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“Estudio comparativo de los Métodos para la Cuantificación de Coliformes en
Lapan S.C.”
Pérez-Ramírez, J; Herrera-Rodríguez, P. (*)
(*)Laboratorio de análisis de Productos Agropecuarios del Norte.Instituto Tecnológico
Superior de Álamo Temapache (LAPAN-TSAT). Km 6.5 Carretera Tuxpam- Potrero del Llano.
Xoyotitla, Álamo. Ver. CP. 92750. Tel y Fax. 01 765 84 4 00 38, jacky_perezr@hotmail.com.
Resumen
En esta investigación se comparó el método para la cuenta de microorganismos
coliformes en placa de la NOM-113-SSA1-1994 con el método de recuento de
coliformes en placa petrifilm de la AOAC.
Para hacer este trabajo se analizaron tres matrices. Experimentalmente con un método
de contaminación artificial y por niveles de contaminación se detecta que hay
diferencia en la matriz de formula láctea ya que en un rango de contaminación se
obtuvo un resultado por debajo de lo esperado. En el nivel de contaminación ensayado
de 100 a 1000 se cuantifico un promedio de 30 UFC/g.
En la matriz de vegetales se determina un promedio de 84 UFC/g como Limite de
Detección ensayado (práctico), cumple con el nivel teórico esperado de 10 a 100
UFC/g.
En la matriz de salchicha se determina un promedio de 51 UFC/g como Limite de
Detección ensayado (práctico). Cumple con el nivel teórico esperado de 10 a 100
UFC/g. Con respecto a la cuantificación se analizaron 5 muestras por matriz a un nivel
que dieran una respuesta de 15-150 UFC en el conteo directo en la primera dilución, los
conteos fuera de este rango se determinan como “valor estimado para cuantificar”.
Después de evaluar 3 alimentos que fueron fortificados en 5 diferentes rangos, Punto 1:
Control negativo, Punto 2: 10-100, Punto 3: 100-1000, Punto 4: 1000-10000 Punto 5:
10000-100000 UFC/g, ya que no aplican especificaciones normativas, se concluyen las
siguientes observaciones.
Los resultados obtenidos cumplen en cada uno de los rangos esperados al ser
contaminados por la cepa de referencia Escherichia Coli ATCC10536.
.
Los resultados son significativos porque no se cuentan con materiales de referencia
cuantitativos y tampoco hay especificaciones, así que se evalúa contra el resultado de
referencia del método petrifilm. Se comprueba que el método utilizado en la
preparación de las diluciones cumple con los resultados, al obtenerse resultados
2
logarítmicos, se observa una mayor dispersión de resultados del método cuando se
trabaja a un nivel bajo de concentración de 10-100 ufc/g o ml.
En la matriz de vegetales, el resultado obtenido más bajo fue de 30 ufc/g y el más alto
fue de 28000 ufc/g, rango significativo de trabajo en ésta matriz, por lo que es
comparable con el método de referencia en placa petrifilm. En la matriz fórmula láctea
el resultado más bajo fue de 10 ufc/ml y el más alto fue de 26000 ufc/ml, rango
significativo de trabajo en esta matriz, comparable con los conteos obtenidos por el
método de referencia en placa petrifilm. En la matriz salchicha, el resultado obtenido
más bajo fue de 35 ufc/g y el más alto fue de 21000 ufc/g, significativo en ésta matriz,
que también es comparable con los conteos obtenidos por el método de referencia en
placa petrifilm.
La validación se llevo a cabo cumpliendo con todos los parámetros que se requieren en
la Norma ISO 17025 para acreditar el método ante SSA y poder demostrar la
competencia técnica del laboratorio para poder realizar el ensayo. Además de que se
está cumpliendo con los requisitos de la norma NOM-113-SSA1-1994 método para la
cuenta de microorganismos coliformes en placa para llevar a cabo el análisis, al
comparar los resultados obtenidos con el método de referencia se puede concluir que los
resultados son similares en ambos métodos, pudiendo utilizarse cualquiera de los dos
métodos para determinar coliformes en placa en el laboratorio.
PALABRAS CLAVE: Matriz Fórmula Láctea, Matriz Vegetales, Matriz Salchicha,
Norma, Petrifilm.
3
I. INTRODUCCION ...............................................................................................................4
II. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ............................................................................6
III. JUSTIFICACION ............................................................................................................6
IV. OBJETIVO GENERAL ..................................................................................................7
4.1 Objetivos específicos..........................................................................................................7
V. MATERIALES Y METODOS ...............................................................................................8
Reactivos ................................................................................................................................8
Materiales ...............................................................................................................................9
Aparatos e instrumentos .......................................................................................................9
Preparación de la muestra .................................................................................................12
Metodología ..........................................................................................................................12
5.2 Método en placa petrifilm para recuento de coliformes ...............................................14
5.2.1 Requerimientos ..........................................................................................................14
5.2.2 Procedimiento ............................................................................................................15
5.3. Procedimiento estadístico...............................................................................................16
VI. RESULTADOS ...................................................................................................................17
6.1 Pruebas previas de validación ........................................................................................17
6.2 Evaluación de los medios de cultivo .............................................................................17
6.3 Determinación del nivel de inoculo .................................................................................18
6.4 Selección de matrices ......................................................................................................19
6.5 Parámetros de Validación ................................................................................................19
6.5.1 Limite de detección ....................................................................................................19
6.5.2 Limite de cuantificación .............................................................................................21
6.5.3 Linealidad ..................................................................................................................22
6.5.4 REPETIBILIDAD ........................................................................................................29
6.5.5 REPRODUCIBILIDAD...............................................................................................33
6.5.6 SESGO .......................................................................................................................38
6.5.7 SELECTIVIDAD .........................................................................................................39
VII.CONCLUSIONES ..............................................................................................................42
VIII. RECOMENDACIONES...................................................................................................42
IX.BIBLIOGRAFIA ...................................................................................................................43
PAGINAS WEB CONSULTADAS .........................................................................................45
4
I. INTRODUCCION
La calidad e inocuidad de los alimentos destinados a la exportación han
adquirido gran importancia en América Latina. Según la Organización Mundial
del Comercio (OMC), el comercio mundial de alimentos en 1999 fue de 437 mil
millones de dólares y se espera que aumente.
En América Latina y el Caribe, cuyo ingreso en divisas depende principalmente
de la exportación de productos básicos, la exportación de alimentos representa
un tercio de las exportaciones de la región, con una participación del 9,5 por
ciento del comercio mundial de alimentos. Con los recursos adicionales que
podrían disponer los países al tener un acceso más amplio a los mercados,
podrían hacer frente más fácilmente a los problemas de inseguridad alimentaria
y la pobreza.
El acceso a los exigentes mercados importadores se ve afectado por el hecho
de que los gobiernos e industrias de los países de la región están poco
familiarizados con los requisitos de los países importadores de alimentos. La
Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA),
durante el primer semestre de 2004, ha retenido 451 importaciones
provenientes de países de América del Sur, de las cuales 182 han sido
rechazadas por motivos de inocuidad.
En el comercio internacional la tendencia es exigir que los productores y
exportadores puedan asegurar la inocuidad del producto desde el lugar de
origen hasta el punto de consumo. Esto debe estar garantizado mediante
certificados emitidos por organismos reconocidos y con certificados de análisis
acreditados.
