carrera de especializacion en biotecnologia...
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CARRERA DE ESPECIALIZACION EN
BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL
FCEN-INTI
Materia de Especialización CEBI_E4b
Ingeniería Genética y Metabólica
Módulo Ingeniería Metabólica
Docente a cargo: Dra. Ana Paula Domínguez Rubio
• Manipulaciones genéticas manipulación de los procesos
metabólicos con el objetivo de mejorar las propiedades de los
organismos de interés biotecnológico
• Se modifican o introducen nuevas reacciones bioquímicas
específicas mediante tecnología recombinante para mejorar
propiedades celulares
• Ventaja de las bacterias haploides
Ingeniería genética y metabólica
Regulación de vías celulares
• Mecanismos de regulación de procesos de síntesis que le permiten al
organismo evitar el exceso de producción de un compuesto
- Ventaja evolutiva: si no se evitara sería una pérdida de recursos y
energía (suelen ser escasos en los ambientes naturales)
• Mejoramiento de cepas industriales con el objetivo de lograr la
SOBREPRODUCCIÓN
• Aumento de productividad:
1) Manejo nutricional: suministro controlado de sustrato limitante o
cofactores enzimático
2) Ingeniería Genética y Metabólica: manipulación genética
Mecanismos de regulación en bacterias
(a) Ambiente extracelular: recursos (fuente de C, H, O, N)
y condiciones (pH, temperatura)
(b) Barreras de
permeabilidad:
transporte
(c) Expresión
genética
(cromosomas,
plásmidos)
(d) Interacción
con otros
metabolitos
. Degradación de polímeros heterogéneos
hasta azúcares simples
. Fermentación simultánea de una mezcla
de azúcares
. Tolerancia a la concentración creciente
del producto final y a las condiciones del
proceso de fermentación
Características ventajosas de los microorganismos
usados en procesos biotecnológicos
¿Cómo se lograron cepas mejoradas a lo largo de la historia?
-Agentes físicos Radiación ionizante (rayos
gamma) y no ionizantes (UV)
-Agentes químicos agentes que reaccionan
con el DNA
¿Cómo se lograron cepas mejoradas a lo largo de la historia?
¿Cómo se lograron cepas mejoradas a lo largo de la historia?
Del laboratorio a la industria…
Producción a gran escala
Fermentadores
Mejoramiento de cepas
y
optimización de condiciones
Producción a pequeña escala
Marco más general…
Productos microbianos de importancia industrial
Metabolitos primarios y secundarios
• Metabolitos primarios producidos durante la
fase exponencial
• Son considerados esenciales para el crecimiento (ej.:
alcoholes formado como parte del metabolismo
energético)
- Aminoácidos, vitaminas y solventes orgánicos
• Metabolitos secundarios: producidos durante la
fase estacionaria
• No son esenciales para el crecimiento y la
reproducción. Su formación depende de las
condiciones de crecimiento y en general su
producción se encuentra reprimida.
- Antibióticos
Productos microbianos de
importancia industrial
• Enzimas
• Metabolitos primarios
- Aminoácidos (Lisina y Glutamato)
- Vitaminas (B12 y B2)
- Solventes orgánicos (ácido acético, etanol)
• Metabolitos secundarios
- Antibióticos
Metabolitos primarios: aminoácidos
-Triptófano: soluciones intravenosas; antioxidante; precursor de la melatonina
-Ácido glutámico: soluciones intravenosas, potenciador de sabor, ablandador de carne, aditivo
para alimento balanceado
- Otros se obtienen por síntesis química como la glicina (precursor herbicida glifosato)
1) La extracción de aa de hidrolizados de proteínas es costosa
2) La síntesis química resulta en mezclas racémica ópticamente inactivas
D-aa y L-aa
- Puede ser por 3) fermentación o por 4) síntesis enzimática
- Las plantas son producen poca cantidad de lisina, metionina y triptófano
La producción microbiológica produce aa estereoespecíficos
L-aa biológicamente activos
¿Por qué la producción microbiológica de
aminoácidos?
