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CARACTERIZACIÓN DE LOS EFECTOS BIOLÓGICOS DE LOS POLIFENOLES EN LA INFLAMACIÓN Y EL METABOLISMO : NUEVAS
PERSPECTIVAS NUTRICIONALES Raúl Beltrán Debón
Dipòsit Legal: T-1517-2011
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Raúl Beltrán Debón
CARACTERIZACIÓN DE LOS EFECTOS BIOLÓGICOS DE LOS
POLIFENOLES EN LA INFLAMACIÓN Y EL METABOLISMO:
NUEVAS PERSPECTIVAS NUTRICIONALES
TESIS DOCTORAL
dirigida por el
Dr. Carlos Alonso-Villaverde Lozano
Dr. Jorge Joven Maried
Departament de Medicina i Cirurgia
Reus
2011
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN DE LOS EFECTOS BIOLÓGICOS DE LOS POLIFENOLES EN LA INFLAMACIÓN Y EL METABOLISMO : NUEVAS PERSPECTIVAS NUTRICIONALES Raúl Beltrán Debón DL:T-1517-2011
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FACULTAT DE MEDICINA I CIÈNCIES DE LA SALUT
DEPARTAMENT DE MEDICINA I CIRURGIA Carrer Sant Llorenç, 21 43201 Reus Tel. 977 759 306 Fax. 977 759352
FEM CONSTAR que aquest treball, titulat “biológicos de los polifenoles en la inflamación y el metabolismo: nuevas perspectivas nutricionales.”, que presenta Raúl Beltrán Debón, ha estat realitzat sota la nostra direcció al Centre de Recerca Biomèdica de l’Institut d’Investigació Sanitària Pere Virgili i que acompleix els requeriments per poder optar al títol de Doctor. Reus, 10 de juny de 2011 El director de la tesi doctoral doctoral Dr. Carlos Alonso-Villaverde Lozano
ALUT
FEM CONSTAR que aquest treball, titulat “Caracterización de los efectos biológicos de los polifenoles en la inflamación y el metabolismo: nuevas
”, que presenta Raúl Beltrán Debón, ha estat sota la nostra direcció al Centre de Recerca Biomèdica de l’Institut
d’Investigació Sanitària Pere Virgili i que acompleix els requeriments per
El codirector de la tesi
Dr. Jorge Joven Maried
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A mi abuelo y
a mi tío Vicente
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AGRADE
AGRADECIMIENTOS
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A g r a d e c i m i e n t o s a
“El agradecimiento es la memoria del corazón” Lao Tse, pensador, filósofo y humanista chino. Sois muchos los que, directa o indirectamente, habéis participado de esta Tesis y a los que siempre recordaré. Estas líneas son para agradeceros de todo corazón vuestra ayuda.
En primer lugar, a mi director de Tesis, el Dr. Carlos Alonso-Villaverde. Gracias por confiar en mí desde el primer día, y por haberme involucrado en este proyecto desde el laboratorio hasta la búsqueda de plantas entierras africanas. Contigo he aprendido y madurado mucho. Gracias por estar ahí en los momentos buenos y en los no tan buenos, por compartir conmigo tus mil ideas por minuto por tenderme la mano cuando necesitaba levantarme.
Y también, a mí co-director de Tesis, el Dr. Jorge Joven, mi maestro y mentor (y nuestro ayo!). Con pocas personas se debe poder aprender tanto como contigo. Gracias por tu dedicación diaria a nosotros, por tus consejos, por tu presión, por los cafés y por las lecciones numeradas de la 1 a la 1072 que espero no olvidar nunca. Cada día se aprenden decenas de cosas contigo.
Al Dr. Jordi Camps, por tu sentido del humor y tu disponibilidad, por introducirme en nuestro laboratorio y darme la oportunidad de aprender día a día.
A mis compañeros de viaje, que desde antes de llegar me acogieron y se han convertido en mi familia. Mis hermanos mayores, Anna, Judit y Gerard, y mi compañero de batalla, Fernando. Siempre habéis estado en los momentos buenos, y sobre todo en los malos. Con vosotros he aprendido a trabajar en equipo, pero sobretodo he encontrado cariño y grandes amigos. Hemos vivido tantas cosas juntos que necesitaría otro libro para enumerar todas las cosas por las que os estoy agradecido, y por las que nunca olvidaré el tiempo que he compartido con vosotros. Gracias por las horas interminables de laboratorio, por los tupers, por la ayuda en el estabulario, por el parking, por aguantar mis canciones, por las cenas y en definitiva, por vuestra amistad. Y a Esther, mi hija adoptiva, que luego se convirtió en nuestra hermana pequeña. En el poco tiempo que nos conocemos (a lo tonto, ¡ya van dos años!), siempre me has mostrado tu apoyo incondicional. Gracias por escucharme en los momentos difíciles y por tu confianza. Aunque seas la hermana pequeña parece que lleves toda la vida con nosotros. ¡A currar!, esto solo ha hecho que comenzar y te espera un gran futuro por delante.
A Alba, nuestra técnico de anatomía patológica. Gracias por no decir nunca que no aunque te pidiera las cosas a última hora y por ayudarme en cualquier cosa que he necesitado. Y a las que me acompañaron en los primeros años, Esther y Mónica. A las nuevas incorporaciones, Anabel y Marta (¡mi segunda hija adoptiva!), gracias por toda la ayuda prestada.
A los compañeros del laboratorio de análisis clínicos del hospital de Sant Joan, por estar siempre disponibles cuando llegábamos “els pesats de recerca” con peticiones extrañas. A la jefa de tardes, Ángeles, gracias por esos ratos
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A g r a d e c i m i e n t o s
inolvidables en los que hemos reído tanto. Si me hubieses dado con la escoba todas las veces que lo he merecido… A las “biobankers”, por las sobremesas, los rotores, por no tener un no por respuesta y sobre todo por el apoyo técnico cuando lo he necesitado.
Gracias a todos los amigos con los que trabajamos a distancia y formamos la Bioactive Food Components Platform. Gracias a los amigos de Granada, en especial al Dr. Antonio Segura, por su capacidad de trabajo y pasión. Y gracias a Inma y Salva por el trabajo realizado y por soportarme de lejos, y de cerca. Gracias a los amigos de Elche, en especial al Dr. Vicente Micol, por estar atento a todo lo que pasa en este mundo de las plantas y a María, por todo tu trabajo. Y gracias al Dr. Javier Menéndez, por las conversaciones mantenidas, tan enriquecedoras. Gracias a todos por recibirme siempre con los brazos abiertos.
Muchas gracias a todos los compañeros de la Facultat de Medicina i Ciències de la Salut, sois tantos que espero no olvidarme de ninguno. En primer lugar a los amigos del estabulario, Amparo, Esperanza y Juan, ya que sin vuestro trabajo y dedicación diarios esta Tesis no habría sido posible. A Fàtima por todo lo que me has enseñado y por el cariño recibido desde el primer momento, muchas gracias. A todas las compañeras de la URLA y el GIP (no recuerdo ningún compañero…), por todo lo aprendido y por vuestra disponibilidad. A las amigas del IISPV, en especial a Neus y Rebeca que tantos líos nos han solucionado.
Aunque estéis al otro lado de Reus, no quiero olvidarme de todos los compañeros del Hospital Universitari de Sant Joan. A Asun y Laura del servicio de Medicina Interna por toda la ayuda prestada aun cuando íbamos sin avisar. Gracias Nahúm por confiar en mí para empezar un proyecto tan interesante.
Gracias a todos los profesores de la licenciatura de Bioquímica por descubrirme este mundo. Y sobre todo a los compañeros de clase, Enric, Edu, Mariona, Merchi, Anna y Terete; y compañeros de piso, Xavi, Serni, Enric (otra vez), Edu (de nuevo), Sandra y Andrea, con los que compartí unos años que no olvidaré, que siempre me animaron a seguir adelante y que más que compañeros, fueron mis amigos.
A todos mis amigos y familiares que durante estos años he dejado en segundo plano tantas veces. ¡Os echo de menos igual!. Especialmente a mi abuelo, a quién se que le hubiese gustado conocer el desenlace de este trabajo.
Y por último, aunque deberían ser los primeros, a mis seres más queridos. Esta Tesis es también vuestra.
A mis padres y a mi hermana, por confiar en mí y apoyarme incondicionalmente, en todo momento. Por la educación recibida y el amor que me dais. Gracias por ayudarme a seguir adelante y a levantarme aun en los momentos más duros.
Y a Marta. Mi compañera y mi mejor amiga. Gracias por apoyarme en todas mis decisiones, por tu paciencia y por estar ahí siempre, en los buenos y en los malos momentos. Pero sobre todo gracias por tu amor infinito e incondicional.
¡Muchas gracias a todos!
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ÍNDICE
ÍNDICE
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Í n d i c e a
2
INTRODUCCIÓN 4
Capítulo 1. Los polifenoles en la dieta 7
1.1 Los polifenoles 7
1.2 Flavonoides 9
Capítulo 2. La hipótesis de la xenohormesis 13
2.1 La hormesis 14
2.2 La xenohormesis 16
2.3 La inducción de genes sensibles al estrés celular 17 mediante compuestos xenohorméticos
Capítulo 3. Polifenoles y enfermedad 19
3.1 Obesidad 21
3.2 La aterosclerosis 23
3.3 Enfermedades inflamatorias crónicas 24
3.4 La enfermedad del hígado graso no alcohólica (NAFLD) 25
3.5 Especies vegetales a estudio 28
3.5.1 Hibiscus sabdariffa 29
3.5.2 Aspalathus linearis 30
Capítulo 4. Técnicas analíticas 31
4.1 Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) 32
4.2 Espectroscopía de masas (MS) 34
4.2.1 Ionización por electrospray (ESI) 35
4.2.2 Analizadores de masas 37
A Trampa de iones (IT) 37
B Tiempo de vuelo (TOF) 38
HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 41
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Í n d i c e
3
RESULTADOS 45
ESTUDIO 1 47 Direct characterization of aqueous extract of Hibiscus sabdariffa using HPLC with diode array detection coupled to ESI and ion trap MS. Journal of Separation Science. 2009, 32:3441–3448
ESTUDIO 2 57 Identification of phenolic compounds in aqueous and ethanolic rooibos extracts (Aspalathus linearis) by HPLC-ESI-MS (TOF/IT). Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2011, 400:3643–3654
ESTUDIO 3 71 Continous administration of polyphenols from aqueous rooibos (Aspalathus
linearis) extract ameliorates dietary-induced metabolic disturbances in hyperlipidemic mice. Phytomedicine. 2011, 18:414–424
ESTUDIO 4 85 The aqueous extract of Hibiscus sabdariffa calices modulates the production of monocyte chemoattractant protein-1 in humans.
Phytomedicine. 2010, 7:186–191
RESULTADOS PRELIMINARES 93 Estudio I 95
El tratamiento con un extracto acuoso de Hibiscus sabdariffa en un modelo animal de hiperlipémia sometido de forma crónica a una dieta rica en grasa previene la esteatosis hepática y la hiperlipémia.
Estudio II 105 Metabolomic study of liver composition of animals treated with Hibiscus sabdariffa and Aspalathus linearis.
DISCUSION Y CONCLUSIONES 119
BIBLIOGRAFÍA 131
MATERIAL SUPLEMENTARIO 147
OTROS 155 Publicaciones indexadas 157 Publicaciones no indexadas 161 Participaciones en congresos 161 Abreviaturas 162
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INTROD
INTRODUCCIÓN
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C A P Í T U L O 1 . L o s p o l i f e n o l e s e n l a d i e t a
7 7
CAPÍTULO 1. LOS POLIFENOLES EN LA DIETA
Muchos estudios observacionales correlacionan la dieta mediterránea con un
menor riesgo de padecer enfermedades cardiovasculares. Inicialmente se observó
que la relación desfavorable de ácidos grasos poliinsaturados frente a los
monoinsaturados contribuía significativamente con otros factores de riesgo
conocidos como la presión sanguínea, la edad, el colesterol sérico o el tabaquismo
sobre la incidencia de muerte de origen cardiovascular1. Aunque se demostró una
asociación con la dieta no se pudieron establecer los mecanismos moleculares
subyacentes relacionados con la patología ateromatosa2. Posteriormente,
estudios observacionales señalaron una posible relación entre vitaminas
antioxidantes y la reducción de la mortalidad cardiovascular. Sin embargo, este
hallazgo no ha podido ser corroborado en estudios clínicos controlados3,4
.
Existen datos que apuntan a que el efecto beneficioso de la dieta mediterránea
es debido probablemente a la combinación específica de numerosos
micronutrientes. Por ejemplo, el aceite de oliva muestra efectos nutrigenómicos
in vivo, regulando negativamente numerosos genes proaterogénicos5, y uno de
sus componentes, el ácido oleico, que inicialmente se postuló como ingrediente
fundamental en la dieta mediterránea, muestra efectos similares aunque no
todos los observados con el total el aceite de oliva, indicando la presencia de
otros biocomponentes activos en el aceite de oliva6.
