bioquimica metabolismo glucolisis

Bioquímica

Universidad de Guadalajara

Bioquímica Médica Dr. Roberto Carlos Rosales Gómez

Centro Universitario de Tonalá

Metabolismo energético

Es el proceso global a través del cual los sistemas vivientes adquieren y

utilizan la energía libre para llevar a cabo sus diversas funciones.

Glucólisis

glykus, Dulce + lysis, liberación Vía de Embden-Meyerhof-Parnas

Video 1

La glucolisis es una secuencia de 10 reacciones enzimática en la que una

molécula de glucosa se convierte en dos moléculas de piruvato, un compuesto de 3

átomos de carbono, con la generación simultanea de 2 ATP

La glucólisis tiene un papel fundamental en el metabolismo energético dado que proporciona una parte significativa de la energía libre que la mayoría de los organismos utiliza, y prepara la glucosa y otros compuestos para su degradación oxidativa posterior.

De este modo es adecuado comenzar nuestro estudio sobre las vías metabólicas específicas

considerando la glucolisis

Aspectos Generales

Las enzimas de la glucólisis se localizan en el citosol y se encuentran eventualmente

asociadas en forma laxa entre sí o con otras estructuras celulares

La glucólisis convierte la glucosa en 2 Unidades de

piruvato. La energía libre que se libera en este proceso se recupera para la

síntesis de ATP a partir de ADP y Pi. De este modo la glucólisis es una vía

de reacciones de fosforilación acopladas químicamente.

Puede considerarse que la glucólisis se presenta en dos Etapas :

Video 2

≈Etapa I: Inversión de energía. O

Preparatoria o de gasto de energía

En esta etapa preparatoria la Hexosa glucosa es fosforilada.

Y luego experimenta una ruptura para producir 2 moléculas de la triosa

gliceraldehído-3-fosfato. Este proceso consume 2 ATP

≈Etapa II: Recuperación de energía.

Las dos moléculas se convierten en piruvato con la generación simultánea de cuatro ATP, por lo tanto, la glucólisis tiene una ganancia neta de 2 ATP

La etapa II produce cuatro ATP

Glucosa+2NAD+ + 2 ADP + 2 Pi 2 Piruvato + 2 NADH + 2 ATP + 2

H2O + 4 H+ Las transformaciones enzimáticas

subsecuentes convierten estos productos de baja energía en compuestos con altos potenciales de transferencia de grupos fosforilos capaces de fosforilar el ADP

para formar ATP El NADH que se forma en este proceso debe reoxidarse continuamente para

mantener el suministro del principal agente oxidante de la vía, el NAD+

Las Reacciones de la Glucólisis

La glucólisis está comprendida en una secuencia de 10 reacciones

enzimáticas.

1.- Hexocinasa :consumo del primer ATP

Es la transferencia de un grupo fosforilo de ATP a la glucosa para

formar glucosa-6-fosfato (G6P) en una reacción catalizada por la hexocinasa

Una cinasa es una enzima que transfiere grupos fosforilos entre el ATP

y un metabolito. Las hexocinsa es una enzima ubicua,

relativamente no especifica, que cataliza la fosforilacion de hexosas.

El segundo sustrato de le hexocinasa, es un complejo Mg 2+ -ATP.

El ATP que no forma el complejo es un inhibidor competitivo potente de la hexocinasa.

El Mg 2+ es esencial para la actividad de la cinasa, escuda las cargas negativas de los átomos de oxigeno del fosfato α y β o β y γ del ATP, y hace que átomo de fosforo γ sea más accesible para el ataque nucleófilo del grupo C6-OH de la glucosa

El complejo hexosa- hexocinasa de levadura indica que la glucosa induce un gran cambio conformacional de la hexocinasa. Este movimiento ubica el ATP muy próximo al grupo –C6H2OH de la glucosa y excluye el agua del sitio

activo (efectos de catálisis por proximidad)

En la hexocinasa el cambio conformacional inducido por el sustrato

es el responsable de la especificidad de la enzima. Además la polaridad del sitio activo se reduce por la exclusión

del agua y por lo tanto acelera el proceso de la reacción nucleófila

Video Paso 1

2.- Fosfoglucosa Isomerasa

Es la conversión de G6P a Fructosa-6-fosfato (F6P) catalizada por la fosfoglucosa isomerasa (PGI) (esto es, la isomerización de una aldosa a una cetosa)

La reacción requiere la apertura del anillo seguido de la isomerización y el

subsecuente cierre del anillo.

Un mecanismo de acción enzimática propuesto por la reacción de la

fosfoglucosa isomerasa (PGI) involucra la catálisis acido-base general

Paso 1: la unión del sustrato

Paso 2: la apertura del anillo catalizada por un grupo acido de la enzima, probablemente el grupo  ε amino de un residuo conservado de Lys.

