como clasificar hoy en dia las leucemias y linfomas · slpc-b: anomalÍas que afectan a genes de...
Post on 01-Oct-2018
248 Views
Preview:
TRANSCRIPT
Cómo clasificar hoy en día las Leucemias y los Linfomas?
El rol de la citometría de flujo
SANDRA QUIJANO GÓMEZ MSc. PhD.Octubre de 2011
El rol de la citometría de flujo
SÍNDROMES LINFOPROLIFERATIVOS CRÓNICOS B (SLPC-B)Expansiones (mono)clonales de linfocitos B maduros
clínicamente heterogéneas
Leucemias linfoides crónicas de células B maduras/periféricas:Leucemia linfática crónica/Linfoma linfocítico de célula B pequeñaLeucemia prolinfocíticaTricoleucemia
Linfomas de células B maduras/periféricos:
CLASIFICACIÓN DE LOS SLPC-B SEGÚN LA OMS
Linfomas de células B maduras/periféricos:Linfoma linfoplasmocíticoLinfoma de la zona marginal esplénicaLinfoma de la zona marginal extranodal tipo MALTLinfoma de la zona marginal nodal (células B monocitoides)Linfoma folicularLinfoma de células del mantoLinfoma B difuso de célula grandeLinfoma de Burkitt
Neoplasias de células plasmáticas:Mieloma múltiple/plasmocitoma
Campo E. et al. Blood 2011
SLPC-B: ANOMALÍAS QUE AFECTAN A GENES DE CONTROL DE CICLO CELULAR Y DE LA APOPTOSIS
SLPC-B Gen Función Alteración Frecuencia
LF BCL2 Inhibición de apoptosis t(14;18) 80%-90%
MALT BCL10 Inhibición de apoptosis t(1;14) <5%API2/MLT1 a través de NFκκκκB t(11;18) 30%-50%
MALT1 t(14;18) 20%FOXP1 Factor de transcripción t(3;14) 10%-50%
regulador de desarrollo B
LCM CICLINA D1 Ciclo celular (transición G1/S) t(11;14) >90%
LLC-B RB/D13S25 del(13q) 10%-60%LLC-B RB/D13S25 del(13q) 10%-60%ATM/MLL Control del ciclo celular del(11q) 5%-15%
P53 del(17p) 1%-5%MDM2? +12 15%-25%
LLP PAX5 Diferenciación B t(9;14) 50%
MW BLIMP1 Diferenciación BCiclo celular (arresto G0/G1) del(6q21) 30%-50%
LBDCG BCL6 Activación y diferenciación B t(3q27) 30%-40%C-MYC Control del ciclo celular t(8;14) 5%-10%BCL-2 Inhibición de apoptosis t(14;18) 30%-40%
LB C-MYC Diferenciación t(8;14) 80%Control del ciclo celular t(8;22) 5%Inducción de apoptosis t(2;8) 15%
Campo E. et al. Blood 2011Küppers R. Nat Rev Cancer 2005 Quijano S et al. Blood. 2008
MECANISMOS DE TRANSFORMACIÓN MALIGNA DE CÉLULAS B DE CENTRO GERMINAL EN SLPC-B
Célula plasmática
Centro germinal (CG)
Célula Bdel CG
Apoptosis
Linfoplasmocito
DC foliculares
B T
*Anomalías adicionales de P53, RB, P16, P27, ATM
MAYOR AGRESIVIDAD TUMORAL YVENTAJA PROLIFERATIVA
Apoptosis
C-MYC NFκκκκBBCL2
BCL-6PAX5
BCL6
Mecanismos oncogénicos
Küppers R. Nat Rev Cancer 2005
Alteraciones genéticas en Leucemias agudas
•60-80% de los casos presentan alteracionescromosómicas estructurales y/ó numéricas
*Pronóstico: buen pronóstico -t(12;21) e hiperdiploidia (51-65 cromosomas) malpronóstico -t(9;22); t(4;11), t(1,19) e hipodiploidia-.* Implicadas en proceso de transformación maligna, activación de vías mitógenas,inhibición de la apoptosis y la respuesta inmune anti-tumoral.