A nivel internacional desde junio de 1997, la Comisión del Codex Alimentarius
recomienda que los laboratorios responsables del control de exportación e
importación de alimentos cumplan con los requisitos de la norma ISO/IEC
5
17025 y sean acreditados por un organismo competente. Por otra parte el
Comité del Codex de Métodos de Análisis y Muestreo (CX/MAS) sólo
recomienda métodos acreditados con la norma ISO/IEC 17025, ya que cumple
con los requisitos de competencia en los ensayos en el laboratorio para
garantizar la calidad de los análisis.
La Directiva 93/99 EEC de la Unión Europea, en vigencia, establece que los
laboratorios centrales de control de alimentos deberán acreditarse con normas
internacionalmente reconocidas como la ISO/IEC 17025, participar en
programas interlaboratorio y emplear métodos validados.
En particular, los resultados obtenidos por los laboratorios de microbiología
basados en principios de aseguramiento de calidad, validados y acreditados
son internacionalmente reconocidos y considerados de referencia para la
evaluación de conformidad de los productos de intercambio en el comercio
internacional.
La demostración y la cuenta de microorganismos coliformes, puede realizarse
mediante el empleo de medios de cultivos líquidos o sólidos con características
selectivas o diferenciales.
El número de organismos se establece mediante la cuenta de unidades
formadoras de colonias (NOM-113-SSA1-1994. Método para la Cuenta de
Microorganismos Coliformes Totales en Placa). Esta Norma Oficial Mexicana
establece el método microbiológico para determinar el número de
microorganismos coliformes totales presentes en productos alimenticios por
medio de la técnica de cuenta en placa.
6
II. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
El Laboratorio De Análisis De Productos Agropecuarios Del Noreste S.C.,
trabaja en el área de microbiología con 6 métodos validados por SAGARPA,
Con la finalidad de crecer cada día más en el ámbito laboral se quieren
implementar métodos del área de SSA de acuerdo a pruebas efectivas que
cumplan con los requisitos particulares de las normas donde se establecen los
procedimientos para dichos métodos de SSA, uno de los métodos es el de la
NOM-113-SSA1-1994 RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES EN PLACA
Se requiere validar y acreditar el método comparándolo con el método de
referencia de RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES EN PLACA
PETRIFILM de la AOAC (Association of Analytical Communities).
III. JUSTIFICACION
Al validar el método de Coliformes totales en placa se está cumpliendo un
punto de la Norma ISO 17025 por la cual se rige y se califica el laboratorio
como competente para realizar el análisis, en los Requisitos Técnicos apartado
5.4 Métodos de Ensayo y Calibración y Validación de los Métodos de la Norma
ISO/IEC17025:2005 dice:
“Se deben emplear los métodos y los procedimientos más indicados para cada
ensayo y/o calibración. Se debe garantizar el muestreo, la manipulación, el
transporte, la preparación, y todas aquellas fases que conformen la operación
de ensayo o calibración precisa. Se debe ser riguroso en la selección de
método cuando el cliente no lo especifique, se seleccionarán métodos
publicados en normas internacionales, nacionales, o en revistas o por
fabricantes de prestigio. Los métodos empleados han debido ser previamente
validados. El cliente debe ser informado del método a elegir. La incorporación
de métodos de ensayos y calibración desarrollados por el laboratorio para su
propio uso debe ser de un modo planificado y contar con personal debidamente
calificado y provisto con los recursos adecuados. En caso de emplear métodos
no normalizados, deben ser acordados con el cliente incluyendo unas
especificaciones y la finalidad del mismo. En todo caso el método desarrollado
7
debe haber sido validado convenientemente antes de su uso. La validación
consiste en la confirmación mediante examen y la demostración de evidencias
objetivas que demuestren el cumplimiento de ciertos requisitos para el uso
específico previsto. Es decir es comprobar que una actividad es apta para el fin
hacia el que va orientada, en este caso un método que debe ser por ello
validado”.
La Norma NOM-113-SSA1-1994 RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES
EN PLACA cumple con los requerimientos necesarios para llevar a cabo la
validación del análisis ya que esta dentro de la organización SSA siendo un
punto importante para LAPAN S.C. ya que no cuenta con análisis validados por
SSA hasta este momento solo se trabaja con métodos validados por
SAGARPA, así se obtendrá un método nuevo con el cual se beneficia la
empresa económicamente, creciendo en el campo laboral y ofreciendo nuevos
análisis a los diferentes clientes con los que trabaja al realizar los análisis de
sus productos.
IV. OBJETIVO GENERAL
Validar y Comparar el método para la cuenta de microorganismos coliformes en
placa de la NOM-113-SSA1-1994 con el método de recuento de coliformes en
placa petrifilm de la AOAC (Association of Analytical Communities).
4.1 Objetivos específicos
Validar la norma NOM-113-SSA1-1994 método para la cuenta de
coliformes totales en placa.
Comparar los resultados del método de la Norma Oficial Mexicana con el
de la AOAC (Association of Analytical Communities).
Comprobar que ambos métodos son eficientes en el recuento de
coliformes.
Confirmar que el laboratorio puede aplicar correctamente los métodos
normalizados antes de utilizarlos para el ensayo.
8
V. MATERIALES Y METODOS
5.1 Método para la cuenta de microorganismos coliformes en placa
El número de organismos se establece mediante la cuenta de unidades
formadoras de colonias (NOM-113-SSA1-1994. Método para la cuenta de
Microorganismos Coliformes Totales en placa). Esta Norma oficial Mexicana
establece el método microbiológico para determinar el número de
microorganismos coliformes totales presentes en productos alimenticios por
medio de la técnica cuenta en placa, se debe mencionar que esta Norma es de
observancia obligatoria en el territorio nacional para las personas físicas y
morales que requieran efectuar este método en productos nacionales o de
importación, para fines oficiales.
El método permite determinar el número de microorganismos coliformes
presentes en una muestra, utilizando un medio selectivo Agar Rojo Violeta Bilis
Lactosa (rvba) en el que se desarrollan bacterias a 35ºC en aproximadamente
24 hrs. dando como resultado la producción de gas y ácidos orgánicos los
cuales viran el indicador de pH y precipitan las sales biliares.
Reactivos
Solución reguladora de fosfatos (solución concentrada)
INGREDIENTES CANTIDADES
Fosfato monopotásico 34,0 g
Agua 1,0 l
Agua peptonada
INGREDIENTES CANTIDADES
Peptona 1,0 g
NaCl 8,5 g
Agua 1,0 l
9
Agar-rojo- violeta-bilis-lactosa (rvba)
INGREDIENTES CANTIDADES
Peptona 7,0 g
Extracto de levadura 3,0 g
Lactosa 10,0 g
Sales biliares 1,5 g
Cloruro de sodio 5,0 g
Rojo neutro 0,03 g
Cristal violeta 0,002 g
Agar 15,0 g
Agua 1,0 l
Materiales
Pipetas bacteriológicas
Frascos de vidrio de 250 ml con tapón de rosca.
Tubos de 16 X 150 mm con tapón de rosca.
Utensilios esterilizables para la obtención de muestras: cuchillos, pinzas,
tijeras, cucharas, espátulas, etc.
Cajas Petri.
Aparatos e instrumentos
Horno para esterilizar que alcance una temperatura mínima de 170°C.
Autoclave con termómetro y manómetro, calibrada con termómetro de
máximas y mínimas.
Baño de agua con control de temperatura y circulación mecánica,
provista con termómetro calibrado con divisiones de 0,1° C y que
mantenga la temperatura a 45 ± 1,0°C.
