capitulo 13. aplicacion genetica

APLICACIÓN DE LA GENETICA

bioquímica

I.- APLICACIÓN EN BIOTECNOLOGÍA

•Biotecnología. Es la utilización de células y componentes de células, microbianas, vegetales y animales en cultivo para la fabricación de sustancias específicas.• Ingeniería Genética, rama que se concentra en el estudio del ADN, para su manipulación•La constitución genética de los individuos se denomina genotipo•Los rasgos observables o medibles de un individuo se denominan fenotipo.•El fenotipo es consecuencia del genotipo..•La Ingeniería genética busca cambiar el fenotipo manipulando del genotipo.

II.- HERRAMIENTAS DE MANIPULACION

• Mutaciones• Ingeniería genética.

– Fusión de protoplastos– ADN- recombinante. Permiten la propagación de

secuencias de DNA de cualquier organismo mediante su inserción en moléculas de DNA de otro origen.

– PCR . Técnicas de amplificación, que permiten la obtención in vitro de cantidades ilimitadas de copias exactas de una secuencia de DNA

2.1.- MUTACIÓN

•Cualquier cambio heredable en el material genético.•Las mutaciones en un gen determinado crean variantes de este gen, denominadas alelos.

•TIPOS:•Espontáneas. Debidas a procesos celulares normales–Dependen de la tasa de error de la DNA polimerasa y de la eficiencia de los sistemas de reparación–Suceden con baja frecuencia•Inducidas–Debidas a agentes físicos o químicos (mutágeno) que dañan las moléculas de DNA–La frecuencia de mutación es función de la dosis de mutágeno

Tipos de mutaciones• Mutación por sustitución de bases: Se producen al cambiar en una posición un par de

bases por otro. Distinguimos dos tipos que se producen por diferentes mecanismos bioquímicos: Mutaciones transicionales (transicion), cuando un par de bases es sustituido por su alternativa del mismo tipo. Las dos bases púricas son adenina (A) y guanina (G), y las dos pirimídicas son citosina (C) y timina (T). La sustitución de un par AT, por ejemplo, por un par GC, sería una transición.Mutaciones transversionales (transversion), cuando un par de bases es sustituida por otra del otro tipo. Por ejemplo, la sustitución del par AT por TA o por CG.Mutaciones de corrimiento estructural. Cuando se añaden o se quitan pares de nucleótidos alterándose la longitud de la cadena. Si se añaden o quitan pares en un número que no sea múltiplo de tres (es decir si no se trata de un número exacto de codones), las consecuencias son especialmente graves, porque a partir de ese punto, y no sólo en él, toda la información queda alterada. Hay dos casos: Mutación por pérdida o deleción de nucleótidos: en la secuencia de nucleótidos se pierde uno y la cadena se acorta en una unidad.Mutación por inserción de nuevos nucleótidos: Dentro de la secuencia del ADN se introducen nucleótidos adicionales, interpuestos entre los que ya había, alargándose correspondientemente la cadena.

GATCATAGATACCATGAGATCATAGATACCATGA

Tipos de mutaciones

GATCATAGATACCATGA GATCATAGATACCATGA

GATCATA ATACCATGA

GATCATAGATACCATGA

SustituciónSustitución

GATCATAAATACCATGADeleciónDeleción

GATCATAATACCATGA

GATCATAGATACCATGAGATCATAG ATACCATGAGATCATAGCATACCATGAInserciónInserción

2.1.1.- Mecanismos endógenos

1. Pérdida de bases tipo purinas por ruptura espontánea del enlace con el azúcar 5000/día/célula humana

2. Deaminación espontánea de citosinas y adeninas produce uracilo e hipoxantina

3. Daños oxidativos. Moléculas con oxígenos reactivos atacan los anillos de las bases nitrogenadas. (superóxidos, peróxidos y radicales hidroxilo) que se producen durante el metabolismo normal, el ozono y ciertas drogas pueden dañar el ADN, ejemplo, la 8-oxi-7,8 dihidrodesoxiguanina.

