clase adn dra gotti

Analisis de ADN. Aplicacion de la Biologia Molecular en la Justicia

Civil y CriminalDra Adriana Silvia Gotti

Bioquimica.Directora del Centro de Estudios Biomoleculares y Genetica ForenseCEBYG.Posadas . MisionesLAC _Corrientes

El Paradigma

La prueba de ADN• A partir del descubrimiento de zonas variables en el ADN , y la posibilidad de emplearlas para identificación humana a

mediados de la década del 80 , la certeza en los estudios de paternidad y de

identificación criminal se incremento a más del 99,99% .

Reseña Histórica

• Abril de 1985 _se resuelve el primer caso judicial mediante el estudio de Huellas Digitales genéticas o Fingerprinting .Gran Bretaña.

• Junio de 1985 una corte civil Inglesa acepta la evidencia de ADN en un caso de Paternidad discutida.

• Octubre de 1986 se produce el debut de esta prueba en la identificación criminal comprobándose la inocencia del principal sospechoso en un caso de violación y muerte.

• 1987 _Las pruebas de ADN son admitidas como evidencias en las Cortes criminales de Gran Bretaña y Estados Unidos.

• 1988 se desarrollan amplificaciones de ADN por PCR.(polymerase Chain Reaction.(Biología Molecular)

• 1989 _a raiz de dudosos resultados en un caso criminal realizados por Lifecodes Corp se discute en EEUU la validez Científica de la prueba de ADN.

• 1990 The U. S. Congress Office of Technoly Assessment concluye que la identificación de individuos basada en la prueba de ADN es Científicamente válida, siempre que se disponga de la certeza metodológica de su realización

Aplicación de los Estudios de ADN en la Justicia Civil y penal.

Dra Adriana Silvia Gotti

Bioquimica

Especialista en genetica Forense

Núcleo

Citoplasma

MembranaPlasmática

La célula

El núcleo

Contiene toda la información genética y regula su expresión

Composición y Estructura del ADN

• Desoxirribosa (azúcar de tipo pentosa)

• Un grupo Fosfato

• Cuatro tipo de Bases Nitrogenadas (Citosina,Timina,Adenina y Guanina)

NUCLEÓTIDO

• Cada Subunidad de ADN formada por una Desoxirribosa, un grupo fosfato y una base nitrogenada se denomina NUCLEÓTIDO

La doble Hélicede ADN

El “ADN” como almacén de información

Los cromosomas

Pares de bases

cromosoma

Celula

Nucleo

Histonas

• Unidad Básica de la HERENCIA

• Están contenidos en los CROMOSOMAS

• Formados por ADN

La secuencia del ADN está estructurada en codones de 3 nucleótidos. Se pueden distinguir:

•Genes o secuencias codificantes, que contienen la infomación para sintetizar proteínas.

•Secuencias no codificantes, que incluyen secuencias reguladoras de la expresión (promotores, intrones, …).

Genoma es el conjunto de todos los genes de un organismo.

Los genes, unidades de información

PROYECTO DEL GENOMA HUMANO

• “Manual de instrucciones de los seres humanos”

• 3 mil millones de bases nitrogenadas

Implicaciones del diagnóstico genético

• Identificar portadores de enfermedades hereditarias y tumores malignos.

• Aplicaciones en la medicina forense

• Investigaciones sobre paternidad

Identificación visual

IDENTIFICACION HUMANAIndividuos vivos Cadáveres

• Exámenes generales: datos fisonómicos, sexo, peso, talla, cabello, color de ojos y piel, marcas.

• Registro de voz.

• Trazado caligráfico.

• Huellas dactilares.

• Huellas genéticas.

• Métodos bioquímicos

• Diagnóstico de especie.

• Datación de los restos.

• Exámenes generales.

• Elementos extrínsecos.

• Caracteres patológicos, naturales o traumáticos.

• Identidad radiográfica y dental.

• Métodos bioquímicos.

METODOS BIOQUIMICOSEvalúan fenotipo Evalúan genotipo: ADN

• Grupos sanguíneos: ABO, RH, MNS, Duffy, Lewis.

• Proteínas plasmáticas: haptoglobina, 1-antitripsina, transferrina.

