidad del contaminante al reducir la tensión interfacial entre los
hidrocarburos y el agua del suelo, (Urum, Grigson, Pekdemir, & McMenamy, 2006). La
aplicación de surfactantes sintéticos es útil cuando los contaminantes son altamente
hidrofóbicos y/o se absorben firmemente en partículas de arcilla o materia orgánica del suelo
(Menéndez et al., 2007).
2.4. Bioaumentación
Consiste en la adición de microorganismos alóctonos o autóctonos, microorganismos
modificados genéticamente o consorcios bacterianos con capacidad de degradar
contaminantes orgánicos (Volke & Velasco, 2002; Castillo et al., 2005), con la finalidad de
incrementar la densidad poblacional y las enzimas adecuados para la degradación. Este
método es utilizado en suelos contaminados donde la población nativa se encuentra en un
número muy bajo o carecen de capacidad enzimática para degradar compuestos orgánicos
tóxicos (Gentry, Rensing, & Pepper, 2004).
La bioaumentación se puede realizar de tres maneras: (a) aislamiento y
enriquecimiento de microorganismos autóctonos para su posterior reinoculación;
(b) aislamiento, enriquecimiento e inoculación de microorganismos alóctonos; y (c)
aplicando microorganismos modificados genéticamente (Zawierucha & Malina, 2011). La
supervivencia y capacidad de degradación de los microorganismos introducidos en un sitio
contaminado dependen en gran medida de las condiciones ambientales (Vogel 1996).
Para la selección de un cultivo microbiano apropiado para la bioaumentación se debe
tener en cuenta características como: rápido crecimiento, facilidad de cultivo, resistencia a
altas concentraciones de contaminantes y capacidad de adaptación a las condiciones
ambientales (Mrozik & Piotrowska, 2009). Para llevar a cabo un óptimo proceso, se debe
evaluar las fracciones de los contaminantes disponibles para determinar la concentración del
inóculo que se aplicará (Zawierucha & Malina 2006).
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2.5. Consorcio microbiano
En los procesos de biodegradación un microorganismo puede descomponer un
número limitado de componentes del contaminante, por lo que es necesario encontrar
microorganismos que puedan degradar los componentes en su totalidad. La construcción de
consorcios microbianos es una alternativa viable para la eliminación de sustancias complejas
y mezclas de contaminantes. Los microorganismos que se utilizan en un proceso, pueden ser
obtenidos por aislamiento a partir de fuentes naturales o de una colección de cultivos
(García, 2012).
Los cultivos mixtos pueden ser consorcios definidos y consorcios no definidos. Los
primeros se caracterizan por ser una combinación de cepas aisladas con capacidades
degradativas conocidas complementarias entre sí. Algunas desventajas de estos consorcios
son el gran número de cepas distintas para conseguir una degradación extensa del crudo de
petróleo, debido a la cantidad de componentes presentes y al espectro metabólico limitado
de una cepa bacteriana (Leahy et al., 1990). Otra desventaja es la posible formación de
metabolitos intermediarios que sean tóxicos para las cepas que conforman el consorcio
(Kazunga et al., 2000).
Los consorcios no definidos se caracterizan por ser obtenidos a partir de procesos de
enriquecimiento de muestras ambientales con episodios previos y recurrentes de
contaminación. Como resultado la población microbiana se seleccionada de forma natural, la
cual potencialmente dispone de una mayor eficiencia en la degradación de compuestos
conocidos y desconocidos que un consorcio definido. Por lo tanto, es más probable que en
un consorcio no definido se hayan seleccionado degradadores de productos finales que se
acumulan como resultado de procesos cometabólicos (García, 2012).
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III. MATERIAL Y MÉTODOS
3.1. Material de estudio
3.1.1. Material biológico
Semillas de Raphanus sativus L. “rabanito” y 5 cultivos de bacterias degradadoras de
petróleo aisladas de suelo contaminado con hidrocarburos durante agosto de 2014,
caracterizadas in vitro como hidrocarbonoclásticas (Cabanillas y Pissani, 2015) y
proporcionadas por el laboratorio de Microbiología y Parasitología de la Facultad de Ciencia
Biológicas en la Universidad Pedro Ruiz Gallo.
3.2. Métodos y Técnicas
3.2.1. Población y muestra de estudio
En la investigación descriptiva la población estuvo constituida por el suelo
contaminado con hidrocarburos de petróleo en el distrito de Puerto Eten, región
Lambayeque y se investigó una muestra probabilística de suelo contaminado. En la
investigación explicativa la población universal fueron las bacterias hidrocarbonoclásticas,
la población muestreal fueron las bacterias hidrocarbonoclásticas aisladas del suelo
contaminado durante agosto 2014, en Talara, región Piura y la unidad muestreal fueron los
cinco cultivos de bacterias hidrocarbonoclásticas Y5, 97a, 14c, 60b y 23b, seleccionadas por
conveniencia.
3.2.2. Variables en estudio
a. Variable Independiente: Bioaumentación y bioestimulación
b. Variable dependiente: Eficiencia de biodegradación de petróleo
3.2.3. Tipo de estudio y diseño de contrastación de hipótesis
La investigación se realizó en dos fases. En la primera fase descriptiva, se cuantificó
el tiempo de utilización del petróleo y el número de unidades de actividad emulsificante
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(UAE) de los 5 cultivos de bacterias hidrocarbonoclásticas. En la segunda fase explicativa,
se determinaron las características químicas, microbiológicas y toxicidad del suelo
experimental, y se realizó un ensayo en condiciones de invernadero para determinar la
eficiencia de la bioaumentación y bioestimulación en la biodegradación de petróleo.
La hipótesis en la primera fase se contrastó con el diseño de una sola casilla
(Vásquez, Díaz, Vásquez y Vásquez; 2012) de Goode y Hatt (1986) y en la segunda fase con
el diseño experimental completamente aleatorio, DCA (Hernández, Fernández y Baptista,
2014). Los tratamientos fueron 15 (Figura 2), correspondientes a T1: Bioaumentación cultivo
bacteriano Y5, T2: Bioaumentación cultivo bacteriano 97a, T3: Bioaumentación cultivo
bacteriano 14c, T4: Bioaumentación cultivo bacteriano 60b, T5: Bioaumentación cultivo
bacteriano 23b, T6: Bioaumentación consorcio mixto, T7: Bioaumentación cultivo bacteriano
Y5 + Bioestimulación, T8: Bioaumentación cultivo bacteriano 97a + Bioestimulación, T9:
Bioaumentación cultivo bacteriano 14c + Bioestimulación, T10: Bioaumentación cultivo
bacteriano 60b + Bioestimulación, T11: Bioaumentación cultivo bacteriano 23b +
Bioestimulación, T12: Bioaumentación consorcio mixto + Bioestimulación, T13: Testigo sin
bioaumentación, sin bioestimulación, T14: Testigo con bioestimulación, T15: Testigo
abiótico.
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Figura 2. Diseño experimental completamente aleatorio para determinar la eficiencia de la
bioaumentación y bioestimulación en la biodegradación de petróleo en suelos
contaminados.
T1 T1 T1 T1 T1 T2 T3
T2 T3 T4
T3 T4 T5
T4 T5 T6
T5 T6 T7
T6 T7 T8
T7 T8 T9
T8 T9 T10
T9 T10 T11
T10 T11 T12
T11 T12 T13
T12 T13 T14
T13 T14 T15
T14 T15 T1
T15 T1 T2
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3.2.4. Reactivación de cultivos de bacterias hidrocarbonoclásticas
Las bacterias fueron cultivadas en tubos 13 x 100 mm conteniendo caldo nutritivo a
30ºC, con agitación constante, durante 24 horas. A continuación, se sembraron mediante la
técnica de agotamiento y estría en agar Bushnell Haas (Anexo 1) suplementado con petróleo
comercial 1%, incubando a 30ºC. Se seleccionaron cinco colonias características (Figura 3)
y se cultivaron en viales con agar Bushnell Haas - 1% de petróleo durante 24 horas,
constituyendo las bacterias reactivadas o cultivos de trabajo.
3.2.5. Primera fase: Cuantificación del tiempo de utilización del petróleo y número de
unidades de actividad emulsificante (UAE mL-1)
Las bacterias cultivadas en agar Bushnell Haas se inocularon por triplicado en 5 mL
de caldo Bushnell Haas - 1% de petróleo (50 µL) con indicador purpura de bromocresol
(Figura 4), incluyendo tres tubos con caldo no inoculado (Testigo). La incubación se realizó
a 30°C, con agitación manual diaria por 10 minutos, registrando los días requeridos para la
observación del viraje del indicador, interpretándose como positivo el cambio de color de
lila a amarillo, indicando la utilización del petróleo como fuente de carbono y energía.
Para la determinación del número de unidades de actividad emulsificante (Escalante,
2002), los cultivo en agar Bushnell Haas con petróleo, fueron inoculados por triplicado en
5 mL de caldo extracto de levadura (Figura 5, Anexo 1) y se agregó 2% (0,1 mL) de etanol,
incluyéndose tres tubos con caldo de cultivo no inoculado como testigo. La incubación se
realizó a 30 °C, durante 96 horas, con agitación manual diaria durante 10 minutos.
Posteriormente, los caldos se centrifugaron a 3500 rpm, durante 5 minutos, se tomaron 2 mL
de cada sobrenadante y se depositaron en tubos de ensayo de 16x100 mm, donde se agregó
2,2% (44 µL) de petróleo crudo. Los tubos se taparon herméticamente, se agitaron
manualmente durante 5 minutos, hasta lograr una emulsión.
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Figura 3. Colonias características de bacterias hidrocarbonoclásticas
Figura 4. Caldo Bushnell Haas - 1% de petróleo (50 µL) con indicador púrpura de
bromocresol.
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Figura 5. Caldo extracto de levadura para la cuantificación del número de UAE.