4. Error de replicación. La ADN polimerasa puede incorporar bases equivocadas en la replicación. como por ejemplo el 5-bromouracilo o la 2-aminopurina, que se incorporan en el ADN que se replica en lugar de las bases correspondientes timina y adenina

Bases nitrogendas

A.- Perdida de base

• Ocurre una deleción

B.- Desaminación • La Citosina (C) por desaminación se convierte en Uracilo (U) y el Uracilo

empareja con Adenina (A) produciéndose transiciones: GC→AT. • El Uracilo (U) no forma parte del ADN, existiéndo un enzima llamada

glucosidasa de uracilo encargada de detectar la presencia de U en el ADN y retirarlo. Al retirar el Uracilo (U) se produce una sede apirimidínica.

Efecto de deaminación

C.- Daños oxidativos al ADN

Transformación de Guanina (G) en 8-oxo-7,8-dihidro-desoxiguanina que simula una Adenina (A). Esta alteración del ADN produce transversiones: GC→TA.

La Timidina se convierte en Glicol de timidina.

• El metabolismo aeróbico produce radicales superoxido O2, peróxido de hidrógeno H2O2 e hidroxilo.

2.1.2.-Agentes mutagénicos exógenos

1. Radiaciones ionizantes: rayos gamma y rayos X causan rupturas en la doble hélice y deleción

2. Luz UV causa formación de dímeros de timina

3. Químicos ambientales como agentes alquilantes, deaminantes y otras sustancias químicas forman derivados con las bases del ADN.

a.- Radiación ionizante

• Reacciones oxidativas. Produce iones (hidrógeno o de radicales hidroxilo (OH) ionizados).

• Estos radicales reaccionan con otras moléculas de su misma clase para formar peróxido de hidrógeno (H2O2) que puede destruir proteínas y ADN.

• Daños cromosómicos. roturas físicas ó “lesiones” cromosómicas que luego estimulan intercambios entre partes del mismo cromosoma o de diferentes cromosomas.

b.- Radiación ultravioleta

•La absorción de rayos UV es principalmente en citosina y timina. •La radiación UV provoca la inserción de una molécula de agua en el doble enlace C-C.•Cuando hay dos pirimidinas sucesivas en la misma hélice la luz UV hace que se produzcan puente de hidrógeno entre ambas. formando dímeros de Timina.•Tales dímeros distorsionan la hélice de DNA e impiden su replicación, como resultado la célula no se divide y puede morir.

Dimeros de timina

Agentes alquilantes

• Etil metano sulfonato (EMS), metil metano sulfonato (MMS), dietil sulfato(DES) , etiletanosulfonato, mostaza nitrogenada, etc.

• El EMS introduce un metilo o etilo en la Guanina y produce transiciones GC→AT.

• Etiletanosulfonato y mostaza nitrogenada, tambien adicionan grupos metilo o etilo a la Guanina, haciendo que se comporte como un análogo de base de la Adenina.

c.- Químicos ambientales

Alquilantes Introducción de etilo en guanina y timina

Desaminantes

• Iones bisulfito y ácido nitroso.• El ácido nitroso transforma la Citosina (C) en Uracilo (U),

el Uracilo (U) empareja con la Adenina (A) produciendo transiciones.

• La desaminación de las Adenina (A) la convierte en hipoxantina (H) que empareja con la Citosina (C) produciendo transiciones.

• Hidroxilamina añade un grupo hidroxilo(OH) al grupo amino de la citosina, haciendo que la base sufra un cambio tautomérico.

Desaminacion

•La aflatoxina B1 es un carcinógeno poderoso que se une a la posición N7 de la Guanina.•La formación de este producto da lugar a la rotura del enlace entre la base y el azucar, generando un sitio apurínico.•El sistema SOS pone habitualmente en la sede apurínica una Adenina (A) dando lugar a transversiones. Es un potente carcinógeno.