Obtención de aa
1) Extracción
2) Síntesis química
3) Fermentación,
4) Catálisis enzimática
Biosíntesis de Aminoácidos
4) Síntesis enzimática 3) Fermentación
Fermentación en sentido biotecnológico y
no en sentido fermentación-respiración celular
El esqueleto carbono de los aminoácidos deriva de
precursores provenientes de tres vías metabólicas:
Biosíntesis de Aminoácidos
- Las plantas y las bacterias
sintetizan todos los aa
- Los mamíferos sólo
sintetizan 10 de los 20 aa
3) Ciclo Krebs
(aerobiosis)
1) Glucolisis
(anaerobiosis)
2) Camino de pentosas
In vitro: en tubo de ensayo a partir de enzimas
purificadas a partir de orgarismos
In vivo: en microorganismos con sustratos
específicos
Síntesis enzimática de aa
Sustrato Producto
2 opciones
- Aumentar la expresión de
enzimas que provenn
precursores
-Aumentar la expresión de
enzima limitante
limitante
- Aumentar la expresión de
punto ramificación
- Introducción de enzima
heteróloga que no sea
inhibida por el producto
- Introducción de nuevas
enzimas para favorecer la
catálisis
¿Cómo se logra incrementar la
productividad del proceso metabólico ?
Algunos ejemplos…
1) Introducir enzimas para aprovechar
nuevos sustratos
• HCE promoter: promotor fuerte constitutivo
• pgsA: proteína de anclaje del complejo poli-
Ɣ-glutamato sintetasa de Bacillus subtilis
• amyA: α-amilasa de Streptococcus bovis
• Km r: gen de resistencia a kanamicina
• Hom: homoserina deshidrogenasa de C.
glutamicum
• sacB: levansacarasa de Bacillus subtilis
C. glutamicum es una
bacteria gram-positiva
que originalmente se la
caracterizó por su
secreción de aa
Objetivo: Expresar la enzima α-amilasa en la superficie bacteriana para
que pueda sintetizar y secretar al medio externo un aa de interés a partir de
almidón
1) Introducir enzimas para aprovechar
nuevos sustratos
Objetivo: Expresar la enzima α-amilasa en la superficie bacteriana para
que pueda sintetizar y secretar al medio externo un aa de interés a partir de
almidón
Result of the Western blot analysis of
PgsA–AmyA fusion protein.
-Lanes 1 and 4 marker proteins,
-Lanes 2 and 3 cell wall fractions of
wildtype C. glutamicum and Δhom::HPA,
respectively.
The molecular sizes of the PgsA and AmyA
proteins were approximately 43 and 78 kDa,
respectively, and that of the PgsA-AmyA fusion
protein, therefore, was predicted to be
approximately 121 kDa.
SDS-PAGE using an 8% (w/v) gel and stained with the primary rabbit anti-AmyA antibody
followed by staining with the secondary goat anti-rabbit IgG conjugated with alkaline