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25
Se realizó la lectura de la absorbancia en espectrofotómetro digital de luz visible,
GREETMED, a 540 nm. Los valores se corrigieron con el testigo caldo extracto de
levadura-etanol y se realizó la conversión (Escalante, 2002) de la absorbancia de cada
muestra a unidades de actividad emulsificante por mililitro, considerando 0,826 de
absorbancia como 1 unidad de actividad emulsificante por mililitro, UAE mL-1.
3.2.6. Segunda fase: Eficiencia de la bioaumentación y bioestimulación en la
biodegradación de petróleo
En terrarios conteniendo suelo experimental contaminado con petróleo, se aplicaron
las tecnologías de bioaumentación y bioestimulación, y se determinó la eficiencia de la
biorremediación.
a. Lugar de recolección del suelo experimental contaminado
En la periferia del terminal de ventas petrolera Eten, carretera Playa Lobos Km. 5, en
el distrito de Puerto Eten (Figura 6), región Lambayeque, se colectó el suelo experimental
contaminado con hidrocarburos de petróleo. Puerto Eten está comprendido entre los
paralelos 6° 56’ 30” latitud sur y 82° 1’ 24” longitud oeste. Según el Instituto Nacional de
Defensa Civil (INDECI, 2003), la zona presenta un clima desértico subtropical, con una
temperatura media de 21°C.
b. Obtención del suelo experimental contaminado
El suelo contaminado con petróleo fue colectado con una palana a 10 cm de
profundidad, depositándolo en un saco de polietileno densa (MINAM, 2014) debidamente
etiquetado, inmediatamente se transportó hacia el laboratorio de Microbiología y
Parasitología, sección Biotecnología Microbiana de la Facultad de Ciencias Biológicas,
Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo, en Lambayeque.
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26
Figura 6. Vista satelital del lugar de muestreo en el distrito de Puerto Eten, región
Lambayeque (https://www.google.com.pe/maps/@-6.9545445,-79.853050430
0a,35y,90h,39.45t/data=!3m1!1e3).
Lugar de muestreo
(627023.14 m E – 9231150.38 m S)
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c. Caracterización del suelo experimental contaminado
En el laboratorio se tomaron tres muestras de 1 kg, con las que se realizó el análisis
químico, microbiológico y determinación de la toxicidad de los contaminantes del suelo. La
obtención de las muestras se realizó según el método de “cuarteo y amontonamiento”
(Figura 7); el suelo experimental se extendió sobre una superficie impermeable, para separar
las piedras y disgregar las partículas gruesas. Con ayuda de una palana, la masa del suelo del
extremo inferior derecho se mezcló cinco veces con el superior izquierdo, el inferior
izquierdo con el superior derecho, el superior con el inferior y el derecho con el izquierdo.
Después de la mezcla se formó un “montón” con el suelo y se tomaron las muestras
requeridas.
El análisis químico del suelo contaminado se realizó en una muestra de 1 Kg,
determinándose la cantidad de hidrocarburos totales (HTP) mediante cromatografía de gases
acoplada a espectrometría de masas (GC-MS), utilizando un cromatógrafo de gases modelo
6890N (Net Work GC system) y un espectrómetro de masas modelo 5975 inert XL (Agilent
Tecnologies).
El análisis microbiológico se realizó por triplicado a partir de una submuestra de
10 g, con las que se determinó el número más probable (NMP g-1) de microorganismos
totales y degradadores de hidrocarburos o hidrocarbonoclásticos32. La submuestra se
depositó en un matraz con 90 mL de solución salina, NaCI 0,85% (p/v), obteniéndose una
suspensión de suelo, con la que se realizó diluciones decimales hasta 10-8 (Figuras 8, 9).
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Figura 7. Muestra lista para la técnica de “cuarteo y amontonamiento”
Figura 8. Suspensión del suelo experimental contaminado.
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Figura 9. Dilución de la submuestra de suelo experimental contaminado.
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Para determinar el número más probable de microorganismos totales, 1 mL de las
diluciones 10-6, 10-7 y 10-8 se inocularon por triplicado en tubos de 150x20 mm conteniendo
5 mL de caldo nutritivo (Figura 10). Para el número más probable de microorganismos
hidrocarbonoclásticos, 1 mL de las diluciones 10-5, 10-6 y 10-7 se inocularon por triplicado
en tubos con 5 mL de caldo Bushnell Haas e inmediatamente después en cada tubo se
vertieron 0,025 mL (25 µL) de petróleo (Figura 11) como fuente de carbono (Cabanillas y
Pissani; 2015). Todos los tubos se incubaron a 30°C por 10 días y la turbidez del medio de
cultivo se consideró positivo a la presencia de microorganismos totales e
hidrocarbonoclásticos, realizándose el cálculo correspondiente (Blodgett, 2010; Huapaya,
2011) según el método estándar (Anexo 2).
La toxicidad de los contaminantes del suelo (Salas y Meza; 2011) se determinó por
triplicado en submuestras de 10 g, utilizando semillas de rabanito, a las que previamente se
les determinó el porcentaje de germinación (Flores y Benites; 2015). En cuatro placas de
Petri con papel filtro esterilizado y humedecido con agua destilada se depositaron
25 semillas por placa, se taparon y mantuvieron a temperatura ambiental (28°C),
humedeciéndolas interdiariamente, hasta obtener el máximo de germinación (Figura 12),
que fue 100%, después de 120 horas.
Para el ensayo de toxicidad, en placas de Petri, se depositaron las submuestras de
10 g de suelo, se humedecieron con 12 mL de agua destilada y en cada placa, con una pinza
se depositaron 25 semillas de rabanito (Figura 13). Todas las placas de Petri se cubrieron
con papel metálico durante 120 horas, a 30°C, cada 48 horas se vertieron 5 mL de agua
destilada para mantener la humedad requerida. A las 120 horas se contaron las semillas
germinadas y se midió la longitud de las radículas emergidas (Figura 14), calculándose
(Llanos, 2012) el porcentaje relativo de germinación (PGR), crecimiento relativo de la
radícula (CRR) e índice de germinación (IG):
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Figura 10. Caldo nutritivo con microorganismos totales.
Figura 11. Caldo Bushnell con microorganismos hidrocarbonoclásticos.
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Figura 12. Prueba de germinación de semillas de Raphanus sativus L.
Figura 13. Semillas de rabanito en Placa conteniendo suelo humedecido.
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33
PGR = Número de semillas germinadas en el suelo contaminado
Número de semillas germinadas en el testigo x 100
CRR = Longitud promedio de radículas en el suelo contaminado
Longitud promedio de radículas en el testigo x 100
IG = PGR x CRR
100
La fitotoxicidad se determinó con el criterio de interpretación (Rodríguez; 2012):
IG ≥ 80% indica que no hay sustancias fitotóxicas o están en muy baja concentración, 80%
> IG > 50% se interpreta como presencia moderada de estas sustancias y un IG ≤ 50% indica
fuerte presencia de sustancias fitotóxicas, criterios correspondientes a niveles de
fitotoxicidad bajo, moderado y severo (Purisaca y Quevedo; 2015).
d. Acondicionamiento de suelo experimental contaminado en terrarios
El suelo experimental se homogenizó sobre una manta de polietileno, se tamizó a
través de una malla metálica de 15 mm de diámetro y se distribuyó en 45 bandejas de
polipropileno (Figura 14), a razón de 1,200 kg de suelo por terrario.
e. Propagación de bacterias para la bioaumentación
El inóculo de los cultivos de trabajo se obtuvo por el método de siembra a gran
escala (Llanos, 2012), trabajando con un inóculo madre, intermedio y definitivo. Las
bacterias se cultivaron en 3 mL de caldo nutritivo, a 30 °C, durante 24 horas.
Con los cultivos de bacterias, se obtuvo un paquete celular cuya concentración se
estandarizó con el tubo 3 del nefelómetro de Mc Farland, obteniendo una suspensión
bacteriana con 9,0x108 cel mL-1. La propagación se trabajó con 0,2mL de la suspensión
bacteriana estandarizada, la cual se inoculó en 1,8 mL de caldo Bushnell Haas con 5 % de
petróleo crudo, incubando a 30°C por 24 horas; estos constituyeron el inóculo madre. Este
fue inoculado en 18 mL de caldo Bushnell Haas con 5% de petróleo crudo, incubándose a
30°C por 24 horas para constituir el inóculo intermedio, el cual a su vez fue inoculado en
200 mL del mismo caldo, incubado en las mismas condiciones y constituyó el inóculo
definitivo en una cantidad de 220 mL.
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34
Figura 14. Medición de las radículas emergidas.
Figura 15. Suelo contaminado distribuido en terrarios.
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f. Eficiencia de la bioaumentación y bioestimulación
La eficiencia de la bioaumentación y bioestimulación en la biodegradación de
petróleo en suelos contaminados se investigó en un ensayo con 15 tratamientos. Los
tratamientos correspondieron a:
Bioaumentación cultivo bacteriano Y5 (T1)
Bioaumentación cultivo bacteriano 97a (T2)
Bioaumentación cultivo bacteriano 14c (T3)
Bioaumentación cultivo bacteriano 60b (T4)
Bioaumentación cultivo bacteriano 23b (T5)
Bioaumentación consorcio mixto (T6)
Bioaumentación cultivo bacteriano Y5 + Bioestimulación (T7)
Bioaumentación cultivo bacteriano 97a + Bioestimulación (T8)
Bioaumentación cultivo bacteriano 14c + Bioestimulación (T9)
Bioaumentación cultivo bacteriano 60b + Bioestimulación (T10)
Bioaumentación cultivo bacteriano 23b + Bioestimulación (T11)
Bioaumentación consorcio mixto + Bioestimulación (T12)
Testigo sin bioaumentación, sin bioestimulación (T13)
Testigo con bioestimulación (T14)
Testigo abiótico (T15)
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En los tratamientos con bioaumentación, se aplicaron 120 mL (10%) del cultivo
bacteriano por terrario. Inmediatamente después, el contenido de los terrarios se mezcló
durante 5 minutos.