Paso 3: la sustracción del protón acídico del C2 por una base, presumiblemente un residuo conservado de His, para formar un intermediario cis-enediolato (este protón es acidico porque es α respecto de un grupo carbonilo)

Paso 4: el protón del C1 se remplaza en una reacción global de transferencia de protones. Estos últimos sustraídos por las bases se intercambian rápidamente con los protones del solvente. Paso 5: el cierre del anillo para formar el producto que es subsecuentemente liberado para liberar la enzima libre; y de este modo, completar el ciclo catalítico

Video Paso 2

3.- Fosfofructocinasa consumo del segundo ATP

la fosfofructocinasa (PFK) fosforila la fructosa-6-fosfato (F6P) para generar fructosa-1,6-

bisfosfato (FBP o F1,6P) .

El producto es un bisfosfato en vez de un difosfato, porque sus dos grupos fosfatos no están unidos directamente uno con el

otro

La reacción de la de Fosfofructocinasa (PFK) es similar a la de hexocinasa.

La enzima cataliza el ataque nucleófilo del grupo C1-OH de la Fructosa-6-

Fosfato (F6P) sobre el átomo de fosforo γ electrofílico del complejo Mg 2+ –ATP

La fosfofructocinasa (PFK) desempeña un papel central en el control de la

glucólisis porque cataliza una de las reacciones determinantes de la

velocidad de la vía

Video Paso 3

4.- Aldolasa

Es la ruptura de la Fructosa-1,6-bisfosfato (FBP) para formar 3 triosas,

gliceraldehído-3-fosfato (GAP) y dihidroxiacetona fosfato (DHAP)

En el punto de la vía el sistema de numeración de los átomos cambia. Los átomos 1,2,3 de la

glucosa se convierten en 3,2,1 de la

dihidroxiacetona fosfato (DHAP) y así se revierte el

orden. Los átomos 4,5,6 se convierten en los

átomos 1,2,3 del gliceraldehído-3-fosfato

(GAP)

Esta reacción es una ruptura aldólica cuyo mecanismo no enzimático

catalizado por una base

El intermediario Enolato está estabilizado por resonancia como resultado de la

capacidad de sustraer electrones de la toma de oxigeno del carbonilo.

La ruptura aldólica de la Fructosa-6-fosfato (F6P) generaría productos de un largo de

cadena de carbonos desigual, mientras que la ruptura aldólica de la la Fructosa-1,6-

bisfosfato (FBP) genera dos compuestos de C3 interconvertibles que pueden por lo tanto

ingresar en una vía común de degradación.

La ruptura aldólica esta catalizada por la estabilización de su intermediario Enolato por medio del aumento de la

deslocalización de los electrones.

Paso 1: la unión del sustrato

Paso 2: la reacción del grupo carbonilo de la Fructosa-1,6-bisfosfato (FBP) con el grupo  ε amino de la Lys del sitio activo para formar un catión iminio; esto es, una base de schiff protonada

Paso 3: la ruptura del enlace C3-C4 que resulta en la formación de una enamina y la liberación de gliceraldehído-3-fosfato (GAP). El ion iminio es un grupo con mejor capacidad de sustraer electrones que el átomo de oxigeno del grupo carbonilo del precursor

La catálisis se produce porque el intermediario enamina es más estable

que el intermediario enolato correspondiente a la reacción de la ruptura aldólica catalizada por una

base

Paso 4: la protonación de la enamina para generar un catión iminio

Paso 5: la hidrólisis de este catión iminio para liberar dihidroxiacetona fosfato (DHAP) con la regeneración de la enzima libre

Video paso 4

5.-Triosa Fosfato Isomerasa

La triosa Fosfato Isomerasa (TIM) cataliza este proceso en la reacción 5 de la

glucolisis le reacción final de la etapa 1:

La evidencia que sustenta este esquema de reacción surge de los análogos del estado de transición

fosofoglucohidroxamato y 2-fosfoglicolato, compuestos estables que las estructuras geométricas se asemejan a las propuestas de los

intermediarios enediol y enediolato

Las enzimas catalizan las reacciones por medio de la unión al complejo del estado de transición mas fuertemente

que al sustrato y de hecho el fosfoglucohidroxamato y el Z-

fosfoglicolato se unen 155 y 100 veces con más firmeza a la triosa Fosfato

Isomerasa (TIM) que el gliceraldehído-3-fosfato (GAP) y la dihidroxiacetona fosfato

(DHAP)

El Glu 165 y la His 95 funcionan como un ácido y una base generales.

Las consideraciones referentes al mecanismo sugieren que la conversión del gliceraldehído-3-fosfato (GAP) en el intermediario enediol está catalizada por una base general que sustrae un protón del C2 del gliceraldehído-3-

fosfato (GAP) , y por un ácido general que protón el átomo de oxígeno de su

carbonilo.

Inventario de la glucólisis hasta este momento.