1.1 Los polifenoles
Los polifenoles están presentes en las plantas como una mezcla y no como
componentes aislados, un hecho que con frecuencia es ignorado en la realización
de estudios experimentales. Varios miles de estos fitoquímicos ya han sido
identificados. Los compuestos fenólicos pueden clasificarse de diversas formas,
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I n t r o d u c c i ó n a
8
por ejemplo, respecto a su unidad base o a la naturaleza de los grupos funcionales
ligados a esta unidad base. La más utilizada es la clasificación que los divide en
ácidos fenólicos, flavonoides y, los menos abundantes, estilbenos y lignanos,
aunque existen muchos más tipos de estructuras.
Figura 1. Clasificación de los compuestos fenólicos con los fenoles simples y polifenoles principales, entre los que se encuentran los flavonoides.
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C A P Í T U L O 1 . L o s p o l i f e n o l e s e n l a d i e t a
9 9
Desde un punto de vista estructural, los compuestos fenólicos pueden
clasificarse en fenoles simples y polifenoles. Estos últimos se caracterizan por
tener uno o más de un grupo fenol, y se dividen a su vez en xantonas, estilbenos,
antraquinonas, lignanos (y polímeros de estos) y, los más abundantes, los
flavonoides (Figura 1).
1.2 Flavonoides
Son los compuestos polifenólicos más abundantes en las plantas y pueden ser
clasificados como flavonoles, flavonas, isoflavonas, flavanonas, antocianinas y
flavanoles (catequinas y proantocianidinas). Estos compuestos están
caracterizados por una estructura benzo-γ-pirona (C6-C3-C6; Figuras 2 y 3). Esta
estructura permite la sustitución en diversas posiciones de diferentes grupos
funcionales como hidroxilos, metoxilos u O-glucósidos, lo que explica las más de
8000 estructuras caracterizadas hasta la fecha7.
Figura 2. Estructura básica de los flavonoides.
Los flavonoides son productos del metabolismo secundario de las plantas
sintetizados a partir de fenilalanina y desempeñan numerosas funciones. Casi
todos son pigmentos que cubren todo el espectro de la luz visible y la ultra-
violeta. Una de las funciones principales es la atracción de insectos, animales y
aves polinizadoras, y la regulación de genes fotosensibles, aunque no participan
en la fotosíntesis8. Los flavonoides inhiben o matan muchas cepas bacterianas,
inhiben enzimas virales claves como la transcriptasa inversa y la proteasa, y
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destruyen algunos protozoos patogénicos. Por otro lado, su toxicidad frente a
células animales es baja.
Figura 3. Estructuras base que caracterizan los diferentes tipos de flavonoides.
Actualmente se acepta que los polifenoles se sintetizan principalmente en
respuesta a un gran estrés como periodos prolongados de sequía, la radiación
ultravioleta o la infección por patógenos. Por lo tanto, en las frutas y verduras que
se cultivan y consumen en las sociedades occidentales, donde las condiciones
climáticas no son extremas y se controlan los agentes patógenos con el fin de
aumentar la producción, la cantidad esperada de polifenoles es baja o muy baja
(algunas excepciones son las cebollas, el ajo y las verduras crucíferas).
Simplemente, no parece factible poder comer suficientes frutas y verduras para
ingerir una cantidad efectiva de polifenoles, aun suponiendo que estos sean muy
activos y fácilmente biodisponibles.
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De este hecho se infiere que, por un lado, si los polifenoles se asocian con una
serie de beneficios para la salud en los humanos, y por otro, el consumo debe ser
mayor, la dosis necesaria no puede conseguirse mediante simples cambios en la
dieta.
Para aumentar la ingesta de polifenoles, una estrategia complementaria sería la
de cambiar ciertas prácticas agrícolas y la fabricación de suplementos dietéticos
concentrados. Sin embargo, no sólo los factores cuantitativos, sino también
cualitativos deben ser considerados. Ciertos polifenoles se encuentran
ampliamente distribuidos, mientras que otros son específicos de determinados
alimentos, y a menudo, asociados a una mezcla mal caracterizada. Además, el
conocimiento de su composición se limita a unas pocas variedades para las que
existe un grado aceptable de disponibilidad, precio y aceptación. Muchos tipos de
productos derivados de las plantas exóticas o tropicales no han sido analizados y
pueden representar una importante fuente de polifenoles.
Por otra parte, las normas actuales de fabricación de complementos dietéticos
exigen una composición del producto bien definida, lo que es difícil de controlar
en productos derivados de plantas, ya que el contenido de polifenoles depende
de la madurez en el momento de la cosecha, el procesamiento y el
almacenamiento9-13
, y puede llegar a ser muy variable de un año a otro o incluso
entre lotes de fabricación. Los factores ambientales y los métodos de preparación
culinaria también son importantes. Algunos de estos son los siguientes: la
exposición a la luz, el cultivo orgánico (recordemos que cuanto mayor es el estrés
mayor es el contenido en polifenoles), la lluvia, el tipo de suelo, la producción de
frutos por árbol, hervir, pelar, freír o la utilización de un horno microondas14
. La
elaboración industrial de alimentos también afecta el contenido de polifenoles15
.
En algunos casos, este efecto es comercialmente inevitable, como en la
producción de zumo de fruta, donde se eliminan ciertos polifenoles responsables
de la decoloración y formación de precipitados. Por lo tanto, en la evaluación de
los efectos biológicos derivados del consumo de plantas ricas en polifenoles la
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I n t r o d u c c i ó n a
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caracterización química del producto final y los efectos de su posterior
manipulación se deben tomar en cuenta.
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C A P Í T U L O 2 . L a h i p ó t e s i s d e l a x e n o h o r m e s i s
13 13
Figura 4. La corteza del sauce blanco contiene una gran canti-dad de ácido salicílico.
CAPÍTULO 2. LA HIPÓTESIS DE LA XENOHORMESIS
Desde hace miles de años las plantas tienen un uso terapéutico. Una tercera
parte de los 20 fármacos más vendidos en el mercado son derivados de plantas, y
cada semana se descubre una nueva molécula que puede ser beneficiosa para la
salud16
. La economía global y la salud humana dependen en parte de la capacidad
para descubrir medicinas nuevas y efectivas. Sorprendentemente, no son muchos
los esfuerzos destinados al hecho de que las plantas sinteticen moléculas
beneficiosas para la salud de otros organismos. Una de las razones es la facilidad
de patentar nuevos fármacos sintéticos (conocidos como “nuevas entidades
químicas”), y otra es la suciedad de los compuestos derivados de las plantas. Un
compuesto se considera sucio cuando interacciona con numerosas proteínas
endógenas. A priori, un compuesto de este tipo, con varias dianas moleculares,
puede tener un efecto imperceptible, o incluso adverso, frente a una molécula
pura que específicamente interacciona con una proteína en concreto16
.
Contrariamente a esta idea, existen numero-
sos ejemplos de moléculas vegetales que
interaccionan con diversos enzimas y recepto-
res y que son extraordinariamente seguras. Ya
en el siglo V a. C., el griego Hipócrates escribió
acerca del ácido salicílico “un polvo amargo
extraído de la corteza del sauce que alivia
dolores y reduce la fiebre”. En 1763, el
reverendo Edwar Stone experimentó con la
corteza del sauce blanco (Salix alba, Figura 4) en el tratamiento de la fiebre y
concluyó que era “un remedio muy eficaz”. Desde entonces se ha aislado una gran
variedad de salicilatos de diferentes plantas que han ayudado en el tratamiento
de la gota, la fiebre reumática, el dolor y la artritis, y hoy en día se fabrican 45000
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I n t r o d u c c i ó n a
14
toneladas métricas anuales de un derivado acetilado del ácido salicílico para
tratar una gran variedad de enfermedades: la aspirina.
Éste sólo es un ejemplo de las decenas de compuestos que se conocen hoy en
día derivados de las plantas, que son beneficios para la salud y que además
interaccionan con más de una diana molecular.
2.1 La hormesis
Los organismos vivos se topan continuamente con situaciones adversas o
estímulos nocivos, y la adaptación a estos agresores externos, ya sean químicos,
físicos, biológicos o sociales, es un principio clave de supervivencia.
Por otro lado, la exposición leve a un estímulo que a altas concentraciones
puede ser perjudicial, puede proporcionar posteriormente resistencia o tolerancia
a una agresión, incluso protagonizada por el mismo estímulo. Esta respuesta
adaptativa al estrés se ha identificado como un proceso conservado
evolutivamente.
En toxicología, el término hormesis, define una
respuesta biológica de dos fases, no lineal, donde la
exposición a una dosis baja (o a un estímulo débil)
por parte de un tóxico ambiental (o una situación
nociva) produce un efecto potencialmente benefi-
cioso, mientras que una dosis alta produce efectos
adversos17
(Figura 5). En el campo de las disciplinas
biomédicas, el término hormesis se define como
una respuesta adaptativa de las células y
organismos frente a un estrés moderado (o
intermitente)18
.
Figura 5. Una dosis muy baja de un agente perjudicial puede producir efectos beneficiosos en un organismo.
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C A P Í T U L O 2 . L a h i p ó t e s i s d e l a x e n o h o r m e s i s
15 15
Así pues, la hormesis se podría definir como un proceso en el que la exposición a
una dosis baja a un compuesto químico o factor ambiental, que es perjudicial a
altas concentraciones, induce un efecto beneficioso adaptativo sobre la célula u
organismo.
La hormesis representa un concepto fundamental en la teoría evolutiva,
explicando cómo la vida en la tierra se ha adaptado a un ambiente a veces tan
agresivo. Para sobrevivir a los venenos ambientales, los organismos han
desarrollado diferentes vías de señalización celular que median las respuestas
horméticas. Estos incluyen factores de transcripción y las cinasas que los regulan,
modulando la expresión de genes codificantes de una batería de proteínas
citoprotectoras y de resistencia al estrés (como chaperonas, enzimas
antioxidantes y detoxificantes, etc.)19
.
El estrés oxidativo es uno de los factores principales en el envejecimiento y en
las enfermedades crónicas. Uno de los factores principales que afectan al nivel de
estrés oxidativo es la cantidad de energía ingerida y por ello, despierta un gran
interés cómo pueden influir los factores dietéticos en el curso de una enfermedad
modificando el estrés oxidativo. La cantidad de calorías consumidas se
correlacionan inequívocamente con un riesgo más elevado de padecer
enfermedades crónicas20
. Por ejemplo, los ácidos grasos saturados y el colesterol
pueden inducir enfermedades cardiovasculares21,22
y dietas altas en azúcares
simples incrementan el riesgo de diabetes23
.
En animales de experimentación, muchos estudios de restricción calórica (bien
por reducción en la ingesta o por periodos de ayuno intermitentes) demuestran
que las células de estos animales incrementan su resistencia a diferentes tipos de
estrés. Por ejemplo, la mortalidad por causas naturales o inducida por
temperatura o toxinas concretas, se reduce significativamente en aquellos
animales sometidos a una restricción calórica frente a los animales que
consumieron una dieta normal ad libitum24-27
. La ingesta reducida de energía,
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I n t r o d u c c i ó n a
16
también protege a los animales de diferentes tipos de cáncer en varios tejidos
como tumores pancreáticos28
, tumores mamarios29
y cáncer de próstata30
, cada
uno inducido mediante diferentes compuestos químicos. En humanos, el ayuno
en días alternos mejora los síntomas y reduce marcadores de inflamación y de
estrés oxidativo en pacientes con asma31
.
Otro ejemplo de proceso hormético además de la restricción calórica, es la
exposición a bajas concentraciones a algunos fitoquímicos. Los organismos han
evolucionado hasta adquirir la capacidad de detectar marcadores de estrés
producidos por otras especies de su mismo hábitat. En esta línea, los organismos
pueden prepararse con antelación frente a condiciones ambientales adversas.
Esta hormesis entre especies, se conoce como xenohormesis, que describe un
fenómeno donde un organismo detecta las señales químicas de otras especies
acerca del estado del entorno o de la disponibilidad de alimentos y responde a
ellas de forma que generen en él efectos beneficiosos16,32
.
2.2 La xenohormesis
Las plantas y animales comparten un alto grado de homología entre sus vías
metabólicas de respuesta al estrés33
. Cuando las plantas están sometidas a
condiciones ambientales adversas, como la sequía, infecciones microbianas o
plagas de insectos, producen compuestos químicos que les ayudan a resistir o
incluso las protegen de dichas condiciones ambientales adversas. Por otro lado,
como los animales dependen de las plantas como fuente alimenticia, han
desarrollado mecanismos que les permiten detectar estas sustancias bioactivas
producidas por las plantas estresadas, con la finalidad de estimar las cambiantes
condiciones externas33
. En este contexto, estos fitoquímicos producidos por las
plantas como autodefensa frente a condiciones adversas son inherentemente
fitoalexinas (toxinas vegetales). Estos fitoquímicos xenohorméticos, que alertan a
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C A P Í T U L O 2 . L a h i p ó t e s i s d e l a x e n o h o r m e s i s
17 17
los animales de la adversidad, pueden estimular sus vías metabólicas de respuesta
al estrés y, temporalmente, fortalecer su capacidad de defensa celular. El término
xenohormesis se acuñó para definir esta interacción entre especies.