Reemplazo de una base en el ADN

•Los análogos de bases son compuestos químicos que pueden remplazar a una base determinada. •El 5-Bromouracilo (5BU) es análogo de la Timina (T) y puede remplazarla. •El 5BU en su forma cetónica empareja con la Adenina (A) mientras que en su forma enólica (5BU*) empareja con la Guanina (G).

bromouracilo

• La 2-Aminopurina (2AP) es análogo de la Adenina (A) y puede remplazarla.

• La 2AP aparea con la Timina (T) pero en su forma imíno (2AP*) empareja con la Citosina (C).

• Esta alteración produce transiciones.

Remplazo de una base en el ADN

Agentes intercalantes

• La Proflavina, Naranja de acridina y otros Compuestos (ICR): son compuestos con estructuras planas que se meten o intercalan entre las bases nitrogenadas del ADN produciendo adiciones o deleciones de un solo par de nucleótidos.

Mutágenos que producen pérdida del emparejamiento específico

• Estos mutágenos dañan muchas bases nitrogenadas y producen como consecuencia un bloqueo de la replicación del ADN.

• La mayoría de los compuestos cancerígenos producen este tipo de alteraciones. Debido a la gran cantidad de alteraciones que producen en el ADN como primera medida se produce un bloqueo de la replicación y se ponen en marcha un sistema de emergencia denominado abreviadamente SOS para reparar los daños y permitir que la célula se replique y pueda seguir viviendo. El sistema SOS consta de al menos tres genes denominados recA, umuC y umuD.

• Este sistema produce un relajamiento de la especificidad de apareamiento de la ADN polimerasa III de E. coli. Algunos ejemplos de esta situación son:

• Benzopireno: es un producto resultante de los motores de combustión y es un potente carcinógeno.

• Hidroxilamina (HA): produce específicamente transiciones GC→AT.

Reparacion de daño al ADN• Reparación de apareamientos incorrectos: la reparación de apareamientos

incorrectos posterior a la replicación requiere la existencia de un sistema que sea capaz de realizar las siguientes operaciones:

• Reconocer las bases mal apareadas.• Determinar cual de las dos bases es la incorrecta.• Eliminar la base incorrecta y sintetizar.• Esta reparación la realizan los productos de los genes mutH, mutL, mutS y mutU.

Limitaciones de las mutaciones

• El efecto principal de la mutagénesis es originar mutaciones aleatorias en el organismo, la mayor parte de las cuales son negativas para su supervivencia, o empeoran algunas de sus características originales.

• los programas de mejora suelen ser muy largos y tediosos, y a menudo no dan los resultados deseados.

2.2.- INGENIERÍA GENÉTICA

•Surge en los años 70 (siglo XX) cuando se consigue introducir material genético de una especie en células de otra especie muy distinta.•Tecnicas:–Fusion de protoplastos–ADN recombinante (clonacion)

a.- Fusión de protoplastos

Fusión de protoplastos vegetales•Obtención de células de las dos especies que se van ha hibridar.•Aplicación de una enzima (celulasa ó pectinasa) la cual destruye la pared celular, quedando la célula desprotegida de esa membrana, tomando el nombre de protoplastos. •Se aplican pulsos eléctricos a células en suspensión (electroporación) o inducir la desorganización de las membranas empleando polietilenglicol.

Fusion…

•Luego ocurren las uniones de protoplastos y la mitosis de esas uniones celulares producen muchas células lo que origina un callo. •Con ayuda de auxina y citoquinina, se estimula el desarrollo radicular y foliar y forma una plantita híbrida.•Ejemplo. La hibridación entre el tomate y la papa. Papaya con naranja.

En el campo de la En el campo de la Ingeniería genéticaIngeniería genética consiste en aislar y multiplicar un gen, o en consiste en aislar y multiplicar un gen, o en general, un trozo de general, un trozo de ADNADN

En En Animales superiores Animales superiores consiste en obtener consiste en obtener un individuo a partir de una célula o de un un individuo a partir de una célula o de un núcleo de otro individuo núcleo de otro individuo

El proceso de clonación molecular persigue la propagación de una molécula de DNA de forma estable en un hospedero distinto a aquel del que procede, mediante su inserción en un replicón del hospedero elegido.