En la bioestimulación, se aplicaron los nutrientes nitrógeno y fosforo (Carreño et
al., 2009; Chávez, 2010) en la relación C:N:P de 100:10:1 (Anexo 3), correspondiendo
0,128 g de úrea (46% N) y 0,029 g de fosfato diamónico (18% N, 46% P) por terrario. En
los tratamientos respectivos, los nutrientes se aplicaron antes de la bioaumentación. Todos
los terrarios fueron removidos cada 6 días hasta por 120 días y se regaron según los
requerimientos con agua declorada durante 24 horas.
Cada 30 días, hasta por 120 días se tomaron submuestras para el análisis
microbiológico y ensayo de toxicidad respectivo. A los 120 días, se seleccionó el suelo del
tratamiento con el que se alcanzó el mayor índice de germinación de rabanito,
correspondiente a la menor toxicidad, para determinar la concentración de hidrocarburos
totales de petróleo, (TPH) y calcular la eficiencia de la biodegradación de petróleo (Ramírez,
2005):
E = Si−Sf
Si x 100
Donde:
E = Eficiencia de la biodegradación de petróleo (%)
Si = Concentración inicial de HTP
Sf = Concentración final de HTP
Durante la biorremediación se registraron las temperaturas máxima (31ºC), mínima
(18ºC) y media (12,5ºC), datos obtenidos por la Estación Meteorológica de la Universidad
Nacional Pedro Ruiz Gallo, ubicada en el fundo “El Ciénago” en Lambayeque.
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g. Análisis estadístico de los datos
Los datos obtenidos fueron ordenados en tablas y figuras. Se realizó el análisis de
varianza de los índices de germinación obtenidos y la superioridad entre los tratamientos se
determinó mediante la prueba múltiple de Tukey, con un nivel de significancia (Hernández,
Fernández y Baptista, 2014) de 0,05, utilizando los programas Microsoft Office Word y
Excel versión 2013.
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IV. RESULTADOS
4.1. Tiempo de utilización del petróleo y número de unidades de actividad
emulsificante
Las bacterias hidrocarbonoclásticas investigadas utilizaron el petróleo como fuente
de carbono y energía en un tiempo de 60 y 80 horas (Tabla 1, Figura 16), correspondiendo el
menor tiempo, 60 horas, a los cultivos Y5, 97a y 60b, y 80 horas a los cultivos 14c y 23b. A
su vez, la cuantificación del número de unidades emulsificantes (UAE) se encontró en un
rango de 0,716 - 1,569 UAE mL-1 (Tabla 2), correspondiendo el mayor valor al cultivo Y5 y
el menor valor al cultivo 23b.
4.2. Características químicas, microbiológicas y toxicidad del suelo experimental
contaminado con petróleo
El suelo experimental presentó un contenido de hidrocarburos totales, HTP de
38 899 mg kg-1 (Tabla 3). El número más probable de microorganismos totales fue de
2,4x106 NMP g-1, población que supero a la hidrocarbonoclástica de 1,5x105 NMP g-1. En
cuanto al nivel de toxicidad del suelo experimental, fue severo (Tabla 4) en el índice de
germinación del rabanito.
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39
a b
Tabla 1.
Tiempo requerido para la utilización del petróleo como fuente de carbono y energía por los
cultivos de trabajo
Cultivo
Bacteriano
Tiempo
(horas)
Y5
97a
60b
14c
23b
60
60
60
80
80
Figura 16. Determinación del tiempo de utilización del petróleo (a) testigo (b) caldo
inoculado.
a b
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40
Tabla 2.
Unidades de actividad emulsificante alcanzadas por los cultivos de trabajo
Cultivo
bacteriano UAE
Y5
97a
14c
60b
23b
1,569
1,315
1,254
0,770
0,716
Tabla 3.
Contenido de hidrocarburos totales y número más probable de microorganismos totales e
hidrocarbonoclásticos en el suelo experimental contaminado con petróleo
Características Valor
TPH (mg kg-1)
Microorganismos totales (NMP g-1)
Microorganismos hidrocarbonoclásticos (NMP g-1)
38 899
2,4 x 106
1,5 x 105
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Tabla 4.
Nivel de toxicidad del suelo experimental contaminado con petróleo determinado en la
germinación de Raphanus sativus L., 2018
Características Valor
Promedio elongación radicular (mm)
Porcentaje relativo de germinación (PGR)
Crecimiento relativo de radícula (CRR)
Índice de germinación (% IG)
Nivel de fitotoxicidad
4,1
5,0
74
3,7
Severo
Fitotoxicidad: Baja (IG ≥ 80%), Moderada (80% > IG > 50%), Severa (IG ≤ 50%)
4.3. Eficiencia de la bioaumentación y bioestimulación en la biodegradación de
petróleo
Durante el proceso de biodegradación de petróleo en el suelo experimental inoculado
con los cultivos de bacterias hidrocarbonoclásticas, se observó que la población de
microorganismos totales a los 0 días osciló entre 2,1x106 - 3,5x106 NMP g-1 (Tabla 5); en
cuanto a los testigos, el mayor valor se observó en el testigo con bioestimulación (T14) con
2,7 x 106 NMP g-1 y el menor valor correspondió al testigo abiótico (T15) con una población
< 3,0 x 106 NMP g-1. A los 30 días, los microorganismos se incrementaron en todos los
tratamientos y a los 60 días alcanzaron su máxima población. A los 90 días la población de
microorganismos comenzó a disminuir en todos los tratamientos a excepción de los testigos
T13 y T14 donde alcanzaron su máxima población.
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42
La población de microorganismos hidrocarbonoclásticos fue de 2,1x105 - 3,6x105
NMP g-1 a los 0 días (Tabla 6), valores que se incrementaron conforme transcurrió el tiempo.
A los 90 días se alcanzó la máxima población, observándose los mayores valores en los
tratamientos con bioaumentación más bioestimulación correspondiendo una población
> 1,1 x 107 NMP g-1 al tratamiento Bioaumentación consorcio mixto + Bioestimulación
(T12). En los testigos la población de hidrocarbonoclásticos se incrementó hasta 3,5 x 105
NMP g-1 y 3,8 x 105 NMP g-1 a los 90 días con T13 y T14, respectivamente.
El índice de germinación de rabanito osciló entre 0 a 18% en todos los tratamientos a
los 0 días, significando un nivel de toxicidad severo de los contaminantes del suelo
experimental (Tablas 7 y 8, anexos 4 al 8). El nivel de toxicidad disminuyo conforme
transcurrió el tiempo, lo cual se vio reflejado en el incremento del índice de germinación; a
los 30 días el nivel de toxicidad fue moderado con los tratamientos de bioaumentación
consorcio mixto y todos los de bioaumentación-bioestimulación (IG 52–58%) y a los 60 días
en los demás tratamientos con bioaumentación (IG 55-58%).
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Tabla 5.
Número más probable de microorganismos totales (NMP g-1) durante la biodegradación de petróleo en terrarios
Tratamientos NMP g-1 / días
0 30 60 90 120
T1: Bioaumentación cultivo bacteriano Y5
T2: Bioaumentación cultivo bacteriano 97a
T3: Bioaumentación cultivo bacteriano 14c
T4: Bioaumentación cultivo bacteriano 60b
T5: Bioaumentación cultivo bacteriano 23b
T6: Bioaumentación consorcio mixto
T7: Bioaumentación cultivo bacteriano Y5 + Bioestimulación
T8: Bioaumentación cultivo bacteriano 97a + Bioestimulación
T9: Bioaumentación cultivo bacteriano 14c + Bioestimulación
T10: Bioaumentación cultivo bacteriano 60b + Bioestimulación
T11: Bioaumentación cultivo bacteriano 23b + Bioestimulación
T12: Bioaumentación consorcio mixto + Bioestimulación
T13: Testigo sin bioaumentación, sin bioestimulación
T14: Testigo con bioestimulación
T15: Testigo abiótico
2,8 x 106
2,8 x 106
2,1 x 106
2,8 x 106
2,1 x 106
3,5 x 106
2,8 x 106
3,5 x 106
2,8 x 106
2,1 x 106
2,1 x 106
2,1 x 106
2,0 x 106
2,7 x 106
<3,0 x 106
3,5 x 106
2,9 x 106
2,8 x 106
3,5 x 106
2,8 x 106
2,9 x 106
3,5 x 106
2,9 x 106
2,9 x 106
3,5 x 106
2,9 x 106
2,9 x 106
3,5 x 106
3,5 x 106
7,4 x 105
>1,1 x 108
1,1 x 108
1,1 x 108
4,6 x 107
1,1 x 108
>1,1 x 108
1,1 x 108
>1,1 x 108
>1,1 x 108
1,1 x 108
1,1 x 108
>1,1 x 108
2,1 x 107
4,6 x 107
1,1x 106
9,3 x 106
4,3 x 106
2,4 x 107
2,1 x 107
7,5 x 106
1,1 x 108
4,6 x 107
1,1 x 108
1,1 x 108
4,6 x 107
4,6 x 107
1,1 x 108
2,4 x 107
>1,1 x 108
1,5 x 106
7,5 x 106
2,3 x 106
9,3 x 106
7,5 x 106
2,3 x 106
1,5 x 107
1,5 x 107
2,1 x 107
2,1 x 107
1,5 x 107
1,5 x 107
2,1 x 107
7,5 x 106
1,5 x 107
2,0 x 106
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Tabla 6.