Son miles los compuestos identificados provenientes de las plantas y que, en
muchos casos, proveen de efectos beneficiosos a los animales34,35
. Puesto que el
estrés oxidativo es un factor importante en las enfermedades crónicas36
, y que las
frutas y verduras contienen compuestos químicos que, a altas concentraciones,
poseen la capacidad de eliminar radicales de oxígeno, en una primera hipótesis se
atribuyeron los efectos beneficiosos para la salud de estos fitoquímicos a su
capacidad antioxidante37
. De hecho, concentraciones micromolares de numerosos
polifenoles protegen frente al estrés oxidativo en experimentos realizados en
varios modelos celulares, la aterosclerosis y enfermedades neurodegenerativas38-
40. Sin embargo, los resultados obtenidos en ensayos clínicos y estudios primarios
con dosis altas de dichos antioxidantes son muchas veces desilusionantes41
.
La hipótesis xenohormesis ha sido recientemente lanzada como posible
mecanismo para explicar, al menos parcialmente, los efectos de las plantas en los
animales16
.
2.3 La inducción de genes sensibles al estrés celular mediante
compuestos xenohorméticos.
La respuesta al estrés por parte de las plantas ha evolucionado durante al
menos un millón de años. Ya que la gran mayoría de las plantas no pueden
desplazarse físicamente, deben soportar el estrés ambiental que acontezca en
cada momento. Este tipo de “vida sedentaria” puede explicar la complejidad de su
respuesta al estrés33
. Las plantas producen toxinas para protegerse contra
hongos, insectos y predadores. En consecuencia, las plantas cultivadas destinadas
al consumo contienen menos toxinas naturales que sus homólogas silvestres42
.
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I n t r o d u c c i ó n a
18
Cuando las plantas están bajo condiciones agresivas, se aprecia un aumento en la
acumulación de pesticidas naturales (biopesticidas) que en ocasiones pueden
llegar a producir intoxicaciones agudas en humanos. Algunos estudios estiman
que el 99,99% de los pesticidas presentes en la dieta son compuestos químicos
que producen las plantas para protegerse43
.
La xenohormesis puede explicar cómo los compuestos químicos que producen
las plantas en condiciones ambientales adversas, y que utilizan como defensa
ante éstas, pueden producir efectos beneficiosos en los animales que las
consumen. Los animales aprovechan la información contenida en estos
compuestos producidos por las plantas ante el estrés. De hecho, la mayoría de los
efectos beneficiosos para la salud que se conocen de las plantas comestibles se
atribuyen a las moléculas fabricadas en respuesta al estrés. Aunque los
compuestos xenohorméticos poseen propiedades nocivas para los insectos y
microorganismos, a las dosis subtóxicas ingeridas por los humanos como parte de
su dieta, los mismos compuestos inducen respuestas de estrés celular
moderadas44,45
. Estas a su vez, activan vías de adaptación de respuesta al estrés,
lo que deriva en un aumento de la expresión de genes codificantes de proteínas
citoprotectoras como enzimas antioxidantes, chaperonas, factores de
crecimiento, enzimas de detoxificación de fase-2, proteínas mitocondriales, etc.
Por ejemplo, el estrés oxidativo causado por algunos flavonoides (con actividad
prooxidante) contribuye a sus actividades beneficiosas para la salud induciendo
enzimas antioxidantes, resultando en un efecto beneficioso, que partió de una
supuesta reacción química tóxica.
Otro ejemplo es el resveratrol, que modula directamente alrededor de 30
enzimas y receptores sin ningún indicio de toxicidad, y los efectos observados
radican en la inhibición de algunos o en la activación de otros46
. Los polifenoles
del té verde y la curcumina, interaccionan con decenas de dianas moleculares
proporcionando numerosos beneficios para la salud47,48
.
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C A P Í T U L O 3 . P o l i f e n o l e s y e n f e r m e d a d
19 19
CAPÍTULO 3. POLIFENOLES Y ENFERMEDAD
La señal química de estrés ambiental en plantas son los polifenoles, los cuales
otorgan protección frente a estrés en los humanos o animales que los ingieren.
Esto sugiere la existencia de mecanismos que detecten este contenido
polifenólico inducido por estrés. Así pues, el estrés sucede en las plantas, y los
beneficiarios son los animales sensibles a estas señales químicas tras ingerirlas.
Un hecho a tener en cuenta es, contrariamente a lo que se creía hasta hace
poco, que muchos de los efectos de los polifenoles pueden no estar ligados a sus
propiedades antioxidantes intrínsecas, sino a cambios adaptativos que involucren
a estas moléculas en la regulación de mecanismos de respuesta al estrés
metabólico. Es decir, algunos mecanismos son químicamente simples (por
ejemplo, actividad antioxidante), pero otros compuestos parecen actuar como
moléculas de señalización o mensajeros químicos49,50
.
Las plantas estresadas proveen de una enorme fuente de moléculas
xenohorméticas que pueden modular enzimas involucrados en la regulación de la
respuesta al estrés y en la supervivencia celular. El interés en este tema emergió
debido a hallazgos que indicaban que la ingesta de una dieta hipocalórica (como
ejemplo de estrés moderado), incrementaba la supervivencia en numerosos
modelos experimentales. Estos efectos fueron similares a los observados en los
polifenoles a través de la activación de las sirtuinas51,52
.
Recientemente, experimentos de restricción de glucosa han otorgado una
conexión plausible entre reguladores metabólicos críticos, indicando que los
polifenoles deberían ser estudiados como moléculas de señalización53
. La
ausencia de glucosa aumenta la actividad de AMPK, y ésta induce la transcripción
del enzima sintetizador de NAD, Nampt, necesario para la activación de SIRT1.
Esto es todavía más importante considerando que ATP y NAD son indicadores del
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20
estado energético celular, auditado por AMP-cinasa (ratio AMP/ATP) y las
sirtuinas (que requieren de NAD para deacetilar substratos).
Muchos polifenoles son moduladores de la transcripción54
. Aunque los
mecanismos son difíciles de comprobar debido a las actividades pleiotrópicas de
los polifenoles, la supresión de la actividad NF-κβ sugiere que los polifenoles
poseen un papel importante en la modulación de la resistencia a la insulina y la
inflamación55
. Este hecho es particularmente importante porque estos efectos se
solapan con los ya conocidos factores de riesgo de las enfermedades crónicas. El
hecho de que los animales y plantas compartan un alto grado de homología en las
secuencias de las vías de las cinasas reguladas por señales extracelulares (ERKs),
explicaría que muchos polifenoles puedan modular vías de las cinasas, incluida
AMPK, y que los polifenoles puedan modular simultáneamente la señalización
redox e inhibir la función mitocondrial, son mecanismos potenciales a tener en
cuenta56,57
. Así pues, una reducción en la señalización inducida por estrés con un
incremento en radicales libres mitocondriales y una subsecuente reducción en la
producción de ATP, pueden ser efectos predecibles debidos a la ingestión de
polifenoles, sugiriendo implicaciones importantes en la prevención de las
enfermedades crónicas y el envejecimiento.
Los mecanismos moleculares sobre los que actúan los polifenoles todavía están
por dilucidar. Son muchos los polifenoles y muchas sus dianas potenciales.
Además, se debe tener en cuenta que los mecanismos que un polifenol pueda
activar pueden no ser los mismos si es administrado individualmente o si lo hace
formando parte de una mezcla compleja de polifenoles. Dependiendo de la
patología que se estudie y de las vías metabólicas que estén alteradas en cada
caso, la receta óptima de polifenoles puede variar sustancialmente.
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C A P Í T U L O 3 . P o l i f e n o l e s y e n f e r m e d a d
21 21
3.1 Obesidad
La obesidad se define como una enfermedad crónica multifactorial
caracterizada por un aumento de masa grasa, y por lo tanto del peso corporal,
como consecuencia de un balance energético positivo mantenido en el tiempo58
.
Esta ganancia de peso supone normalmente un aumento de las reservas del
organismo en forma de grasa en relación con el promedio normal para la edad,
sexo, talla y complexión59,60
. Actualmente se considera la obesidad como una de
las alteraciones metabólicas de mayor repercusión no sólo desde el punto de vista
sanitario, sino también desde ámbitos psicológicos, sociales y económicos61
. Este
fenómeno, de naturaleza epidémica, se debe en gran medida a los cambios
ambientales y sociales que han tenido lugar en las últimas décadas y que han
interaccionado con una determinada predisposición génica62
.
Actualmente, este trastorno se define como pandemia, con creciente
prevalencia63
, que supone una grave amenaza para la salud pública, debido al
riesgo a desarrollar enfermedades asociadas como la diabetes, hipertensión,
enfermedades cardiovasculares, alteraciones inflamatorias, aumento del riesgo
de padecer cáncer, insuficiencia respiratoria y osteoartritis, entre otras, y por el
elevado coste sanitario que se deriva de las mismas64
.
Algunos de los flavonoides más estudiados en el tratamiento de la obesidad son
los extraídos del té. Los compuestos mayoritarios del té son las catequinas,
principalmente (-)-epicatequina (EC), (-)-epicatequina-3-gallato (ECG), (-)epigalo-
catequina (EGC) y (-)-epigalocatequina-3-galato (EGCG)65
. Los extractos de hojas
del té mostraron una importante actividad hipolipemiante en ratas después de 63
semanas de tratamiento66
.
Los efectos de las catequinas purificadas sobre el peso de las ratas también
fueron estudiados67
. Cabe destacar que solamente la inyección intraperitoneal de
EGCG, y no de las otras catequinas (EC, EGC y ECG), causó una pérdida de peso
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I n t r o d u c c i ó n a
22
corporal en ratas de ambos sexos en un periodo comprendido entre 2 y 7 días de
tratamiento. Los mismos resultados se obtuvieron suplementando la dieta con
EGCG en ratones alimentados con una dieta rica en grasa68
. En este último
estudio, los animales control ganaron el doble de peso que los animales tratados
con EGCG, aunque la ingesta de comida no mostró diferencias entre grupos. La
pérdida de peso se debió exclusivamente a una reducción en la cantidad de grasa
corporal68
. En experimentos realizados en líneas celulares de preadipocitos 3T3-
L1, EGCG inhibió la proliferación de forma dosis-dependiente69
.
Los mecanismos moleculares encontrados muestran que los polifenoles del té
estimulan la absorción de glucosa acompañada de un reducción en la
translocación del transportador de glucosa 4 (GLUT4) en el tejido adiposo,
mientras que en el músculo esquelético el aumento de absorción de glucosa se
acompaña de un aumento en la translocación de GLUT4 a la membrana celular.
Además, estos polifenoles suprimen la expresión de PPARγ y activan SREBP-1 en
el tejido adiposo. En resumen, los polifenoles del té muestran efectos biológicos
en la prevención de la obesidad modulando la absorción de glucosa en el tejido
adiposo y en el músculo esquelético y suprimiendo la expresión de factores de
transcripción relacionados con la adipogénesis70
.
Otros estudios se centran en la modulación de la actividad de la lipasa
pancreática (LP)71
. Este enzima, sintetizado en los humanos por el gen PNLIP,
posee una función clave en la digestión de los triglicéridos72
. La LP se secreta al
duodeno y es la responsable de la hidrólisis del 50-70% de la grasas ingeridas73
.
Este enzima se utiliza a menudo para evaluar el potencial de eficacia de productos
naturales como agentes antiobesidad74
. El orlistat es uno de los fármacos
aprobados en Europa que se utiliza en el tratamiento de la obesidad. Esta
molécula inhibe la actividad de la LP reduciendo la absorción de triglicéridos75
.
Muchos polifenoles como los flavanoles, taninos y calconas inhiben la LP73,76
. Un
flavonoide con actividad inhibitoria de la LP es la hesperidina, obtenida de la
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23 23
cáscara de Citrus unshiu77
. Las proantocianidinas reducen la concentración
plasmática de triglicéridos bloqueando la absorción de lípidos de la dieta78
e
inhiben enzimas digestivos como la tripsina, la amilasa y la lipasa74
.
3.2 La aterosclerosis
Los polifenoles han recibido una gran atención en la prevención de
enfermedades cardiovasculares, derivada en parte de la llamada paradoja
francesa, que se ha justificado en principio debido a la protección antioxidante
que ofrecen los polifenoles presentes en el vino y las verduras. Tal vez el
compuesto más estudiado en este contexto es el resveratrol. Se ha demostrado
que el resveratrol ejerce efectos protectores en el modelo de ratones deficientes
en la apolipoproteína E79
, actuando en la concentración sanguínea de lípidos y
sobre el desarrollo de la placa aterosclerótica. El mecanismo parece ser, al menos
en parte, antiinflamatorio, ya que disminuye la expresión de ICAM-1 y VCAM-1 en
los vasos sanguíneos. Sin embargo, el resveratrol no afectó a los niveles
sanguíneos de lípidos en conejos hipercolesterolémicos80
o en ratas normales81
,
aunque mejora la concentración lipídica en sangre en ratas Zucker, un modelo
animal de obesidad que, en avanzada edad, muestran algunas alteraciones
similares a las observadas en la diabetes tipo II82
. De hecho, otro estudio mostró
una extensión de las lesiones ateroscleróticas sin otro efecto significativo sobre
los lípidos o la oxidación de las LDL80
. Así pues, es poco probable que el
resveratrol tenga efectos protectores cardiovasculares a través de cambios en el
perfil lipídico. El resveratrol puede inhibir la producción de especies reactivas de
oxígeno generadas a raíz de la captación de LDL oxidadas por los macrófagos83
.