Licuadora de una o dos velocidades controladas por un reóstato o bien
un homogeneizador peristáltico (Stomacher).
Vasos para licuadora con tapa esterilizables o bolsas estériles para
homogeneizador peristáltico.
10
Incubadora con termostato que evite variaciones mayores de ± 1,0° C,
provista con termómetro calibrado.
Contador de colonias de campo oscuro, con luz adecuada, placa de
cristal cuadriculada y lente amplificador.
Registrador mecánico o electrónico.
Microscopio óptico.
Potenciómetro con una escala mínima de 0,1 unidades de pH a 25 °C.
11
12
Preparación de la muestra
La preparación de la muestra debe ser de acuerdo a lo establecido en la NOM-
110-SSA1-1994 "Preparación y Dilución de Muestras de Alimentos para su
Análisis Microbiológico".
Metodología
PESAR 10 gr DE MUESTRA
HOMOGENEIZAR LA MUESTRA
REALIZAR DILUCIONES DECIMALES
DEPOSITAR 1 ml DE CADA DILUCION EN CAJAS PETRI
POR DUPLICADO
VERTER 4 ml DEL MEDIO RVBA EN LA SUPERFICIE
DEL MEDIO INOCULADO
ADICIONAR 15 A 20 ml DEL MEDIO RVBA FUNDIDO Y
MANTENIDO A 45°C
HOMOGENEIZAR LA MUESTRA CON MOVIMIENOS
ROTATORIOS
INCUBAR LAS CAJAS EN POSICION INVERTIDA
CONTAR LAS PLACAS QUE DEN UN CONTEO DE
15 A 150 COLONIAS.
13
1. Colocar en cajas Petri por duplicado 1 ml de la muestra líquida directa o
de la dilución primaria, utilizando para tal propósito una pipeta estéril.
2. Repetir el procedimiento tantas veces como diluciones decimales se
requiera sembrar, utilizando una pipeta estéril diferente para cada
dilución.
3. Verter de 15 a 20 ml del medio RVBA fundido y mantenido a 45 ± 1,0°C
en baño de agua. En el caso de utilizar cajas de Petri de plástico se
vierte de 10 a 15 ml del medio. El tiempo transcurrido entre la
preparación de la dilución primaria y el momento en que se vierte el
medio de cultivo, no debe exceder de 20 minutos.
4. Mezclar cuidadosamente el inóculo con el medio con seis movimientos
de derecha a izquierda, seis movimientos en el sentido de las manecillas
del reloj, seis movimientos en el sentido contrario al de las manecillas
del reloj y seis de atrás para adelante, sobre una superficie lisa y
nivelada. Permitir que la mezcla solidifique dejando las cajas Petri
reposar sobre una superficie horizontal fría.
5. Preparar una caja control con 15 ml de medio para verificar la
esterilidad.
6. Después de que está el medio completamente solidificado en la caja,
verter aproximadamente 4 ml del medio RVBA a 45 ± 1,0°C en la
superficie del medio inoculado. Dejar que solidifique.
7. Invertir las placas y colocarlas en la incubadora a 35°C, durante 24 ± 2
horas.
8. Después del periodo especificado para la incubación, contar las colonias
con el contador de colonias.
9. Seleccionar las placas que contengan entre 15 y 150 colonias. Las
colonias típicas son de color rojo oscuro, generalmente se encuentran
rodeadas de un halo de precipitación debido a las sales biliares, el cual
es de color rojo claro o rosa, la morfología colonial es semejante a lentes
biconvexos con un diámetro de 0,5 a 2,0 mm.
14
5.2 Método en placa petrifilm para recuento de coliformes
La placa Petrifilm para Recuento de Coliformes es un sistema de medio de
cultivo listo para ser usado, que contiene los nutrientes de Bilis Rojo-Violeta
(VRB), un agente gelificante soluble en agua fría y un indicador tetrazolio
(TTC), que facilita la enumeración de las colonias.
Pueden ser usadas para alimentos y monitoreo ambiental, son rápidas y fáciles
de usar, siguiendo los pasos a continuación descritos:
1. Preparar la muestra
2. Inocular y distribuir 1 ml de la muestra sobre la placa Petrifilm
3. Incubar a la temperatura apropiada durante 24 horas.
4. Contar todas las colonias de color rojo. Asociadas a gas (AOAC) o bien
todas las colonias de color rojo con o sin gas (AFNOR) como coliformes.
5.2.1 Requerimientos
Para su uso se necesita:
Estufa incubadora (para temperaturas entre 30 y 37°C)
Diluyentes estériles (use alguno de los siguientes diluyentes: tampón
Butterfield, agua peptonada al 0,1%, diluyente de sal peptonada (método
ISO 6887), Agua peptonada tamponada, solución salina (0,85 a 0,90%),
caldo letheen libre de bisulfito, o agua destilada).
15
Material de laboratorio (pipetas, vasos, bolsas de muestreo, balanzas,
(etc.)
Refrigerador para el almacenamiento de placas (Nota: los envases de
placas Petrifilm sellados deben ser almacenados a Temperaturas ≤ 8 °C.
Una vez abiertos se almacenan a Temperatura ambiente).
Método de destrucción de placas usadas. (Autoclave o Incineración).
5.2.2 Procedimiento
Solo se requieren 3 pasos:
1. Inocule 1 ml de la dilución de la muestra y espárzalo.
2. Incube a la temperatura apropiada.
3. Cuente las colonias.
Son un método consistente de análisis y fácil de realizar, por lo que se reducen
las oportunidades de error cuando se compara contra otros métodos. La
cuadrícula de fondo facilita el conteo de las colonias, entregando resultados
rápidos, precisos y consistentes. Las Placas Petrifilm pueden leerse también en
un contador de colonias tipo Québec u otro tipo lupa con luz.
Un tinte indicador rojo provee un mejor contraste para facilitar el conteo de las
colonias y la lámina superior atrapa el gas producido por los Coliformes en
forma de burbujas. Las colonias confirmadas de Coliformes son rojas y se
encuentran asociadas a burbujas de gas. Los no Coliformes se colorean de rojo
pero no están asociadas a burbujas de gas.
16
5.3. Procedimiento estadístico
Se utilizara la evacuación de regresión lineal en el parámetro de Linealidad
para saber la proporcionalidad entre la concentración del analito y su
respuesta. Se determinó los parámetros siguiendo la fórmula general de la
recta.
y = a + bx Se trabajara con la formula de Desviación Estándar par los parámetros de
repetibilidad y reproducibilidad.
Para llevar a cabo la estimación en la diferencias de la precisión de 2 analistas
se compara la precisión de analistas usando la prueba de F para varianzas de
dos muestras usando α=0.05 Y también se lleva a cabo el análisis de la prueba
de t para dos muestras donde se suponen varianzas iguales.
En el parámetro de selectividad se trabajara con la formula de especificidad:
Para determinar la capacidad del método de distinguir el analito o
microorganismo de interés entre otras sustancias o microorganismos
interferentes, para demostrar que el método es especifico para cada
determinación indicada en el procedimiento de análisis.
17
VI. RESULTADOS
6.1 Pruebas previas de validación
El tipo de Análisis que se va a llevar a cabo es un Análisis Cuantitativo
haciendo una validación parcial del Método de la norma NOM-113-SSA1-1994.