Van Dongen et al, Lancet 2010. Onciu M. Hematol Oncol Clin N Am. 2009
Malignidades hematológicasMalignidades hematológicas: : APLICACIONES CLINICAS DEL APLICACIONES CLINICAS DEL
INMUNOFENOTIPOINMUNOFENOTIPO
Diagnóstico: identificación de célulasneoplásicas (presencia vs ausencia)
Clasificación: identificación de línea, Clasificación: identificación de línea, estadio madurativo, screening de
alteraciones cromosómicas
Evaluación PronósticaMonitorización del tratamiento
CaracterizaciónCaracterización inmunofenotípicainmunofenotípica de de célulascélulastumoralestumorales porpor citometríacitometría de de flujoflujo
EN QUE SE PARECEN LAS CELULAS LEUCEMICAS A EN QUE SE PARECEN LAS CELULAS LEUCEMICAS A LAS CELULAS NORMALES ?LAS CELULAS NORMALES ?
-- Reflejan línea celular y estadio madurativo.Reflejan línea celular y estadio madurativo.
EN QUE SE DIFERENCIAN LAS CELULAS LEUCEMICASEN QUE SE DIFERENCIAN LAS CELULAS LEUCEMICASDE LAS CELULAS NORMALES ?DE LAS CELULAS NORMALES ?
-- Reflejan distintos patrones de expresión de Reflejan distintos patrones de expresión de proteínas proteínas
(alteraciones genéticas)(alteraciones genéticas)
La interpretación adecuada de neoplasias La interpretación adecuada de neoplasias hematológicas requiere el hematológicas requiere el
“CONOCIMIENTO““CONOCIMIENTO“del del InmunofenotipoInmunofenotipo dededel del InmunofenotipoInmunofenotipo dede
MUESTRAS NORMALESMUESTRAS NORMALES
Saavedra, C., Quijano S, Orfao A. et al. Biomédica 2010Wood B. et al. Clinical Cytometry 2007Van Lochem. et al. Clinical Cytometry 2004 Pérez de Andrés M. et al. Clinical Cytometry. 2010
Inmunofenotipo de poblaciones B de Médula Ósea normal:Citometría de flujo de 4 fluorescencias
Clinical Cytometry 2004
Inmunofenotipo de poblaciones B de Médula Ósea normal:Citometría de flujo de 4 fluorescencias
Selección decélulas CD19+
Pre-pre B
Pre-B
Célula B inmadura
Célula B madura
Van Lochem. et al. Clinical Cytometry 2004
Inmunofenotipo de células B de distintos tejidos normalesCitometría de flujo de 6-8 fluorescencias
Pre-B I
Pre-B II
B inmadurasB maduras
Plasmáticas
B inmaduras
B maduras
Plasmablastos
SP= 614 individuos sanos20-90 años
Pérez de Andrés et al. Clinical Cytometry 2010
Plasmablastos
B inmaduras
B vírgenes
B memoriaPB
B vírgenes
B memoria
Plasmablastos
B centro germinal
1. Cuantificar distintas subpoblaciones celulares hematopoyéticas deMO normal en términos absolutos y relativos.
2. Analizar la expresión de diferentes marcadores celulares cuyareactividad está asociada a la diferenciación linfoide y mieloide, con el
OBJETIVOS
reactividad está asociada a la diferenciación linfoide y mieloide, con elfin de establecer rangos de expresión para los mismos.
3. Utilizar estos resultados como parámetros de análisis para eldiagnóstico y clasificación de las leucemias mieloides agudas ysíndromes mielodisplásicos que se estudien en la Unidad de Citometríadel Hospital Universitario San Ignacio.