Esta molécula también reduce la infiltración celular, la fibrosis y la expresión de
citoquinas inflamatorias en un modelo de miocarditis autoinmune84
. Otros
polifenoles como la miricetina y la fisetina reducen la oxidación de las LDL y
disminuyen la expresión de CD3685
. Ambas acciones favorecen la reducción de la
formación de células espumosas y por lo tanto son considerados protectores
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24
contra la aterosclerosis. Otra forma que tienen los flavonoides de evitar la
oxidación de las LDL es mediante el bloqueo de mieloperoxidasa de los
neutrófilos. Este efecto es menos importante en los metabolitos de los
flavonoides86
, que por lo general son menos bioactivos que sus precursores en
forma de aglicona intacta87
. Cabe señalar también que los macrófagos ubicados
en las placas de ateroma pueden absorber conjugados de quercetina y
convertirlos de nuevo a quercetina activa88
. El mismo mecanismo (prevención de
la oxidación de las LDL y reducción de la expresión de CD36) se ha descrito para
ECG que, curiosamente, parece ejercer esta acción específicamente en las
lesiones ateroscleróticas89
. Lo mismo ocurre con el kaempferol y la
rhamnocitrina90
, la quercetina91
, e incluso la quercetina-3-glucurónido88
.
Otros mecanismos de protección incluyen la activación del ABCA1, lo que
posiblemente aumente la concentración sanguínea de las HDL92
; la menor
producción de NADPHox93,94
; actividades antiaterotromboticas95,96
; descenso de
MCP-197
e inhibición de la proteína C reactiva98
.
Los polifenoles tienen efectos puramente vasculares que no se detallan en esta
memoria99
. Además, la mayor parte de la evidencia apunta a que los efectos
antiateroscleróticos se deben a un mecanismo antinflamatorio, más que
antioxidante.
3.3 Enfermedades inflamatorias crónicas.
La inflamación está presente en casi todas las enfermedades, pero en algunas
como el asma, la artritis reumatoide o las alergias, el componente inflamatorio es
especialmente importante.
Los polifenoles pueden prevenir la aparición de tejidos neoplásicos mediante la
modulación de la respuesta inmune. Por ejemplo, se ha demostrado que la
genisteína oral protege contra la carcinogénesis a través de la
inmunoestimulación, reduciendo la expresión de Treg, y mejorando la
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25 25
citotoxicidad de las células T y la función de las células Natural Killer100
. La
genisteína también evita la nefrotoxicidad mediante vías antinflamatorias101
y
previene la inflamación y ulceración de la mucosa gástrica102
, efecto compartido
por otros flavonoides como la catequina103
. Varios flavonoides protegen contra el
shock inducido por LPS en modelos animales, incluida la rutina104
, la baicaleina105
,
la apigenina106
, la hesperidina107
, el resveratrol108
, la quercetina 3-O-beta-(2(")-
galoil)-rhamnopyranosido109
, y EGCG110,111
. Estos efectos probablemente se
deriven de la inhibición de las funciones de los monocitos. Un estudio realizado en
ratones apunta que la quercetina protege contra el shock inducido mediante
Salmonella typhimurium-aroA112
. En cualquier caso, la quercetina no muestra
ningún efecto protector frente a la fiebre inducida por LPS113
. Además, la
quercitrina, otro flavonoide, protege contra el shock anafiláctico114
. El
resveratrol115,116
y la baicalina117,118
muestran efectos protectores frente a la
pancreatitis experimental, mientras que el ácido elágico es útil en el tratamiento
la pancreatitis crónica119
. La demetilnobiletina reduce la hipersensibilidad de tipo
retardada o tardía, con una menor proliferación de células T, menor síntesis de
citoquinas, y mayores niveles de IL-10120
. El resveratrol121
y la baicalina122
tienen
efectos protectores contra el daño hepático inducido por tetracloruro de carbono
(CCl4) y además el primero mejora la lesión hepática en un modelo de hemorragia
traumática123
.
3.4 La enfermedad del hígado graso no alcohólica (NAFLD)
El hígado es el principal órgano metabólico y lleva a cabo una gran variedad de
funciones bioquímicas necesarias para la homeostasis metabólica. Este órgano es
sensible a muchos procesos patológicos, siendo la NAFLD la causa más común de
disfunción hepática124
.
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26
La NAFLD describe una condición clínico-patológica mayoritariamente
asintomática, caracterizada por una significativa acumulación de lípidos en forma
de vesículas (esteatosis, contenido graso > 5-10 % en peso) en los hepatocitos del
parénquima del hígado y en ausencia de un consumo de alcohol significativo125,126
.
Esta enfermedad engloba la esteatosis con un pronóstico benigno, y la
esteatosis acompañada de inflamación y de daño hepatocelular (esteatohepatitis
no alcohólica o NASH), la cual puede desembocar en fibrosis avanzada, cirrosis y
en último extremo en carcinoma hepatocelular125
. Por tanto, debido a que esta
acumulación lipídica en el hígado es un prerrequisito para el desarrollo de NASH y
de sus complicaciones, el estudio de la esteatosis puede ser la base del desarrollo
de nuevas estrategias de prevención y tratamiento de las enfermedades hepáticas
crónicas.
Estudios recientes demuestran que algunos polifenoles127-131
o extractos de
polifenoles132
pueden impedir, al menos parcialmente, la esteatosis hepática
inducida por dietas ricas en grasa. De hecho, los polifenoles pueden actuar sobre
el metabolismo lipídico incidiendo en la actividad del enzima desaturasa. Por
ejemplo, algunos polifenoles reducen la expresión del gen de la Δ-9 desaturasa
(estearoil-CoA desaturasa 1; SCD1)68,133
y de la Δ-6 desaturasa134
. Sin embargo,
queda estudiar si los polifenoles pueden modular la composición de los ácidos
grasos presentes en el hígado, no sólo el contenido total de lípidos.
Los polifenoles también pueden actuar sobre las vías de señalización del
metabolismo lipídico, incluyendo la síntesis y degradación de estos. Diferentes
estudios56,135
demostraron que niveles elevados de glucosa inhiben la actividad de
la AMPK y la fosforilación de la acetil-CoA carboxilasa, aumentando por lo tanto el
contenido de lípidos en los hepatocitos. Sin embargo, la administración de
polifenoles revirtió la inhibición de la actividad de la AMPK y la fosforilación de la
acetil-CoA carboxilasa56
. Por otra parte, se ha demostrado que los polifenoles
estimulan la AMPK y evitan la acumulación de lípidos en los hepatocitos,
probablemente mediante la activación de sirtuina-1 deacetilasa135
. Como las
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mitocondrias son un orgánulo clave en el metabolismo lipídico y la principal
fuente de especies reactivas de oxígeno y nitrógeno en los hepatocitos, se
postulan como candidatas para desempeñar un papel central en la progresión de
la esteatosis a esteatohepatitis no alcohólica y cirrosis136
. Algunos polifenoles
también han demostrado capacidad para modificar la actividad mitocondrial y
aumentar la mitocondriogenesis137
. Este efecto puede aumentar el catabolismo
de lípidos mitocondrial y por lo tanto, atenuar la acumulación hepática de ácidos
grasos.
La activación de AMPK puede considerarse una diana terapéutica adecuada para
tratar esta enfermedad, y los polifenoles son compuestos naturales que actúan
directamente sobre esta proteína138
.
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3.5 Especies vegetales a estudio
En nuestra región geográfica, donde disfrutamos de la dieta mediterránea, es
muy común el consumo de alimentos como las frutas, las verduras, el aceite o el
vino. Desgraciadamente, el contenido de polifenoles en estos alimentos es muy
bajo y su absorción es poco eficiente. Por otro lado, la absorción de una cantidad
aceptable de polifenoles a partir de alimentos como el aceite o el vino, conllevaría
la ingesta en cantidades nada saludables de otros componentes como grasas o
alcohol. Así pues, es de gran interés encontrar e identificar plantas con un alto
contenido en polifenoles que puedan ser incorporados a la dieta. En la presente
tesis doctoral, se han centrado los esfuerzos tanto en Hibiscus sabdariffa,
procedente del Sahel africano como en Aspalathus linearis (rooibos) procedente
de un valle de la República de Sudáfrica (Figura 6).
Figura 6. Distribución geográfica de las dos especies vegetales estudia-das, Hibiscus sabdariffa en el Sahel africano, y Aspalathus linearis en la costa oeste de Sudáfrica.
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29 29
3.5.1 Hibiscus sabdariffa
Hibiscus sabdariffa L., (de la familia de las
malváceas, Figura 7), generalmente llamado
bissap, karkadé o flor de Jamaica, es una
planta tropical consumida habitualmente
como refresco o infusión. Tradicionalmente,
se ha utilizado con eficacia contra la
hipertensión, la inflamación y los trastornos
hepáticos139-141
. Estudios previos muestran
que H. sabdariffa posee actividad antitumo-
ral, antioxidante e hipolipemiante142-147
.
Recientemente, fue publicado que el extracto
de H. sabdariffa inhibe la oxidación de las LDL
y reduce la concentración de triglicéridos en
suero148
, y el colesterol y el colesterol-LDL
en animales de experimentación149
. El examen histológico reveló que podría
reducir la formación de células espumosas e inhibir la proliferación y migración de
las células vasculares de músculo liso, lo que sugiere el efecto antiaterosclerótico
de H. sabdariffa.
Además, los estudios en humanos muestran efectos antihipertensivos y
antiinflamatorios150,151
. Las antocianinas son los pigmentos que otorgan el color
rojo a la planta y son los responsables de la amplia gama de colores en muchos
alimentos. La fuente principal de flavonoides, incluyendo dichas antocininas, son
los pétalos 152
. Las propiedades antioxidantes de H. sabdariffa y otras especies de
hibisco han sido ampliamente estudiados153,154
.
Figura 7. Los cálices de Hibiscus sabdariffa poseen una gran cantidad de polifenoles.
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3.5.2 Aspalathus linearis
El té rooibos, es una infusión derivada de Aspalathus linearis (Figura 8), nativa
de la costa oeste de la República de Sudáfrica. Es un arbusto utilizado
popularmente en la preparación de un té suave que no contiene cafeína, muy
pocos taninos y grandes cantidades de polifenoles. Existen dos tipos de rooibos, el
natural y el fermentado. El color natural del rooibos es verde, pero durante su
fermentación, el color cambia de verde a rojo debido a la oxidación de los
polifenoles155
. Las características más relevantes del rooibos radican en su
actividad antioxidante156,157
y antimutagénica158
.
Figura 8. Flores de Aspalathus linearis en la costa oeste de Sudáfrica.
Estudios in vitro e in vivo demuestran que el rooibos posee una gran
bioactividad. Previene la oxidación lipídica y el estrés oxidativo159,160
, la
inflamación161
, y demuestra una gran capacidad hepatoprotectora162
.
Los compuestos mayoritarios identificados en esta planta son la orientina, la iso-
orientina, la rutina y la aspalatina163-165
. Algunos de estos compuestos son
absorbidos efectivamente, lo que ratifica el valor de esta planta puesto que los
polifenoles no se absorben con facilidad166-169
. Algunos estudios in vivo muestran
que la aspalatina posee efectos hipoglicemiantes en un modelo de ratón
diabético170
. La rutina en cambio, posee efectos antihipertensivos171
y la orientina
muestra actividad cardioprotectora172
.
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CAPÍTULO 4. TÉCNICAS ANALÍTICAS
Un parte importante en el estudio de los componentes biactivos de las plantas,
es el desarrollo de técnicas analíticas que permitan determinar los compuestos
presentes en los extractos vegetales. Estas técnicas deben ser robustas,
reproducibles, rápidas y con el menor coste económico posible. Para llevar a cabo
la identificación de los compuestos individualmente, deben utilizarse técnicas
separativas como la electroforesis capilar (CE), la cromatografía de gases o la
cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).
La caracterización de los compuestos polifenólicos de las plantas utilizadas en
esta memoria se ha llevado a cabo utilizando HPLC (Figura 9). A continuación se
describen brevemente los sistemas de separación y detección utilizados.
Figura 9. Esquema general de las partes principales de un sistema de análisis de muestras.
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4.1 Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)
La HPLC (del inglés high-performance liquid chromatography) es una técnica de
separación utilizada para analizar la composición de mezclas complejas. En esta
técnica, la mezcla a resolver se inyecta en un sistema formado por un fluido, fase
móvil, que circula en contacto con una fase fija o inmóvil (fase estacionaria). En el
caso de la cromatografía líquida, la fase estacionaria es un sólido o un líquido
fijado en un sólido y la fase móvil es un líquido. Las dos fases se eligen de forma
que los componentes de la mezcla que se quiere analizar se distribuyan de
distinto modo entre la fase móvil y la estacionaria. Aquellos componentes que son
fuertemente retenidos por la fase estacionaria se mueven lentamente con el flujo
de la fase móvil; por el contrario, los componentes que se unen débilmente a la
fase estacionaria se mueven con rapidez. Como consecuencia de la distinta
movilidad, los componentes de la mezcla se separan en bandas o zonas discretas
que pueden analizarse cualitativa o cuantitativamente (Figura 10).