Digestión con enzimas de restricción

Ligación en un vector adecuado (plásmido)

Vector

Inserto

Introducción en el hospedador (E. coli)

Propagación por división celular

Las herramientas de la clonación

•Enzimas para la manipulación del DNA–Enzimas de restricción–Ligasas–Polimerasas–Kinasas y fosfatasas•Vectores de clonación.•a) un plásmido (fragmento extra de ADN bicatenario circular de unos 4,3 kb, que existe en algunas especies de bacterias).b) un cósmido (similar al plásmido pero de mayor longitud, unos 40 kb).c) un virus vector ( en este caso el ADN extraño que se quiere transferir se incorpora al ADN vírico y funciona como ADN recombinante).

Tecnología del ADN recombinante

Plásmidos

1

Plásmidos

2

Extremos cohesivos

Plásmido

3

Molécula de ADN recombinante

gen de resistencia a la ampicilina

Plásmido

Virus

2

1

3

Ciclo lisogénicoCiclo lisogénico

PCR

• La reacción en cadena de la polimerasa, PCR (Polymerase Chain Reaction), es una técnica de biología molecular desarrollada en 1986 por Kary Mullis, cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original, o molde.

• Esta técnica se fundamenta en la propiedad natural de las ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual emplea ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recién formadas entre sí tras cada fase de replicación y, a continuación, dejar que vuelvan a unirse a polimerasas para que vuelvan a duplicarlas.

Se basa en el proceso de replicación del ADN, para ello se utilizan unos oligonucleótidos que se han de diseñar como cebadores que inician la replicación "in vitro“.

Esta técnica tiene múltiples utilidades: realizar pruebas de paternidad o averiguar la autoría de un delito; realizar secuenciaciones de genomas (mucho más rápido que a partir de la clonación en células), etc.

PCR• Inicialmente la técnica era lenta, ya que las polimerasas se

desnaturalizaban al realizar los cambios de temperatura y era necesario agregar nuevas polimerasas en cada ciclo. (95 °C en las fases de desnaturalización del ADN)

• Hoy se emplean ADN polimerasas termoestables, extraídas de microorganismos adaptados a vivir a esas temperaturas.

• Dichos microorganismos son: Thermus aquaticus (polimerasa Taq), Pyrococcus furiosus (Pfu), Thermococcus litoralis (Vent) y Thermus termophilus (Tth).

• Hoy, todo el proceso de la PCR está automatizado mediante un aparato llamado termociclador, que permite calentar y enfriar los tubos de reacción para controlar la temperatura necesaria para cada etapa de la reacción.

Obtención de proteínas de interés médico, comercial, etc.(insulina, hormona del crecimiento, factores de

coagulación)

Obtención de vacunas recombinantes(aternativa al uso de organismos patógenos inactivos)

La levadura fabrica las proteínas víricas con poder inmunológico

Inyección de proteínas víricas en un chimpancé

plásmido bacteriano

Integración del plásmido híbrido en el núcleo de una célula de levaduraADN

Extracción del ADN del virus

Así, se ha conseguido obtener la vacuna de la hepatitis B mediante la tecnología

del ADN recombinante. El gen de la subunidad proteica del virus de la hepatitis

fue introducido en la bacteria Escherichia coli y en la levadura Saccharomyces

cerevisiae, las cuales produjeron en cultivo la proteína del virus.

Los anticuerpos sirven como defensa frente a enfermedades infecciosas y

sustancias extrañas, pero además son un medio de curación para aquellos

enfermos que no son capaces de producirlos.

La técnica de los anticuerpos monoclonales permite obtener gran cantidad

de ellos y sin impurezas; consiste en inmortalizar las células responsables de

su fabricación, las células plasmáticas que se forman por activación de los

linfocitos B. La forma de conseguirlo es hibridando células plasmáticas y células

tumorales con capacidad para multiplicarse indefinidamente (células de

mielomas), el resultado son células híbridas llamadas hibridomas que se pueden

clonar. Cada clon (procedente de un solo hibridoma) producirá un anticuerpo

monoclonal.