En la siguiente tabla se muestra la evaluación de los medios de cultivo
utilizando como cepa control positivo Escherichia coli ATCC 10536 y cepas de
control negativo Staphylucoccus Aureus ATCC 25963, Enterobacter aerogenes
ATCC 13048 donde el medio a evaluar es el Agar bilis rojo violeta (RVBA)
Marca: BD Difco, Catalogo: 211695 Lote 9061762. Utilizando el medio de
referencia ACS: Agar cuenta estándar. Marca: BD Difco, Catálogo: 247940,
Lote: 6170172. Para la determinación de Coliformes en Placa.
6.2 Evaluación de los medios de cultivo
El objetivo es definir la metodología para evaluar la productividad y selectividad
de medios de cultivo utilizados en el laboratorio de microbiología. {Norma
ISO/TS 11133-2:2000}. Para la interpretación de los resultados de todas las
pruebas es necesario comparar la cantidad de crecimiento sobre el medio a
evaluar con respecto al crecimiento sobre un medio de referencia. El uso de un
medio de referencia específico es obligatorio en los métodos cuantitativos.
Fecha de evaluación: 2010-Agosto-17
Cepa de prueba
% T
suspensión madre
Dilución 10 -6
Dilución 10-7
Dilución 10 -8
ACS
RVBA
ACS
RVBA
ACS
RVBA
E.aerogenes
43,67 %
MNC
MNC
158
67
17
10
E. coli
55,81 %
375
238
43
31
2
5
S. aureus
44,00 %
MNC
0
UFC/ml
MNC
0
117
0
18
6.3 Determinación del nivel de inoculo
Por los resultados obtenidos en la evaluación de los medios de cultivo se
determinó utilizar como control la dilución 10-7 de la suspensión madre de la
cepa de referencia (control positivo).
Tabla 4: Resultados de los controles sembrados en la dilución 10-7 por el
método de Petrifilm.
Fecha % T
dilución
madre
Resultado del
control UFC/ml
Estimado de la
solución madre
Log
solución
madre
10-08-17 55,81 43 430000000 8,63
10-09-01 61,85 26 260000000 8,41
10-09-02 61,65 22 220000000 8,34
10-09-03 61,83 24 240000000 8,38
10-09-04 60,53 21 210000000 8,32
10-09-09 58,84 9 90000000 7,95
10-09-10 55,00 27 270000000 8,43
Promedios 24,57 245700000 8,35
Valor asignado en la dilución: 10-7 = 24,57 UFC/ ml
A partir de la cuantificación en la dilución 10-7
se determina los siguientes
valores para contaminar (fortificar) artificialmente las muestras de validación
Tabla 5: valores para contaminación artificial de la muestra.
Nivel de
inoculo
UFC/g
Dilución decimal
utilizada
ml/dilución
1-10 2ml/ 10-7
10-100 1ml/ 10-6
100-1000 1ml/ 10-5
1000-10000 1ml/ 10-4
19
10000-
100000
1ml/ 10-3
6.4 Selección de matrices
Para escoger los tipos de matrices a validar se debe considerar los tipos de
matrices por los cuales esta especificada la norma de referencia. La selección
de las matrices a evaluar se llevo de acuerdo a la categoría de
microorganismos no patógenos.
Tabla 6: Selección de Matrices a validar.
Microorganismo (genero,
especie y colección)
Matriz a validar: (categoría de
alimento/producto)
Escherichia coli ATCC 10536 Frutas y vegetales / Vegetales precocidos congelados
Lácteos / Fórmula láctea ultrapasteurizada
Productos cárnicos / Salchichas ahumadas de pollo
6.5 Parámetros de Validación
6.5.1 Limite de detección
Es el número mínimo de microorganismos que pueden ser detectados por el
método, pero en cantidades que no pueden estimarse con precisión.
Se analizaron 5 muestras por matriz a un nivel que de un conteo de 1-10 UFC
(1 ml dil 10-7) en el conteo de la primera dilución, obteniéndose los siguientes
resultados:
MATRIZ VEGETALES
Número de muestra Nivel de contaminación
(UFC/g)
Resultado (UFC/g)
Resultado (log UFC/g)
LIMITE DETECCION1 10-100 80 1,90
LIMITE DETECCION 2 10-100 90 1,95
20
LIMITE DETECCION 3 10-100 90 1,95
LIMITE DETECCION 4 10-100 80 1,90
LIMITE DETECCION 5 10-100 80 1,90
PROMEDIO
84
1,92
MATRIZ FORMULA LACTEA
Número de muestra Nivel de contaminación
(UFC/g)
Resultado (UFC/g)
Resultado (log UFC/g)
LIMITE DETECCION 6 100-1000 40 1,60
LIMITE DETECCION 7 100-1000 25 1,39
LIMITE DETECCION 8 100-1000 30 1,47
LIMITE DETECCION 9 100-1000 25 1,39
LIMITE DETECCION 10 100-1000 30 1,47
PROMEDIO
30
1,47
MATRIZ SALCHICHA
Número de muestra Nivel de contaminación
(UFC/g)
Resultado (UFC/g)
Resultado (log UFC/g)
LIMITE DETECCION 11 10-100 60 1,77
LIMITE DETECCION 12 10-100 60 1,77
LIMITE DETECCION 13 10-100 35 1,54
LIMITE DETECCION 14 10-100 60 1,77
LIMITE DETECCION 15 10-100 40 1,60
PROMEDIO
51
1,69
El Límite de Detección teórico es de 10 UFC/g o UFC/ml, al tener el conteo de
1 UFC en la primera dilución, experimentalmente con un método de
contaminación artificial por niveles de contaminación se llega a la conclusión de
que hay diferencia en las matriz de formula láctea ya que en un rango de
contaminación se obtuvo por debajo de lo esperado, ya que el nivel de
contaminación ensayado de 100 a 1000 se cuantifica un promedio de 30
UFC/g.
En la matriz de vegetales se llega a determinar un promedio de 84 UFC/g como
Limite de Detección ensayado (práctico), cumple con el nivel teórico esperado
de 10 a 100 UFC/g.
21
En la matriz de salchicha se llega a determinar un promedio de 51 UFC/g como
Limite de Detección ensayado (práctico). Cumple con el nivel teórico esperado
de 10 a 100 UFC/g.
6.5.2 Limite de cuantificación
Número mínimo de microorganismos dentro de una variabilidad definida que
puede determinarse en las condiciones experimentales del método evaluado.
Tomar en cuenta la incertidumbre del método para valores bajos.
Se analizaron 5 muestras por matriz a un nivel que dieran una respuesta de
15-150 UFC en el conteo directo en la primera dilución, los conteos fuera de
este rango se determinan como “valor estimado para cuantificar”.