Figura 10. Los componentes de una mezcla se separan al pasar a través de una columna dependiendo de la fuerza de interacción con la misma.
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La cromatografía líquida clásica o a baja presión se lleva a cabo en una columna
generalmente de vidrio rellena con la fase estacionaria. La muestra se introduce
por la parte superior y la fase móvil se hace fluir a través de la columna por
gravedad. Las separaciones requieren mucho tiempo y además presentan baja
eficacia. Con el objeto de aumentar la eficacia en las separaciones, el tamaño de
las partículas de fase estacionaria se fue disminuyendo, lo que generó la
necesidad de utilizar un sistema de bombeo a alta presión para conseguir un flujo
razonable de la fase móvil. De esta manera nació la técnica de cromatografía
líquida de alta resolución (HPLC) que, en fase inversa, es la técnica cromatográfica
más empleada en la actualidad.
La cromatografía de fase normal o "Normal phase HPLC" (NP-HPLC) fue el
primer tipo de sistema HPLC utilizado en el campo de la química, y se caracteriza
por separar los compuestos en base a su polaridad. Esta técnica utiliza una fase
estacionaria polar y una fase móvil apolar, y se emplea cuando el compuesto de
interés es bastante polar. El compuesto polar se asocia y es retenido por la fase
estacionaria. La fuerza de absorción aumenta a medida que aumenta la polaridad
del compuesto, y la interacción entre el compuesto polar y la fase estacionaria
polar (en comparación a la fase móvil) aumenta el tiempo de retención.
Esta técnica cayó en desuso con la aparición de la cromatografía de fase reversa
a finales de los años 70. La HPLC de fase reversa (RP-HPLC) consiste en una fase
estacionaria apolar y una fase móvil de polaridad moderada. El tiempo de
retención es mayor para las moléculas de naturaleza apolar, mientras que las
moléculas de carácter polar eluyen más rápidamente.
La cromatografía de fase reversa es tan utilizada que a menudo se le denomina
HPLC sin ninguna especificación adicional. Esta técnica se basa en el principio de
las interacciones hidrofóbicas que resultan de las fuerzas de repulsión entre un
disolvente relativamente polar, un compuesto relativamente apolar, y una fase
estacionaria apolar.
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4.2 Espectrometría de masas (MS)
En la actualidad, la MS es probablemente la herramienta analítica con mayores
aplicaciones. Es capaz de analizar prácticamente cualquier molécula173
debido a su
selectividad y es uno de los pocos sistemas de detección que proporciona
información estructural.
La MS se basa en la separación al vacío de iones en fase gaseosa de acuerdo con
su relación masa/carga (m/z). Su combinación con una técnica de separación
presenta la ventaja de proporcionar una segunda dimensión de separación, ya
que tras separar los compuestos según su tiempo de retención, el espectrómetro
de masas produce una separación en función de la relación m/z, siendo muy útil
en el análisis de muestras complejas174
.
La versatilidad de la MS se debe, en parte, al amplio abanico de posibilidades de
cada una de las secciones del espectrómetro, en concreto el resultado que se
obtenga va a depender notablemente de cuáles sean la interfase (método de
ionización) y el analizador utilizados (Figura 11).
Figura 11. Un espectrómetro de masas consta de una interfase (método de ionización) que vaporiza la muestra, un analizador que se encarga de separar las moléculas en base a su relación m/z y un detector.
Para llevar a cabo el acoplamiento de las técnicas separativas empleadas que
trabajan en fase líquida (HPLC y CE), con un espectrómetro de masas, en el que
las sustancias para ser analizadas deben estar en fase gaseosa, es necesaria la
utilización de una interfase adecuada que transfiera los iones desde una fase a
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otra. A pesar de la variedad de interfases que se han desarrollado para estos
acoplamientos175,176
, la más utilizada es la ionización por electrospray (ESI). Esta
interfase permite un análisis eficaz de compuestos polares, lábiles y de
compuestos con un alto peso molecular (normalmente hasta 100.000 Da). Por
otro lado, es fácil de implementar, es sensible y puede utilizarse en un amplio
espectro de aplicaciones.
En el analizador de masas se produce la discriminación entre los iones de
diferente m/z al ser sometidos a campos eléctricos o magnéticos constantes, por
pulsos o que varían periódicamente en el tiempo177
. Los más usados son:
cuadrupolo, trampa de iones (IT), triple cuadrupolo (QqQ), tiempo de vuelo (TOF),
transformada de Fourier-resonancia de ión ciclotrónica, orbitrap y algunos de los
acoplamientos entre varios de los mencionados178
. Todos ellos se diferencian en
tamaño y precio, resolución, rango y exactitud de masa que ofrecen, y en la
capacidad de determinar distribuciones isotópicas y de realizar experimentos de
masa en tándem (MS/MS o MSn)173
.
A continuación se detallan en líneas generales la interfase y los analizadores
utilizados en los trabajos presentados en esta tesis.
4.2.1 Ionización por electrospray (ESI)
Esta técnica de ionización suave se utiliza para acoplar técnicas de separación
que trabajan en fase líquida y MS para el análisis de biomoléculas polares, no
volátiles y térmicamente lábiles, en parte por su capacidad de formar iones mono-
o multicargados.
En el proceso de formación del electrospray, el cual se lleva a cabo a presión
atmosférica, intervienen diversos mecanismos al mismo tiempo179
.
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Figura 12. Proceso de ionización en una interfase de ionización por electrospray (ESI).
El primer paso en la creación de iones aislados es la formación de un cono de
líquido en la punta de la aguja de la interfase, desde donde se expelen microgotas
cargadas (Figura 12); es entonces cuando la muestra procedente del capilar o
columna de separación y generalmente con la ayuda de un gas nebulizador, se
carga y dispersa simultáneamente. El disolvente se va evaporando de las
microgotas, aumentando su densidad de carga eléctrica, de modo que los iones
de la igual polaridad son atraídos hacia la superficie de la misma debido al campo
electrostático que se aplica entre la salida de la interfase y la entrada al
espectrómetro de masas (±2-5 kV). Cuando las fuerzas de repulsión
electrostáticas de los iones son mayores que la tensión superficial que mantiene
unidas las gotas de forma esférica (límite de Rayleigh), las microgotas se van
dividiendo en otras aún más pequeñas (explosiones de Coulomb), que seguirán
sufriendo procesos de evaporación sucesivos hasta que finalmente se forman
iones cargados desnudos que pasan a fase gaseosa, siendo atraídos hacia la
entrada del espectrómetro de masas como consecuencia del voltaje
aplicado180,181
.
La ionización puede llevarse a cabo en el modo positivo o negativo. En el modo
positivo, se producirá la formación de iones protonados [MH]+ o múltiplemente
protonados. En el modo negativo, se observa normalmente la desprotonación de
las moléculas, pudiéndose formar también iones múltiplemente desprotona-
dos179
.
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4.2.2 Analizadores de masas
Una vez que en la interfase se ha llevado a cabo la transferencia de los iones
desde la fase líquida a la fase gaseosa, los iones son dirigidos hacia el analizador
de masas. Los analizadores de masas permiten la separación, fragmentación,
detección y cuantificación de los analitos en estudio con un grado de sensibilidad
y selectividad muy elevado, proporcionando información sobre su masa
molecular.
A Trampa de iones (IT)
El analizador IT consiste fundamentalmente en un electrodo anular y dos
electrodos laterales de geometría hiperbólica, que poseen una perforación que
permite la entrada y la salida de los iones. Cuando los iones están dentro, se
aplican diferentes voltajes generando un campo eléctrico tridimensional en la
cavidad de la trampa. Este campo atrapa y concentra los iones dada su trayectoria
de oscilación estable. La naturaleza de la trayectoria depende del potencial y de la
relación m/z de los iones. Para llevar a cabo la determinación de las especies que
entran o se forman en la trampa, los potenciales de los electrodos se alteran
sometiendo a los iones confinados a una rampa lineal de radiofrecuencia (RF), de
manera que son expulsados progresivamente en la dirección axial en función de
su relación m/z (Figura 13), como resultado de desestabilizaciones de las
trayectorias que mantienen dentro de la trampa. Una vez que estos iones llegan al
detector, la señal se procesa y da lugar al espectro de masas.
Figura 13. Los iones son expulsados de la trampa hacia el detector mediante radiofrecuencia.
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B Tiempo de vuelo (TOF)
En el TOF (del inglés, time of flight), la separación se basa en un principio
bastante simple: la distinta velocidad que adquieren los iones en el interior del
analizador en función de su relación m/z. Si todos los iones comienzan su vuelo
por el analizador al mismo tiempo y con la misma energía cinética, los de menor
m/z llegarán al detector antes (a mayor velocidad) que los de mayor m/z182
(Figura 14).
Figura 14. En el analizador TOF, los iones se aceleran y se separan dependiendo de su relación m/z. De esta manera pueden ser detectados indivi-dualmente.
Para ello es necesario emplear una fuente de ionización por pulsos ya que el uso
de una fuente de ionización continua, como el ESI, puede ocasionar grandes
pérdidas de intensidad. Para eliminar este problema, los iones que provienen del
electrospray se introducen y aceleran en el tubo de vuelo en dirección
perpendicular al eje del espectrómetro. Este diseño ortogonal en el TOF
proporciona una alta eficacia a la hora de transmitir en modo de pulsos los iones
que vienen en forma de haz continuo; además, produce dispersiones pequeñas en
la velocidad de los iones, obteniéndose una mayor resolución183
.
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Una de sus principales ventajas es que proporciona una resolución elevada
(Figura 15), lo que permite obtener valores de masa molecular muy exactos;
además permite obtener espectros de masas con una transmisión iónica eficaz y
proporciona ciclos muy rápidos182
.
Figura 15. Cromatograma en tres dimensiones resultante de la separación de los componentes de una mezcla.
El desarrollo de estas técnicas permite caracterizar de manera relativamente
fácil y en poco tiempo los compuestos presentes en un extracto vegetal
determinado. Es necesario el desarrollo de éstas técnicas en el análisis de
muestras biológicas para determinar qué compuestos son absorbidos y si sufren
modificaciones antes de pasar a la sangre. Conocer qué compuestos son retenidos
en los tejidos y sus mecanismos moleculares de actuación, puede ser clave en el
estudio y desarrollo de terapias eficaces en el tratamiento de enfermedades
crónicas como la obesidad, la enfermedad del hígado graso no alcohólica y los
procesos inflamatorios asociados.
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HIPÓTES
HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
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H i p ó t e s i s y o b j e t i v o s
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Hipótesis
El consumo de extractos ricos en polifenoles de origen vegetal pueden tener
efectos beneficiosos en la salud humana.
Objetivos
1. Desarrollar y estandarizar técnicas analíticas reproducibles para la
caracterización y cuantificación de los compuestos presentes en los
extractos de plantas.
2. Evaluar la actividad antiinflamatoria.
3. Asesorar la capacidad de extractos vegetales de actuar en la prevención de
esteatosis hepática en modelos animales.
4. Establecer posibles mecanismos moleculares de actuación.
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RESULT
RESULTADOS
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47
ESTUDIO 1
Direct characterization of aqueous extract of Hibiscus
sabdariffa using HPLC with diode array detection coupled
to ESI and ion trap MS.
Journal of Separation Science. 2009, 32:3441–3448
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UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN DE LOS EFECTOS BIOLÓGICOS DE LOS POLIFENOLES EN LA INFLAMACIÓN Y EL METABOLISMO : NUEVAS PERSPECTIVAS NUTRICIONALES Raúl Beltrán Debón DL:T-1517-2011
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57
ESTUDIO 2
Identification of phenolic compounds in aqueous and
ethanolic rooibos extracts (Aspalathus linearis) by HPLC-
ESI-MS (TOF/IT).
Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2011, 400:3643–3654
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN DE LOS EFECTOS BIOLÓGICOS DE LOS POLIFENOLES EN LA INFLAMACIÓN Y EL METABOLISMO : NUEVAS PERSPECTIVAS NUTRICIONALES Raúl Beltrán Debón DL:T-1517-2011
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ESTUDIO 3
Continous administration of polyphenols from aqueous
rooibos (Aspalathus linearis) extract ameliorates dietary-
induced metabolic disturbances in hyperlipidemic mice.
Phytomedicine. 2011, 18:414–424
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN DE LOS EFECTOS BIOLÓGICOS DE LOS POLIFENOLES EN LA INFLAMACIÓN Y EL METABOLISMO : NUEVAS PERSPECTIVAS NUTRICIONALES Raúl Beltrán Debón DL:T-1517-2011
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN DE LOS EFECTOS BIOLÓGICOS DE LOS POLIFENOLES EN LA INFLAMACIÓN Y EL METABOLISMO : NUEVAS PERSPECTIVAS NUTRICIONALES Raúl Beltrán Debón DL:T-1517-2011
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ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN DE LOS EFECTOS BIOLÓGICOS DE LOS POLIFENOLES EN LA INFLAMACIÓN Y EL METABOLISMO : NUEVAS PERSPECTIVAS NUTRICIONALES Raúl Beltrán Debón DL:T-1517-2011
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UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN DE LOS EFECTOS BIOLÓGICOS DE LOS POLIFENOLES EN LA INFLAMACIÓN Y EL METABOLISMO : NUEVAS PERSPECTIVAS NUTRICIONALES Raúl Beltrán Debón DL:T-1517-2011
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ESTUDIO 4
The aqueous extract of Hibiscus sabdariffa calices
modulates the production of monocyte chemoattractant
protein-1 in humans.
