clonación manipulación de dna curso 2011-12. el problema básico ¿cómo mantener estable un...
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Clonación
Manipulación de DNA
Curso 2011-12
El problema básico
¿Cómo mantener estable un fragmento de DNA dentro de una célula?
Uniéndolo a un vector de clonacion
Vector de clonacion
Fenotipo seleccionable
Dianas de restricción unicas
Multicopia
DNA de replicación autónoma
Diana única
Plásmidos recombinantes
Quimeras
Pasos en la clonación
•Ligación
•Crecimiento en placas de agar en medio selectivo
•Restricción del vector y del inserto
•Transformación
Fragmentación de DNA
Enzimas de restricción
Werner Arber
Premio Nobel de Medicina en 1978
"for the discovery of restriction enzymes and their application to problems of molecular genetics".
Eje de simetría doble
dabalearrozalazorraelabad
DIANAS de restricción
Secuencias palindrómicas
ana anna
Romos Protuberantes
Probabilidad de corte
1/4 x 1/4x 1/4 x1/4= (1/4)4 =1/256
(1/4)6 = 1/4096
(1/4)8 = 1/65536
~ 12.5x106 fragmentos
~ 781250 fragmentos
~ 48828 fragmentos
Nº fragmentos en genoma humano
Enzimas de restricción
nomenclatura
4
4
8
6
6
1/4
IsosquizómerosEnzimas de restricción que reconocen la misma sequencia
Pueden cortar en el mismo sitio
Como NdelI y MboI GATC
O no
NarI GG CGCC
BbeI GGCGC C
EheI GGC GCC
KasI G GCGCC
Ligación de DNA
5´3´
Truco para favorecer laformación de recombinantes
Impedir la religación del vector
Extremos cohesivos compatibles
¿Podríamos digerir el recombinante con BamHI?
….NGAT ATCN…..
….NCTA TAGN…..
….NGAT….NCTA
ATCN…..TAGN…..
….NCTA….NGAT CCTN…..
GGAN…..
….NCTA….NGATCCTN…..
GGAN…..
Animación > Manipulation >Revolution > Players
http://www.dnaftb.org/34/concept/index.html
Premio Nobel de Química 1980
Vectores de clonacion
Vectores plasmídicos
Características de los vectores de clonación
•Pequeño tamaño
•Marcador genético de selección
•Sitios únicos de restricción
ColE1
•Mutación en las secuencias control de la replicación de ColE1 resultantes en más de 500 copias/célula
•Adición de múltiples sitios de clonaje únicos (MCS) (“poly-linker”)
Vectores mejorados
MCS (Multi Cloning Site)
(polylinker)
MCS de pUC18
MCS de pUC19
•MCS (polylinker) en secuencia codificante para el fragmento N-terminal de la -galactosidasa.
pUCPlac O N-lacZ
pUCPlac O N-lacZ
IPTGXGal
pUCPlac O N-lacZ
pUCPlac O N-lacZ
IPTGXGal
Allolactosa
Isopropil D tiogalctósido IPTG
INDUCTORno hidrolizable
Inductor
X-gal
Ensayo de -galactosidasa
•MCS (polylinker) en secuencia codificante para el fragmento N-terminal de la -galactosidasa.
•Selección de plásmidos con inserto: colonias blancas en placas con IPTG y X-Gal.
Colonias blancas Colonias azules
+ X-gal + X-gal
+ IPTG
Animación> clonación / clonación (vectores plasmídicos)
+ inserto
- inserto
Vectores lanzadera
Shuttle
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