MATRIZ VEGETALES
Número de muestra Nivel de contaminación
(UFC/g)
Resultado (UFC/g)
Resultado (log UFC/g)
LIM CUANTIFICAC 1 100-1000 340 2,53
LIM CUANTIFICAC 2 100-1000 230 2,36
LIM CUANTIFICAC 3 100-1000 240 2,38
LIM CUANTIFICAC 4 100-1000 330 2,51
LIM CUANTIFICAC 5 100-1000 270 2,43 PROMEDIO 282 2.45
MATRIZ FORMULA LACTEA
Número de muestra Nivel de contaminación
(UFC/g)
Resultado (UFC/g)
Resultado (log UFC/g)
LIM CUANTIFICAC 6 100-1000 330 2,51
LIM CUANTIFICAC 7 100-1000 270 2,43
LIM CUANTIFICAC 8 100-1000 310 2,49
LIM CUANTIFICAC 9 100-1000 280 2,44
LIM CUANTIFICAC 10 100-1000 310 2,49
PROMEDIO 300 2,47
22
MATRIZ SALCHICHA
Número de muestra Nivel de contaminación
(UFC/g)
Resultado (UFC/g)
Resultado (log UFC/g)
LIM CUANTIFICAC 11 100-1000 220 2,34
LIM CUANTIFICAC 12 100-1000 210 2,32
LIM CUANTIFICAC 13 100-1000 200 2,30
LIM CUANTIFICAC 14 100-1000 160 2,20
LIM CUANTIFICAC 15 100-1000 200 2,30
PROMEDIO 198 2,29
Los conteos obtenidos de esta fase se determinaron dentro de un rango de 15
a 150 UFC, se estableció la contaminación artificial en un nivel de 100-1000
ufc/g, los resultados cumplen dentro del conteo esperado.
6.5.3 Linealidad
Capacidad del método cuando se utiliza con una matriz dada a dar resultados
que están en proporción a la cantidad de analito en la muestra, es decir, un
aumento en la sustancia analizada corresponde aun lineal o proporcional.
Se contaminaron (fortificaron) 3 productos que pertenecen a 3 diferentes
grupos de alimentos, por 3 días diferentes, aplicados por duplicado aplicados
por el método de referencia con placas petrifilm y por el método de la NOM 113
SSA1 1994 con la cepa Escherichia coli ATCC 10536.
Las matrices trabajadas fueron:
Vegetales precocidos congelados
Formula Láctea ultra pasteurizada
Salchichas de pollo
Se contaminaron en los rangos de:
Punto 1: Control negativo
Punto 2: 10-100,
Punto 3: 100-1000,
Punto 4: 1000-10000
Punto 5: 10000-100000 UFC/g
23
Obteniéndose los siguientes resultados:
DIA 1
Matriz
Nivel de contamina
ción (UFC/g o
ml)
Resultados en 10 g (UFC/g o UFC/ml)
Resultado (log UFC/g o UFC/ml)
Método NOM 013
Método PETRIFIL
M
Método NOM 013
Método PETRIFIL
M
Control negativo vegetales
<10 <10 <10 N/A N/A
Vegetales 10-100 55 55 1,74 1,74
Vegetales 100-1000 810 440 2,90 2,64
Vegetales 1000-10000 3200 2900 3,50 3,46
Vegetales 10000-1000000
28000 28000 4,44 4,44
Control negativo fórmula láctea
<10 <10 <10 N/A N/A
Formula Láctea 10-100 10 25 1 1,40
Formula Láctea 100-1000 120 270 2,08 2,43
Formula Láctea 1000-10000 1400 2700 3,14 3,43
Formula Láctea 10000-100000
26000 30000 4,41 4,47
Control negativo salchicha
<10 <10 <10 N/A N/A
Salchicha 10-100 35 20 1,54 1,30
Salchicha 100-1000 180 310 2,25 2,50
Salchicha 1000-10000 2500 3400 3,40 3,53
Salchicha 10000-100000
21000 26000 4,32 4,41
24
DIA 2
Matriz
Nivel de contamina
ción (UFC/g o
ml)
Resultados en 10 g (UFC/g o UFC/ml)
Resultado (log UFC/g o UFC/ml)
Método NOM 013
Método PETRIFIL
M
Método NOM 013
Método PETRIFILM
Control negativo vegetales
<10 <10 <10 N/A N/A
Vegetales 10-100 30 10 1,47 1
Vegetales 100-1000 180 190 2,25 2,27
Vegetales 1000-10000
2000 1900 3,30 3,27
Vegetales 10000-100000
15000 18000 4,17 4,25
Control negativo fórmula láctea
<10 <10 <10 N/A N/A
Formula Láctea 10-100 15 20 1,17 1,30
Formula Láctea 100-1000 180 180 2,25 2,25
Formula Láctea 1000-10000
550 1900 2,74 3,27
Formula Láctea 10000-100000
9900 28000 4,00 4,44
Control negativo salchicha
<10 <10 <10 N/A N/A
Salchicha 10-100 <10 20 0.70 1,30
Salchicha 100-1000 110 230 2,04 2,36
Salchicha 1000-10000
1700 2100 3,23 3,32
Salchicha 10000-100000
8700 17000 3,93 4,23
25
DIA 3
Matriz
Nivel de contamina
ción (UFC/g o
ml)
Resultados en 10 g (UFC/g o UFC/ml)
Resultado (log UFC/g o UFC/ml)
Método NOM 013
Método PETRIFIL
M
Método NOM 013
Método PETRIFILM
Control negativo vegetales
<10 <10 <10 N/A N/A
Vegetales 10-100 60 60 1,77 1,77
Vegetales 100-1000 160 290 2,20 2,46
Vegetales 1000-10000
1600 2700 3,20 3,43
Vegetales 10000-100000
20000 35000 4,30 4,54
Control negativo fórmula láctea
<10 <10 <10 N/A N/A
Formula Láctea 10-100 20 45 1,30 1,65
Formula Láctea 100-1000 110 280 2,04 2,44
Formula Láctea 1000-10000
1000 2100 3 3,32
Formula Láctea 10000-100000
7300 26000 3,86 4,41
Control negativo salchicha
<10 <10 <10 N/A N/A
Salchicha 10-100 45 40 1,65 1,60
Salchicha 100-1000 230 300 2,36 2,47
Salchicha 1000-10000
2400 2900 3,38 3,46
Salchicha 10000-100000
21000 25000 4,32 4,39
Se obtienen las siguientes gráficas por las matrices trabajadas:
26
Figura 1: linealidad matriz vegetales comparando los resultados de la norma con
los de las placa petrifilm.
Figura 2: linealidad matriz formula láctea comparando los resultados de la norma
con los de la placa petrifilm
MATRIZ VEGETALES y = 1.0796x - 0.2324
R2 = 0.9717
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
0 1 2 3 4 5
LOG UFC/g NOM
LO
G U
FC
/g
PE
TR
IFIL
M
MATRIZ FORMULA LACTEA y = 0.9636x - 0.2128
R2 = 0.9768
0
1
2
3
4
5
0 1 2 3 4 5
LOG UFC/g NOM
LO
G U
FC
/g P
ET
RIF
ILM
27
Figura 3: linealidad matriz salchicha de pollo comparando los resultados de la
norma con los de las placa petrifilm
Figura 4: regresión lineal del método
MATRIZ SALCHICHA DE POLLO y = 1.0504x - 0.044
R2 = 0.9814
0
1
2
3
4
5
0 1 2 3 4 5
LOG UFC/g NOM
LO
G U
FC
/G P
ET
RIF
ILM
REGRESION LINEAR DEL METODO
y = 0.9996x + 0.1564
R2 = 0.9566
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
0 1 2 3 4 5
LOG NOM (UFC/G)
LO
G P
ET
RIF
ILM
(U
FC
/G)
28
Se obtienen los siguientes resultados:
Categoría de alimento
Producto ensayado/Microorganismo
(género, especie y colección)
Regresión lineal
R2
Frutas y vegetales
Vegetales pre cocidos congelados /
Escherichia coli ATCC 10536
y = 0,08x - 0,23 0,9717
Lácteos Formula Láctea ultra pasteurizada
/Escherichia coli ATCC 10536
y = 0,96x - 0,21 0,9718
Productos cárnicos
Salchichas ahumadas de pollo/
Escherichia coli ATCC 10536
y = 1,05x - 0,04 0,9814
La ecuación de regresión linear del método de todas las categorías de
alimento es la siguiente
y = 0,9996X + 0,1564
Después de evaluar 3 alimentos que fueron fortificados en 5 diferentes rangos,
Punto 1: Control negativo, Punto 2: 10-100, Punto 3: 100-1000, Punto 4: 1000-
10000 Punto 5: 10000-100000 UFC/g, ya que no aplican especificaciones
normativas, se concluyen las siguientes observaciones,
-Los resultados obtenidos cumplen en cada uno de los rangos esperados al ser
contaminados por la cepa de referencia Escherichia Coli ATCC10536.