• Enzimas eritrocitarias: fosfatasa ácida eritrocitaria, adenilato kinasa, PGM, ADA.

• HLA: Antígenos de histocompatibilidad.

• Minisatélites: sondeos de locus múltiple y locus único.

• Microsatélites: métodos de PCR.

• Variantes de secuencia: HLA-DQPolymarker, genoma mitocondrial.

• Existen regiones codificantes, que contienen la información para la síntesis proteica, y no codificantes.

• Dentro de las no codificantes existen regiones polimórficas.

• Existen alrededor de 3 x 106 sitios polimóficos en nuestro genoma.

DRA. GOTTI ADRIANA SILVIA

Nuclear- 2 copias por célula- Heredado 50 % de cada progenitor - Único para cada individuo

Tipos de ADN en genética forense

Mitocondrial- ~1000 copias/célula- Herencia materna - No es único para cada individuo

Tipos de ADN según su TRANSMICIÓN

1. Nuclear: 50% padre + 50% madre- altísimo poder discriminación - recombinación

2. Mitocondrial: 100% madre poder discriminación limitado

3. Cromosoma “Y”: 100% padre poder discriminación limitado

POLIMORFISMOS

De secuencia:

Individuo 1: ……GTACGGTACGT……Individuo 2: ……GTACCGTACGT……

Individuo 1: ……GTACGGTACGT……Individuo 2: ……GTACGTACGT……

De longitud:

Individuo 1: ……(AATG) (AATG) (AATG)…… 3 repeticiones

Individuo 2: ……(AATG) (AATG)…… 2 repeticiones

ADN nuclear

1. Unidades: 3000 millones x 2 23 pares de cromosomas

2. Herencia mixta: padre y madre

3. Dos copias por célula (núcleo)

Longitud de las unidades de repetición

Dinucleótidos: CA

Trinucleótidos: AAT

Tetranucleótidos: AGAT

Pentanucleótidos: AATGT

Marcadores forenses

Altamente polimórficasElevado grado de heterocigosidad genética

Vía de Herencia del ADN del cromosoma “Y” (representa el 2% del genoma humano)

PRINCIPALES APLICACIONES DE LOS STRs DEL CROMOSOMA “Y”

- Investigación Biológica de la paternidad

- Criminalística

- Estudios de Identificación Genética

- Estudios sobre el origen y evolución de las poblaciones

ADN mitocondrial

1. Unidades: 16.569 pb

2. Herencia materna

3. de 100 a 10.000 copias por célula 10 a 100 mitocondrias por célula 10 a 100 copias por mitocondria

Vía de herencia del ADN mt

- Técnicas de PCR y secuenciación automática

- Altamente polimórfico

- Alto número de copias

- Herencia estrictamente materna

- Se conoce con exactitud la secuencia de todos sus nucleótidos

- Tasa de evolución entre 5 y 10 veces mayor que un gen nuclear

ORGANIZACIÓN GENÓMICA

Sólo el 10% es ADN no codificante

MUTACIONES

ADNmt acumula un numero de mutaciones superior al ADN genómico

Normal

Sustitución

Deleción

Inserción

Sustituciones

Transiciones Py-Py: C>T T>C

Pu-Pu: A>G G>A

Transversiones C>A T>G G>C A>T A>C G>T C>G T>A

HETEROPLASMIA: coexistencia, debida a mutaciones, de dos o más poblaciones de ADNmt en un individuo

HETEROPLASMIA DE SECUENCIA

heteroplasmia intercelular

heteroplasmia intramitocondrial

heteroplasmia intracelular

HOMOPLASMIA: misma secuencia en todas las moléculas de ADNmt

HETEROPLASMIA DE LONGITUD

DRA. GOTTI ADRIANA SILVIAPREPARACIÓN DE LA MUESTRA

EXTRACCIÓN DEL ADN

CUANTIFICACIÓN

AMPLIFICACIÓN POR PCR

PURIFICACIÓN PCR

SECUENCIACIÓN

PURIFICACIÓN SECUENCIACIÓN

ANÁLISIS DE DATOS

ELECTROFORESIS

USO DEL ADNmt EN GENÉTICA FORENSE

1. Identificación de restos antiguos

2. Identificación de restos cadavéricos (desastres en masa)

3. Identificación de vestigios mínimos - pelos sin bulbo - manchas biológicas mínimas y parcialmente degradadas

4. Estudios de relaciones familiares vía materna

Polimorfismos de Longitud

Alelo 1

Alelo 2

Sitio de Restricción Sitio de Restricción

Unidad de Repetición

Tipos de Polimorfismos de Longitud.

