cultivo in vitro. introduccion ii

CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES: CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES: FUNDAMENTOS Y APLICACIONES EN FUNDAMENTOS Y APLICACIONES EN

DIFERENTES ESPECIDIFERENTES ESPECIES

CURSO – TALLER DE BIOTECNOLOGIA VEGETAL

Dra. Miriam Isidrón PérezDra. Miriam Isidrón PérezDra. Miriam Isidrón PérezDra. Miriam Isidrón Pérez

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Las plantas Las plantas Las plantas Las plantas desdedesdedesdedesde el laboratorio hasta el campo.el laboratorio hasta el campo.el laboratorio hasta el campo.el laboratorio hasta el campo.

Introducción al cultivo in vitro de plantas.

Desdiferenciación / Rediferenciación.Morfogénesis de novo.

Tipo de respuestas en el cultivo in vitro de

Plática 2.

Tipo de respuestas en el cultivo in vitro de tejidos vegetales:

Organogénesis y Embriogénesis directa e indirecta.

• Existen tres conceptos básicos que fundamentan el cultivo in vitro de células y tejidos vegetales:

- Totipotencialidad celular.

- Balance de reguladores del crecimiento vegetal.

Principales conceptos fisiológicos aplicablesa los cultivosin vitro

•Desdiferenciación / Rediferenciación.

Desdiferenciación / Rediferenciación• En condiciones de laboratorio “in vitro”, se parte de

cualquier planta o de cualquier órgano de la planta(condición es que sean células vivas).

• Se puede obtener el cultivo demeristemos y ladiferenciaciónde brotesy raíces, siempreque se partadediferenciaciónde brotesy raíces, siempreque se partadeun pedazo de la planta (explante) que tenga células vivas,en condiciones y medios apropiados.

• Este es elfundamento fisiológicode la obtención de loscultivos de tejidos vegetales “in vitro”, tanto de plantasdicotiledóneas (tabaco, papa, tomate, etc.) como de plantasmonocotiledóneas ( arroz, maíz, caña de azúcar, etc.).

Desdiferención y Rediferenciación

TROZO DE TALLO CON

YEMA

Se siembra en un medio de cultivo

Explanto(asepsia)

Ambiente

• Sin respuesta

• Cultivo infectado

• Regeneración

indirecta

Respuesta

Posibles respuestas de los cultivos vegetales in vitro

(asepsia)

Cultivo

indirecta

• Regeneración

directa

Desdiferención y Rediferenciaciónproceso

MorfogénesisMorfogénesis de novo: es el resultado de unadivisión y diferenciación celular organizada conpatrones definidos, que depende básicamente dela actividad y expresión de ciertos genes.

Organogénesis Embriogénesis somática

MITOSIS UNIDIRECCIONAL MITOSIS BIDIRECCIONAL

• Posibles vías morfogenéticas:

- Organogénesis

- Embriogénesis

• Diferencias entre las dos posibles vías:

- La organogénesis es de origen pluricelular. Un grupo o cluster de células del explanto inicial se desdiferencia inicialmente para luego rediferenciarse dando lugar a un

Existen dos posibles vías morfogenéticas implicadas enla diferenciaciónde novo de brotes y/o plantas completas

inicialmente para luego rediferenciarse dando lugar a un órgano vegetal. No se obtienen por esta vía plantas completas. MITOSIS UNIDIRECCIONAL

- La embriogénesis se presupone de origen unicelular.Una célula del explanto se aísla y constituye el puntode partida para la obtención de un embrión somático.Se diferencian embriones o estructuras bipolaresque completan cada una de las etapas implicadasen la ontogenia de un embrión cigótico. El resultado es una planta completa. MITOSIS BIDIRECCIONAL

- Organogénesis :-Es de origen pluricelular.-Un grupo de células del explante inicial se desdiferenciainicialmente para luego rediferenciarse dando lugar a unbrote o a un órgano vegetal.- LA DIVISION MITOSICA ES UNIDIRECCIONAL.