Phytomedicine. 2010, 7:186–191
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PRELIMI
RESULTADOS PRELIMINARES
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ESTUDIO I
El tratamiento con un extracto acuoso de Hibiscus
sabdariffa en un modelo animal de hiperlipémia
sometido de forma crónica a una dieta rica en grasa
previene la esteatosis hepática y la hiperlipémia.
Resultados preliminares.
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Los resultados presentados a continuación se observaron en ratones deficientes
en el receptor de las lipoproteínas de baja densidad (LDLr-/-
). Este modelo
presenta importantes alteraciones metabólicas que en algunos aspectos son
equiparables al síndrome metabólico en humanos184
. El background genético de
estos animales es C57BL/6J y fueron obtenidos de Jackson Laboratories (EE.UU.).
Materiales y métodos
Estudios animales
El número de animales utilizados (n=32) lo determinamos basándonos en
estudios previos185
. Los animales fueron estabulados en un ciclo de 12 h de
luz/oscuridad a una temperatura controlada de 25ºC y alimentados ad libitum con
agua y dieta comercial (Harlan, Barcelona). A las 10 semanas de edad, los
animales se dividieron en dos grupos. El grupo alimentado con dieta normal
(chow diet, CD, n=16) continuó con la misma dieta (3% grasa y 0,03% de
colesterol) y el segundo grupo (n=16) fue alimentado con una dieta rica en grasa
suplementada con colesterol (high fat diet, HF, 20% aceite de palma, 0,25% de
colesterol). Cada uno de estos grupos dietéticos fue dividido a su vez en dos
grupos de tratamiento (n=8). El grupo control recibió agua como único aporte
líquido, mientras que el otro recibió un extracto vegetal acuoso de 10 g/L de
Hibiscus sabdariffa. Para prevenir la degradación de los extractos, estos se
renovaban cada dos días. El peso y la ingesta de los animales se controlaron
semanalmente y los tratamientos duraron 14 semanas. Pasado este periodo, los
animales fueron sacrificados utilizando una sobredosis de ketamina y xilacina.
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Recogida de muestras y determinaciones analíticas
Las muestras de sangre y los tejidos se procesaron siguiendo los protocolos de
nuestro laboratorio publicados anteriormente186
. En las muestras de suero se
analizaron la concentración de glucosa, colesterol, triglicéridos, ácidos grasos
libres y bilirrubina y las actividades enzimáticas AST y ALT, utilizando al analizador
automático Synchron LXi 725 (Beckman Coulter, IZASA, Barcelona). El test de
tolerancia a la glucosa se llevó a cabo siguiendo protocolos descritos
anteriormente186
.
Histología
La esteatosis hepática se evaluó cualitativamente en una escala de 0 a 3, donde
0 representa la ausencia total de esteatosis y 3 el mayor grado de esteatosis
(>66%).
Proteómica (Western blot)
Mediante inmunodetección por Western Blot, se analizó la expresión de
diversas proteínas en el hígado y el tejido adiposo epididimal. Los tejidos fueron
homogeneizados en tampón de lisis (5 ml/g; 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM
EDTA, 1 mM EGTA, 1% CHAPS, 1 mM Pefabloc y 1% cóctel inhibidor de fosfatasas
nº 2, Sigma-Aldrich Inc., Steinheim, Alemania) utilizando el homogenizador
Precellys 24 (Bertin Technologies, Francia). Las muestras fueron deslipidadas
utilizando metanol/dietileter (3:7). Las proteínas se cuantificaron utilizando el 2D
Quant kit (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EE.UU.) y la electroforesis se realizó
utilizando geles de gradiente de poliacrilamida Bis-Tris NuPage 4-12% (Invitrogen,
Barcelona). Las proteínas fueron transferidas a membranas de nitrocelulosa
utilizando el sistema de transferencia iBlot (Invitrogen). Los anticuerpos de
detección utilizados fueron rabbit anti-AMPK (2532, Cell Signaling Tech., Danvers,
MA, EE.UU.), rabbit anti-pAMPK (2531, Cell Signaling Tech.), rabbit anti-C/EBPβ
(∆198, St. Cruz Biotech., Heidelberg, Alemania), rabbit anti-FAS (3180, Cell
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Signaling Tech.) y rabbit anti-actin (H-300, St. Cruz Biotech.). El anticuerpo
secundario utilizado fue goat anti-rabbit-HRP (Dako, Glostrup, Dinamarca). Para la
detección quimioluminiscente se utilizó el kit ECL Advance Western Blotting
Detection kit (Amersham, GE Healthcare, Barcelona), y el revelado se realizó en el
sistema VersaDoc (Bio-Rad, Madrid).
Análisis estadísticos
Todos los análisis estadísticos se llevaron a cabo utilizando el software Statistical
Package for Social Sciences (SPSS, Chicago, IL, EE.UU.).
Resultados
Se realizó un control semanal del peso de los animales y de la ingesta de
alimentos. Tanto en los animales que recibieron dieta rica en grasa (High-fat diet),
como los que recibieron dieta normal (Chow diet), la administración del extracto
vegetal redujo significativamente el aumento de peso de los ratones.
Figura 1. Incremento de peso de los animales alimentados con dieta rica en grasa (High-fat diet) y
dieta normal (Chow diet) y tratados con H. sabdariffa (puntos negros) o con agua (puntos blancos).
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Esta reducción del aumento de peso producida por el extracto vegetal, podía
atribuirse a una disminución en la ingesta de alimentos. En cambio, el análisis de
este parámetro mostró que los animales comieron prácticamente lo mismo,
incluso, los animales alimentados con la dieta rica en grasa y tratados con el
extracto de H. sabdariffa comieron más.
Figura 2. Ingesta de los animales alimentados con dieta rica en grasa (High-fat diet) y dieta normal
(Chow diet) y tratados con H. sabdariffa (puntos negros) o con agua (puntos blancos).
Se realizó un análisis bioquímico en los sueros de los ratones con el fin de
conocer algunos parámetros de interés metabólico y de función hepática de los
ratones.
En ambos tratamientos dietéticos, la concentración de colesterol plasmática
aumentó en los animales tratados con H. sabdariffa, siendo significativa en los
animales alimentados con dieta normal (Chow diet). Por el contrario, la
concentración de triglicéridos disminuyó en ambos grupos dietéticos en los
animales tratados con H. sabdariffa, aunque este descenso solamente fue
significativo en los animales alimentados con dieta rica en grasa (High-fat diet). La
concentración de ácidos grasos libres (NEFA) disminuyó significativamente en
ambos grupos dietéticos en los animales tratados con el extracto vegetal.
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El análisis de los marcadores de función hepática, bilirrubina y actividad AST,
solamente mostró diferencias significativas en los animales tratados con el
extracto de H. sabdariffa y alimentados con dieta rica en grasa.
Figura 3. Concentraciones séricas de diferentes parámetros bioquímicos. NEFA – ácidos grasos libres,
del inglés non-esterified fatty acids. AST – Aspartato aminotransferasa. * p < 0.05
La concentración sérica de glucosa en los animales tratados con H. sabdariffa
mostró un aumento significativo en estos animales (Figura 3). Este dato no
corresponde al observado en los test de tolerancia a la glucosa, donde la
concentración basal de glucosa era la misma tanto en animales tratados con H.
sabdariffa como en los no tratados. Creemos que el aumento observado en el
análisis bioquímico se debe a un fallo en el diseño experimental. Antes de ser
sacrificados, los animales se dejaron en ayunas durante 8 horas. En este periodo
de tiempo, se les retiró la comida pero no la bebida, por lo que los animales
tratados con H. sabdariffa continuaron ingiriendo el extracto. Este extracto
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contiene una fracción de polisacáridos los cuales pueden ser los responsables del
aumento de glucosa observado.
Figura 4. Curvas de glucosa de los animales alimentados con dieta rica en grasa (High-fat diet) y dieta
normal (Chow diet) y tratados con H. sabdariffa (puntos negros) o con agua (puntos blancos).
El análisis de la esteatosis hepática reveló que el tratamiento con el extracto de
H. sabdariffa evitaba la acumulación intrahepática de lípidos. En ambos grupos
dietéticos, la incidencia de esteatosis hepática fue menor, pero los resultados más
significativos, de los cuales se presentan imágenes histológicas en la figura
siguiente, se obtuvieron en los animales alimentados con la dieta rica en grasa y
tratados con el extracto de H. sabdariffa.
Figura 5. Fotografías de cortes histológicos hepáticos de animales alimentados con la dieta rica en
grasa y tratados con agua (Control) o con H. sabdariffa. El gráfico muestra la valoración cualitativa de
la esteatosis en los grupos estudiados. * p < 0.05.
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Mediante western blot se analizó la expresión hepática de uno de los enzimas
claves en el control de metabolismo energético, la AMPK. La forma activa de este
enzima se presenta de forma fosforilada, por lo que se analizó la AMPK total, y la
AMPK fosforilada. En la figura inferior, se observa como en ambos grupos
dietéticos, la cantidad hepática de AMPK fosforilada (pAMPK) es ligeramente
mayor en aquellos animales que fueron tratados con H. sabdariffa.
Figura 6. Análisis de la expresión en homogenados de tejido hepático mediante western blot de AMPK
y AMPK fosforilada (pAMPK). Como control se utilizó la Actina para comprobar que en todos los casos
se había utilizado la misma cantidad de muestra.
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ESTUDIO II
Metabolomic study of liver composition of animals
treated with Hibiscus sabdariffa and Aspalathus linearis.
Study description and results
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E s t u d i o I I
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I. Purpose of Experiment
The goal of this study was to characterize alterations in liver metabolism
associated with preventive intervention of liver steatosis by treatment with
Hibiscus sabdariffa (Hb) and Aspalathus linearis (Roo) plant extracts.
II. Experimental design
Liver samples utilized for this study were collected from C57BL/6J background
mice deficient in low density lipoproteins receptor (LDLr KO).
Dietary and treatment group identification:
HF - high fat diet (20% palm oil + 0.25% cholesterol)
CD - normal chow diet
Hb - treatment with Hb (Hibiscus sabdariffa extract)
Roo - treatment with Roo (Aspalathus linearis extract)
Global biochemical profiles were compared across the following sample groups.
Treatment Groups
Group Animals Group ID Description
1 6 CD+C LDLr KO + Water + Chow Diet
2 6 CD+Hb LDLr KO + Hb + Chow Diet
3 6 HF+C LDLr KO + Water + HF diet+0.25% Cholesterol
4 6 HF+Hb LDLr KO + Hb + HF diet+0.25% Cholesterol
5 6 HF+Roo LDLr KO + Roo + HF diet+0.25% Cholesterol
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III. Summary of Procedure
At the time of analysis samples were extracted and prepared for analysis using
Metabolon’s standard solvent extraction method. The extracted samples were
split into equal parts for analysis on the GC/MS and LC/MS/MS platforms. Also
included were several technical replicate samples created from a homogeneous
pool containing a small amount of all study samples.
IV. Data Quality: Instrument and Process Variability
QC Sample Measurement Median RSD
Internal Standards Instrument Variability 4 %
Endogenous Biochemicals Total Process Variability 12 %
Instrument variability was determined by calculating the median relative
standard deviation (RSD) for the internal standards that were added to each
sample prior to injection into the mass spectrometers. Overall process variability
was determined by calculating the median RSD for all endogenous metabolites
(i.e., non-instrument standards) present in 100% of the Client Matrix samples,
which are technical replicates of pooled client samples. Values for instrument and
process variability meet Metabolon’s acceptance criteria as shown in the table
above.
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V. Metabolite Summary and Significantly Altered Biochemicals
The mView product specification includes all detectable compounds of known
identity (named biochemicals). The present dataset comprises a total 499
biochemicals, 272 named and 227 unnamed compounds (with the Hb study
sample set exhibiting 495 total compounds, 272 named and 223 unnamed).
Following log transformation and imputation with minimum observed values for
each compound, contrasts resulting from the two-way ANOVA were used to
identify biochemicals that differed significantly between study
diet/treatment/gene knockout groups. A summary of the numbers of
biochemicals that achieved statistical significance (p≤0.05), as well as those
approaching significance (0.05<p<0.1), is shown below. When analyzing 493-499
compounds, we would expect to see 25 compounds meeting the p≤0.05 cut-off by
random chance. For the primary Hb sample set, the two-way ANOVA identified
biochemicals exhibiting a significant diet main effect, treatment main effect or
diet:treatment interaction.
An estimate of the false discovery rate (q-value) is calculated to take into
account the multiple comparisons that normally occur in metabolomic-based
studies; as q-values were reasonable for p≤0.05, no q-value cutoff was established
for this study.