-Todos los resultados se aplicaron por los dos métodos en placas petrifilm y
medio Rojo Bilis Verde Brillante y se evalúan comparando los resultados.
-Los resultados son significativos porque no se cuentan con materiales de
referencia cuantitativos y tampoco hay especificaciones, así que se evalúa
contra el resultado de referencia del método petrifilm.
29
-Se comprueba que el método utilizado en la preparación de las diluciones
cumple con los resultados, ya que se obtienen resultados logarítmicos.
-Se observa una mayor dispersión de resultados del método cuando se trabaja
un nivel bajo de concentración de 10-100 ufc/g o ml.
MATRIZ VEGETALES
- El resultado obtenido más bajo fue de 30 ufc/g y el más alto fue de 28000
ufc/g, este es el rango significativo de trabajo en esta matriz.
-Se obtienen resultados muy similares entre los conteos obtenidos por el
método de referencia en placa petrifilm
MATRIZ FORMULA LACTEA
- El resultado obtenido más bajo fue de 10 ufc/ml y el más alto fue de 26000
ufc/ml, este es el rango significativo de trabajo en esta matriz.
-Se obtienen resultados muy similares entre los conteos obtenidos por el
método de referencia en placa petrifilm
MATRIZ SALCHICHA
- El resultado obtenido más bajo fue de 35 ufc/g y el más alto fue de 21000
ufc/g, este es el rango significativo de trabajo en esta matriz.
-Se obtienen resultados muy similares entre los conteos obtenidos por el
método de referencia en placa petrifilm
-Se obtienen resultados muy similares entre los conteos obtenidos por el
método de referencia en placa petrifilm en las 3 matrices.
6.5.4 REPETIBILIDAD
Precisión en condiciones de reproducibilidad.
Se contaminaron (fortificaron) y analizaron a un nivel de 1000 – 10000 UFC/g
ó UFC/ml 3 muestras de cada matriz por 3 días diferentes obteniéndose los
siguientes resultados:
30
Día 1
No Muestra
Matriz
Nivel de contaminación
UFC/g o UFC/ml
Resultado UFC/g o UFC/ml
log UFC/g o UFC/ ml
REPETIBILIDAD 1 Vegetales 1000-10000 1200 3,07 REPETIBILIDAD 2 Vegetales 1000-10000 1500 3,17
REPETIBILIDAD 3 Vegetales 1000-10000 1600 3,20 Promedio: 1433 3,14
REPETIBILIDAD 4 Fórmula láctea
1000-10000 1700 3,23
REPETIBILIDAD 5 Formula láctea
1000-10000 1200 3,07
REPETIBILIDAD 6 Fórmula láctea
1000-10000 990 2,99
Promedio: 1296 3,09
REPETIBILIDAD 7 Salchicha 1000-10000 2600 3,41 REPETIBILIDAD 8 Salchicha 1000-10000 2400 3,38
REPETIBILIDAD 9 Salchicha 1000-10000 2500 3,39
Promedio: 2500 3,39
PROMEDIO 1743 3.21
DESVIACIÓN ESTÁNDAR log ufc/gr o ml (s) 0,154
Cálculo de Repetibilidad del día 1
Se determina obteniendo la desviación estándar s
s =√Σ(xi – x)2 n-1 grados de libertad
n-1
Sr (log ufc/g o ml) = 0,15
Se determina el coeficiente de variación en el día 1:
MATRIZ S X % CV
VEGETALES 208.1666 1433.333 14.52325
FORMULA LACTEA 364.7373 1296.667 28.12884
SALCHICHA 100 2500 4
31
Día 2
No Muestra
Matriz
Nivel de contaminación
UFC/g o UFC/ml
Resultado UFC/g o UFC/ml
log UFC/g o UFC/ ml
REPETIBILIDAD 1 Vegetales 1000-10000 2700 3,43
REPETIBILIDAD 2 Vegetales 1000-10000 2500 3,39 REPETIBILIDAD 3 Vegetales 1000-10000 2600 3,41
Promedio: 2600 3,41 REPETIBILIDAD 4 Fórmula
láctea 1000-10000 1960 3,29
REPETIBILIDAD 5 Formula láctea
1000-10000 2000 3,30
REPETIBILIDAD 6 Fórmula láctea
1000-10000 1900 3,27
Promedio: 1953 3,29 REPETIBILIDAD 7 Salchicha 1000-10000 2100 3,32
REPETIBILIDAD 8 Salchicha 1000-10000 2370 3,37 REPETIBILIDAD 9 Salchicha 1000-10000 2400 3,38
Promedio: 2290 3,35 PROMEDIO 2266 3,35
DESVIACIÓN ESTÁNDAR log ufc/gr o ml (s) 0,06
Cálculo de Repetibilidad del día 2
Se determina obteniendo la desviación estándar s
s =√Σ(xi – x)2 n-1 grados de libertad
n-1
Sr (log ufc/g o ml) = 0,06
Se determina el coeficiente de variación en el día 2:
MATRIZ S X % CV
VEGETALES 100 2600 3,84
FORMULA LACTEA 50,33 1953 2,57
SALCHICHA 165,22 2290 7,21
32
Día 3
No Muestra
Matriz
Nivel de contaminación
UFC/g o UFC/ml
Resultado UFC/g o UFC/ml
log UFC/g o UFC/ ml
REPETIBILIDAD 1 Vegetales 1000-10000 2360 3,37 REPETIBILIDAD 2 Vegetales 1000-10000 2420 3,38
REPETIBILIDAD 3 Vegetales 1000-10000 2500 3,39 Promedio: 2426 3,38
REPETIBILIDAD 4 Fórmula láctea
1000-10000 1640 3,21
REPETIBILIDAD 5 Formula láctea
1000-10000 1400 3,14
REPETIBILIDAD 6 Fórmula láctea
1000-10000 1650 3,21
Promedio: 1563 3,18
REPETIBILIDAD 7 Salchicha 1000-10000 2160 3,33 REPETIBILIDAD 8 Salchicha 1000-10000 2140 3,33
REPETIBILIDAD 9 Salchicha 1000-10000 2260 3,35
Promedio: 2186 3,33
PROMEDIO 2033 3,30
DESVIACIÓN ESTÁNDAR (s) 0,09
Cálculo de Repetibilidad del día 3
Se determina obteniendo la desviación estándar s
s =√Σ(xi – x)2 n-1 grados de libertad
n-1
Sr (log ufc/g o ml) = 0,09
Se determina el coeficiente de variación en el día 3:
MATRIZ S X % CV
VEGETALES 70,23 2426 2,89
FORMULA LACTEA 141,53 1563 9,05
SALCHICHA 64,29 2186 2,94
Una vez estimada la desviación estándar se promedia cuadráticamente las
estimaciones de repetibilidad de los 3 días:
33
SR (log ufc/g o ml) =√ (s1)2+ (s2)2+(s3)2/3=√ (0,15)2+(0,06)2+(0,09)2/3= 0,10
Se estima la reproducibilidad entre los tres días (SR), obteniendo la desviación
estándar de los promedios de los tres días
SR (log ufc/g o ml)=0,70
La desviación estándar de repetibilidad de las 3 matrices validadas en 3
días es de 0,10
La desviación estándar de reproducibilidad los 3 días ensayados en las
3 matrices validadas es de 0,70
No hay una diferencia significativa entre los resultados obtenidos por matriz , ya
que todas las muestras fortificadas artificialmente cumplen dentro del rango de
trabajo planeado, el cual era de 100-1000 ufc/g o ml.