Las enfermedades genéticas debidas a un solo gen defectuoso ascienden a más de 4000, de las cuales 345 afectan al cromosoma X, por lo que serán transmitidas a los niños varones, si su madre posee uno de esos defectos genéticos. La terapia génica está siendo considerada la cuarta revolución de la medicina (después de las medidas de salud pública, la anestesia, y las vacunas y antibióticos). Para su aplicación se siguen dos estrategias:

a) Insertar una copia sana de un gen en las células del paciente con una enfermedad genética, para compensar el efecto del gen defectuoso ( esto se consiguió con una niña que tenía una inmunodeficiencia grave).

b) Introducir un gen especialmente diseñado para que proporcione una nueva característica a las células (por ejemplo, introducir en linfocitos un gen que produzca un inhibidor del virus del sida en pacientes afectados por el VIH).

La clonación en plantas se consigue sobre todo mediante la manipulación de cultivos celulares. La principal técnica empleada es la micropropagación o propagación vegetativa in vitro, la cual permite clonar en corto tiempo un gran número de especies. Este procedimiento se utiliza para la selección y producción de plantas en grandes cantidades, así como para la investigación en biología vegetal.

Se consigue mediante la obtención de unos fragmentos o explantes de la planta madre. Los explantes se colocan en un medio de cultivo adecuado y produce un callo (masa de células sin diferenciar); los callos pueden dividirse en multitud de fragmentos o incluso hacerse una suspensión de células. En el momento que se desee, se cambian las concentraciones de hormonas auxina y citoquinina, esto hace que se diferencien las células de los callos con lo que originarán plantas enteras. Se usa para hacer más rentables la producción de flores o de metabolitos secundarios (perfumes, pigmentos, etc.)

Se trata de disparar bolitas de oro que llevan fragmentos de ADN adheridos, con una especie de pistola, sobre una población de células. Las bolitas que queden en el citoplasma pueden transferir el ADN que transportan a algún cromosoma de la célula bombardeada.

Las aplicaciones agrícolas van desde el mejoramiento de procesos básicos como la fotosíntesis y la fijación de nitrógeno atmosférico por parte de las plantas, hasta la resistencia a herbicidas, agentes patógenos y factores de estrés (salinidad del suelo, sequía, etc.), así como la obtención de productos agrícolas de mejor calidad y características nuevas. Figura 6: Obtención de una planta transgénica por transformación biolística

Plantas transgénicas

tumores

célula vegetal

Proliferación de hormonas crecimiento. Se forman tumores en las zonas de la lesión

Plásmido Ti

núcleo

cromosoma

cromosoma

Agrobacterium

inductor de tumorescontiene oncogenes(genes onc)

Ingeniero genético natural tras sutitución de genes onc por genes de interés

Transgénesis= introducción de ADN extraño en un genoma, de modo que se mantenga estable de forma hereditaria y afecte a todas las células en los organismos multicelulares.

Agrobacterium tumefaciens es patógena de plantas.Produce tumores

•Resistencia a herbicidas, insectos y enfermedades microbianas El maíz transgénico de Novartis Resistente al herbicida y al gusano barrenador europeo (contiene el Gen de resistencia a la toxina Bt de Bacillus thuringiensis)

Problemas:Larvas de especies de insectos predadores benéficos (larvas verdes de crisopa) murieron cuando fueron alimentadas con el gusano barrenador europeo Gold rice de Monsanto con color amarillo por los altos niveles de vitamina A Sintesis de productos de interés comercial

La obtención de un gran numero de animales con cierta característica (producir mas leche, engordar rápidamente, producir lana azul, etc.) . Se usan para ello dos técnicas:a)la disgregación de células embrionarias a partir de un embrión, de modo que cada célula separada funciona como un zigoto y originará un animal.b)la transferencia nuclear; ésta consiste en obtener óvulos enucleados (se les ha extraído el núcleo por microsucción) y conseguir introducir un núcleo de una célula embrionaria o de una diferenciada (especializada), con esta última modalidad se obtuvo la famosa oveja Dolly. Cuanto más diferenciada esté una célula más difícil es conseguir su reprogramación para que funcione como un zigoto y origine un nuevo animal.

