centro de biología molecular y celular estudios estructurales de los fragmentos amino terminal de...

Centro de Biología Molecular y Celular

Estudios estructurales de los fragmentosamino terminal de los canales de potasio

tipo Shaker B nativo (ShB) y mutado (ShBL7E)

Posible topología de los segmentos transmembrana de cada

una de las subunidades de un canal de K+ tipo Shaker.

OBJETIVOS

1.- Explicar la diferente capacidad funcional de los péptidos ShB y ShBL7E en términos estructurales, confrontándolos con una diana modelo que contenga elementos que imiten los sitios de unión de la bola inactivante en el canal.

2.- Postular un modelo estructural del péptido inactivante ShB cuando se encuentra unido a la diana modelo.

3.- Explorar la posible regulación de la actividad de estos péptidos, y consecuentemente de los canales de potasio que los contienen, a través de modificaciones post-traduccionales que introduzcan cambios semejantes a los que diferencian al péptido ShB del péptido mutante ShBL7E.

4.- Sintetizar y caracterizar adecuadamente un análogo fotoactivable del péptido ShB, diseñado para marcar covalentemente por fotoafinidad el sitio de la proteína canal al que se une la “bola” inactivante.

200 220 240200 220 240-20

-10

0

10

20

30

0 4 0 8 0

-12

-8

-4

0

Longitud de onda (nm)

1

7

1

7

% TFE

2

20

[] M

.R.M

. x 1

0-3 (g

rad

o. c

m2 .d

mo

l-1) A B

Fig. 1: Espectros de dicroismo circular de los péptidos ShB (A) y ShBL7E (B) tomados en H2O (1), TFE (7) y en mezclas H2O/ TFE.

1700 1650 1600 1700 1650 1600

Número de onda, cm-1

A B

Fig. 2: Espectros de FTIR de los péptidos ShB y ShBL7E tomados en distintos tampones acuosos: efecto de la fuerza iónica (A) y bandas componentes (B).

Temperatura, ºCNúmero de onda, cm-1

1700 1650 1600

1700 1650 1600

30 45 60 7560

70

80

90

100

163

3/1

64

3 c

m-1

(%)

A

B

C

Fig. 4: Efecto del colato 5 mM (A) y 20 mM (B) sobre la banda amida I del espectro de FTIR de los péptidos ShB y ShBL7E. ShB presenta componentes de estructura , muy estables a la temperatura (C).

- 38.

9

15

ShBL7E- 3

4

- 39

ShB

ShB + Tripsina

- 44

ShBL7E + Tripsina

Tiempo (min)30 45 60 750

Fig. 5: Cromatogramas de HPLC de los péptidos ShB y ShBL7E y los fragmentos resultantes de la hidrólisis con tripsina de estos.

Fig. 6: Efecto de la tripsina sobre la banda amida I del espectro de FTIR de los péptidos ShB (A) y ShBL7E (B) en presencia de vesículas de PG: pérdida de los componentes de estructura .

Número de onda, cm-1

1760 1680 1600

A

1760 1680 1600

B

Control

Digestióntripsina

Fragmento1-14 purificado

por HPLC

Fig. 7: Banda amida I del espectro de FTIR del péptido ShB en presencia de vesículas de PG en distintas situaciones experimentales: gran estabilidad de los componentes de estructura .

1700 1650 1600

Número de onda, cm-1

Control

100 mM EDTA

1 M NaCl

2 % n-octil--glucopiranósido

1700 1650 1600 1700 1650 1600

pD=7.4 pD=8.9

PA/PC

PG/PC

PA/PC

PG/PC

ShB

ShBL7E

G)

E)

C)

A) B)

D)

F)

H)

100%90%50%30%

Número de onda, cm-1

Fig. 10: La adopción de estructura requiere una gran densidad de carga negativa superficial.