- Embriogénesis :-Se presupone de origen unicelular.-Se presupone de origen unicelular.- Una célula del explante se aísla y constituye el punto departida para la obtención de un embrión somático.-Se diferencian embriones o estructuras bipolares quecompletan cada una de las etapas implicadas en laontogenia de un embrión cigótico.-LA DIVISION MITOSICA ES BIDIRECCIONAL.

Organogénesis (formación de órganos)

Formación de tallos, raíces, flores, etc.

¡¡Regeneración de una planta completa!!Explante

MITOSIS UNIDIRECCIONAL

Organogénesis

Formación de tallos Formación de raíces

Enraizamiento Tallos

Planta completa

MITOSIS UNIDIRECCIONAL

EJEMPLO DE ORGANOGENESIS DIRECTA

EJEMPLO DE ORGANOGENESIS DIRECTA

ORGANOGENESIS INDIRECTA (a partir de callo)

Embriogénesis Somática• Procedimiento para la regeneración vía

embriogénesis somática• 1. Iniciación: callos embriogénicos• 2. Proliferación: callos embriogénicos, masas

proembriogénicas (PEM)proembriogénicas (PEM)• 3. Desarrollo y maduración de embriones :

embriones• 4. Germinación de embriones (Regeneración)• Estadíos de desarrollo en dicotiledóneas:

– Masas proembriogénicas– Estadío globular– Torpedo– Embrión somático

Elección del explanto inicial

Semillas comerciales(zanahoria, tomate)

Escarificación

Esterilización

Semillas estériles

Germinación

Tritón X-100 3%, 10 minHipoclorito de Na 15%, 20 min

MS + 2,4-D

Germinación

% de germinación?

Disección bajo lupa

Esterilidad Medio de Hoagland

M. apicalHojaM. axilarTalloRaízM. radicular

Regeneración directa e indirecta MITOSIS UNIDERECCIONAL.

Organoogénesis

directa

Organogénesis

indirecta

Explanto (disco de hoja)

Explanto (células vegetales)

REGENERACIÓN

Callo

Propagación vegetativa por embriogénesis somática

Suspensión celular

Embriones somáticos

ENCAPSULACIÓN

GERMINACIÓN

GERMINACIÓN Semilla artificial

•• Caña de azúcar Caña de azúcar

•• PapayaPapaya

•• Bananos y Bananos y plátanosplátanos

•• GuayabaGuayaba•• GuayabaGuayaba

•• CaféCafé

•• CaobaCaoba

•• AnthuriumAnthurium

••Frijol Frijol

C) Formación de yemas con callo previoA) Yemas apicales y/o axilares, después raíces

Ejemplos de algunos sistemas de micropropagación

Organogénesis directa Organogénesis indirecta

B) Formación de yemas sobre explantes y después raíces

Embriogénesis somática indirecta

(ej.: tabaco, papa etc.)(ej.: piña,clavel, kiwi, manzano, etc.)

(ej.: begonia, violeta africana, etc.)

(ej.: trigo, maiz, apio, zanahoria, abeto, etc.)Organogénesis directa

D) Formación de embriones sobre callos

• La micropropagación vegetal, o propagación clonal masiva de plantas superiores, posibilita la obtenci óny cultivo de plantas a gran escala.

• Se realiza bajo estrictas condiciones de esterilid ad en un medio sintético nutritivo y con control de tempe ratura, luz y fotoperíodo.

La micropropagación constituye la principal aplicación comercial del cultivo de tejidos vegetales

Propagación vegetativa in vitroRegeneración directa e indirecta

Sistemas de propagación vegetativain vitro

Aplicaciones del Cultivo de tejidos a la conservación de GERMOPLASMA

Colecta e IntroducciColecta e IntroducciColecta e IntroducciColecta e Introduccióóóónnnn

ConservaciConservaciConservaciConservacióóóónnnn““““Ex situEx situEx situEx situ””””

En campoEn campoEn campoEn campo

““““In In In In vitrovitrovitrovitro””””

Banco de Banco de Banco de Banco de GermoplasmaGermoplasmaGermoplasmaGermoplasma

CaracterizaciCaracterizaciCaracterizaciCaracterizacióóóón n n n EvaluaciEvaluaciEvaluaciEvaluacióóóón preliminarn preliminarn preliminarn preliminar