Muestras de MO disgregadas (aprox. 5 mL)
Pasadas por jeringa (diámetro X)
100 uL muestra
Marcaje celularFITC PE PERCP APC ESFERAS
EDTA
Análisis de muestras de MO mediante citometría de flujo
Adquisición y análisis en el Citómetro de flujo FACSCalibur BDBProgramas informáticos CellQuest Pro y Paint A Gate BDB
FITC PE PERCP APC ESFERAS
cyTdT cyMPO CD45 CD34 +CD34 CD11b CD45 CD34 +
HLA-DR CD117 CD45 CD34 +CD64 CD14 CD45 CD34 +CD71 CD36 CD45 CD34 +CD15 CD16 CD33 CD34 +
Malignidades hematológicasMalignidades hematológicas: : APLICACIONES CLINICAS DEL APLICACIONES CLINICAS DEL
INMUNOFENOTIPOINMUNOFENOTIPO
Diagnóstico: identificación de célulasneoplásicas (presencia vs ausencia)
Clasificación: identificación de línea, Clasificación: identificación de línea, estadio madurativo, screening de
alteraciones cromosómicas
Evaluación PronósticaMonitorización del tratamiento
LLA-B Momento del Diagnóstico (90% de linfoblastos)
10 10 10 10 100 1 2 3 4
2008001040_CD20,2f,CD10#ABF.fcs
CD34 PE-A ->10 10 10 10 100 1 2 3 4
2008001040_CD20,2f,CD10#ABF.fcs
CD19 FITC-A ->
0 256 512 768 1024
2008001040_CD20,2f,CD10#ABF.fcs
FSC-A ->
LINEA BCELULASINMADURAS
FRECUENCIA ELEVADA
10 10 10 10 100 1 2 3 4
2008001040_CD20,2f,CD10#ABF.fcs
CD45 PerCP-A ->10 10 10 10 100 1 2 3 4
2008001040_CD20,2f,CD10#ABF.fcs
CD10 APC-A ->
10 10 10 10 100 1 2 3 4
2008001040_CD20,2f,CD10#ABF.fcs
CD38 PE-Cy7-A ->
HEMATOPOYETICAS CELULASINMADURAS
MARCADORESABERRANTES
SPLCSPLC--B: fenotipo normal vs aberranteB: fenotipo normal vs aberranteCélula B normalCélula B normal Células B aberrantesCélulas B aberrantes
Tricoleucemia
LLC-B
Tricoleucemia
Tricoleucemia
Malignidades hematológicasMalignidades hematológicas: : APLICACIONES CLINICAS DEL APLICACIONES CLINICAS DEL
INMUNOFENOTIPOINMUNOFENOTIPO
Diagnóstico: identificación de célulasneoplásicas (presencia vs ausencia)
Clasificación: identificación de línea, Clasificación: identificación de línea, estadio madurativo, screening de
alteraciones cromosómicas
Evaluación PronósticaMonitorización del tratamiento
0 256 512 768 1024
Leucemia Promielocítica Aguda: INMUNOFENOTIPO DE CASO t(15;17)+
SSC-
A
SSC-
A
SSC-
A
CD33++ CD117-/+0 256 512 768 1024
MO_MUESTRA.fcs
FSC-A -> 10 10 10 10 100 1 2 3 4
MO_MUESTRA.fcs
CD33 PerCP-Cy5-5-A ->10 10 10 10 100 1 2 3 4
MO_MUESTRA.fcs
CD117 APC-A ->FSC-A CD33 PERCPCY5.5 CD117 APC
Promielocito normal CD15+ Promielocito aberrante CD15+ débil
LLA-B: INMUNOFENOTIPO DE CASO BCR/ABL+
10 10 10 10 100 1 2 3 4
RFR7690.007
CD34 ->
10 10 10 10 100 1 2 3 4
RFR7690.008
CD10 ->
10 10 10 10 100 1 2 3 4
RFR7690.008
CD13 ->
10 10 10 10 100 1 2 3 4
RFR7690.011
CD34 ->
CD19
CD45
CD20CD19
CD10 CD13 CD34 CD34
CD19++,CD13+, CD45-/+, CD20-/+