Minisatélites

Locus Múltiple

Locus Específico

Microsatélites Locus Específico PCR/PAGE o automatización

Southern

PCR /Agarosa

Evolución de los Sistemas de Identificación Molecular

• 1985 Minisatélites Locus Múltiple Jeffreys.• 1987 Minisatélites Locus Específico Nakamura.• 1989 HLA-Dq Higuchi.• 1991 Microsatélites (STRs) Edwards.• 1992 Secuenciación de mtDNA HVRI y II

Ginther.• 1993 STRs del Cromosoma Y Roewer.

1985 Minisatélites Locus Múltiple Jeffreys.

• Alto Poder Discriminativo.

• Patrones fenotípicos.• Baja reproducibilidad

entre laboratorios.

1987 Minisatélites de Locus Específico _NAKAMURA

• Constituyen los marcadores más eficientes en estudios en los que la calidad y cantidad de ADN no son restrictivos.

1991_Microsatélites o STRs.

• Herramienta indispensable para la investigación forense.

• Gran número de STRs disponibles.

• Alta sensibilidad.• Evaluación manual o

automatizada.

Análisis automatizado de STRs

1989 HLA-Dq Higuchi.

• Poder Discriminativo muy limitado (equivalente a un grupo sanguíneo).

• Muy sensible.• Utilidad actual escasa

o nula.

1992_Secuenciación del ADN mt.GINTHER

• Permite el rastreo de la línea materna.

• Gran sensibilidad debida al alto número de copias, reducido tamaño y estructura circular.

Análisis de Minisatélites.

• Transferencia de Southern.

• Gran capacidad discriminativa.

• Requiere integridad y alta concentración de ADN.

• Optimo para estudios de paternidad.

• Económica.

Dra .Adriana Silvia GottiCentro de Estudios Biomoleculares y

Genetica Forense. Posadas . Misiones Argentina

Amplificación de DNA in vitro:PCR (Polymerase Chain Reaction)

ObjetivosConocer:

• Los fundamentos de la técnica de amplificación de DNA por PCR

• Usos y aplicaciones de la PCR

• Ventajas y desventajas de la PCR

• Métodos de secuenciación de DNA

PCR Polymerase Chain Reaction

•Es la amplificación de DNA in vitro por medio de la polimerización en cadena de DNA utilizando un termociclador.

•El propósito del PCR es hacer muchas copias de un fragmento de DNA.

•Se realiza la amplificación de un segmento específico de DNA, teniendo poco material disponible.

Polimerasa Chain Reaction: Reacción en Cadena de la Polimerasa

• Fue diseñada por el Dr. Kary Mullis en 1987.

• Ganó el premio Nóbel de Química en 1993 por su invento.

• Utilizo la reacción PCR para amplificación del gen de -hemoglobina humana, y el diagnóstico prenatal de anemia falsiforme.

Termociclador

La PCR se realiza en un “Thermo Cycler” Termociclador.

Es una máquina que calienta y enfría la reacción en periodos cortos de tiempo.

• 1. Desnaturalización: Consiste en separar la doble hebra de DNA y convertirla en hebra sencilla.

-Típicamente se usa una temperatura de 95˚C - 97˚C, por 15 a 40 segundos –el tiempo depende del tamaño del genoma-

El proceso de “PCR” incluye 3 pasos básicos que se repiten 25 veces o más:

2. Apareamiento o “anneling”:• Los cebadores “primers” previamente

diseñados, reaccionan con la hebra sencilla de DNA y se pegan en lugares específicos por complementariedad de bases. Para esto, se baja la temperatura -ej: 55˚C por 30 segundos-. La temperatura y el tiempo puede variar entre cebadores según sea el caso.