Número más probable de microorganismos hidrocarbonoclásticos (NMP g-1) durante la biodegradación de petróleo en terrarios
Tratamientos NMP g-1 / días
0 30 60 90 120
T1: Bioaumentación cultivo bacteriano Y5
T2: Bioaumentación cultivo bacteriano 97a
T3: Bioaumentación cultivo bacteriano 14c
T4: Bioaumentación cultivo bacteriano 60b
T5: Bioaumentación cultivo bacteriano 23b
T6: Bioaumentación consorcio mixto
T7: Bioaumentación cultivo bacteriano Y5 + Bioestimulación
T8: Bioaumentación cultivo bacteriano 97a + Bioestimulación
T9: Bioaumentación cultivo bacteriano 14c + Bioestimulación
T10: Bioaumentación cultivo bacteriano 60b + Bioestimulación
T11: Bioaumentación cultivo bacteriano 23b + Bioestimulación
T12: Bioaumentación consorcio mixto + Bioestimulación
T13: Testigo sin bioaumentación, sin bioestimulación
T14: Testigo con bioestimulación
T15: Testigo abiótico
2,9 x 105
3,6 x 105
3,5 x 105
3,5 x 105
2,1 x 105
3,6 x 105
3,6 x 105
3,6 x 105
3,5 x 105
3,5 x 105
2,1 x 105
3,6 x 105
1,5 x 105
2,0 x 105
<3,0 x 105
1,5 x 106
9,3 x 105
9,3 x 105
3,6 x 105
1,5 x 106
2,1 x 106
2,1 x 106
1,1 x 107
4,6 x 106
2,3 x 105
2,4 x 106
4,6 x 106
2,8 x 105
3,5 x 105
3,6 x 104
2,1 x 106
2,4 x 106
2,4 x 106
2,3 x 105
2,1 x 106
2,1 x 106
4,6 x 106
4,6 x 106
1,1 x 107
9,3 x 105
4,6 x 106
1,1 x 107
2,0 x 105
3,5 x 105
7,2 x 104
2,9 x 106
4,6 x 106
4,6 x 106
2,3 x 105
4,6 x 106
4,6 x 106
1,1 x 107
1,1 x 107
1,1 x 107
1,1 x 107
1,1 x 107
>1,1 x 107
3,5 x 105
3,8 x 105
7,4 x 104
1,5 x 106
2,1 x 106
1,5 x 106
3,5 x 105
1,5 x 106
9,3 x 15
9,3 x 105
9,3 x 105
1,5 x 106
4,3 x 105
9,3 x 105
2,4 x 106
9,2 x 104
2,0 x 105
1,1 x 105
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Tabla 7.
Índice de germinación de Raphanus sativus L. durante la biodegradación de petróleo en terrarios
Tratamientos Índice de germinación (%) Significancia
(α = 0,05) 0 30 60 90 120
T1: Bioaumentación cultivo bacteriano Y5
T2: Bioaumentación cultivo bacteriano 97a
T3: Bioaumentación cultivo bacteriano 14c
T4: Bioaumentación cultivo bacteriano 60b
T5: Bioaumentación cultivo bacteriano 23b
T6: Bioaumentación consorcio mixto
T7: Bioaumentación cultivo bacteriano Y5 + Bioestimulación
T8: Bioaumentación cultivo bacteriano 97a + Bioestimulación
T9: Bioaumentación cultivo bacteriano 14c + Bioestimulación
T10: Bioaumentación cultivo bacteriano 60b + Bioestimulación
T11: Bioaumentación cultivo bacteriano 23b + Bioestimulación
T12: Bioaumentación consorcio mixto + Bioestimulación
T13: Testigo sin bioaumentación, sin bioestimulación
T14: Testigo con bioestimulación
T15: Testigo abiótico
6
5
6
8
6
12
11
10
14
12
10
18
3
5
0
32
34
36
34
32
52
54
54
55
55
54
58
18
24
0
56
55
56
58
56
62
61
60
64
62
60
68
23
35
6
62
66
64
62
65
67
72
76
73
74
73
82
39
42
16
75
72
74
73
75
76
86
86
85
85
82
94
53
55
30
c
c
c
c
c
c
b
b
b
b
b
a
d
d
e
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Tabla 8.
Nivel de toxicidad en el índice de germinación de Raphanus sativus L. durante la biodegradación de petróleo en terrarios
Tratamientos Nivel de toxicidad / días
0 30 60 90 120
T1: Bioaumentación cultivo bacteriano Y5
T2: Bioaumentación cultivo bacteriano 97a
T3: Bioaumentación cultivo bacteriano 14c
T4: Bioaumentación cultivo bacteriano 60b
T5: Bioaumentación cultivo bacteriano 23b
T6: Bioaumentación consorcio mixto
T7: Bioaumentación cultivo bacteriano Y5 + Bioestimulación
T8: Bioaumentación cultivo bacteriano 97a + Bioestimulación
T9: Bioaumentación cultivo bacteriano 14c + Bioestimulación
T10: Bioaumentación cultivo bacteriano 60b + Bioestimulación
T11: Bioaumentación cultivo bacteriano 23b + Bioestimulación
T12: Bioaumentación consorcio mixto + Bioestimulación
T13: Testigo sin bioaumentación, sin bioestimulación
T14: Testigo con bioestimulación
T15: Testigo abiótico
Severo
Severo
Severo
Severo
Severo
Severo
Severo
Severo
Severo
Severo
Severo
Severo
Severo
Severo
Severo
Severo
Severo
Severo
Severo
Severo
Moderado
Moderado
Moderado
Moderado
Moderado
Moderado
Moderado
Severo
Severo
Severo
Moderado
Moderado
Moderado
Moderado
Moderado
Moderado
Moderado
Moderado
Moderado
Moderado
Moderado
Moderado
Severo
Severo
Severo
Moderado
Moderado
Moderado
Moderado
Moderado
Moderado
Moderado
Moderado
Moderado
Moderado
Moderado
Bajo
Severo
Severo
Severo
Moderado
Moderado
Moderado
Moderado
Moderado
Moderado
Bajo
Bajo
Bajo
Bajo
Bajo
Bajo
Moderado
Moderado
Severo
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A los 90 días el nivel de toxicidad fue moderado en todos los tratamientos
inoculados, a excepción de T12 Bioaumentación consorcio mixto + Bioestimulación con el
que se alcanzó un nivel bajo de toxicidad (IG 82%). A los 120 días los índices de
germinación fueron de 72 a 76% con los tratamiento de bioaumentación y de 82 a 94% con
los tratamientos de bioaumentación – bioestimulación, correspondiendo el mayor valor a T12
(IG 94%).
Los testigos T13 y T14 alcanzaron un nivel de toxicidad moderado a los 90 días, con
índices de germinación de 53% y 55%, respectivamente. El testigo abiótico (T15) presentó
un nivel de toxicidad severo durante todo el proceso de biodegradación.
La prueba F del análisis de varianza de los promedios del índice de germinación
demostró alta significancia (Anexo 9) y según la prueba múltiple de Tukey, el mayor valor
correspondió a tratamiento Bioaumentación consorcio mixto + Bioestimulación (T12),
diferenciándose significativamente de los demás tratamientos (Tabla 7)
Con el tratamiento T12 se cuantificó el HTP final determinándose 8 653 mg kg-1,
correspondiendo a 78% de eficiencia en la biodegradación de petróleo (Tabla 9), del suelo
contaminado con hidrocarburos de petróleo.
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Tabla 9.
Características del suelo biodegradado con bioaumentación consorcio mixto + bioestimulación durante 120 días
Características Días
0 30 60 90 120
Microorganismos totales (NMP g-1)
Microorganismos hidrocarbonoclásticos (NMP g-1)
Índice de germinación (%)
Nivel de toxicidad
HTP (mg kg-1)
Eficiencia (%)
2,1 x 106
3,6 x 105
18
Severo
38 899
-
2,9 x 106
4,6 x 106
58
Moderado
-
-
>1,1 x 108
1,1 x 107
68
Moderado
-
-
1,1 x 108
>1,1 x 107
82
Bajo
-
-
2,1 x 107
2,4 x 106
94
Bajo
8 653
78
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V. DISCUSIÓN
Las bacterias hidrocarbonoclásticas previamente aisladas de un suelo contaminado
con hidrocarburos de petróleo mejoraron la calidad del suelo experimental, demostrándose
la capacidad metabólica de los microorganismos individuales o consorcios nativos y
alóctonos para mejorar la tasa de degradación de los contaminantes (Fodelianakis, 2015;
Varjani, 2017). En zonas impactadas con hidrocarburos de manera recurrente o con
episodios previos de contaminación, los microorganismos se seleccionan en favor de la
metabolización del contaminante (Buendía, 2012; Lladó, 2012).
La capacidad metabólica de los microorganismos frente a los contaminantes del
suelo, es la base sobre la cual se sustenta la presente investigación de biodegradación en la
cual las bacterias utilizan los contaminantes como sustrato para su desarrollo y crecimiento,
significando una degradación gradual de la molécula para formar al final uno o más
fragmentos menos tóxicos, en algunos casos mineralizando hasta dióxido de carbono y agua
(Samanez, 2008; Lladó, 2012).
El tiempo requerido para la utilización de petróleo por los cultivos de bacterias
hidrocarbonoclásticas de 60 y 80 horas, fue el tiempo reportado por Cabanillas y Pissani
(2015). Al igual que los valores de actividad emulsificante con un máximo de
1,569 UAE mL-1, valor que se encuentra en el rango 0,069 – 2,75 UAE mL-1, mencionado
por otros investigadores (Arizaca, 2015; Quiliche, Cortez, Rodríguez, Silva y Huayna,
2016).
En la primera etapa de degradación de los hidrocarburos, se metabolizan las
fracciones más sencillas: n-alcanos de cadena corta, por oxidaciones sucesivas a través de la
vía de β-oxidación. En la segunda etapa se degradan las fracciones pesadas, como los
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isoprenoides, cicloalcanos y aromáticos (Llanos, 2012). Los microorganismos facilitan la
difusión hacia el interior de compuestos orgánicos hidrófobos, como los hidrocarburos, por
medio de biosurfactantes y bioemulsificantes, mejorando la disponibilidad del contaminante
(Arrieta, 2011).
El suelo experimental presentó microorganismos e hidrocarburos totales de petróleo
(HTP), requeridos para la investigación de la degradación microbiana de este contaminante
(Purisca y Quevedo, 2015). El contenido de HTP fue de 38 899 mg kg-1, valor superior al
rango de 19 000 – 25 000 mg kg-1 registrados por Buendía (2012), Ñustez (2012) y Purisaca
y Quevedo (2015). La fracción TPH se define como aquellos hidrocarburos del extracto
orgánico total pertenecientes a las fracciones saturada y aromática (Viñas, 2005), cuya
concentración sirve como indicador general del tipo de contaminación26. Al respecto,
Buendía (2012) mencionó que para biorremediar un suelo contaminado, el HTP debe ser
menor de 50 000 mg kg-1.