phosphatase
1) Introducir enzimas para aprovechar
nuevos sustratos
Objetivo: Expresar la enzima α-amilasa en la superficie bacteriana para
que pueda sintetizar y secretar al medio externo un aa de interés a partir de
almidón
WT
mutante
WT
mutante
Fermentación de L-lisina con almidón soluble como la única fuente de C
WT
mutante
WT
mutante
2) Mutar genes para aumentar la expresión
de enzima limitante
También en C. glutamicum
Objetivo: mutar el promotor de la enzima DHPS (enzima limitante) para aumentar
el número de copias de las mismas y con ello su actividad
Dihydrodipicolinate
synthase
Objetivo: mutar el promotor de la enzima DHPS (enzima limitante) para aumentar
el número de copias de las mismas y con ello su actividad
WT
2) Mutar genes para aumentar la expresión
de enzima limitante
Objetivo: Aumentar la síntesis
de algún aa aromático de
interés
También en C. glutamicum
3) Mutar genes para desfavorecer vías
metabólicas que conduzcan a productos
indeseados
Esquema de metabolismo conversión a L-triptófano, L-fenilalanina y L-tirosina en
C. glutamicum. La líneas punteadas indican inhibición feedback negativo.
3) Mutar genes para desfavorecer vías
metabólicas que conduzcan a productos
indeseados
Esquema de metabolismo conversión a L-triptófano, L-fenilalanina y L-tirosina en
C. glutamicum. La líneas punteadas indican inhibición feedback negativo.
4) Incrementar el número de enzimas
mediante sobreexpresión
Esquema de la ingeniería metabólica para la producción de L-triptófano en C.
glutamicum.
5) Incrementar los genes de las enzimas
de vías que proveen precursores
5)
Ej.: Sobreexpresion de
enzimas en la ruta de las
pentosas (transcetolasa)
Esquema de la ingeniería metabólica para la producción de L-triptófano en C.
glutamicum.
6) Mutar genes para inactivar al transportador
6)
Esquema de la ingeniería metabólica para la producción de L-triptófano en C.
glutamicum.
5) Incrementar los genes de las enzimas
de vías que proveen precursores
3) Mutar genes
para desfavorecer
vías metabólicas
que conduzcan a
productos
indeseados
6) Mutar genes para inactivar al
transportador
3)
3)
4) 6) 4)
5)
4) Incrementar el
número de enzimas
mediante
sobreexpresión
Metabolitos primarios: vitaminas
- Se utilizan como suplemento alimenticio y producto
farmaceútico
Producción Microbiológicas: Vitamina B12 y Riboflavina B2.
Todas las otras se pueden producir ya sea por extracción desde fuentes
naturales o por rutas de síntesis química
Vitamina B12 (metilcobalina):
-Es una vitamina esencial (cofactor de enzimas mutasas )
-Es sintetizada únicamente por microorganismos
-Estructura química compleja, requiere 70 reacciones
químicas
-Se extrae como subproducto de la fermentación de
distintos antibióticos empleando cepas de streptomyces
con bajos rendimientos
Vitamina B12 (metilcobalina):
-Estructura química compleja, requiere 70
reacciones químicas
Diseño de una ruta biosintética heteróloga
a) Se selecciona un hospedador para la ruta de biosíntesis
heteróloga considerando:
- La capacidad de suministro de precursores y cofactores
- Las herramientas de ingeniería genética disponibles
- La capacidad de fermentación a escala industrial,
utilizando una fuente de carbono barata y fácilmente
disponible
Diseño de una ruta biosintética heteróloga
b) La actividad de la enzima se
verifica in vitro y posteriormente in
vivo.
Se detectan productos del ensayo in
vitro o in vivo mediante análisis
espectroscópico, espectrometría de
masas o ensayos microbiológicos.
Diseño de una ruta biosintética heteróloga
c) Se ensamblan los genes de interés y
otros elementos funcionales en
plásmidos o se los integra al genoma.
Para construir la ruta metabólica, se
divide en módulos separados. Estos
módulos se verifican secuencialmente en
un por separado y luego se los
ensambla.
Ribosomal Binding Site
CoDing Sequences
Diseño de una ruta biosintética heteróloga
d) Sobre la cuantificación de los metabolitos,
se deben eliminar los cuellos de botella y se
debe integrar el flujo metabólico para apuntar
a la maximización del compuesto
Para optimizar la expresión génica en la vía
metabólica, se diseñan promotores, RBS y
número de copias de genes.
Diseño de una ruta biosintética heteróloga
e) Las características de las cepas diseñadas se verifican
mediante fermentación.
Varios sustratos (i.e, ALA, iones de cobalto, betaína y
DMB) y condiciones (i.e, concentración de oxígeno
disuelto, pH y temperatura) pueden ser optimizado para
mejorar el rendimiento y la productividad
Metabolitos primarios:
ácidos orgánicos y solventes
Principales ácidos orgánicos y solventes
producidos por microorganismos
1. Acido cítrico
2. Acido acético
3. Acido láctico
4. Acido succínico
5. Acido propiónico y butírico
4. Acido succínico
6. Etanol
7. Butanol
8. Acetona
9. 1,2 y 1,3 propanodiol
10. 2,3 butanodiol
Etanol
-Obtención desde levaduras a partir de azúcares
Levaduras:
Saccharomyces spp.