No hay una diferencia significativa entre los resultados obtenidos por diferente
día, ya que todas las muestras fortificadas artificialmente cumplen dentro del
rango de trabajo planeado, el cual era de 100-1000 ufc/g o ml.
A pesar de que todas las muestras fueron fortificadas al mismo nivel de
contaminación, la formula láctea presenta una menor recuperación con la cepa
de e. coli ATCC 10536, a diferencia de las matrices de vegetales y salchicha.
6.5.5 REPRODUCIBILIDAD
Condiciones en las que operadores diferentes obtienen resultados de ensayo
independientes con el mismo método e idénticas muestras de ensayo, en
laboratorios diferentes y en equipos diferentes.
Para llevar a cabo la reproducibilidad, se incluyen resultados de un segundo
analista y resultados del analista titular de la fase de Repetibilidad.
El nivel fue de 1000 a 10000 UFC/g ó UFC/ml
34
Resultados del segundo analista:
Cálculo de Repetibilidad del analista 2.
Se determina obteniendo la desviación estándar s
–
n-1 grados de libertad
Sr (log ufc/g o ml) = 0,17
Se determina el coeficiente de variación del analista 2:
MATRIZ S X % CV
VEGETALES 416 2266 18,35
FORMULA LACTEA 173 1800 9,61
SALCHICHA 353 1060 33,30
No Muestra
Matriz
Nivel de contaminación
UFC/g o UFC/ml
Resultado UFC/g o UFC/ml
log UFC/g o UFC/ ml
REPRODUCIBILIDAD 1 Vegetales 1000-10000 2600 3,41
REPRODUCIBILIDAD 2 Vegetales 1000-10000 1800 3,25 REPRODUCIBILIDAD 3 Vegetales 1000-10000 2400 3,38
Promedio: 2266 3.34 REPRODUCIBILIDAD 4 Fórmula
láctea 1000-10000 1900 3,27
REPRODUCIBILIDAD 5 Formula láctea
1000-10000 1900 3,27
REPRODUCIBILIDAD 6 Fórmula láctea
1000-10000 1600 3,20
Promedio: 1800 3.24 REPRODUCIBILIDAD 7 Salchicha 1000-10000 930 2,96
REPRODUCIBILIDAD 8 Salchicha 1000-10000 1460 3,16 REPRODUCIBILIDAD 9 Salchicha 1000-10000 790 2,89
Promedio: 1060 3.0 PROMEDIO 1708 3,20
DESVIACIÓN ESTÁNDAR (s) 0,17
35
Comparación con resultados del tercer día del analista titular contra los
resultados de del segundo analista:
No Muestra
Matriz
Nivel de contaminación log UFC/g o ml
Resultados analista 1 Log UFC/g
o ml
Resultados analista 2 Log UFC/g
o ml
REPRODUCIBILIDAD 1 Vegetales
3-4 3,37 3,41
REPRODUCIBILIDAD 2 Vegetales
3-4 3,38 3,25
REPRODUCIBILIDAD 3 Vegetales
3-4 3,39 3,38
Promedio: 3,38 3.34 REPRODUCIBILIDAD 4 Fórmula
láctea 3-4 3,21 3,27
REPRODUCIBILIDAD 5 Formula láctea
3-4 3,14 3,27
REPRODUCIBILIDAD 6 Fórmula láctea
3-4 3,21 3,20
Promedio: 3,18 3.24 REPRODUCIBILIDAD 7 Salchic
ha 3-4 3,33 2,96
REPRODUCIBILIDAD 8 Salchicha
3-4 3,33 3,16
REPRODUCIBILIDAD 9 salchicha
3-4 3,35 2,89
Promedio: 3,33 3.0 PROMEDIO 3,30 3,20
DESVIACIÓN ESTÁNDAR (s) 0,09 0,17
Se estimo si hay diferencia entre la precisión de los dos analistas, comparando
la precisión entre los dos analistas usando la prueba de F para varianza de dos
muestras usando α=0,05.
36
Prueba de f para varianza de 2
muestras
Variable
1
Variable
2
Media 3.301111 3.198889
Varianza 0.008186 0.030511
Observaciones 9 9
Grados de
libertad 8 8
F 0.268299
P(F<=f) una
Cola 0.040399
Valor critico
para f una cola 0.290858
Suponiendo que la prueba de f es una hipótesis en donde el valor límite para f
es de 0,29.
Obtenemos que F<0,29
Por lo tanto concluimos que no se observa diferencia significativa entre la
varianza de los dos analistas con α=0,05, después de analizar los resultados
del método validado en tres diferentes matrices.
37
Comparamos las medias de los dos analistas usando α=0,05
Prueba de t para dos muestras
suponiendo varianzas iguales
Variable
1
Variable
2
Media 3.301111 3.198889
Varianza 0.008186 0.030511
Observaciones 9 9
Varianza agrupada 0.019349
Diferencia hipotética de
las medias 0
Grados de libertad 16
t estadístico 1.55893
P(T<=t) one cola 0.069286
Valor critico de t una
cola 1.745884
P(T<=t) dos colas 0.138571
Valor critico de t dos
colas 2.119905
Evalúo diferencias en las medias entre ambos analistas (uso t como valor
absoluto para t de dos colas)
ItI <2,11
Por medio de este test no se observa diferencia significativa entre la diferencia
de los dos analistas con α=0,05
Se estima la reproducibilidad entre analistas (SR) obteniendo la desviación
estándar de los promedios de los dos analistas:
SR= Desviación estándar: = 0,07
38
El coeficiente de variación, muestra el grado de confianza de los datos
presentados presentan un grado de concordancia mayor del 20% en la matriz
de formula lactea y vegetales, no así en la matriz de salchicha del segundo día,
en la que se reporto un coeficiente de variación del 33 %. Por lo tanto se
evaluara un coeficiente de variación de >33% en estas matrices.
No existe diferencia significativa entre los resultados de los dos analistas,
después de realizar el análisis estadístico f y t con un nivel de significación
α=0,05
6.5.6 SESGO
Es el error sistemático total en contra posición al error aleatorio. No puede
haber una o más sistemática componentes de error que contribuyen a la
polarización. Una diferencia más sistemática del valor de referencia aceptado
se refleja por un valor de sesgo más grande.
En base a los resultados de repetitibilidad y reproducibilidad se calculó el sesgo
del ensayo.