Tabla I: Máximos de emisión de fluorescencia (max) y coeficiente de partición superficial que presentan los péptidos marcados con NBD en presencia de vesículas de fosfolípido.

max (nm) K p* x 10

-4 (M

-1)

Nombre del

péptidopH tampón PC PA PG PC PA PG

ShB -NBD

ShBL7E-NDB

ShB -NBD

ShBL7E-NBD

7 555 551 531 531 no unión 77.1±11.6 2.80±1.1

7 554 551 533 534 no unión 3.05±1.45 0.72±0.2

8.5 552 --- 530 536 --- 1.95±0.65 0.64±0.09

8.5 553 --- 536 552 --- 0.62±0.025 0.05

Fig. 13: Ni el péptido ShB ni el ShBL7E se unen a vesículas de PC. Sin embargo, ambos péptidos se unen con gran eficiencia y de forma saturable a vesículas de PA y, en menor medida, de PG.

42

1

2

3

x 10 (M) 8fC *

Xb

* x

103

ShB

Fosfolípido/péptido (M/M)

Flu

ore

scen

cia

de

Em

isió

n a

530

nm

(un

idad

es a

rbit

rari

as)

0 2000 4000 6000

ShBL7E

PA

PA

PG

PG

PC

PC

Fig. 14: El péptido ShB estabiliza la forma dianiónica del PA.

pKa = 7.66

5 6 7

20

40

100

8 9 10 11

0

60

80

pKa = 8.0

pKa = 7.45

PA

PA + ShBPA + ShBL7E

pH

Áre

a 98

0 cm

-1/1

180

cm-1 n

orm

aliz

ada

Fig. 15: Inserción del péptido ShB en vesículas fosfolipídicas aniónicas.

2

4

6

2

4

6

0 .0 0 .1 0 .2 0 .30 .0

0 .2

0 .4

0 .6

0 .8

1.0

A

B

C

Razón molar (péptido/lípido)0.00 0.05 0.10 0.15

Razón molar (péptido/lípido)

ShBL7E

ShBL7E

ShB

ShB

H/

H0

H(K

ca

l/mo

l líp

ido

)

DMPG

DMPA

Tabla II: Secuencia de aminoácidos de derivados del péptido ShB (con el extremo C-terminal amidado) y sus análogos marcados con una sonda fluorescente.

# nombre delpéptido

grado demarcaje

secuencia del péptido

1 5 10 15 20

1 ShB M A A V A G L Y G L G E D R Q H R K K Q

2 ShBL7E M A A V A G E Y G L G E D R Q H R K K Q

3 ShB-21C M A A V A G L Y G L G E D R Q H R K K Q C

4 ShBL7E-21C M A A V A G E Y G L G E D R Q H R K K Q C

5 ShB-21C-NBD 89 % M A A V A G L Y G L G E D R Q H R K K Q C-NBD

6 ShBL7E-21C-NBD 88 % M A A V A G E Y G L G E D R Q H R K K Q C-NBD

7 ShB-21C-Rho 76 % M A A V A G L Y G L G E D R Q H R K K Q C-Rho

8 ShBL7E-21C-Rho 73 % M A A V A G E Y G L G E D R Q H R K K Q C-Rho

9 ShB-21C-Pyr 75 % M A A V A G L Y G L G E D R Q H R K K Q C-Pyr

10 ShBL7E-21C-Pyr 94 % M A A V A G E Y G L G E D R Q H R K K Q C-Pyr

Fig. 16: La inserción del péptido ShB en la bicapa aniónica es dependiente del pH.

1

2

3

4

5

6

7

pH

5.0 6.0 7.0 8.0

H(K

cal/

mo

l)DMPA

DMPA + ShB

DMPA + ShBL7E

Fig. 22: Esquema de reacción entre el 1-(p-azidosalicilamido)-4-(iodoacetamido)butano (ASIB) y un péptido que contenga cisteina para dar lugar a un péptido derivatizado con ASIB.

Péptido-SH + 2 222I CH C N CH CH CH CH N C2

H O

O HHO

3N

ASIB

2 222 CH C N CH CH CH CH N C2H O

O HHO

3NPéptido-S+HI

ASIB-péptido

Longitud de onda (nm)

Ab

so

rban

cia

250 275 300 325 350 375 4000.0

1.0

1.5

0.5

péptido ShBL7E-21C-ASIBpéptido ShB-21C-ASIB

péptido ShBASIB

Fig. 24: Ningún péptido alteró la velocidad de activación del canal Shaker4-46.

potencial de membrana (mV)

Canal ShB4-46 (5)+ péptido ShBL7E (6)+ péptido ShBL7E-ASIB (5)+ péptido ShB (5)+ péptido ShB-ASIB (5)

-20 -10 0 10 20 30 401

2

3

4

5

6

t 1/2 a

cti

vac

ión

(m

s)

Fig. 25: El péptido ShB-ASIB es un análogo funcional del péptido ShB.