Bacteria:
Zymomonas mobilis
¡Bacterias capaces de producir alcohol desde distintos sustratos
con alto rendimiento!
Pasteur
(1822-1895)
-Uso medicinal, químico y combustible (bioetanol)
¡Igual tolerancia y mayor
productividad que levaduras!
Investigaciones en bacterias durante los últimos 20 años:
Etanol
Se busca:
-Fermentaciones continuas con reciclado de levadura
-Ídem con vacío para evaporar etanol
-Levaduras inmovilizadas
Búsquedas de nuevas cepas:
-Toleren etanol
-Fermenten azúcares rápidamente
-Capaces de flocular
Enzimas claves: piruvato decarboxilasa y alcohol deshidrogenasa
Levaduras: Saccharomyces spp.
Etanol
Bacteria: Zymomonas mobilis
Bacilo gram negativo aerobio facultativo
Metabolismo fermentativo obligado con producción de etanol
Algunos fermentan sacarosa
Producen 2 moles de etanol y 2 de CO2 por mol de glucosa producción
de etanol del 10-12%
Genoma completo desde el 2005 (2,06 Mb)
Desde 1970 1400 trabajos publicados
•Vive sobre plantas como el cactus Maguey. Fermenta el jugo de
maguey produciendo el pulque: una bebida alcohólica de alta
graduación, espesa y de color blanco
Etanol
Tipo de glucólisis más común
Vía de Embden-Meyerhof,
Es una ruta metabólica
alternativa.
Es exclusiva de un número
reducido de microorganismos
que carecen la vía de
Embden-Meyerhof
Vía de Entner-Doudoroff
Z. Mobilis utiliza
esta vía
exclusivamente
Productos de fermentación de Saccharomyces vs. Zymomonas
Etanol
Zymomonas mobilis Saccharomyces carlsbergensis.
Etanol
-Uso medicinal, químico y combustible (bioetanol)
Combustible (bioetanol): al 95% puede ser usado como combustible
Agotamiento de las
reservas de petróleo
incremento del precio
$
Programas gubernamentales de búsqueda de nuevas fuentes de
energía
Etanol
$
Primera generación de bioetanol
Fuente: Nancy I. López
Etanol
Segunda generación de bioetanol: cambio de materia prima
No pueden usar pentosas
eficientemente
Menos susceptible a
manipulaciones genéticas
Diferentes requerimientos de
oxígeno durante crecimiento y
producción de etanol
Segunda generación de bioetanol: cambio de materia prima
Etanol
Saccharomyces cerevisiae Zymomonas mobilis
Escherichia coli
+
Genes recombinantes para
la síntesis de etanol
pentosas
hexosas
etanol
pentosas
hexosas
etanol
Segunda generación de bioetanol: cambio de materia prima
Etanol
Zymomonas mobilis
+
Genes recombinantes para usar lignocelulosa
Glucosa
Frutosa etanol
lignocelulosa
Lignocelulosa o biomasa
lignocelulósica:
materia vegetal seca
Materia prima más abundante
disponible en la Tierra para la
producción de biocombustibles
Objetivo: lograr un microorganismo productor de etanol a partir de la
fermentación de todos los azúcares (glucosa, manosa y xilosa)
liberados de la biomasa lignocelulósica para la producción bioetanol.
Bioetanol
etanol lignocelulosa
Zymomonas mobilis
Objetivo: lograr un microorganismo productor de etanol a partir de la
fermentación de todos los azúcares (glucosa, manosa y xilosa)
liberados de la biomasa lignocelulósica para la producción bioetanol.