3. Polimerización o Extensión.

Una Polimerasa de DNA extiende los “primers”, en el espacio

comprendido entre ambos “primers”, y coloca dinucleotidos

trifosfatados (dNTP’s) de 5’a 3’ leyendo el DNA de 3’a 5’. De

estas forma sintetiza la secuencia complementaria de las

hebras de DNA moldee

Se efectúa a 70˚C por 1½ minutos (puede variar según sea

necesario)

Los pasos 1, 2 y 3 se repiten cuantas veces sea necesario.

En la PCR hay una amplificación exponencial

Reactivos necesarios para PCR:• Amortiguador (Buffer): 50mM KCl, 10mM Tris. Cl

(pH 8.3 a temperatura ambiente) y 1.5 mM MgCl2.• MgCl2: Puede estar en forma de MgCl2, MgSO4. Se

usa 25mM -Es un cofactor para la función de la polimerasa-

• dNTP’s (Dinucleotidos trifosfatados): dATP, dGTP, dCTP, dTTP.

-La concentración de dNTPS, es proporcional al tamaño del fragmento que se desea amplificar. Ej: Si vamos a amplificar un fragmento de 500pb vs uno de 5500 pb, necesitamos más concentración de dNTPS para el de 5500pb.

-Generalmente, se usa una concentración de 200M de cada uno.

Reactivos necesarios para PCR:• Cebadores “primers”: Son secuencias cortas de

nucleótidos 20-24 nucleótidos de longitud, complementarias a una región del DNA que se quiere amplificar. -Se usa a concentración de 1M-

• DNA molde: El DNA a amplificar puede tener desde 50 a 2,000 nucleótidos de longitud.

El mínimo va de 10-100 ng. y el máximo entre 400-500 ng.

• Polimerasa: Generalmente se usa 2 unidades por reacción.

ADYUVANTES DE LA PCR• Son elementos que mejoran el rendimiento y la

especificidad de la PCR.

• Se usa DMSO, glicerol o BSA.

• El adyuvante más utilizado es el BSA. A concentraciones por encima de 0.8 µg/µl el BSA incrementa la eficiencia de la PCR y actúa como una proteína captadora de iones que pueden ser inhibidores de la Taq polimerasa

•En un principio, la polimerasa de DNA que se utilizaba era de la bacteria E. coli, pero esta es sensible a alta temperatura, por lo que había que añadir enzima fresca al comenzar el tercer ciclo.

•Se reemplazo la enzima por la de la bacteria “Thermus aquaticus” conocida como Taq pol

Polimerasa

Análisis de la Muestra

• La detección del producto de la PCR se realiza normalmente mediante corrido electroforético.

• Dependiendo del tamaño de la amplificación y la resolución que deseemos utilizaremos diferentes medios (agarosa, poliacrilamida) a distintas concentraciones.

Análisis de la Muestra• La posterior visualización se puede realizar con

bromuro de etidio (lámpara de luz UV), tinción de

plata, fluorescencia, radioactividad Ladder: pesos conocidos

1: Fragmento a 1857 pb

2 y 4: Fragmento a 800 pb

3: No hay producto

5: Multiples bandas (primers inespecíficos se pegan a varios sitios)

Análisis de la Muestra

• En algunos casos, los productos amplificados poseen secuencias que son reconocidas por endonucleasas

• Hibridación, Southern Blot

Se puede amplificar directamente de:

– ADN genómico

– cDNA (RT-PCR)Aplicaciones

Detección de agentes infecciosos como: hepatitis B y C, papiloma virus, HIV, entre otros Análisis de DNA de cualquier organismo vivo o muerto, análisis de fósilesMutagénesis dirigida (cambios en la información contenida a través de “primers” con mutaciones)Investigación forensePruebas de paternidad

Aplicaciones

• Ejemplo de un caso de criminalística resuelto utilizando electroforesis en gel vertical de acrilamida.

• Si se observan los patrones bandas podrá comprobarse como los perfiles obtenidos en las manchas de sangre encontradas en el sombrero (Hat) y pantalón (Jeans) del sospechoso (S) coinciden con el perfil genético de la víctima (V)

Criminalística

Utilidad del PCR

Ventajas del “PCR”

• A partir de una muestra pequeña de ADN se puede

obtener una cantidad considerable para el estudio que

se vaya a realizar.