+ péptido ShBL7E

+ péptido ShBL7E-ASIB

+ péptido ShB + péptido ShB-ASIB

ShB4-46 ShB4-46

Inactivación tipo-N

Inactivación tipo-C50 ms

500 ms

ShB4-46+ péptido ShBL7E

+ péptido ShBL7E-ASIB

A B

C

Fig. 30: El péptido ShBY8(P) se comporta estructuralmente como ShBL7E.

1700 1650 1600

PG

23 º C70 º C

23 º C

Número de onda, cm-11700 1650 1600

PA

23 º C

70 º C

23 º C

Número de onda, cm-1

PC

1700 1650 1600

23 º C70 º C

23 º C

Número de onda, cm-1

Tabla III: Efecto de diferentes péptidos sobre el curso temporal de la activación e inactivación de corrientes de K+ en canales ShB6-46. La constante de activación (1/2) se mide como el tiempo necesario para alcanzar el 50 % de la amplitud máxima de la corriente a diferentes potenciales. El valor de la constante de inactivación () se estima ajustando el tramo de disminución de la corriente a una función exponencial de caida simple. Media desviación estándar (n).

t1/2 activación (ms) t1/2 inactivación (ms)

Péptido 0 mV Control (sin péptido) 5.631.12 (7) 3.280.43 (8) 2.320.21 (8) 1300160 (6)ShB 4.910.95 (5) 3.170.39 (7) 2.220.23 (6) 21548 (6)ShB-Y8(P) 5.871.03 (5) 3.390.47 (5) 2.380.36 (5) 76687 (6)ShB-Y8(P)(Quinasa Src)

5.650.89 (4) 3.350.32 (4) 2.170.29 (4) 63481 (5)

-20 mV +20 mV +20 mV

Fig. 32: El péptido ShBY8(P) presenta componentes de estructura que dependen de la relación lípido-péptido.

1700 16001650

PA

1700 16001650

Razón molarShB-Y8(P)/fosfolípido

0.13

0.06

0.03

23 ºC

70 ºC

22 ºC

Número de onda, cm-1

PG

Fig. 33: El péptido ShBY8(P) no se inserta en vesículas fosfolipídicas.

0,00 0,04 0,08 0,122

3

4

5

6

7

0,00 0,04 0,08 0,122

3

4

5

6

7

Razón molar (péptido/PLs)

H

(Kca

l/mol

lípi

do)

DMPC

DMPG DMPA

Razón molar (péptido/PLs)

0,00 0,04 0,08 0,122

3

4

5

6

7

PéptidoShB-Y8(P)

Razón molar (péptido/PLs)

PéptidoShB

PéptidoShB-Y8(P)

PéptidoShB

PéptidoShB-Y8(P)

PéptidoShB

H(K

cal/m

ol lí

pido

)

H

(Kca

l/mol

lípi

do)

Fig. 34: Propuesta de dos modelos alternativos de estructura en “horquilla “ para el péptido ShB insertado en vesículas fosfolipídicas aniónicas. El giro necesario para que se forme esta estructura puede tener lugar a partir de dos secuencias de tetrapéptido: VAGL (panel A) y AGLY (panel B).

456

12

7

8 5

12

67

A

B

Porcentajes de unión de los péptidos marcados con NBD a distintos fosfolípidos.

Po

rcen

taje

de

pép

tid

ou

nid

o a

PL

s

Relación molar PLs/péptido

pH 7.0 pH 8.5

100

80

60

40

20

0

0 1400 2800 4200 5600 0 1400 2800 4200 5600

100

80

60

40

20

0

PA/ShB

PG/ShBPA/ShBL7E

PG/ShBL7E

PA/ShB

PG/ShB

PA/ShBL7E