La cuantificación de las poblaciones de microorganismos totales e
hidrocarbonoclásticos fue de 2,4x106 NMP g-1 y 1,5x105 NMP g-1, respectivamente; valores
menores a los reportados por Contreras y Carreño (2018), >1,1x107 NMP g-1 para
microorganismos totales y 1,1x106 NMP g-1 para hidrocarbonoclásticos.
Los microorganismos totales o heterótrofos totales metabolizan como fuente de
carbono sustancias orgánicas y los microorganismos hidrocarbonoclásticos degradan el
petróleo como única fuente de carbono y energía (Acuña, Pucci, Morales y Pucci, 2010).
Los contaminantes del petróleo se depositan principalmente en la zona más superficial del
suelo, donde se encuentra el mayor contenido de materia orgánica que incluye a los
microorganismos en general. Los suelos expuestos a contaminación recurrente con
hidrocarburos de petróleo constituyen un microhábitat adecuado para la evolución de
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especies microbianas degradadoras. El contaminante es un factor importante en la selección
de microorganismos capaces de sobrevivir y adaptarse (Gómez et al., 2008).
El nivel de toxicidad del suelo experimental fue severo, parámetro valorado
utilizando como bioindicador semillas de Raphanus sativus L. “rabanito”, material biológico
también utilizado por otros investigadores en un suelo impactado con hidrocarburos
(Contreras y Carreño, 2018; Oliva, 2018); un bioindicador alternativo es Lactuca sativa L.
“lechuga” (Purisaca y Quevedo, 2015) y Brassica alba L. “mostaza blanca” (Jiang et al.,
2016). Los hidrocarburos son los compuestos mayoritarios (50 – 98%) del petróleo
(Ramírez, 2014), predominando los de cadena lineal n-alcanos y en menor proporción los
alcanos ramificados, cicloalcanos e hidrocarburos aromáticos (HAPs), estos últimos
representan una peligrosidad intrínseca, toxicidad aguda, teratogenica, mutagenica y
carcinógena. Los HAPs se bioacumulan y son recalcitrantes, resistiendo a la degradación
fotolítica, química y biológica (Viñas, 2005).
La tasa de biodegradación es influenciada por las condiciones ambientales y la
población microbiana, al igual que por factores físico-químicos como pH, humedad,
temperatura, contenido de agua, salinidad, oxígeno y disponibilidad de nutrientes (Varjani &
Upasani, 2016). Por esta razón esta investigación se aplicaron riegos, volteos y técnicas de
bioaumentacion y bioestimulación (Cabanillas y Pissani, 2015). La bioaumentación la
adición de microorganismos degradadores seleccionados naturalmente en el ambiente
contaminado. Estos microorganismos se aíslan, caracterizan y después se reintroducen para
la degradación de los contaminantes (Arrieta, 2011). En la bioestimulación, la actividad
microbiana es estimulada o incrementada por la adición de nutrientes como el nitrógeno,
fósforo y potasio (Gómez et al., 2008).
En la bioaumentación se aplicó 5% del inóculo o consorcio bacteriano
correspondiente (Llanos, 2012), no obstante, se puede utilizar hasta 10% según Samanez
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(2008). En la bioestimulación, se adicionaron los fertilizantes sintéticos úrea (46%N) y
fosfato diamónico (18% N, 46%P) en la relación C:N:P de 100:10:1 al igual que Llanos
(2012), Cabanillas y Pissani (2015) y Gómez et al. (2008); otros investigadores utilizan
nutrientes en forma de nitrato de amonio y ortofosfato de potasio (Jiang et al., 2016) para
obtener la relación 100:10:0,1.
La temperatura ambiental en el proceso de fue de 12,5 – 31ºC; valores aceptables y
dentro del rango de 30 - 40 ºC, considerado óptimo y en el que se intensifica la actividad
enzimática de los microorganismos, acelerando al máximo la degradación. Cuando la
temperatura es menor, la viscosidad del petróleo aumenta, varia su solubilidad en agua y
disminuye la volatilización de algunas fracciones tóxicas para los microorganismos. Por el
contrario, a temperaturas mayores, la toxicidad de los hidrocarburos se incrementa,
inhibiéndose la actividad microbiana (Pardo et al., 2004).
Durante la biodegradación, el suelo fue removido para favorecer la aireación. La tasa
de degradación es directamente proporcional a la disponibilidad de oxígeno, ya que es
utilizado como aceptor final de electrones y también como sustrato en las reacciones
catalizadas por las oxigenasas (Lladó, 2012); además la oxigenación facilita la volatilización
de los compuestos tóxicos (Arrieta, 2011). La humedad se mantuvo en 60% de la capacidad
de campo (cc), valores muy bajos pueden significar una inactividad metabólica de los
microorganismos, así como una reducción del transporte de nutrientes y contaminantes, es
decir, de su biodisponibilidad. Un exceso de agua, por el contrario, podría suponer una
disminución en la circulación del aire y, por tanto, una disminución de la disponibilidad del
oxígeno. El rango óptimo de contenido de agua en un suelo para la biodegradación (Realp et
al., 2008), suele estar entre 30% y 80% cc.
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La eficiencia de la biodegradación de los hidrocarburos de petróleo se determinó
indirectamente mediante la cinética de la población microbiana y la toxicidad de los
contaminantes del suelo experimental y directamente a través de la cuantificación del HTP,
coincidiendo con Cabanillas y Pissani (2015) y Purisaca y Quevedo (2015).
Los microorganismos se incrementaron, alcanzando la máxima población de
heterótrofos totales a los 60 días y de hidrocarbonoclásticos a los 90 días, resultado que
puede ser explicado porque el hidrocarburo como fuente de carbono puede sostener la
población microbiana (Hernández et al., 2003). El aumento de la población microbiana se
asoció al mayor porcentaje de biodegradación de hidrocarburos de petróleo como lo
demostró Pardo et al. (2004). Estos investigadores determinaron a los 30 días 38,6% de
degradación, en comparación 28,1% a los 60 días y 4,7% a los 90 días de iniciado el proceso
de biorremediación.
Los microorganismos totales e hidrocarbonoclásticos disminuyeron a partir de los
90 días y 120 días, respectivamente. Esta disminución de la población microbiana también
fue observada por Samanez (2008) y Contreras y Carreño (2018), lo cual es explicado por la
disminución en la disponibilidad de los sustratos hidrocarbonados más fácilmente
biodegradables. Conforme transcurre el tiempo, permanecen los compuestos más resistentes
a la degradación microbiana, sobreviviendo los microorganismos previamente
seleccionados, propagados y reintroducidos en los suelos contaminado según la tecnología
de la bioaumentación (Cabanillas y Pissani, 2015).
La bioestimulación incrementó la biorremediación del suelo experimental
contaminado. La combinación de las técnicas de bioumentación y bioestimulación mejoran
la eficiencia de biorremediación en comparación de un suelo remediado solo con atenuación
natural. La adición de nutrientes, como el nitrógeno y fósforo, es parámetro clave para
promover la biodegradación. Los hidrocarburos de petróleo presentan pocos elementos
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esenciales para la célula bacteriana como son N, P, K y algunos minerales traza (Llanos,
2012); estos elementos representan un factor limitante en la biodegradación de
hidrocarburos por lo que se debe ajustar la proporción C:N:P mediante la adición de úrea y
fosfato, lográndose de esta manera, acelerar el proceso de degradación (Arrieta, 2011).
El consorcio mixto constituido por los cultivos de bacterias hidrocarbonoclásticos
fue más eficiente que las bacterias aplicadas independientemente. Esto se debe a que los
consorcios microbianos con los que establecen procesos simbióticos de comensalismo y
cometabolismo, que en conjunto mineralizan el contaminante (Gómez, 2008). La aplicación
de varios géneros bacterianos asegura mayor efectividad en la biorremediación, debido a que
se metabolizan diferentes compuestos (Arrieta, 2011).
La bioaumentación aplicada junto a la bioestimulación con un consorcio mixto
demostró mayor eficiencia en la degradación del contaminante y consecuentemente la
disminución de la toxicidad a un nivel bajo a los 90 días, lográndose una eficiencia de
degradación de 78%. El porcentaje de eficiencia supero al 71,4% reportado por Samanez
(2008) con bioaumentación + bioestimulación y 61,9% con bioaumentación, y 75% con
bioaumentación + bioestimulación por Cabanillas y Pissani (2015); concluyéndose que la
reintroducción de microorganismos aislados previamente de un ambiente contaminado tiene
mayor efectividad en la biodegradación de petróleo, cuando los microorganismos disponen
de compuestos inorgánicos.
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VI. CONCLUSIONES
Se demostró la eficiencia del 78% en la biodegradación de petróleo por bioaumentación
con un consorcio mixto más bioestimulación.
Los cultivos de bacterias hidrocarbonoclásticas utilizaron el petróleo como fuente de
carbono y energía en un tiempo de 60 y 80 horas, y la cuantificación del número de unidades
emulsificantes se encontró en un rango de 0,716 - 1,569 UAE mL-1.
El suelo experimental contaminado presentó un contenido de HTP de 38 899 mg kg-1,
población de microorganismos totales (2,4x106 NMP g-1) e hidrocarbonoclásticos
(1,5x105 NMP g-1) y un nivel de toxicidad severo en el índice de germinación de Raphanus
sativus L. “rabanito”.
La bioaumentación y bioestimulación incrementaron la población de microorganismos
totales e hidrocarbonoclásticos, disminuyó la toxicidad de los contaminantes y
concentración de hidrocarburos totales de petróleo, alcanzándose con el tratamiento
bioaumentación consorcio mixto + bioestimulación el mayor valor de eficiencia.
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VII. RECOMENDACIONES
Caracterizar a nivel molecular los cultivos bacterianos Y5, 97a, 60b, 14c y 23b.
Investigar sustratos de bajo costo para el incremento a gran escala de los consorcios
mixtos bacterianos.