Bioetanol
etanol lignocelulosa
Zymomonas mobilis
etanol lignocelulosa
Manosa Frutosa
E. coli
Introducem genes que
codifican enzimas
catabólicas
Zymomonas mobilis
recombinante
Pgap: promoter of the Z.
mobilis glycelaldehyde-3-
phosphate dehydrogenase
Gene (promotor fuerte)
manA: E. coli
phosphomannose
isomerase gene
Frk:
Z. mobilis
fructokinase
gene
Manosa
y
fructosa
Cell growth and fermentation of mannose or a mixture
of glucose and mannose in Z. mobilis carrying the
mannose catabolicenzyme genes.
Bioetanol
Residual glucose
Accumulation of ethanol
Growth of strain
Residual mannose
Cell growth and fermentation of mannose or a mixture
of glucose and mannose in Z. mobilis carrying the
mannose catabolicenzyme genes.
Bioetanol
Residual glucose
Accumulation of ethanol
Growth of strain
Residual mannose
Cell growth and fermentation of mannose or a mixture
of glucose and mannose in Z. mobilis carrying the
mannose catabolicenzyme genes.
Bioetanol
Residual glucose
Accumulation of ethanol
Growth of strain
Residual mannose
Capacidad de co-fermentar
manosa y glucosa
Cell growth and fermentation of mannose or a mixture
of glucose and mannose in Z. mobilis integrated with
manA
Bioetanol
Residual glucose
Accumulation of ethanol
Growth of strain
Residual mannose
Integración de E.
coli manA en el
ADN cromosómico
de Z. mobilis
Cell growth and fermentation of mannose or a mixture
of glucose and mannose in Z. mobilis integrated with
manA
Bioetanol
Residual glucose
Accumulation of ethanol
Growth of strain
Residual mannose
Integración de E.
coli manA en el
ADN cromosómico
de Z. mobilis
Cell growth and fermentation of mannose or a mixture
of glucose and mannose in Z. mobilis integrated with
manA
Bioetanol
Residual glucose
Accumulation of ethanol
Growth of strain
Residual mannose
Integración de E.
coli manA en el
ADN cromosómico
de Z. mobilis
Capacidad de co-fermentar
manosa y glucosa
Pgap: promoter of the Z.
mobilis glycelaldehyde-3-
phosphate dehydrogenase
Gene (promotor fuerte)
xylA, xilb, tal y tkt A:
E. coli genes.
Para conferirle habilidad que fermente xilosa:
introducción de 4 genes
Xilosa
Cell growth and fermentation of glucose or a mixture
of glucose and xylose in Z. mobilis carrying the xylose
catabolic enzyme genes
Bioetanol
Residual glucose
Accumulation of ethanol
Growth of strain
Residual xylose
Capacidad de co-fermentar
xilosa y glucosa
Fermentation profiles for glucose, xylose, mannose, and their
indicated mixtures in Z. mobilis harboring mannose and xylose
catabolic enzyme genes
Bioetanol
Residual glucose Residual xylose Residual mannose
Growth of strain Accumulation of ethanol
Capacidad de
co-fermentar
manosa ,xilosa
y glucosa
Time courses of 25-ml-scale continuous fermentation using 9:1
acid hydrolysate–RM medium in a reactor packed with immobilized Z.
mobilis [sucZE2::manA, pZA22-xtR]
Bioetanol
Residual glucose Residual xylose Residual mannose
Accumulation of ethanol
Capacidad de co-fermentar
manosa ,xilosa y glucosa
Hidrolizado ácido real
preparado a partir de
materia prima celulósica
que contiene glucosa,
manosa y xilosa.
Metabolitos primarios:
ácidos orgánicos y solventes
•Mantener alta productividad
•Requerir bajos requerimientos nutricionales
Ácidos orgánicos:
•Tolerar alta concentración de ácidos
¿Qué cepa a utilizar?
Ácido acético (vinagre)
Latín vīnum y ācrem, (vino agrio). Aunque no sólo se elabora a partir
del vino, cualquier otra bebida alcohólica puede emplearse como
base, como por ejemplo la cerveza para producir vinagre de malta y
también algunas frutas o verduras.