Clonación de animales (TRANSFERENCIA NUCLEAR DE CÉLULAS EMBRIONARIAS)

Aparato de microinyección

Clonación de animales (TRANSFERENCIA DEL NÚCLEO DE UNA CELULA SOMATICA: CÉLULA DIFERENCIADA)

Terneros clonados y manipulados genéticamente (fábrica de anticuerpos humanos)

genes para anticuerpos células dérmicas clonaciónhumanos recombinantes

Objetivo: Tratamiento de enfermedades inmunológicas

Futuro: Tratamiento de una amplia gama de enfermedades ocasionadas por bacterias y virus, como hepatitis, ántrax (utilizada como arma biológica)

Clonan terneros en EE UU para producir anticuerpos humanos

efe- Washington - agosto 2002 

Clonan cerdos destinados a trasplantar sus órganos a humanos

La empresa escocesa PPL Therapeutics logra retirar de los cerditos el gen que provoca el rechazo en transplantes a humanos "alfa 1,3 galactosil transferasa"

Enero 2002. AP Photo/Roanoke Times, Gene Dalton (IDEAL-EFE)

Paso importante en favor del xenotrasplante (transferencia de células u órganos de una especie a otra)

Ayudará a superar la escasez de órganos humanos para hacer trasplantes de todo tipo

Técnica de clonación

La posibilidad de clonar animales mamíferos, tanto a partir de células embrionarias como de células diferenciadas , abre la puerta para la clonación de humanos.

En 1993 un experimento de clonación humana hecho con embriones humanos que no podrían haber sobrevivido, pero que mediante la disgregación de sus células se obtuvieron 48 embriones clónicos (idénticos genéticamente) que fueron posteriormente destruidos.

Clonar personas enteras está prohibido en muchos países y condenado por muchas instituciones, pero clonar tejidos humanos con fines terapéuticos es pedido por multitud de científicos, sobre todo desde que se puede dirigir la diferenciación de células madre hacia la obtención de tejidos concretos.

Para obtener a Dolly: 277 fusiones de ovocitos con células mamarias, solo 29 embriones fueron aptos. De estos solo uno resultó un éxito

La clonación humana ya se esté intentando de forma clandestina por varios laboratorios en el mundo

La clonación reproductiva no arroja los resultados suficientes, no existen garantías como para decir 'Vamos a clonar un ser humano'

Por cada intento de clonación hay detrás miles de fallos, abortos y malformaciones genéticas

Declaración Universal de Derecho Humanos y Genoma Humano de la UNESCO (1997), adoptada en 1998 por la Asamblea General de ONU (busca un balance entre una continuación en las investigaciones y la salvaguarda de los derechos humanos)

Frente a los múltiples beneficios de la ingeniería genética pueden surgir algunos problemas

Problemas sanitarios nuevos microorganismos patógenos, efectos secundarios de nuevos fármacos de diseño, etc...

Problemas ecológicos desaparición de especies con consecuencias desconocidas, nuevas contaminaciones debidas a un metabolismo incontrolado, etc...

Problemas sociales y políticos en el campo de la producción industrial, agrícola y ganadera, pueden crear diferencias aún más grandes entre países ricos y pobres. El sondeo génico en personas puede llevar a consecuencias nefastas en la contratación laboral, por ejemplo, y atenta contra la intimidad a que tiene derecho toda persona (empleo, agencias de seguros, discriminación..).

Problemas éticos y morales Poder conocer y modificar el patrimonio genético humano puede ser una puerta abierta al eugenismo "Eugenesia: la ciencia del incremento de la felicidad humana a través del perfeccionamiento de las características hereditarias".