CD20
FMC7
CD24
CD19
SSC
FSC
CD27
CD25
CD22
sIgM sIg
CD79
b
CD11
cCD
38
CD23
CD43
CD5
bcl2
Grupo A (n=38)
Marcador13q-trisomía 1211q-17p-
Grupo fenotípicoA B C
% +12
% -13q
11%
78%
37%
43%
46%
33%
Alteración genética
FENOTIPO Y ALTERACIONES GENÉTICAS EN LLC-B
n= 180 pacientes
-3.00 0.00 +3.00
Grupo B (n=19)
Grupo C (n=33)
Pacientes
% -13q
% -11q
% -17p
78%
5%
5%
43%
5%
5%
33%
18%
3%
FenotipoCD38-
CD79b-/dsIg-/d
FMC7-
CD23-CD38+
CD20+
FMC7+
sIg+CD79b+
Quijano S et al. Clinical Cytometry. 2008
LLC-BNEGATIVA
LLC-BPOSITIVA
LINFOCITOS T LINFOCITOS T
CELULAS B TUMORALES
CELULAS B TUMORALES
Casos ZAP70+:- Peor pronóstico- Ausencia de mutaciones genesIGVH (fenotipo de linfocito Bvirgen)-Trisomía 12- Asociado a estadiosavanzados
CD3 PercP
CD3 PercP
Zap70 PE Zap70 PE
Expresión de Zap70 en LLC-B por citometría de flujo
Carreras J et al. J of Pathol 2005
Inmunohistoquímica
Crespo M et al. N Engl J Med 2003
Lanasa M. Hematology 2010Rivkina A et al. Exp Oncol 2011
Zap70 PE Zap70 PE
Análisis del ciclo celular en neoplasias hematológicaspor citometría de flujo
- Identifican grupos de pacientes con mayor riesgo detransformación a variantes más agresivas de la enfermedad.
- La tasa proliferativa y la aneuploidia de ADN se asociancon la agresividad tumoral y son factores pronósticosindependientes.
- Las leucemias y linfomas muestran una tasa proliferativamuy heterogénea que, puede reflejar la de sucontrapartida madurativa normal y que varía según laalteración genética asociada y el microambiente celular.
Quijano S et al. Blood. 2008
transformación a variantes más agresivas de la enfermedad.
Quijano S et al. Clinical Cytometry. 2008
ANÁLISIS DEL CICLO CELULAR:- Muestras control:
� MO (n=10): CD45/CD19/DRAQ5CD38/CD19/DRAQ5
� SP (n=5): CD20/CD23/DRAQ5
� GGLL (n=5): CD38/CD20/DRAQ5CD20-FITC
CD23
-PE
10 10 10 10 100 1 2 3 4
1010
1010
100
12
34
Cantidad de ADN0 256 512 768 1024
200
300
400
0
100
No de
eventos %S+G2/M= 0.1%
- Linfomas B (n = 432 pacientes):Kit Cycloscope-NHL (Cytognos; Salamanca)
CD19/CD20/CD22/CD23-FITC +Yorudo de propidiop (IP)
SSC
Cantidad de ADN
100
200
300
400
CD19/20/22/23 FITC410 10 10 10 100 1 2
No de
eventos
3
1024
0 25
6 51
2 76
8
00 256 512 768 1024
%S+G2/M= 18%
Quijano S et al. Blood. 2008
fase
S+G2
/MGGLL
10%
15%
20%
25%
30%
MO SP MO
*
*
TASA PROLIFERATIVA DE LAS CÉLULAS B NORMALES A LO LARGO DE LA DIFERENCIACIÓN B
%de
célulasen
fase
0%
5%
10%
*
* * *
*
*
*
CD45lo
CD19loCD45+
CD19hi
Precursores B
CD45hi
CD19+CD20+
CD23+CD20+
CD23-CD38lo
CD20+CD38+
CD20hiCD38hi
CD20loCD38hi
CD19+
Linfocitos B maduros Células Plasmáticas
*p<0.05
Quijano S, et al. Cytometry Part B (Clinical Cytometry) 2008.Quijano S, et al. Blood 2008.