• El producto se puede utilizar para clonar, secuenciar y

análisis.

• Se puede amplificar ADN de cualquier organismo vivo

o muerto.

• Sus aplicaciones son múltiples: medicina forense,

diagnósticos, análisis prenatales, etc.

Desventajas del “PCR”• Se puede reproducir solamente partes del genoma en

donde se conoce por lo menos una mínima secuencia

de 20 – 40 pb.

• Se necesitan “primers” específicos que sean

complementarios al fragmento que se desea sintetizar.

• La polimerización puede tener errores al sintetizar el

• Puede contaminarse con otro ADN (puede ser del

mismo investigador o de cualquier otro)

Materiales Para PCR

• Termociclador “Thermo

cycler”

• Microcentrífuga

• Micropipetas de 2, 20 y 200 ul

• Microtubos para “PCR”,

estériles

• Puntas estériles

• Agua destilada, desionizada y

estéril

• ADN molde (ADN en estudio)

• Primer Forward y Reverse

• dNTP’s (dATP, dTTP, dCTP,

dGTP de [25 μM] c/u)

• 10X buffer para PCR

(Solución amortiguadora para

“PCR”)

• MgCl2 (25 mM)

• BSA

• Polimerasa Taq

Herencia del DNA mitocondrial

•Amplificaremos una region hipervariable. Genoma de 16571 pares de bases: Hebra pesada (H), Hebra liviana (L). Primer Directo H34, primer reverso L15829

Procedimiento para extracción del DNA genómico (previamente

realizado)• Se realizó un frotis bucal

• El contenido del hisopo “swab” se resuspende en 1000ul de NaCl 0.9%

• Centrifugar por 5 minutos a 7K

• Descarta sobrenadante

• Resuspender el precipitado “pellet” en 500ul de chelex al 10%

• Incubar a 100˚C por 20 minutos

• Centrifugar por 5 minutos a 7K

• Tomar el sobrenadante ( DNA en solución)

• Dejar la muestra a -20 grados hasta cuando se va a trabajar con ellaNota: El chelex actúa como agente desestabilizador de membranas y quelante.

Diagrama de la extracción del DNA genómico (previamente realizado)

Procedimiento para amplificar el DNA (PCR)

• Añada los siguientes reactivos en el orden indicado:

Cantidad (ul) Componente

10.3 Agua estéril (dH2O)

3.0 MgCl2 25mM

0.5 BSA 100X

1.5 2.5 Mm de dNTPs

1.0 Primer H34. 5’-3’

1.0 Primer L15829. 3’-5’

2.5 Buffer 10X

0.2 Taq pol

5.0 DNA en estudio

Mix 117.3

Mix 22.7

Total: 25 ul

• Condiciones para reacción en el

termociclador:

1 ciclo : 94°C por 2.5 minutos.

32 ciclos: 94 °C por 30 segundos

54 °C por 1 minutos

72 °C por 70 segundos

1 ciclo: 72 °C por 10 minutos

• Lleve a reaccionar en el

termociclador.

Secuenciación de DNAMétodo enzimático de terminación de cadena

(método dideoxi de Sanger)• Polimerización interrumpida de ADN• Se lleva a cado polimerización de ADN en

presencia de derivados dideoxi que detienen la polimerización en diferente momento, obteniéndose fragmentos de diferente tamaño.

• Se examinan en electroforesis, se “lee” secuencia directamente del gel

Método dideoxi de Sanger

Método dideoxi de Sanger (2)

Método dideoxi de Sanger (3)

Método secuenciación automática

Electroferograma de la secuenciación automática

Geles de secuencia

Secuencia automática Secuencia Manual

Direcciones de animaciones

• Dirección PCR

http://www.sumanasinc.com/webcontent/anisamples/molecularbiology/pcr.html

• Dirección de secuenciación

http://smcg.cifn.unam.mx/enp-unam/03-EstructuraDelGenoma/animaciones/secuencia.swf

TOMA Y CONSERVACION DE MUESTRAS PARA ANALISIS DE

Obtención de las Evidencias.Obtención de las Evidencias.