Levaduras
(Saccharomyces cerevisiae)
Fermentación alcohólica
anaerobiosis
Ácido acético (vinagre): fermentación mixta
Bacterias del Ácido
acético (AAB)
(Acetobacter spp.,
Gluconobacter spp.)
Fermentación ácido
acética
aerobiosis
PQQ-ADH
pyrroquinoline quinone-
dependent alcohol
dehydrogenase
Ácido acético
Oxidación de etanol a ácido acético
PQQ-ADH is a key enzyme in the ethanol oxidase
respiratory chain of acetic acid bacteria
Ácido acético
Objetivo: sobreexpresar 2 subunidades de la
enzima PQQ-ADH (adhA y adhB) con el fin de
lograr aumentar la producción de ácido acético
Padh: promoter region of the
operon coding for PQQ-ADH
from A. pasteurianus
Ácido acético
Construction of recombinant plasmid PBBR-adhA-adhB.
Padh 367 bp
adhA 2226 bp
adhB 1419 bp
PCR amplification products shown by agarose gel
electrophoresis.
Ácido acético
M marker (bp)
1 Padh
2 adhA
3 adhB
Padh 367 bp
adhA 2226 bp
adhB 1419 bp
Verification of recombinant plasmids by restriction enzyme
digeston
Ácido acético
Lanes:
M 8-kbp marker
1 PBBR-adhA digested with Bam HI and Spe I
2 PBBR-adhB digested with Spe I and Xba I
3 PBBR-adhA-adhB digested with Bam H I.
Padh 367 bp
adhA 2226 bp
adhB 1419 bp
SDS-PAGE of recombinant protiens over-expressed in the
genetically engineered strain
Ácido acético
Lanes:
M molecular weight marker (KDa)
1 and 2 original strain
3 engineered strain
Comparison of fermentation parameters in the original and
engineered strains.
Ácido acético
original strain
engineered strain
Ethanol content
original strain
engineered strain original strain
engineered strain
Comparison of 2D-PAGE patterns between original
engineered strains.
Ácido acético
Protein spots whose expression level changed more than 50% were identified
as differentially expressed proteins.
Comparison of 2D-PAGE patterns between original
engineered strains.
Ácido acético
El objetivo es separar las proteínas mediante un gel con gradiente de pH en
condiciones desnaturalizantes de acuerdo con su punto isoeléctrico
(isoelectroenfoque) y por su peso molecular en gel de poliacrilamida al 12%
con SDS (SDS-PAGE).
Comparison of 2D-PAGE patterns between original
engineered strains.
Ácido acético
El punto isoeléctrico (pI) de un proteína es su pH cuando su carga neta es 0 y no
se desplaza cuando se le aplica un campo eléctrico. �
En un gel con un gradiente de pH, tanto los extremos N y C terminal como las
cadenas laterales ionizables de las proteínas captan o liberan protones de
acuerdo con el pH, de modo que la carga eléctrica global de las proteínas
dependerá del pH del entorno.
A medida que las moléculas de proteína se van acercando a su punto
isoeléctrico irán perdiendo carga eléctrica o ganando cargas de signo contrario,
hasta llegar al valor de pH en que la carga neta sea cero y las proteínas dejen
de moverse y se focalizan.
Comparison of 2D-PAGE patterns between original
engineered strains.
Ácido acético
Nineteen representative differentially
expressed protein spots were identified
Differentially expressed protein spots were analyzed by tandem mass
spectrometry (MS/MS) and the peptide fingerprint spectrum was identified. The
Swiss-Prot protein database was used to search for peptides; 17 of the 19
queried peptides matched those in the database.
spots
Metabolic Flux Analysis
Ácido acético
El gen de la alcohol deshidrogenasa de A. pasteurianus se modificó mediante la
ingeniería genética aumentando la producción de etanol
TCA
Con un análisis de flujo metabólico de
las vías del etanol y la glucosa, los
resultados revelan que la sobreexpresión
de PQQ-ADH es una manera efectiva de
mejorar la vía de la cadena respiratoria de
oxidación de etanol.