TASA PROLIFERATIVA DE LOS LINFOMAS BVS SU CONTRAPARTIDA NORMAL
fase
S+G2
/M
MON: Linfocitos BCD45hiCD19+
SPN: Células B
CD20+CD23+
GL: Células B CD38loCD20+ CP normales deMO y GL
20%
30%
40%
50%
*
*
GL: Células B CD38+CD20hi
***
*
*Fase S+G2/M significativamente elevada **Fase S+G2/M significativamente disminuida
%de
célulasen
LLC-B (MO)
LLC-B (SP) LZME TL LCM
(MO/SP) MALTLCM(GL) LF LBDCG LB LLP/MW
0%
10%
**
*
**74% 60%
37%
*
93% 83%21%
50%16% 16%
LINFOMAS B: FRECUENCIA DE LAS ALTERACIONES GENÉTICAS ANALIZADAS
% de
casos aneuploides
LLC-B LCM MALT LF LBDCG LB LLP/MW0%5%
10%15%20%25%30%35%40%
5% 21% 10% 18% 42% 29% 6%
% de
casos aneuploides
LLC-B LCM MALT LF LBDCG LB LLP/MW0%
% de
casos alterad
os
0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%
100%
+12 11q- 17p- t(11;14) t(14q32) t(14;18) t(3q27) t(8;14) 6q21- t(14q32)
LLC-B
LCM
MALT
LF
LBDCG
LB
LLP/MW
13q-
22%37%
9% 7%
77%
25%
61
38%
13
30%
8%
86% 93%
Ploidia de ADN en pacientes pediátricos con LLA-B
*
n=14 n=30
LLA-B Indice de ADNMedia ± DS Rango P
Diploides 0,94 ± 0,02 0,94-1 <0,001Hiperdiploides 1,15 ± 0,2 1,01-1,9
Quijano S, Saavedra C et al. Artículo en preparación 2011.
*
*
**
Tasa proliferativa de blastos en pacientes pediátricos con LLA-B
n=7 n=44
*
Quijano S, Saavedra C et al. Artículo en preparación 2011.
Malignidades hematológicasMalignidades hematológicas: : APLICACIONES CLINICAS DEL APLICACIONES CLINICAS DEL
INMUNOFENOTIPOINMUNOFENOTIPO
Diagnóstico: identificación de célulasneoplásicas (presencia vs ausencia)
Clasificación: identificación de línea, Clasificación: identificación de línea, estadio madurativo, screening de
alteraciones cromosómicas
Evaluación PronósticaMonitorización del tratamiento
ENFERMEDAD MINIMA RESIDUALENFERMEDAD MINIMA RESIDUAL
Leucemia Mieloide Aguda
*Realizados con técnicas altamente sensibles: Biología molecular ycitometría de flujo
PCR cuantitativa (RQ-PCR):-Detección de WT1, FLT3, AML1-ETO,CBFbeta/MYH11 en casos con t(8;21) einv(16): identificación de pacientes conalto riesgo de recaída.-Sensibilidad: 0.1%-0.001% (1/1000-1/100.000) (leucémicas/normales)
% de células residuales post-tratamiento (15
días)
Probabilidad de recaída
<0.01% Baja
0.01%-0.1%0.1%-1%
Intermedia
>1% Alta (84%)
Citometría de Flujo:*fenotipos anormales: 75-85% de loscasos- Sensibilidad: puede variar según lasaberraciones fenotípicas detectadas aldiagnóstico
San Miguel JF et al. Blood 2001. Shook D et al. Clin Lymphoma Myeloma 2009.
ENFERMEDAD MINIMA RESIDUALENFERMEDAD MINIMA RESIDUAL
Leucemia Linfoide Aguda
PCR cuantitativa (RQ-PCR):-Detección de BCR-ABL, MLLAF4,E2A-PBX1 y TEL-AML1 consensibilidad: 0.1%-0.001% (1/1000-1/100.000) (leucémicas/normales)
Citometría de Flujo:*Requiere conocimiento de perfilesfenotípicos de MO y SP en condicionesnormales y EXPERIENCIA en el análisis declones y selección de los marcadoresadecuados- Muy útil en fases pre y post-trasplantede células stem.-Sensibilidad: puede variar según lasaberraciones fenotípicas detectadas al
1/100.000) (leucémicas/normales)-Sensibilidad: puede variar según lasaberraciones fenotípicas detectadas aldiagnóstico- Límite de positividad: 0.01%
Adultos LLA-B% de células
residuales post-tratamiento
Probabilidad de recaída (durante
3 años)
Días 11 y 24 <0.01%
0%
Hasta la semana 16:
0.01%>0.01%
47%94%
Bruggemann M. Blood 2006 Campana D. Semin Hematol. 2010.