ConservaciConservaciConservaciConservacióóóónnnn

““““In situIn situIn situIn situ””””

““““In In In In vitrovitrovitrovitro””””

DocumentaciDocumentaciDocumentaciDocumentacióóóón n n n

UsoUsoUsoUso

¿¿¿¿QUE SE CONSERVA?

foráneas

primitivas

VARIEDADES

mejoradas

Donaciones, prospecciones,

intercambio internacional

La mejora genética nacional

locales especies silvestres

Accesiones con cualidades Accesiones con cualidades

puntualizadas, cultivadas, silvestres, puntualizadas, cultivadas, silvestres,

géneros y especies afinesgéneros y especies afines

• Bancos de semillas en frigoríficos o en campo (camote, fresa)

• Colecciones in vitro a

Existendiferentes métodos parala conservaciónde germoplasma

• Colecciones in vitro a mediano plazo

• Crioconservación (largo plazo)

Conservación de Germoplasma ex situ• Conservar colecciones a partir de

colectas nacionales e introducción de material foráneo.

Conservación de semillas Botánicas

Colecciones de campo

Técnicas de almacenamiento apoyadas por BIOTECNOLOGÍA:• Colecciones in vitro.

- A corto y mediano plazo (medio mínimo, poca luz, no hormonas - Crioconservación (- 196ºC)

Botánicas

El cultivo in vitro permite sanear plantas infectadas sistémicamente por diferentes tipos de patógenos, como bacterias, hongos, virus y viroides.

Sanear antes de conservar o multiplicar

• El material vegetal infectado por virus, bacterias, hongos y/o micoplasmas puede ser tratado con diferentes técnicas:

-Termoterapia: 44 ºC ---25ºC----4horas/cu-Quimioterapia: Rivavirin 10mg/L (retroviral)- Electroterapia: 10-30Volt/5-30 minutos

- Cultivo de meristemos

Posibles metodologías utilizadas parael tratamientode plantas

•Estos tratamientos pueden usarse por separado, pero incrementan notablemente su efectividad cuando se los combina, ya sea in vivo o in vitro.

• La conservación de germoplasma se basa en limitarel crecimiento del material vegetal controlandolas condiciones del cultivo de tejidos.

• La restricción del crecimiento puede implementars epor distintas vías:

- Medios de cultivo de composición subóptima.

Colecciones in vitro o bancos de germoplasma in vitro

- Baja intensidad lumínica (< 500 lux)

- Temperaturas inferiores a las adecuadaspara el metabolismo normal de las célulasy tejidos vegetales bajo cultivo (15-20 ºC)

- Alta concentración de compuestos osmóticamente activos (sacarosa, manitol, etc.)

Crioconservación

Crioconservación en nitrógeno líquido a –196°C de temperatura de cultivos celulares de banano y plátano

Protocolo para la crioconservación y cultivode meristemas de soja

BANANOS Y PLÁTANOS (MUSA BANANOS Y PLÁTANOS (MUSA sppspp.) .) producidos por cultivo producidos por cultivo in vitroin vitro..

‘Somaclon Plátano Saba’

(ABB)

Somaclon bananao‘SH-3362’

(AA)

• La teoría de la totipotencialidad celular , enunciadapor Haberlandt a principios del siglo veinte, postula quetoda célula vegetal individual es capaz de regenerar una

planta entera a partir de un cultivo in vitro sin importar elgrado de diferenciación alcanzado. Para ello se requierencondiciones específicas referidas al medio del cultivo,relaciones hormonales, temperatura, fotoperíodo, etc.

• Todo proceso de diferenciación está regulado por elbalance entre diferentes tipos de reguladores del

crecimiento , fundamentalmente de auxinas y citocininas .

Resumen: Los fundamentos teóricosy prácticosdel cultivode tejidos vegetales

crecimiento , fundamentalmente de auxinas y citocininas .

•La desdiferenciación consiste en la transformación y pérdidade las características de especialización de un tipo celula rpara dar lugar a células de tipo meristemático. El siguientepaso involucrado en la regeneración de una planta es laredifereciación de las células previamente desdiferenciadas.