Statistical Comparisons - Significantly Altered Biochemicals
Hb Treatment Study
ANOVA Contrasts CD+Hb
CD+C
HF+C
CD+C
HF+Hb
HF+C
HF+Hb
CD+C
HF+Roo
HF+C
HF+Roo
HF+Hb
Total biochemicals
p≤0.05 103 73 226 227 128 228
Biochemicals (↑↓) 50|53 38|35 43|183 51|176 98|30 215|13
Total biochemicals
0.05<p<0.10 39 32 32 41 36 35
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Biochemicals (↑↓) 18|21 17|15 5|27 14|27 28|8 31|4
Two-Way ANOVA Diet
Main Effect
Treatment
Main Effect
Diet:Treatment
Interaction
Total biochemicals
p≤0.05 151 214 105
Total biochemicals
0.05<p<0.10 32 40 47
We have also included in the electronic deliverables, a file with data for each
biochemical displayed as box plots like that shown in the example figure below.
VI. Biochemical Summary
This study was conducted in order to identify differences in the metabolic
profiles of LDLr knockout mice under normal or high fat diets. Numerous studies
have been conducted with LDLr knockout mice which have reported diet-induced
weight gain and glucose intolerance in response to a high fat diet as well as
modulating aspects of energy metabolism. In addition to the LDLr knockout and
dietary differences, we were also interested in metabolic changes induced by
Median Value
Mean Value
Extreme Data Points
Upper QuartileLower Quartile
“Max” of distribution“Min” of distribution
___
�
Box and Whiskers Legend
+
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supplementation with either hibiscus (Hb) or rooibos (Roo) plant extracts in
conjunction with liver steatosis. Previous studies with either Hb or Roo have
suggested that phenolic compounds present in these extracts may impact
oxidative stress, inflammation, hyperglycemia and even altered liver function. For
this study, liver samples from LDLr knockout mice maintained under normal or
high fat diets were further treated with control (H2O), Hb, or Roo extracts with
groups consisting of 6 biological replicates each. Equivalent amounts of liver
tissue were extracted for each sample and, therefore, no additional normalization
of the biochemical data was required.
Datasets provided in the mView product can be quite large and contain a great
deal of information. To provide an initial focus for further consideration, a few
observations are offered below from a cursory view of the data.
A number of carbohydrate-related metabolites were found to be significantly
and consistently higher with plant extracts (either Hb or Roo) regardless of diet
(high fat (HF) or control (CD)). In particular, maltose was nearly 300-fold higher in
CD+Hb than in the CD+H2O, 600-fold higher in HF+Hb than in HF+H2O or CD+H2O,
and 130-fold greater in the HF+Roo diet compared to the HF control samples.
Previous studies have observed that plant extract formulations may often be
reconstituted in maltose which would be consistent with these findings. In this
case, the plant extracts in this experiment were derived solely from freshly
ground plant material, indicating that the Hb and Roo extracts may be both
extremely high in maltose which may be impacting the liver. In addition to this,
the higher level of maltose may have caused the liver to compensate possibly first
through gluconeogenesis (generating excess glucose) and then secondly through
the sorbitol pathway resulting in the significantly higher levels of sorbitol and
fructose. Lactate levels were also higher in all extract-treated groups and may
indicate an elevated level of glycolysis. These are important observations
consistent between the extract-treated samples regardless of diet that may
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suggest that the formulation process is contributing to differences observed in the
liver.
While the HF diet or plant extracts alone did not significantly affect the levels of
amino acids in comparison to the control diet, the combination of HF+Hb did
result in significant lower levels of nearly all amino acids. This decrease may be an
indication of reduced uptake from the diet or potentially represent increased
amino acid metabolism for energy purposes in response to hibiscus extract.
However, this seems unlikely given the abundance of glucose observed under
these conditions. In contrast to this, the HF+Roo diet resulted in slightly higher
levels of free amino acids in contrast to the HF+C diet. These results are intriguing
and if they are indicative of increased amino acid utilization, these results may be
consistent with reports in the literature which have suggested that diets fortified
with essential and in particular ketogenic amino acids may prevent hepatic
steatosis in mouse models of dietary induced obesity.
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The HF diet resulted in greater levels of bile acids in the liver (many that were
statistically significant compared to control), which may be an indication of
decreased liver function (consistent with steatosis). It is interesting to note that
there was a significant reduction in the levels of bile acids (cholate, taurocholate,
deoxycholate, taurodeoxycholate, 6-beta-hydrolithocholate, beta-muricholate
and taurourso-deoxycholate) in livers maintained on HF diet when Hb extract was
also co-administered. The HF+Roo samples also showed a similar result (lower bile
acids) in relation to the HF control samples. The significant decreases in bile acids
associated with Hb or Roo extract may be suggestive of improved liver function.
This would be consistent with previously reported results from this client, who
found that dietary-induced liver steatosis was prevented by the Roo extract.
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With respect to lipid levels in the liver, several long-chain fatty acids and
glycerol were found to be significantly lower in the HF+Hb liver samples in
contrast to the HF control diet. While the liver is the primary tissue for de novo
synthesis of fatty acids, the changes observed here may be indicative of reduced
lipolysis. However, this is difficult to confirm since monoacyl- or diacyl-glycerols
were not observed. By comparison, sphingolipids including sphinganine (a
ceramide precursor) and sphingosine and sphingomyelin (ceramide catabolites)
were higher in mice reared on the HF diet compared to CD. Ceramide itself was
not detectable on our platform because of its physical characteristics. The
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inclusion of plant extracts in the diet generated interesting changes in the levels
of liver sphingolipids. Though not statistically significant, the levels of sphinganine
and sphingosine in HF+plant extract-treated animals trended upward compared
to HF diet alone. In contrast, stearoyl sphingomyelin and palmitoyl
sphingomyelin were lower in livers from HF+plant extract-treated animals,
returning to levels that mimicked the CD. These results may suggest that either
plant extract in combination with a high fat diet may cause preferential
catabolism of ceramide to sphingosine instead of sphingomyelin. Since elevated
levels of ceramides have been recognized as a factor contributing to impaired
insulin signaling in non-adipose tissue – events that are strongly associated with
liver steatosis – altered ceramide catabolism in association with these plant
extracts may also impact liver steatosis, perhaps in a favorable manner.
One of the most consistent differences associated with HF+Roo samples were
the significant differences in glutathione related metabolites. Both oxidized and
reduced glutathione levels were found to be significantly higher in the HF+Roo
samples in relation to the HF+H2O controls. 5-oxoproline, a degradation product
of glutathione, was also higher in the HF+Roo samples in relation to the HF
controls suggesting increased glutathione turnover. In addition, cysteine-
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glutathione disulfide, which is formed during oxidative reactions with
glutathione, was higher in the HF+Roo samples when compared to HF controls.
Elevated levels of cysteine-glutathione disulfide are often an indicator of an
oxidative environment or of increased oxidative stress. Moreover, urate may be
generated during purine metabolism through the activity of xanthine oxidase – an
enzyme whose activity is increased under conditions of oxidative stress. Urate
levels were nearly 4-fold higher in the HF+Roo samples in relation to the HF
controls, providing further support for conditions of an increased oxidative
environment or oxidative stress with Roo treatment. Finally, additional
antioxidants including alpha-tocopherol and ascorbate were generally greater in
the HF+Roo samples compared to control and may suggest a buildup of
antioxidants to compensate for elevated oxidative stress.
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Data derived from structurally unnamed biochemicals were also provided with
this dataset, resulting in the identification of an additional 227 compounds. Many
of these unnamed metabolites may serve as potential biomarkers of Hb- or Roo-
treatment in relation to a high fat diet. Of particular interest are X-14619 and X-
11651 (a potential bile acid with structural similarities to tauro(cheno)deoxycholic
acid), whose levels were significantly reduced upon addition of Hb to the high fat
diet. X-11651 behaves similar to that of the bile acids discussed previously but X-
14619 may show an amelioration of the effects of the high fat diet with the Hb
extract and may be worth pursuing further. Additional unnamed compounds of
interest included X-11540 (possibly dodecenoyl-carnitine) which was uniquely
higher within the HF+Roo samples as well as X-11611_200 which was unique to
both HF and CD with hibiscus. X-06132_201, X-16820, and X-16830 showed signs
of being significantly higher within only the HF+Hb samples.
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R e s u l t a d o s p r e l i m i n a r e s I
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In conclusion, there were a number of significant differences identified in the
LDLr knockout mouse liver with respect to dietary changes as well as following
treatment with plant extracts, which may have favorable impacts on liver
steatosis. Unique findings with respect to the plant extracts showed that the Hb
extract in particular may have had a positive impact on liver steatosis, possibly
increasing metabolism of amino acids and decreased levels of bile acids. By
comparison, treatment with the Roo extract often generated overlapping effects
to that seen after treatment with Hb. Additionally, the biochemical data provided
in this study may suggest that Roo treatment generates a more oxidative
environment in the liver or perhaps lead to conditions of increased oxidative
stress.
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DISCUSIÓ
DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
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D i s c u s i ó n
121 121
1. DISCUSIÓN
La obesidad es una de las enfermedades más frecuentes en todo el mundo.
Tanto es así que la Organización Mundial de la Salud la califica de pandemia63
,
siendo particularmente alarmante el incremento en la edad infantil. Esta
enfermedad multifactorial se asocia con el desarrollo de otras patologías como la
diabetes, la hipertensión y alteraciones inflamatorias. La tasa de obesidad, del
orden del 15% en Europa y superior al 30% en Norteamérica, justifica los
esfuerzos que la comunidad científica destina a investigar las causas de esta
enfermedad, entre las que se encuentran componentes genéticos, endocrinos y
factores ambientales como hábitos dietéticos inadecuados y modelos sedentarios
de actividad física60
.
Desgraciadamente, la búsqueda de factores de riesgo convencionales para las
enfermedades crónicas es una estrategia limitada que no proporciona una
solución eficaz para el tratamiento de la enfermedad. Una estrategia alternativa
podría centrarse en la población general a través de simples modificaciones en la
dieta, dado que la evidencia científica apoya cada vez más la opinión de que estas
intervenciones dietéticas tienen importantes efectos sobre el estado de salud a
largo plazo. Sin embargo, la financiación de ensayos clínicos para demostrar la
eficacia de los polifenoles en la dieta se complica por el hecho de conseguir
extractos naturales siempre con la misma composición. La industria alimentaria,
con el fin de evitar esta limitación, centra sus investigaciones en los efectos de los
elementos individuales.
Nuestro enfoque, sin embargo, examina la actividad biológica del extracto
completo. Algunos de los compuestos presentes en los extractos estudiados
poseen numerosas actividades biológicas, como las antocianinas, el ácido
hidroxicítrico, el ácido hibiscus y el ácido clorogénico, los cuales se comercializan
como suplementos dietéticos destinados a reducir el sobrepeso y otras
afecciones187
. Una de las desventajas de nuestra estrategia es que la
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D i s c u s i ó n y c o n c l u s i o n e s s
122
interpretación de los resultados puede convertirse en una tarea complicada
debido a las múltiples dianas metabólicas de los compuestos polifenólicos46-48
.
Además, este planteamiento condena la incorporación del extracto como
suplemento dietético antes que como fármaco. Las plantas que son ampliamente
utilizadas en la medicina popular son candidatas inmediatas a la investigación,
como ocurren en el caso de Hibiscus sabdariffa y Aspalathus linearis. La primera
se utiliza tradicionalmente para tratar la hipertensión y los trastornos
hepáticos146,188
, mientras que a la segunda se le atribuyen efectos beneficiosos en
el tratamiento de alergias, asma y problemas dermatológicos158
.
Las técnicas analíticas desarrolladas proporcionan una herramienta eficaz en la
caracterización de los compuestos polifenólicos presentes en extractos acuosos
vegetales. El objetivo era desarrollar un método cualitativo muy simple para
separar y caracterizar simultáneamente los compuestos presentes en ambos
extractos. En el caso de H. sabdariffa se describieron dos compuestos por primera
vez, el 5-O-caffeoylshikimic acid y la N_feruloyltyramina (Estudio 1; pág.47).
Además sabemos que los compuestos mayoritarios presentes en este extracto
son el ácido hibiscus, el ácido hidroxicítrico, el ácido clorogénico y las dos
antocianinas (Material suplementario; pág. 147). También en el caso del extracto
de A. linearis se describieron nuevos compuestos. Concretamente los once
siguientes: patuletin 7-glucoside, esculin, safflomin A, carlinoside, isocarlinoside,
neocarlinoside, 2″-O-β-arabinopyranosylorientin, vicenin-2, eriodictyol-5,3′ di-O-
glucoside, quercetin-3-O-arabinoglucoside y scoparin (Estudio 2; pág. 57).
En los estudios llevados a cabo en ratones, los extractos vegetales de H.
sabdariffa y A. linearis muestran una alta actividad biológica, aunque su
comportamiento difiere en algunos aspectos. En ambos casos, los efectos
producidos por los extractos parecen ser mayores cuanto mayor es la agresión
externa, que en estos estudios, es el consumo de una dieta hipercalórica. Ambos
extractos previenen el incremento de peso en los animales alimentados con la
dieta normal, pero solamente H. sabdariffa consigue hacerlo en los animales
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D i s c u s i ó n
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alimentados con una dieta rica en grasa. Los responsables de este efecto pueden
ser el ácido hidroxicítrico189,190
y su isómero, el ácido hibiscus, ya que su
concentración es muy alta en los extractos de H. sabdariffa (ver Material
suplementario; pág. 147).