Sin embargo disminuye los flujos de
diversos ácidos orgánicos en el ciclo del
ácido tricarboxílico (TCA) en omparación
con la cepa original
.
Para concluir…
• Es menos corrosivo y tiene una menor presión de vapor
• No absorbe agua Mezcla con gasolina sin separación de fases
• Se puede añadir en la refinería y ser transportados y entregados a través
de la infraestructuras existentes
•Mayor energía
•No requiere modificaciones para los motores de automóviles.
Ventajas del butanol frente al etanol
Factores que limitan la producción industrial de butanol:
Alto costo de la materia prima y bajo rendimiento por toxicidad del
solvente
El etanol hasta ahora ha servido como un combustible alternativo debido a
que su proceso de fabricación es fácil y rentable
El butanol, sin embargo, se considera más cercano al combustible fósil en
términos de su densidad energética e higroscopicidad
Limitaciones a la producción: toxicidad del etanol y butano
• Efecto citotóxico del etanol es la razón por la cual se puede usar como
desinfectante y preservante.
• Desventaja en procesos fermentativos
• Citotoxicidad desde efectos reversibles a muerte celular
• Butanol más toxico desestabiliza membrana e interfiere con transporte
• Efectos: alteraciones en metabolismo de fosfolípidos y de ácidos grasos
membrana principal blanco
• Costo en el proceso de fermentación: disminución de tasa de producción a
medida que el producto se acumula
• Organismo a utilizar tolerar altos niveles para producción a escala industrial
Butanol
Fermentación acetona-butanol-etanol (ABE)
Clostridium acetobutylicum
• Bacilos Gram positivos, anaerobios obligados y formadores de esporas
• Usada por Jaim Weizmann en la producción de acetona y biobutanol a partir
de almidón en 1916 (producción de pólvora y TNT: trinitrotolueno).
• Especie más usada para producción industrial.
n-butanol ha sido tradicionalmente producido por Clostridium
acetobutylicum a través de la fermentación ABE
Butanol
Objetivo: modificar genéticamente a E. coli
para la producción de butanol
Butanol
Conversion of butyryl-CoA to butanol
is more efficiently done by alcohol
dehydrogenase from C.
acetobutylicum as compared to the
corresponding native enzyme of host E.
coli due to its higher affinity towards the
butyryl-CoA than the acetyl-CoA
E. coli
C. acetobutylicum
Clostridium acetobutylicum
Escherichia coli
+
Genes recombinantes para
la síntesis de butanol butanol
butanol
Ácidos
grasos
Ácidos
grasos
Butanol
<
-3 genes from C. Acetobutylicum were cloned in a vector and expressed in E. coli:
1) an operon containing phosphotransbutyrylase (ptb) genes
2) butyrate kinase (buk) genes
3) aldehyde-alcohol dehydrogenase (adhE2) gene
Clostridium acetobutylicum
Escherichia coli
+
Genes recombinantes para
la síntesis de butanol butanol
butanol
Ácidos
grasos
Ácidos
grasos
(A) The DH5a strain containing test and control plasmids were grown in LB
medium in presence or absence of IPTG and analyzed for the expression of
aldehyde/alcohol dehydrogenase (AdhE2) and butyrate kinase (Buk) containing
6-histidine tag on Western blot.
Efficient expression of clostridial pathway enzymes
in E. coli
Butanol
Lane M – Molecular weight marker;
lane 1 – pQE30 – IPTG;
lane 2 pQE30 + IPTG;
lane 3 – pQE-adhE2/ptb/buk – IPTG;
lane 4 – pQE-adhE2/ptb/buk + IPTG.
IPTG.= inductor
Wstern blotting was performed to assess the expression of two enzymes, Buk (whose
gene was placed at the 3’end of ptb-buk operon) and AdhE2, where 6-histidine tag was
incorporated during cloning.
