biotecnología avanzada - ingeniería de proteínas
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Ingeniería de proteínas
L.B.G. José Eduardo Almeyda CarbajalAsesor en el desarrollo de nuevos productos. CEMEX-México
17 de mayo de 2014
¿De qué estamos hablando?
Producto Producción Anual
(Tons)
Producto Producción Anual
(Tons)Bioetanol 26,000,00 L-Hydroxifenilalanina 10,000
Ácido L-Glutámico 1,000,000 Ácido 6-
aminofocelanico
7000
Ácido cítrico 1,000,000 Nicotinamida 3000
L-Lisina 350,000 D-p-hidroxifenilglicina 3000
Ácido láctico 250,000 Ácido 7-
aminocefalosporinico
1000
Enzimas de
procesamiento de
alimentos
100,000 Aspartame 600
Ácido glucónico 50,000 L-metioninca 200
Antibióticos 35,000 Dextran 200
Enzimas para
alimentación animal
20,000 Vitamina B12 12
L-Treonina 10,000 Provitaina D2 5
Producto Mercado
(Millones US$)Eritropoyetina 6803
Insulina 4017
Factores de coagulación sanguínea 2585
Factor estimulador de colonias 2181
Interferon b 2087
Interferon a 1832
Anticuerpos monoclonales (Cáncer) 1751
Hormona de crecimiento 1706
Antircuerpo monoclonal 1152
Activador de plasminógeno 642
Interleucina 184
Factor de crecimiento 115
Vacunas 50
Otros 2006
Ingeniería de proteínas
La ingeniería de proteínas, como un sub-disciplina de laingeniería genética, consiste en el diseño de nuevasproteínas o en la generación de proteínas con funcionesnuevas o deseadas.
Solvente Proteínamágica
Mezcla mágica
Exceso deproteínamágica
Lindo, muy lindo ¿Cómo se hace?
Diseño racional
Diseño No Racional
(Evolución Molecular Dirigida)
Diseño de proteínas dirigido por datos o información
Diseño racional
Resonancia Magnética Nuclear Difracción de rayos X
La visualización de determinados dominios o estructuras en las proteínas nos permitedeterminar cuales podrían convertirse en sustituciones candidatas a ser realizadas en lamisma, además del posible efecto sobre la característica a modificar en nuestra proteína.
Microscopía electrónica
Variante: Proteína de novo
Algunas estructuras de usocomún en esta estrategiaincluyen el uso de los motivoscomo “Ramillete de cuatrohélices a” (Generación decanales de protones), “Hélice-bucle-hélice” (reducción detamaño del dominio de uniónde inmunoglobulina G) y dedode zinc.
Método racional: Casos de la vida real
Proteína nativa Modificación MotivoIsomerasa de triosafosfato Mutación puntual de ácido
glutámico a glutamina
Termoestabilidad de 37oC a
26oC
Fitasa con estructura de
hélice de Bacillus sp. MD2
Mutaciones punctuales
E229V y S283R)
Incremento de actividad
específica
Proteína de unión a
ribosoma
Rediseño completo Cambio de actividad
(Isomerasa de triosafosfato)
- Usos de péptidos
helicoidales
Proteínas diiron
El problema con el diseño racional es su dificultad de
aplicación si se carece de la estructura tridimensional dela proteína.
Diseño NO racional
Simula el proceso Darwiniano deevolución, mediante lacombinación de mutagénesis alazar y/o técnicas derecombinación de DNA contécnicas de screening o selecciónde variantes de proteínas quehayan incorporado laspropiedades deseadas
Pasos no racionales
1„ Introducción de mutaciones en la
secuencia
2„ Screening y selección de variantes
identificadas con el fenotipo necesario.
3
„ Recombinación entre variantesseleccionadas para producir nuevascombinaciones
Recomendaciones del tío Darwin
Función físicamente posible
La función debe ser biológica o evolutivamente factible.
Debe ser posible construir librerías de mutantes lo suficientemente complejas
Método rápido para el screening o selección de las proteínas
Darwin’s ways
Método Descripción Mutagénesis por
saturación
Un aminoácido en determinada posición de una proteína es
cambiado por cada uno de los aminoácidos naturales a fin de
encontrar cual de ellos otorga propiedades de interés a la proteína
analizada.
Mutagénesis aleatoria
localizada o de región
específica”
Representaría una combinación entre las estrategias Racional y no
Racional, en el que los cambios aleatorios se realizan en regiones
específicas de una proteína.