Investigar la biorremediación de suelos contaminados a nivel de campo en lotes de
explotación comercial o áreas de interés agrícola.
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VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Acuña, A., Pucci, G., Morales, M. y Pucci O. (2010). Biodegradación de petróleo y sus
derivados por la comunidad bacteriana en un suelo de la Patagonia, Argentina. Revista
de la Sociedad Venezolana de Microbiología, 30, 29-36. Recuperado de
https://www.redalyc.org/pdf/1994/199416355007.pdf
Adams, G., Fufeyin, T., Okoro, S. & Ehinomen, I. (2015). Bioremediation, Biostimulation
and Bioaugmention: A Review. International Journal of Environmental Bioremediation
& Biodegradation, 3(1), 28-39. doi: 10.12691/ijebb-3-1-5
Agency for Toxic Substances and Disease Registry. (2011). Total Petroleum Hydrocarbons.
Estados Unidos: Agency for Toxic Substances and Disease Registry. Recuperado de
http://www.atsdr.cdc.gov/ToxProfiles/tp.asp?id =424&tid=75
Alexander, M. (1994). Introducción a la Microbiología del Suelo. México: Editorial AGT
S.A.
Arizaca, K. (2015). Detección del Gen AlkB en bacterias con posible actividad
biodegradadora, aisladas de suelos contaminados con hidrocarburos (Tesis de
maestría). Universidad Católica de Santa María, Perú.
Arrieta, O. (2011). Evaluación de la influencia del bioestímulo sobre un suelo contaminado
con diésel y su integración a la gestión ambiental (Tesis de maestría). Universidad
Nacional de Colombia, Colombia.
Blodgett, R. (2010). BAM Appendix 2: Most Probable Number from Serial Dilutions.
Estados Unidos: Food and Drug Administration. Recuperado de
https://www.fda.gov/Food/ FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm109656.htm
Braibant, C. (2004). Estudio del potencial de degradación de los hidrocarburos por
Acinetobacter sp. y Pseudomonas putida para su aplicación en la biorremediación de
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BIBLIO
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E POSGRADO - U
NT
58
suelos contaminados (Tesis de especialidad). Instituto Tecnológico de Costa Rica,
Costa Rica. Recuperado de https://core.ac.uk/download/pdf/60987943.pdf
Buendía, H. (2012). Biorremediación de suelos contaminados por hidrocarburos mediante
compost de aserrín y estiércoles (Tesis de maestría). Universidad Nacional Mayor de
San Marcos, Perú.
Cabanillas, J. y Pissani, V. (2015). Efecto de la bioaumentación y bioestimulación en la
eficiencia de biorremediación de suelos contaminados con hidrocarburos de petróleo
(Tesis de pregrado). Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo, Perú.
Cando, M. (2011). Determinación y análisis de un proceso de biorremediación de suelos
contaminados por hidrocarburos (Tesis de pregrado). Universidad Politécnica de
Salesiana, Ecuador.
Carreño, C., Mendoza G. y Villanueva, C. (2009). Microbiología en el tratamiento de
desechos. Perú: Oficina de Impresiones y Publicaciones Universidad Nacional Pero
Ruiz Gallo.
Castillo, R., Roldan, R., Blasco, P., Huertas, R., Caballero, D., Moreno, C. y Luque, M.
(2005). Biotecnología ambiental. Madrid, España: Editorial Tébar, S.L.
Contreras, C. y Carreño, C. (2018). Eficiencia de la biodegradación de hidrocarburos de
petróleo por hongos filamentosos aislados de suelo contaminado. Revista de Ciencias
Naturales e Ingeniería, 1(1): 27-33. doi: 10.25127/ucni.v1i1.269
Coyne, M. (2000). Microbiología del Suelo: un enfoque exploratorio. España: Editorial
Paraninfo.
Crawford, R. & Crawford, D. (2005). Bioremediation: principles and applications. Estados
Unidos: Universidad de Cambridge. Recuperado de http://www.beck-shop.de/fachbuch
/vorwort/9780521019156_Intro_001.pdf
Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/
BIBLIO
TECA D
E POSGRADO - U
NT
59
Chávez, G. (2010). Eficiencia de la degradación de petróleo por Pseudomonas sp. nativa en
terrarios a diferentes concentraciones y tiempos (Tesis de maestría). Universidad
Nacional Pedro Ruiz Gallo, Perú.
Díaz, E., Alarcón, A., Ferrera, R., Almaraz, J. y García, O. (2013). Crecimiento
de Casuarina equisetifolia (Casuarinaceae) en suelo con diésel, y aplicación de
bioestimulación y bioaumentación. Revista de Biología Tropical, 61(3): 1039-1052.
Recuperado de
http://www.scielo.sa.cr/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S00347744201300040000&l
ng=en.
Escalante, R. (2002). Biodegradación de crudo de petróleo en terrarios (Tesis de maestría).
Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Perú.
Filip, Z. (2002). International approach to assessing soil quality by ecologically related
biological parameters. Agriculture, Ecosystems & Environment, 88: 169-174. doi:
10.1016/S0167-8809(01)00254-7
Flores, S. y Benites, J. (2015). Efecto del estiércol de cuy, porcino y vacuno en la
biorremediación de suelo contaminado con hidrocarburos de diésel en terrarios (Tesis
de pregrado). Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo, Perú.
Fodelianakis, S., Antoniou, E., Mapelli, F., Magagnini, M., Nikolopoulou, M., Marasco, R.,
Barbato, M., Tsiola, A., Tsikopoulou, I., Giaccaglia, L., Mahjoubi, M., Jaouani, A.,
Amer, R., Hussein, E., Al-Horani, F., Benzha, F., Blaghen, M., Malkawi, H., Abdel-
Fattah, Y., Cherif, A., Daffonchio, D. & Kalogerakis, N. (2015). Allochthonous
bioaugmentation in oil-polluted ex situ treatment of crude sediments in the presence
indigenous of an effective degrading microbiome. Journal of Hazardous Materials,
287: 78-86. doi: 10.1016/j.jhazmat.2015.01.038
Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/
BIBLIO
TECA D
E POSGRADO - U
NT
60
García, E. (2012). Tratamiento por bioaumentación de un agua contaminada con
hidrocarburos colectada en un terreno en rehabilitación (Tesis de maestría).
Universidad Nacional Autónoma de México, México. Recuperado de
http://www.ptolomeo.unam.mx
:8080/xmlui/bitstream/handle/132.248.52.100/5074/Tesis.pdf?sequence=1
Gentry, T., Rensing, C. & Pepper, I. (2004). New approaches for bioaugmentation as a
remediation technology. Critical Reviews in Environmental Science and Technology,
34(5): 447-494. doi: 10.1080/10643380490452362
Gómez, S., Gutiérrez, D., Hernández, A., Hernández, C., Lozada, M. y Mantilla, P. (2008).
Factores bióticos y abióticos que condicionan la biorremediación por Pseudomonas en
suelos contaminados por hidrocarburos. Nova, 6(9): 76-84. Recuperado de
http://www.unicolmayor.edu.co/invest_nova/NOVA/NOVA9_ART8_PSEUDO.pdf
Gonzáles, H. (2011). Ingeniería Ambiental: Concepto y estrategias de biorremediación.
Universidad Antonio Nariño, 1(1): 20-29. Recuperado de
file:///C:/Users/Edgar/Downloads/96-368-2-PB%20(2).pdf
Hernández, E., Ferrera, R., Gutiérrez, M., Rodríguez, R., Rubiños, J. y Fernández, L. (2003).
Bacterias y hongos hidrocarbonoclastas de rizósfera frijol y maíz, en un suelo
contaminado con petróleo. Terra Latinoamericana, 21(4): 493-502. Recuperado de
http://www.redalyc.org/comocitar.oa?id=57321405
Hernández, R., Fernández, C. y Baptista, P. (2014). Metodología de la Investigación. 6ta ed.
México: Mc Graw, Hill Interamericana Editores S.A.
Huapaya, R. (2011). Métodos stándares de análisis microbiológicos de aguas. Curso de
Capacitación 10 y 11 de diciembre 2011, Perú.
Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/
BIBLIO
TECA D
E POSGRADO - U
NT
61
Instituto Nacional de Defensa Civil. (2003). Plan de prevención ante desastres: Uso del
suelo y medidas de mitigación ciudad de Puerto Eten. Recuperado de
http://bvpad.indeci.gob.pe/doc/estudios_CS/Region_lambayeque/chicl ayo/eten.pdf.
Jiang, Y., Brassington, K., Prpich, G., Paton, G., Semple, K., Pollard, S. & Coulon, F.
Insights into the biodegradation of weathered hydrocarbons in contaminated soils by
bioaugmentation and nutrient stimulation. Chemosphere, 161: 300-307. doi: 10.1016/
j.chemosphere.2016.07.032
Kazunga, C. & Aitken, M. (2000). Products from the incomplete metabolism of pyrene by
polycyclic aromatic hydrocarbon degrading bacteria. Applied and. Environmental
Microbiology, 66(5): 1917-1922. Recuperado de https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc
/articles/PMC101433/
Leahy, J. & Colwell, R. (1990). Microbial degradation of hydrocarbons in the environment.
Microbiology Reviews, 54(3): 305-315. Recuperado de https://www.ncbi.nlm.nih.gov
/pmc/articles/PMC372779/
Loya, D. (2013). Tecnologías para la restauración de suelos contaminados por
hidrocarburos (Tesis de especialidad). Universidad Veracruzana, México.
Lladó, S. (2012). Biorremediación de suelos contaminados por hidrocarburos pesados y
caracterización de comunidades microbianas implicadas (Tesis de doctorado).
Universitat de Barcelona, España.
Llanos, C. (2012). Eficiencia de la biorremediación de suelos contaminados con petróleo
por bacterias nativas en el distrito de Pimentel (Tesis de pregrado). Universidad
Nacional Pedro Ruiz Gallo, Perú.