Ambos extractos muestran una gran actividad hipolipemiante, tanto a nivel
sérico como hepático (Estudio 3; pág. 71 y Estudio I; pág. 95). La diferencia más
importante la observamos en los niveles plasmáticos de colesterol. Mientras que
A. linearis disminuye la concentración plasmática de colesterol, los animales
tratados con H. sabdariffa muestran una concentración mayor respecto al control.
Esto podría ser debido a un aumento de la excreción de colesterol por parte del
hígado. Los resultados obtenidos en el análisis metabolómico de los hígados de
los animales alimentados con una dieta rica en grasa, muestran un contenido de
colesterol intrahepático menor en los animales tratados con H. sabdariffa,
mientras que en los tratados con A. linearis la acumulación de colesterol es
mayor, comparados con el control (Estudio II; pág. 105). Además, estos últimos
muestran una concentración plasmática de VLDL y LDL menor. En ambos casos,
los resultados encajan con la concentración plasmática de colesterol observada.
Por otro lado, la administración de dieta rica en grasa en los animales control
produce un incremento en la concentración hepática de ácidos biliares, lo que
puede indicar una alteración en la función hepática191
. Tanto el tratamiento con
H. sabdariffa como con A. linearis reduce significativamente la concentración de
ácidos biliares en el hígado, sugiriendo una mejora en la función hepática (Estudio
II; pág. 105). Estos resultados se correlacionan además con la esteatosis
observada
Los efectos observados son independientes de cambios en la resistencia a la
insulina, como muestran los test de tolerancia a la glucosa realizados en los
animales de experimentación. Sin embargo, el tratamiento con H. sabdariffa
produce un incremento significativo en la glucosa plasmática. En el hígado, el
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124
contenido de glucosa es mucho mayor en los animales tratados con los extractos
vegetales. Particularmente, la concentración de maltosa es significativamente
mayor. Estos resultados sugieren que ambas plantas son ricas en este azúcar (o en
polisacáridos cuya digestión produzca este disacárido), hecho que podría afectar
particularmente al hígado. La alta concentración de maltosa puede activar
mecanismos compensatorios; por un lado, vía gluconeogénesis generando un
exceso de glucosa, y por otro lado, produciendo sorbitol y fructosa por la vía del
sorbitol (Estudio II; pág. 105). Este alto contenido en glucosa parece activar
parcialmente la glicolisis, como revela la alta concentración de lactato observada
en los animales tratados con los extractos vegetales (Estudio II; pág. 105). Una
posible estrategia, en la que ya hemos empezado a trabajar para evitar estas
alteraciones en las concentraciones hepáticas y plasmáticas de glucosa, es
eliminar los polisacáridos de los extractos vegetales, obteniendo así un extracto
mucho más concentrado.
Las alteraciones observadas en el metabolismo de la glucosa y de los lípidos,
apuntan a un enzima clave en la regulación del metabolismo energético, la AMPK.
Cuando las reservas energéticas disminuyen, AMPK activa vías catabólicas como la
β-oxidación de los ácidos grasos192,193
. Además, inhibe rutas biosintéticas como la
síntesis de ácidos grasos o la gluconeogénesis192,193
. Los dos extractos estudiados
activan la AMPK en el hígado. Este hecho podría bloquear la síntesis de ácidos
grasos, promoviendo su oxidación, lo que explicaría la reducción de los depósitos
intrahepáticos de lípidos. Lo que no explica es el aumento de glucosa
intrahepática, aunque podría deberse a que los hepatocitos transforman la
maltosa en glucosa para dar salida a las grandes cantidades ingeridas de este
disacárido. Por otro lado, como se especifica en el Estudio I del apartado de
Resutados Preliminares, los animales se dejaron en ayunas antes del sacrificio,
pero no se les retiró el extracto vegetal. Este error en el diseño del experimento
explicaría la alta concentración plasmática y hepática de glucosa, y la ausencia en
estos animales de un estado de resistencia a la insulina.
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D i s c u s i ó n
125 125
Aunque los niveles altos de glucosa en sangre son un factor que no se debe
menospreciar, los datos obtenidos muestran que la administración continuada de
extractos ricos en polifenoles puede ayudar en el control de las enfermedades
metabólicas.
En humanos, nuestros estudios in vitro muestran en células mononucleares de
sangre periférica (PBMCs) una protección efectiva ante la muerte celular inducida
por H2O2. Los resultados indican que los componentes responsables de estos
efectos pasan fácilmente a través de la membrana de la célula y pueden
acumularse en ellas e inducir potentes mecanismos de defensa. La importancia
biológica de la interacción entre las especies reactivas de oxígeno y ciertas
citoquinas inflamatorias sigue siendo difícil de explicar. Hemos encontrado una
secreción significativa de IL-6 e IL-8 por parte de los PBMCs en respuesta al estrés
oxidativo que se acentúa aún más por la incorporación del extracto, lo que
sugiere un efecto xenohormético. IL-6 desempeña muchas funciones biológicas,
pero en este contexto, su producción puede deberse a la demanda metabólica
inducida experimentalmente por la adición de H2O2194,195
. Además, la IL-6 también
puede proteger las células contra la apoptosis inducida por H2O2 al inhibir la
muerte celular por la vía de señalización de JNK196
. IL-8 no sólo promueve la
respuesta inflamatoria, sino que también actúa para suprimir la apoptosis,
principalmente a través de la IL-8RA en situación de estrés oxidativo. La presencia
de IL-8 suprime la función de la apoptosis en las interacciones Fas-FasL197
. Por el
contrario, algunos experimentos sugieren que la MCP-1 previene la apoptosis en
varios modelos y aumenta la supervivencia de las células198,199
. En nuestros
resultados, la disminución observada de MCP-1 en nuestro modelo experimental
podría indicar un efecto proapoptótico. En la regulación de la apoptosis pueden
concurrir diferentes vías y moléculas de señalización, y en nuestro caso, el
resultado de esta regulación depende del equilibrio de los efectos opuestos
provocados por citoquinas concurrentes. También puede depender de las
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D i s c u s i ó n y c o n c l u s i o n e s s
126
características de la célula y el factor de inducción, como se ejemplifica en datos
recientes144
en los que los polifenoles de H. sabdariffa impiden la inflamación
inducida por lipopolisacáridos en macrófagos.
Los efectos observados en voluntarios sanos fueron diferentes después de la
ingestión de dosis altas de H. sabdariffa. La concentración plasmática de MCP-1
disminuye significativamente y no se observa ningún efecto en la concentración
de IL-6 e IL-8. Estos estudios deben ampliarse en pacientes con un elevado grado
de inflamación, como pacientes diagnosticados de síndrome metabólico u
obesidad mórbida, donde los efectos podrían ser más importantes. Queda por
determinar si el tratamiento es seguro y si sus efectos se mantienen cuando es
administrado de forma crónica. Así pues, puede ser relevante la investigación
enfocada a la inhibición de la producción de MCP-1 para prevenir enfermedades
inflamatorias crónicas mediante el uso de estos extractos. Aunque no poseemos
datos propios en humanos de la farmacocinética de estos extractos, el potente
efecto observado sugiere una absorción inmediata y significativa de compuestos
biológicamente activos. Existen datos previos acerca de la absorción de las
antocianidinas del H. sabdariffa200
. Además, los glucósidos de estas antocianidinas
son fuertes candidatos según lo indicado previamente por datos obtenidos con
antocianinas del vino tinto purificadas201,202
. Aun así, el papel de otros
compuestos o un efecto combinado no puede ser ignorado. Los flavonoides
poseen una gran actividad antioxidante y tradicionalmente se ha atribuido los
efectos beneficiosos que producen a esta capacidad antioxidante49,50
. Sin
embargo, nuestros resultados demuestran que la disminución en el plasma de la
concentración de MCP-1 no se debe a un aumento concomitante en la capacidad
antioxidante del plasma. En cambio, los posibles mecanismos pueden involucrar
una inhibición directa de las vías inflamatorias y metabólicas responsables de la
producción de MCP-1203
.
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D i s c u s i ó n
127 127
En resumen, los resultados obtenidos muestran que los extractos vegetales ricos
en polifenoles pueden producir beneficios para la salud humana. Además cuentan
con la ventaja de carecer de valor calórico y de la toxicidad potencial del alcohol.
En los animales de experimentación, el metabolismo de los lípidos y la glucosa se
ven claramente alterados a consecuencia del consumo crónico de estos extractos,
reduciendo los lípidos plasmáticos, bloqueando el desarrollo de esteatosis
hepática, y todo ello independientemente a cambios en la resistencia a la insulina.
En los seres humanos, H. sabdariffa provoca una disminución significativa en la
concentración plasmática de MCP-1, lo que sugiere que esta planta puede ser un
valioso complemento de la dieta.
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2. CONCLUSIONES
• La metodología desarrollada para HPLC acoplada a ESI-TOF-MS y ESI-IT-
MS2 es una técnica analítica potente para la separación y caracterización
de los compuestos polifenólicos contenidos en extractos vegetales
acuosos.
• Los efectos biológicos observados en modelos animales de
experimentación parecen ser más importantes cuanto mayor es la
agresión externa (en este caso, el consumo de una dieta hipercalórica).
• Los extractos vegetales, administrados de forma crónica, previenen
trastornos en el metabolismo lipídico como la hiperlipémia y la esteatosis
hepática en modelos animales de experimentación alimentados con una
dieta rica en grasa.
• Los efectos biológicos observados en estos animales son independientes
de cambios en la resistencia a la insulina, y sugieren una activación de la
AMPK como uno de los posibles mecanismos responsables de dichos
efectos.
• En humanos, la administración aguda de una dosis alta de polifenoles
disminuye la concentración plasmática de MCP-1 en unas horas,
sugiriendo una absorción inmediata y significativa de compuestos
bioactivos.
• La gran actividad antiinflamatória de estos compuestos observada en
humanos es independientemente de un aumento en la capacidad
antioxidante del plasma y propone la utilización de extractos acuosos
vegetales en el tratamiento de enfermedades inflamatorias.
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UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI CARACTERIZACIÓN DE LOS EFECTOS BIOLÓGICOS DE LOS POLIFENOLES EN LA INFLAMACIÓN Y EL METABOLISMO : NUEVAS PERSPECTIVAS NUTRICIONALES Raúl Beltrán Debón DL:T-1517-2011
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O t r o s
161 161 161
Publicaciones no indexadas
1. Fernández-Arroyo S, Rodriguez-Medina IC, Beltrán-Debón R, Pasini F, Joven
J, Micol V, Segura-Carretero A, Fernández-Gutierrez A. Quantification of the
polyphenolic fraction and in vitro antioxidant and in vivo anti-hyperlipidemic
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International. 2011 Jun; 44: 1490-5.
2. Herranz-Lopez M, Barrajon-Catalan E, Beltran-Debon R, Joven J, Micol V.
Stevia is a source for alternative sweeteners: potential medicinal effects.
Agro Food Industry Hi-Tech. 2010 May; 21: 3. 38-42
Participaciones en congresos
79th
Annual Congress of the European Atherosclerosis Society (EAS)
Gothenburg 2011
4th
International Conference on Paraoxonases
La Pineda 2010
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O t r o s a
162 162
ABREVIATURAS
ABCA1 – ATP-binding cassette, member 1
ALT – alanino amino transferasa
AMPK – AMP-activated protein kinase
AST – aspartato aminotransferasa
ATP – adenosine triphosphate
CE – Capilar electrophoresis
Da – Dalton
EC – epicatechin
ECG – epicatechin gallate
ECGC – epigallocatechin gallate
EDTA – ethylenediaminetetraacetic acid
EGC – epigallocatechin
EGTA – ethylene glycol tetraacetic acid
ERK – elk-related tyrosine kinase
ESI – electrospray injection
FAS – TNF receptor superfamily member 6
FASL – Fas ligand
GLUT4 – insulin-responsive glucose transporter 4
HDL – high-density lipoprotein
HPLC – high performance liquid chromatography
ICAM-1 – intercellular adhesion molecule 1
IL-6 – interleucina-6
IL-8 – interleucina-8
IL-8RA – chemokine (C-X-C motif) receptor type 2 (CXCR2)
IL-10 – interleucina-10
IT – ion trap
JNK – c-Jun N-terminal kinase
LDL – low-density lipoprotein
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O t r o s
163 163 163
LDLr-/-
- low-density lipoprotein receptor deficient mice
LP – lipasa pancreática
LPS – lipopolisacárido
MCP-1 – monocyte chemoattractant protein-1
MS – mass spectrometry
m/z – relación masa/carga
NAD – nicotinamide adenine dinucleotide
NADPHox – nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase
NAFLD – non-alcoholic fatty liver disease
Nampt – nicotinamide phosphoribosyltransferase
NASH – non-alcoholic steatohepatitis
NEFA – non-esterified fatty acids
NF-κβ – nuclear factor κβ
pAMPK – phosphorylated AMP-activated protein kinase
PBMCs – peripheral blood mononuclear cells
PNLIP – pancreatic lipase
PPARγ – peroxisome proliferator-activated receptor gamma
SCD1 – stearoyl-Coenzyme A desaturase 1
SIRT1 – sirtuin 1
SREBP-1 – sterol regulatory element binding protein 1
TOF – Time of flight
VCAM-1 – vascular cell adhesion molecule 1
VLDL – very low-density lipoprotein
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