DNA shuffling Un grupo de genes con un DNA de doble cadena o secuencias
similares son obtenidos por varios organismos o producidos por la
técnica de PCR propenso a error
Duplicación de genes Se vale de los mecanismos de divergencia naturales que se ejercen
sobre aquellos duplicados bajo una presión selectiva más laxa
Aplicaciones (Si, otra tabla)
Objetivo Enzima Resultado Método Referencia
Enantioselectividad Epóxido
hidrolasa
Incrementada 13
veces
epPCR; DNA
shuffling
van Loo et al.
(2004)
Incremento en la
promiscuidad de la
actividad
Anhidrasa
carbónica
Incrementada 4
veces con 2-naftil
acetato
Mutagénesis-
Recombinación
Gloud & Tawfik
(2005)
Eficiencia catalítica N-
acetiltransferasa
de glifosato
Incrementada
10,000 veces
11 rondas de DNA
shuffling
Castle et al. (2004)
Termoestabilidad Xilanasa Tm incrementada
35oC
Mutación por
saturación de sitio
Palackal et al.
(2004)
Estabilidad en
solventes orgánicos
Subtilisina E Incrementada 170
veces en 60% de
dimetilformamida
Error-prone
PCR+Screening
Chen & Arnold
(1993)
Resistencia contra
cetotaxima
b-lactamasa Incrementada
32,000 veces
DNA shuffling Stemmer (1994)
Diseño guiado por datos o información
Utiliza secuencias aminoacídicas de las bases de datos ybusca coincidencias entre las proteínas de una mismafamilia u homólogas, donde, se afirma que el aminoácidoen la secuencia original debe ser mutado al aminoácidocompartido por la mayoría de las secuencias homólogas
Vamos a mezclar a ver que sale
Concepto consenso guiado por estructura
Diseño Racional
Diseño de proteínas dirigido por datos o
información
Formula mágica
Determinacióndeaminoácidosdel sitio deinterés amodificar
Búsqueda desecuenciasde proteínascon eldominio deinterés enbases dedatos
Construcciónde matricesdefrecuenciasde losaminoácidos del sitio deinterés
Introducciónde lasmodificacionesmediante eluso de lastécnicas delDiseñoRacional
No más “tablas”
„ Glucosa deshidrogenasa„ Fitasas procedentes del género
Aspergillus y BacillusTermoestabilidad
„ Fitasas del tipo ácidas de histidinade hongos o de fitasas con estructura de hélice de bacterias
Actividad de enzima
„ Cambio en la dependencia de NAD a NADP de lactato deshidrogenasa
Cambio de cofactor
Base de Datos de Proteínas o PDB
Depósito de información de la estructura tridimensionalde macromoléculas biológicas obtenida de maneraexperimental (Resonancia Magnética Nuclear,Microscopio electrónico y Rayos X).
Archivo PDB
RCSB-PDB
MSD-EBI PDBj BMRB
Adivinen qué… UNA TABLA
Método
experimental
Proteínas Ácidos
nucléicos
Complejos
ácidos
nucléicos
proteínas
Otros Total
Difracción de
rayos X
82537 1517 4296 4 88354
NMR 9139 1078 206 7 10430
Microscopía
electrónica
523 52 173 0 748
Híbrido 59 3 2 1 65
Otro 155 4 6 13 178
Total 92413 2654 4683 25 99775
Sandra digo, BRENDA
BRaunschweig ENzyme DAtabase” o BRENDA consiste enuna base de datos se ofrece una visión representativa de lascaracterísticas y variabilidad de cada enzima, a partir de lacual el usuario puede referirse a la literatura original para unestudio más detallado
Pfam: Su familia
Amplia colección de familias de proteínas
(14831 familias de proteínas hasta marzo del
2013).
Componentes
Pfam A
Pfam B
BioEdit
Consiste en una herramienta para el análisis,alineamiento, edición y manipulación de secuenciasde aminoácidos y nucleótidos
Visualización de códigos de colores
Generación e impresión de
cromatogramas
Generación de dibujos de plásmidos
Agrupación de secuencias
Vsualización rudimentaria de
arboles filogenéticos
Construcción de secuencias consenso integradas
Swiss-PDB-Viewer
Herramienta de visualización y análisis de laestructura de proteínas y ácidos nucléicos.
Aún no es todo automático
Asignación de los residuos catalíticos.
Interacción de subunidade
Datos insufientes
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