Menéndez, D., Gallego, J., Peláez, A., De Cordoba, G., Moreno, J., Muñoz, D. & Sánchez,
J. (2007). Engineered in situ bioremediation of soil and groundwater polluted with
weathered hydrocarbons. European Journal of Soil Biology, 43:310–321.
Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/
BIBLIO
TECA D
E POSGRADO - U
NT
62
Ministerio del Ambiente. (2014). Guía para el muestreo de suelos. Lima: MINAN.
Recuperado de http://www.minam.gob.pe/wp-content/uploads/2018/07/GUIA-PARA-
EL-MUESTREO-DE-SUELO.pdf
Mrozik, A. & Piotrowska, Z. (2009). Bioaugmentation as a strategy for cleaning up of soils
contaminated with aromatic compounds. Microbiological Research, 165(5): 363–375
doi:10.1016/j.micres.2009.08.001
Ñustez, D. (2012). Biorremediación para la degradación de hidrocarburos totales presentes
en los sedimentos de una estación de servicio de combustible (Tesis de maestría).
Universidad Tecnológica de Pereira, Colombia.
Oliva, R. (2018). Eficiencia de la biodegradación de hidrocarburos totales de petróleo en
microcosmos por hongos filamentosos aislados de suelo contaminado (Tesis de
maestría). Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo, Perú.
Ortega, M. (2012). Modelización de un proceso de biorremediación de suelos contaminados
con gasoil (Tesis de doctorado). Universidad de Granada, España.
Pardo, J., Perdomo, M. y Benavides, J. (2004). Efecto de la adición de fertilizantes
inorgánicos compuestos en la degradación de hidrocarburos en suelos contaminados con
petróleo. Nova, 2(2): 40-49. doi: 10.22490/24629448.6
Pernía, B., Demey, R., Inojosa, Y. y Naranjo, L. (2012). Biodiversidad y potencial
hidrocarbonoclástico de hongos aislados de crudo y sus derivados: Un meta-análisis.
Revista Latinoamericana de Biotecnología Ambiental y Algal, 3(1): 1-40. Recuperado
de
https://www.researchgate.net/publication/260137177_Biodiversidad_y_potencial_hidro
carbonoclastico_de_hongos_aislados_de_crudo_y_sus_derivados_Un_metaanalisis_Bio
diversity_and_hydrocarbonoclastic_potencial_of_fungi_isolated_from_crude_and_petr
oleum_de
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BIBLIO
TECA D
E POSGRADO - U
NT
63
Ponce, D. (2014). Biorremediación de suelos contaminados con hidrocarburos (Tesis de
pregrado). Universidad del Bío-Bío, Chile.
Purisaca, D. y Quevedo, D. (2015). Eficiencia de la biorremediación de suelos contaminados
con petróleo por Actinobacterias nativas de la provincia de Talara, región Piura (Tesis
de pregrado). Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo, Perú.
Quiliche, J., Cortez, A., Rodríguez, P., Silva, M. y Huayna, L. (2016). Aislamiento e
identificación de Pseudomonas aeruginosa potencialmente degradadoras de crudo de
petróleo, provenientes de suelos en talleres de automóviles en el Norte Chico. Infinitum,
6(1): 63-69. Recuperado de http://revistas.unjfsc.edu.pe/index.php/INFINITUM/article/
view/10/10
Ramírez, M. (2014). Microorganismos degradadores de hidrocarburos del petróleo
aislados de la rizósfera de manglar del estado de Campeche y su potencial en la
biorremediación (Tesis de doctorado). Colegio de Postgraduados, México.
Ramírez, N. (2005). Degradación de petróleo Diésel a diferentes concentraciones de
nitrógeno y fosforo por cepas nativas de Pseudomonas spp. (Tesis de maestría).
Universidad Nacional pedro Ruiz Gallo, Perú.
Realp, E., Doménech, J., Martínez, R., Restrepo, C., Lladó, S., Viñas, M. y Solanas, A.
(2008). Ensayo piloto de biorremediación por la tecnología de la biopila dinámica para
la descontaminación de suelos contaminados por creosotas provenientes delas
actividades dedicadas a la preparación de la madera. Revista Técnica Residuos, 103: 38-
49. Recuperado de https://www.researchgate.net
/publication/284666560_Ensayo_piloto_de
_biorremediacion_por_la_tecnologia_de_la_biopila_dinamica_para_la_descontaminaci
on_de_suelos_contaminados_por_creosotas_provenientes_de_las_actividades_dedicada
s_a_la_preparacion_de_la
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BIBLIO
TECA D
E POSGRADO - U
NT
64
Rodríguez, C. (2012). Producción de biogás a partir del bagazo cervecero (Tesis de
pregrado). Universidad de Chile, Chile.
Salas, T. y Meza, V. (2011). Compost de etiquetas de cerveza. Evaluación de la
fitotoxicidad en semillas. Segundo Simposium de Residuos Sólidos en el Perú. Lima,
Perú: Universidad Nacional Agraria La Molina.
Samanez, E. (2005). Biodegradación bacteriana por bioestimulación en suelos
contaminados con petróleo crudo (Tesis de maestría). Universidad Nacional Pedro Ruiz
Gallo, Perú.
Sarkar, D., Ferguson, M., Datta, R. & Birnbaum, S. (2005). Bioremediation of petroleum
hydrocarbons in contaminated soils: comparison of biosolids addition, carbon
supplementation and monitored natural attenuation. Environmental Pollution, 136(1):
187–195. doi: 10.1016/j.envpol.2004.09.025
Singh, A., Parmar, N., Kuhad, R. & Ward, O. (2011). Bioaugmentation, biostimulation, and
biocontrol. Soil Biology, 28: 1-23. doi: 10.1007/978-3-642-19769-7_1
Suja, F., Rahim, F., Raihan, M., Hambali, N., Rizal, M., Khalid, A. & Hamzah, A. (2014).
Effects of local microbial bioaugmentation and biostimulation on the bioremediation of
total petroleum hydrocarbons (TPH) in crude oil contaminated soil based on laboratory
and field observations. International Biodeterioration & Biodegradation, 90: 115-122.
doi: 10.1016/j.ibiod.2014.03.006
Urum, K., Grigson, S., Pekdemir, T. & McMenamy, S. (2006). A comparison of the
efficiency of different surfactants for removal of crude oil from contaminated soils.
Chemosphere 62(9): 1403–1410. doi: 10.1016/j.chemosphere.2005.05.016
Varjani, S. & Upasani V. (2016). Carbon spectrum utilization by an indigenous strain of
Pseudomonas aeruginosa NCIM 5514: Production, characterization and surface active
Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/
BIBLIO
TECA D
E POSGRADO - U
NT
65
properties of biosurfactant. Bioresource Technology, 221: 510–516. doi:
10.1016/j.biortech.2016.09.080
Varjani, S. (2017). Review Microbial degradation of petroleum hydrocarbons. Bioresource
Technology, 223: 277-286. doi: 10.1016/j.biortech. 2016.10.037
Vásquez, A., Díaz, N., Vásquez, N. y Vásquez., V. (2012). Metodología de la Investigación
Científica. Perú: Oficina de Impresiones y Publicaciones Universidad Nacional Pedro
Ruiz Gallo.
Viñas, M. (2005). Biorremediación de suelos contaminados por hidrocarburos:
caracterización microbiológica, química y ecotoxicológica (Tesis de doctorado).
Universidad de Barcelona, España.
Vogel, T. (1996) Bioaugmentation as a soil bioremediation approach. Current Opinion in
Biotechnology, 7(3): 311–316.
Volke, S. y Velasco, T. (2002). Tecnologías de Remediación para Suelos Contaminados.
Instituto de Ecología, México, D.F., México. doi: 10.1016/S0958-1669(96)80036-X
Wu, M., Dick, W., Li, W., Wang, X., Yang, Q., Wang, T., Xu, L., Zhang, M. & Chen, L.
(2016). Bioaugmentation and biostimulation of hydrocarbon degradation and the
microbial community in a petroleum-contaminated soil. International Biodeterioration
& Biodegradation, 107: 158-164. doi: 10.1016/j.ibiod.2015.11.019
Zawierucha, I. & Malina, G. (2006). Bioaugmentation as a method of biodegradation
enhancement in oil hydrocarbons contaminated soil. Ecohydrology and Hydrobiology,
6: 163–169. doi: https://doi.org/10.1016/S1642-3593(06)70138-0
Zawierucha, I. & Malina, G. (2011). Effects of Bioaugmentation and Biostimulation on
Enhancing Biodegradation of Oil Hydrocarbons Contaminated Soils. Soil Biology, 28:
187-201. doi: 10.1007/978-3-642-19769-7_8
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IX. ANEXOS
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ANEXO 1
Composición (gL-1) de medios de cultivo para la cuantificación del tiempo de
utilización del petróleo y número de unidades emulsificantes en Cabanillas y Pissani
(2015)
a. Caldo Bushnell Haas
Componentes gL-1
KH2PO4
K2HPO4
(NH4)2SO4
MgSO4
Cl2Ca
FeCl3
Agua destilada
1,0
1,0
1,0
0,20
0,02
0,005
1000 mL
Ajustar a pH 7,0
b. Caldo extracto de levadura etanol
Componentes gL-1
KH2PO4
K2HPO4
(NH4)2SO4
MgSO4
Extracto de levadura
Etanol
Agua destilada
18,0
6,0
4,0
0,2
3,0
20 mL
1000 mL
Ajustar a pH 7,0
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ANEXO 2
Tabla para el cálculo del Número Más Probable (NMP) para serie de diluciones de tres
tubos, 95% de confiabilidad en Blodgett (2010)
NMP/100ml = (Tabla NMP/100 ml) x 10/V
Donde: V= volumen de muestra de la dilución más baja seleccionada.