Calculamos el promedio de los 3 días y del segundo analista:
= (log promedio, día 1+ log promedio día 2 + log promedio día 3 + log
promedio analista 2)/4*
= (3,21+3,35+3,30+3,20)/4
= 3,26
*No. de repeticiones: 4
Se da un valor asignado de 2457 ˜ 2500 UFC/g en base a la determinación del
nivel de inoculo
Se resta el log del valor asignado menos el promedio de los analistas:
= log (2500)-(3,26)=3,39-3,26= 0,13
Resultado del sesgo: 0,13
39
El coeficiente de variación, muestra el grado de confianza de los datos
presentados presentan un grado de concordancia mayor del 20% en la matriz
de formula láctea y vegetales, no así en la matriz de salchicha del segundo día,
en la que se reporto un coeficiente de variación del 33 %. Por lo tanto se
evaluara un coeficiente de variación de >33% en estas matrices.
No existe diferencia significativa entre los resultados de los dos analistas,
después de realizar el análisis estadístico f y t con un nivel de significación
α=0,05
6.5.7 SELECTIVIDAD
Determinar la capacidad del método de distinguir el analito o microorganismo
de interés entre otras sustancias o microorganismos interferentes, y/o
demostrar que el método es específico para cada determinación indicada
procedimiento de análisis.
Se analizaron doce muestras de 3 matrices diferentes, estas se contaminaron
con las cepas:
-Staphylococcus Aureus ATCC 25963
-Bacillus spizizenii ATCC 6633
Se obtuvieron los siguientes resultados del analista titular:
No Muestra
Matriz
Cepa / Nivel de
contaminación UFC/g o UFC/ml
Resultado esperado UFC/g o UFC/ml
Resultado obtenido UFC/g o UFC/ml
SELECTIVIDAD 1 Verduras S. aureus/ 1x105 <10 UFC/g <10 UFC/g
SELECTIVIDAD 2 Verduras S. aureus/ 1x105 <10 UFC/g <10 UFC/g SELECTIVIDAD 3 Verduras B. spizizenii/
1x105 <10 UFC/g <10 UFC/g
SELECTIVIDAD 4 Verduras B. spizizenii/ 1x105
<10 UFC/g <10 UFC/g
SELECTIVIDAD 5 Fórmula láctea
S. aureus/ 1x105 <10 UFC/ ml <10 UFC/ ml
SELECTIVIDAD 6 Formula láctea
S. aureus/ 1x105 <10 UFC/ ml <10 UFC/ ml
SELECTIVIDAD 7 Fórmula láctea
B. spizizenii/ 1x105
<10 UFC/ ml <10 UFC/ ml
40
SELECTIVIDAD 8 Fórmula láctea
B. spizizenii/ 1x105
<10 UFC/ ml <10 UFC/ ml
SELECTIVIDAD 9 Salchicha S. aureus/ 1x105 <10 UFC/g <10 UFC/g
SELECTIVIDAD 10 Salchicha S. aureus/ 1x105 <10 UFC/g <10 UFC/g SELECTIVIDAD 11 salchicha B. spizizenii/
1x105 <10 UFC/g <10 UFC/g
SELECTIVIDAD 12 salchicha B. spizizenii/ 1x105
<10 UFC/g <10 UFC/g
TOTAL DE MUESTRAS POSITIVAS 0
TOTAL DE MUESTRAS NEGATIVAS 12
TOTAL DE MUESTRAS 12
Resultados del analista 2:
No Muestra
Matriz
Cepa / Nivel de
contaminación UFC/g o UFC/ml
Resultado esperado UFC/g o UFC/ml
Resultado obtenido UFC/g o UFC/ml
SELECTIVIDAD 1 Verduras S. aureus/ 1x105 <10 UFC/g <10 UFC/g SELECTIVIDAD 2 Verduras S. aureus/ 1x105 <10 UFC/g <10 UFC/g
SELECTIVIDAD 3 Verduras B. spizizenii/ 1x105
<10 UFC/g <10 UFC/g
SELECTIVIDAD 4 Verduras B. spizizenii/ 1x105
<10 UFC/g <10 UFC/g
SELECTIVIDAD 5 Form. láctea
S. aureus/ 1x105 <10 UFC/ ml <10 UFC/ ml
SELECTIVIDAD 6 Form. láctea
S. aureus/ 1x105 <10 UFC/ ml <10 UFC/ ml
SELECTIVIDAD 7 Form. láctea
B. spizizenii/ 1x105
<10 UFC/ ml <10 UFC/ ml
SELECTIVIDAD 8 Form. láctea
B. spizizenii/ 1x105
<10 UFC/ ml <10 UFC/ ml
SELECTIVIDAD 9 Salchicha S. aureus/ 1x105 <10 UFC/g <10 UFC/g SELECTIVIDAD 10 Salchicha S. aureus/ 1x105 <10 UFC/g <10 UFC/g
SELECTIVIDAD 11 salchicha B. spizizenii/ 1x105
<10 UFC/g <10 UFC/g
SELECTIVIDAD 12 salchicha B. spizizenii/ 1x105
<10 UFC/g <10 UFC/g
TOTAL DE MUESTRAS POSITIVAS 0 TOTAL DE MUESTRAS NEGATIVAS 12
TOTAL DE MUESTRAS 12
41
Con los datos obtenidos se estiman los parámetros que caracterizan el
rendimiento del método:
Especificidad relativa
Donde
SP=especificidad relativa
NA=total de muestras negativas
PD=total de muestras positivas
Se cumple con el parámetro de especificidad relativa ≥ 90%.
42
VII.CONCLUSIONES
Se evaluó la eficiencia de las placas Petrifilm TM en comparación con la
técnica de la norma NOM-113-SSA1-1994 Método para la cuenta de
Microorganismos Coliformes Totales en placa. Concluyéndose que la
técnica de las placas PetrifilmTM estudiada proporciona resultados
equivalentes a los obtenidos por el método de la norma de SSA.
No hay diferencias estadísticamente significativas entre las técnicas
evaluadas para cada muestra de alimento con un nivel de confianza del
90%.
Existe un alto grado de concordancia entre las técnicas realizadas, lo
que significa que entre las técnicas de recuentos utilizadas existe una
variación menor del 10%.
Se demostró la selectividad del medio Agar Rojo Violeta Bilis Lactosa
(rvba) para monitoreo de Escherichia coli ATCC 10536.
VIII. RECOMENDACIONES
Acreditación por Secretaria de Salud
43
IX.BIBLIOGRAFIA
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various geographical areas". Journal of Applied Bacteriology, 25: 87 (1.962).
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10. Microbiología de las aguas. Rheinheimer, G. . Editorial Acribia S. A. Zaragoza. 1.987.
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Guía para la acreditación de laboratorios que realizan análisis
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traducción el documento EA-4/10 rev. 02: Accreditation for
Microbiological Laboratories.
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Norma Oficial Mexicana NMX-EC-17025-IMNC-2006
Norma Oficial Mexicana NMX-110-SSA1-1994, bienes y servicios.
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microbiológico.
45
Norma ISO 7218:2007. General requirements and guidance for
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Norma Oficial Mexicana NOM-113-SSA1-1994, bienes y servicios.
Método para la cuenta de Microorganismos Coliformes Totales en Placa.
Norma ISO TS 11133 2 2003(E) “Microbiology of food and animal
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Part 2: Practical guidelines on performance testing of culture media”.
Norma ISO/IEC 17025-1999 “General requirements for the competence
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Norma ISO/IEC 17025-1999 “Requisitos generales para la competencia
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http://www.microbiologiamx.com.mx/
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_v58_eev7qe17zHvTSevTSeSSSSSS--&fn=Mbio-NTColiformes.pdf
http://www.bvsde.paho.org/acrobat/determi.pdf
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