I Consenso Colombiano de Citometría: Manejo de muestras para estudios inmunofenotípicos
Tipo de muestra
Tiempo* Lavados Estabilizantes Centrifugación Anticoagulantes Solución salina/PBS estéril para transporte
Sangreperiférica**
Hasta 24 horas
Si No Si EDTA, Heparina No
Médula Ósea Hasta 24 horas
Si No Si EDTA, Heparina No
Sangre decordónumbilical+
Hasta 24 horas
No No No EDTA, Heparina No
Productos deleucaféresis
Hasta 24 horas
No No No EDTA, Heparina NoProductos deleucaféresis
Hasta 24 horas
No No No EDTA, Heparina No
Biopsias detejidossólidos**
60 minutos Si No Si No Si
Punciones detejidos sólidos(PAAF)**
60 minutos Si No Si No SiTemperatura
Líquidocefalorraquídeo(LCR)
30 minutos (sin
estabilizar)
Si Si*** Si (máximo dos pasos)
EDTA No
Otros fluidoscorporales**
60 minutos Si Si Si EDTA Si
*Tiempo máximo comprendido entre la obtención, transporte, y procesamiento de la muestra.**Las muestras pueden ser estabilizadas si se requieren confirmar estudios posteriores .***El empleo de una solución estabilizante previene la pérdida celular por periodos de tiempo superiores a las 24-48horas de su obtención.+: Viabilidad celular
Saavedra, C., Quijano S, Orfao A. et al. Biomédica 2010
Rastreo diagnóstico de meningitis neoplásica por citometría de flujo
“El manejo de muestras de LCR requiere unas condicionesespeciales de almacenamiento, transporte, preparación ymarcaje”.
Kraan J et al. Current Protocols Cytometry 2008
FaseFase prepre--analíticaanalítica
Muestras de LCR estabilizadas (Transfix, Immunostep SL)
Canonico B et al. J Immunol Methods 2004Quijano S et al. J. Clin Oncol. 2009Quijano S et al. Eur. J. Hematol. 2010
Previene pérdida celular por periodosSuperiores a 24-48horas (MO y SP)
LCR: mantiene celularidad >10d a 2-8°CEDTA
Kraan J et al. Current Protocols Cytometry 2008
FaseFase prepre--analíticaanalítica
DETECCIÓN DE INFILTRACIÓN DE SNC EN LNH-B AGRESIVO:
CMF versus Citología (n=123)
100%
CMF Citología PInfiltraciónde LCR 27/123 (22%) 7/123 (6%) <0,0001
100%
75%
50%
25%
0%CMF Citología
PositivosNegativos
Quijano S et al. J. Clin. Oncol. 2009; 27(9): 1462-9
FRECUENCIA DE CÉLULAS B NEOPLÁSICASEN MUESTRAS DE LCR INFILTRADAS POR CMF
Nº de
células/ µµ µµL
% de células
50
100
150
200 *p<0,001
60%
80%
100% *p<0,001
Nº de
células/
% de células
Citología+/CMF+ Citología-/CMF+
0
50
*
Punto de corte: <20% y <1 célula Bneoplásica/µµµµL
0%
20%
40%
Citología+/CMF+ Citología-/CMF+
*
Quijano S et al. J. Clin. Oncol. 2009; 27(9): 1462-9
ANALISIS DE RECAIDAS DURANTE EL SEGUIMIENTO
Seguimiento: 105/123 (85%)20 meses (rango 10-33 meses)
Sancho JM, Orfao A; Quijano S. European J. Hematology 2010; 85 (4): 821-8.
top related