• Constituye el punto crítico para la resolución de una causa judicial.

• Cada Servicio de Investigación Forense deberá establecer claros protocolos para la manipulación, transporte y conservación de las evidencias.

• Cualquier manipulación inadecuada permitirá a la defensa invalidar los resultados del análisis.

Lugar del Hecho = Quirófano !

Conservación de muestras de sangre.

• Soportes adsorbentes.

• Conservación a temperatura ambiente.

• Largo tiempo de conservación.

• Permite generar un banco de muestras.

Otras evidencias

CASO: VIOLACION

• Sangre de sospechoso/ s.

• Evidencias: hisopados, prendas, pelos, uñas, etc.

• Sangre de la víctima.

Prendas

Hisopados

IMPORTANTE: En el análisis previo de las evidencias se debe considerar la

disponibilidad de muestras para análisis de ADN.

MATERIAL CADAVERICO

Los restos humanos como evidencia para el análisis de ADN

Requisitos Para la Conservación de Evidencias.

• Material cadavérico fresco: congelado -20C.• Material cadavérico descompuesto: en mezcla de sales

(hasta 2 meses), congelado si el periodo es mayor• Material Cadavérico esqueletizado: conservar a

temperatura ambiente, en sobres limpios, luego de lavados.

Se debe evitar en todos los casos el empleo de fijadores con formol.

Cadáveres reducidos

Tiempo de muerte aproximado: 1,5 años

Cadáveres Quemados

Cadáveres Saponificados

Tiempo de muerte aprox 8 años Tiempo de muerte aprox 1,5 años

Cadáveres en los Primeros Estadíos de Descomposición

Cadáver conservado

• Conservado desde su muerte en cámara fría (8 meses).

Cadáver Momificado

• Tiempo de muerte aprox. 16 años.

• Inhumado en nicho.• Proceso de

momificación espontáneo.

Tejidos Conservados

• Ciertos tejidos se conservan debido a condiciones ambientales durante periodos prolongados.

• Material muscular con más de 10 meses entre escombros de una explosión.

Huesos quemados con más de 10 Años

Recibidos En proceso

Material de elección en casos de cuerpos muy descompuestos o reducidos

Identificación Molecular de Restos Fragmentados

En ciertos casos el análisis del ADN cadavérico puede ser superfluo

• Si la persona es reconocible.

• Si se dispone de identificación adecuada (huellas dactilares, etc.).

• Si no hay rastros de dudosa procedencia.

En otros puede ser de gran utilidad.

Interpretación de resultados

Violación

EA SV EB

Violación

EA SV EB

Violación

EA SV EB

Violación

Análisis de una Violación

EvidenciaFrac. femenina

EvidenciaFrac. masculina

Víctima

Sospechoso 1

Sospechoso 2

Match Match Match

Algunos casos de identificación por

Análisis de ADN en restos humanos provenientes de

desastres en masa

Toma de muestras del atentado

Santo Tomé (1993).

• Análisis efectuado en 1995.

• Restos óseos y dentales quemados.

• Identificación por comparación con un grupo familiar.

Los Y-STRs dieron la primera pista.

El ADNmt permitió confirmar la matrilínea.

• La secuenciación de las HVR I y II permitió correlacionar a la madre con los supuestos restos de su hijo.

Atentado a la AMIAVista general

Atentado a la AMIA.Muestras

Atentado a la AMIA.Resultados

Accidente Aéreo de LAPA

1999 ACCIDENTE AEREO

CRISTÓBAL COLÓN

Dra. Adriana Silvia Gotti

1. Teoría genovesa clásica:-hermanos del mismo padre y madre

2. Teoría genovesa renovada:-hermanos del mismo padre y diferente madre

3. Teoría mallorquinista-hermanos de la misma madre y diferente padre

CRISTÓBAL COLÓN

Carlos de Evreux, Príncipe de Viana

CRISTÓBAL COLÓN

República Dominicana

Caribe

Sevilla 1898

1. Teoría genovesa clásica:-mismo padre y madre

2. Teoría genovesa renovada:- mismo padre y diferente madre

3. Teoría mallorquinista- misma madre y diferente padre

CRISTÓBAL COLÓN

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