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ANEXO 3
Cálculo de la concentración de úrea y fosfato diamónico requeridos para alcanzar una
relación C:N:P de 100:10:1 en Carreño et al. (2009) y Chávez (2010)
a. Cálculo de FDA (18%N – 46%P)
100 kg FDA 46 U/P
x 1 U/P
Adición por terrario:
0,217 g FDA 1 m2
x 0,0726 m2
100 kg FDA 18 U/N
0,000016 kg FDA x
b. Cálculo de Urea (46%N)
100 kg urea 46 U/N
x 1 U/P
Adición por terrario:
2,174 g urea 1 m2
x 0,0726 m2
0,157 g N (urea) – 0,029 g N (FDA)
x = 1,128 g urea
x = 2,174 kg FDA ha-1
x = 0,217 g FDA m2
x = 0,016 g FDA
x = 0,000029 kg N
x = 0,029 g N FDA
x = 0,0157 g N
x = 21,739 kg urea ha-1
x = 2,1739 g urea m2
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ANEXO 4
Germinación de Raphanus sativus L. sembrado en el suelo experimental contaminado con hidrocarburos de petróleo al inicio de la
biodegradación
Tratamientos
Promedio
elongación
radicular
(mm)
Porcentaje
relativo de
germinación
(PGR)
Crecimiento
relativo de
radícula (CRR)
Índice de
germinación
(%IG)
Nivel de
fitotoxicidad
T1: Bioaumentación cultivo bacteriano Y5
T2: Bioaumentación cultivo bacteriano 97a
T3: Bioaumentación cultivo bacteriano 14c
T4: Bioaumentación cultivo bacteriano 60b
T5: Bioaumentación cultivo bacteriano 23b
T6: Bioaumentación consorcio mixto
T7: Bioaumentación cultivo bacteriano Y5 + Bioestimulación
T8: Bioaumentación cultivo bacteriano 97a + Bioestimulación
T9: Bioaumentación cultivo bacteriano 14c + Bioestimulación
T10: Bioaumentación cultivo bacteriano 60b + Bioestimulación
T11: Bioaumentación cultivo bacteriano 23b + Bioestimulación
T12: Bioaumentación consorcio mixto + Bioestimulación
T13: Testigo sin bioaumentación, sin bioestimulación
T14: Testigo con bioestimulación
T15: Testigo abiótico
33
39
33
36
33
40
28
28
41
44
28
38
25
28
0
10
7
10
12
10
24
22
20
19
24
20
26
7
8
0
59
71
59
65
59
50
50
50
73
50
50
69
45
62
0
6
5
6
8
6
12
11
10
14
12
10
18
3
5
0
Severo
Severo
Severo
Severo
Severo
Severo
Severo
Severo
Severo
Severo
Severo
Severo
Severo
Severo
Severo
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ANEXO 5
Germinación de Raphanus sativus L. sembrado en el suelo experimental contaminado con hidrocarburos de petróleo a los 30 días de la
biodegradación
Tratamientos
Promedio
elongación
radicular
(mm)
Porcentaje
relativo de
germinación
(PGR)
Crecimiento
relativo de
radícula (CRR)
Índice de
germinación
(%IG)
Nivel de
fitotoxicidad
T1: Bioaumentación cultivo bacteriano Y5
T2: Bioaumentación cultivo bacteriano 97a
T3: Bioaumentación cultivo bacteriano 14c
T4: Bioaumentación cultivo bacteriano 60b
T5: Bioaumentación cultivo bacteriano 23b
T6: Bioaumentación consorcio mixto
T7: Bioaumentación cultivo bacteriano Y5 + Bioestimulación
T8: Bioaumentación cultivo bacteriano 97a + Bioestimulación
T9: Bioaumentación cultivo bacteriano 14c + Bioestimulación
T10: Bioaumentación cultivo bacteriano 60b + Bioestimulación
T11: Bioaumentación cultivo bacteriano 23b + Bioestimulación
T12: Bioaumentación consorcio mixto + Bioestimulación
T13: Testigo sin bioaumentación, sin bioestimulación
T14: Testigo con bioestimulación
T15: Testigo abiótico
38
44
36
38
36
46
36
33
46
47
35
45
32
34
0
50
52
52
50
55
60
62
62
65
64
60
66
37
38
0
64
65
69
68
58
87
87
87
84
86
90
88
48
63
0
32
34
36
34
32
52
54
54
55
55
54
58
18
24
0
Severo
Severo
Severo
Severo
Severo
Moderado
Moderado
Moderado
Moderado
Moderado
Moderado
Moderado
Severo
Severo
Severo
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ANEXO 6
Germinación de Raphanus sativus L. sembrado en el suelo experimental contaminado con hidrocarburos de petróleo a los 60 días de la
biodegradación
Tratamientos
Promedio
elongación
radicular
(mm)
Porcentaje
relativo de
germinación
(PGR)
Crecimiento
relativo de
radícula (CRR)
Índice de
germinación
(%IG)
Nivel de
fitotoxicidad
T1: Bioaumentación cultivo bacteriano Y5
T2: Bioaumentación cultivo bacteriano 97a
T3: Bioaumentación cultivo bacteriano 14c
T4: Bioaumentación cultivo bacteriano 60b
T5: Bioaumentación cultivo bacteriano 23b
T6: Bioaumentación consorcio mixto
T7: Bioaumentación cultivo bacteriano Y5 + Bioestimulación
T8: Bioaumentación cultivo bacteriano 97a + Bioestimulación
T9: Bioaumentación cultivo bacteriano 14c + Bioestimulación
T10: Bioaumentación cultivo bacteriano 60b + Bioestimulación
T11: Bioaumentación cultivo bacteriano 23b + Bioestimulación
T12: Bioaumentación consorcio mixto + Bioestimulación
T13: Testigo sin bioaumentación, sin bioestimulación
T14: Testigo con bioestimulación
T15: Testigo abiótico
44
48
42
44
46
54
40
41
55
53
52
58
42
44
40
64
64
68
58
68
70
70
65
66
65
65
70
40
44
42
87
85
82
92
82
88
87
92
97
95
92
97
57
79
14
56
55
56
58
56
62
61
60
64
62
60
68
23
35
6
Moderado
Moderado
Moderado
Moderado
Moderado
Moderado
Moderado
Moderado
Moderado
Moderado
Moderado
Moderado
Severo
Severo
Severo
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ANEXO 7
Germinación de Raphanus sativus L. sembrado en el suelo experimental contaminado con hidrocarburos de petróleo a los 90 días de la
biodegradación
Tratamientos
Promedio
elongación
radicular
(mm)
Porcentaje
relativo de
germinación
(PGR)
Crecimiento
relativo de
radícula (CRR)
Índice de
germinación
(%IG)
Nivel de
fitotoxicidad
T1: Bioaumentación cultivo bacteriano Y5
T2: Bioaumentación cultivo bacteriano 97a
T3: Bioaumentación cultivo bacteriano 14c
T4: Bioaumentación cultivo bacteriano 60b
T5: Bioaumentación cultivo bacteriano 23b
T6: Bioaumentación consorcio mixto
T7: Bioaumentación cultivo bacteriano Y5 + Bioestimulación
T8: Bioaumentación cultivo bacteriano 97a + Bioestimulación
T9: Bioaumentación cultivo bacteriano 14c + Bioestimulación
T10: Bioaumentación cultivo bacteriano 60b + Bioestimulación
T11: Bioaumentación cultivo bacteriano 23b + Bioestimulación
T12: Bioaumentación consorcio mixto + Bioestimulación
T13: Testigo sin bioaumentación, sin bioestimulación
T14: Testigo con bioestimulación
T15: Testigo abiótico
44
48
42
44
46
54
40
41
55
53
52
58
42
44
40
74
78
78
71
71
73
76
78
78
75
75
83
50
52
44
84
84
82
87
91
91
95
97
93
98
97
99
78
80
36
62
66
64
62
65
67
72
76
73
74
73
82
39
42
16
Moderado
Moderado
Moderado
Moderado
Moderado
Moderado
Moderado
Moderado
Moderado
Moderado
Moderado
Bajo
Severo
Severo
Severo
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74
ANEXO 8
Germinación de Raphanus sativus L. sembrado en el suelo experimental contaminado con hidrocarburos de petróleo a los 120 días de la
biodegradación
Tratamientos
Promedio
elongación
radicular
(mm)
Porcentaje
relativo de
germinación
(PGR)
Crecimiento
relativo de
radícula (CRR)
Índice de
germinación
(%IG)
Nivel de
fitotoxicidad
T1: Bioaumentación cultivo bacteriano Y5
T2: Bioaumentación cultivo bacteriano 97a
T3: Bioaumentación cultivo bacteriano 14c
T4: Bioaumentación cultivo bacteriano 60b
T5: Bioaumentación cultivo bacteriano 23b
T6: Bioaumentación consorcio mixto
T7: Bioaumentación cultivo bacteriano Y5 + Bioestimulación
T8: Bioaumentación cultivo bacteriano 97a + Bioestimulación
T9: Bioaumentación cultivo bacteriano 14c + Bioestimulación
T10: Bioaumentación cultivo bacteriano 60b + Bioestimulación
T11: Bioaumentación cultivo bacteriano 23b + Bioestimulación
T12: Bioaumentación consorcio mixto + Bioestimulación
T13: Testigo sin bioaumentación, sin bioestimulación
T14: Testigo con bioestimulación
T15: Testigo abiótico
52
58
50
54
57
55
60
60
65
63
62
68
54
56
48
88
84
84
82
84
82
90
89
93
93
84
98
62
64
50
85
85
88
89
89
92
95
96
91
91
94
95
85
86
60
75
72
74
73
75
76
86
86
85
85
82
94
53
55
30
Moderado
Moderado
Moderado
Moderado
Moderado
Moderado
Bajo
Bajo
Bajo
Bajo
Bajo
Bajo
Moderado
Moderado
Severo
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ANEXO 9
Prueba de homogeneidad de varianzas y análisis de varianza de los valores promedios
del índice de germinación de Raphanus sativus L.
Prueba de homogeneidad de varianzas
Estadístico de
Levene
gL1 gL2 Sig
0,945 14 30 0,566
Anova de un factor
Fuente de
variación
Suma de
cuadrados
gL
Media
cuadrática
F Sig.
Inter-grupos
Intra-grupos
Total
14060,800
68,000
14128,800
14
30
44
1004,343
2,267
443,092 0,000
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