Clear bands corresponding to the molecular weight of Buk (~39 kDa) and AdhE2 (~96
kDa) were observed on Western blot using antibody against 6-histidine tag indicating
their efficient expression in E. coli
(~39 kDa)
(~96 kDa)
The grown cells in the LB medium were permeabilized with chloroform and
analyzed for the activity of phosphotransbutyrylase
Activity of phosphotransbutyrylase (Ptb), Buk and AdhE2
Butanol
Significant enzyme expression and their activities were also observed in the
uninduced cells, suggesting the leaking expression of these enzymes.
C) Cells containing control and test plasmids were grown in LB medium
containing 10 mM butyric acid and samples were withdrawn after 48 h and 120 h
to test for butanol production.
Activity of phosphotransbutyrylase (Ptb), Buk and AdhE2
Butanol
Both Ptb and Buk enzymes were reversible in nature and might be diverting some
of the internal butyryl CoA pool of E. coli into butyrate.
Butyrate tolerance level of engineered E. coli. The strain containing pQE-
adhE2/ptb/buk plasmid was grown under anaerobic condition and resuspended in
TB medium containing various concentration of butyric acid and 100 mM glycerol to
achieve OD of 1
Tolerance level of butyric acid to the E. coli host strain
Butanol
Butyric acid
concentration beyond
100 mM was inhibitory
to both cell growth
and butanol
production
Butyrate tolerance level of engineered E. coli. The strain containing pQE-
adhE2/ptb/buk plasmid was grown under anaerobic condition and resuspended in
TB medium containing various concentration of butyric acid and 100 mM glycerol to
achieve OD of 5
Tolerance level of butyric acid to the E. coli host strain
Butanol
Butyric acid
concentration beyond
100 mM was inhibitory
to both cell growth
and butanol
production
Four fold higher cell density at the time of induction and butyric acid
addition did not improve the tolerance level beyond 100 mM
Engineered E. coli MG1655 (pQE-adhE2/ptb/buk) strain was grown under anaerobic
condition and resuspended in Terrific Broth with 40 mM butyric acid and 40 mM of
either glucose or glycerol as electron donor. Various substrates consumed and
butanol produced were analyzed through HPLC after 120 h of incubation. The
butanol yield was calculated with respect to (wrt) each carbon source.
Substrate specificity and substrate ratio for butanol
production
Butanol
Different ratios of glycerol and butyric acid were tested for production of
butanol using cells at the OD of 1.0.
Substrate specificity and substrate ratio for butanol
production
Butanol
1.5:1
Different butyric acid concentrations were tested for production of butanol using
cells at the OD 600 600 of 10 by keeping the glycerol to butyric acid ratio fixed at
1.5:1.
Since glycerol to butyric acid ratio of 1.5:1 worked best for butanol production,
we analyzed the effect of increased biocatalyst on butanol production when higher
amount of substrates in the same ratio was used.
Butanol
. Maximum butanol concentration of ~60 mM
was obtained when butyric acid concentration in the
medium was 90 mM (Figure 4C).
Various short chain fatty acids were added in the growth medium (i.e. Terrific
broth + 45 mM glycerol) of E. coli carrying control or the test plasmid and their
conversion to the corresponding alcohol were monitored through HPLC or GC.
Butanol
Substrate specificity of engineered cells towards various
short chain fatty acids.
Butanol
Strain specificity of engineered cells on the uptake of
butyric acid and production of butanol.
Tested three commonly used laboratory E. coli strains, i.e., E. coli M15, E. coli
MG1655 and E. coli B, for their ability o convert butyric acid into butanol when
transformed with pQE-adhE2/ptb/buk plasmid.
Butanol
Production of butanol in the bioreactor in batch and
continuous mode
OD of 1.0.
OD of 10 To improve the titer and
productivity of butanol
Though the
butanol production
rate was
considerably lower
than what is
expected at the
commercial scale
¡OPTIMIZACIÓN!
OD of 10
Continuous production of butanol by cell
recycling through hollow-fiber cassette.
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