En este punto de la glucólisis, unamolécula de glucosa se transformó en

dos moléculas de gliceraldehído-3-fosfato (GAP). Esto completa la primera

etapa de la glucólisis

Nótese que se consumieron dos moléculas

de ATP para generar los intermediarios fosforilados. Esta inversión de energía

aún no se saldó, pero con un poco de arte químico el

gliceraldehído-3-fosfato (GAP) de “baja energía” puede

convenirse en Compuestos de “alta energía” cuyas

energías libres de hidrólisis pueden acoplarse a la síntesis de ATP en una segunda etapa de la

glucólisis. Una hexosa es fosofrilada, isomerizada, nuevamente fosforilada, y luego escindida en dos triosas fosfato

interconvertibles.. En este proceso se consumen 2 ATP

6.-Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa: formación del primer intermediario de “alta energía"

 La reacción 6 de la glucólisis es la

oxidación y la fosforilación del gliceraldehído-3-fosfato (GAP) porel NAD+ y el Pi, catalizada por la enzima gliceraldehído-3-fosfato

deshidrogenasa (GAPDH);

En esta reacción la oxidación delaldehído, una

reacción exergónica, conduce la síntesis del acil fosfato de “alta energía" 1,3-bisfosfoglicerato

(1,3-BPG).

Estudios sobre el mecanismo de la reacción:

varios experimentos enzimáticosclave contribuyeron a la dilucidación

del mecanismo de reacción de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH);

1. La gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH); se inactiva mediante alquilación con

cantidades estequiométricas de yodoacetato. La presencia de carboximetilcisteína en el hidrolizado de la enzima alquilada resultante

sugiere que la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH); tiene un grupo

sulfhidrilo de una Cys en el sirio activo.

La reacción del yodoacetato con un residuo Cys del sitio activo

2. La GAPDH transfiere cuantitativamente 3H desde el Cl del gliceraldehído-3-fosfato (GAP) al NAD+por lo tanto, se demuestra que esta

reacción se produce pormedio de la transferencia directa de un

hidruro.

Transferencia cuantitativa del tritio desde el sustrato hasta el NAD+

3. La gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH); cataliza el intercambio de 32P entre Pi y

el producto análogo acetil fosfato. Estas reacciones de intercambio del isótopo indican la presencia de un intermediario acilenzima; o

sea, el grupo acilo forma un complejo covalente con la enzima similar al

intermediario aciI-enzima en el mecanismo de reacción de la serino proteasa.

El intercambio de 32P desde el fosfsto hasta el acetil fosfato catalizado por la enzima

David Trentham propuso un mecanismo para la GAPDH basado en

esta información y los resultados de los estudios cinéticos:

Paso 1 E1 GAP se une a la enzima.Paso 2 El grupo sulfliidrilo esencial, que actúa como un nucleófilo, ataca el aldehído para formar un tiohemiacetal.Paso 3 El tioherniacetal experimenta una oxidación a un acil tioéster por medio de la transferencia directa de un hidruro al NAD+. Este intermediario que se aisló tiene una alta energía libre de hidrólisis. Por consiguiente. La energía de la oxidación del aldehído no se disipa’, sino que se conservó por medio de la síntesis del tioéster y la reducción del NAD+ a NADH.Paso 4 El Pi se une al complejo enzima—tioéster—NADH. Paso 5 El intermediario tioéster experimenta un ataque nucleófilo por el Pi para formar el anhídrido mixto de “alta energía” 1,3-BPG, que luego se disocia de la enzima seguido del reemplazo del NADH por otra molécula de NAD+ para regenerar la enzima.

1. El GAP se une a la enzima

2. El grupo sulfhidrilo del sitio activo forma un tiohemiacetal con el sustrato

3. El NAD+ oxida el tiohemiacetal a un tioester

4. El Pi se une a la enzima y

5. Ataca al tioester, formado por el producto acil fosfato, 1,3-BPG, Que se disocia de la enzima seguido por el remplazo del NADH recientemente formado por un NAD, y regenera por consiguiente la enzima activa.

Video Paso 5

7.-Fosfogiicerato cinasa: producción del primer ATP

La reacción 7 de la vía glucolítica produce ATP junto

con 3-fosfoglicerat0 (3PG) en una reacción catalizada por la

enzima fosfoglicerato cinasa (PGK)

Nótese que esta enzima se llama “cinasa” porque la

reacción inversa es la transferencia del grupo fosforilo

desde el ATP hasta el 3-fosfoglicerato (3PG)

La fosfoglicerato cinasa (PGK) tiene una apariencia bilobulada notoria.

El sitio de unión al Mg 2+ -ADP se encuentra ubicado sobre un dominio a —10 Á de distancia desde el sitio de unión al l,3-BPG que se ubica en el otro dominio.

Las mediciones físicas sugieren que al unir el sustrato los dos dominios de la fosfoglicerato cinasa (PGK) giran juntos para permitir que el sustrato reaccione en un

ambiente libre de agua como se produce con la heXocinasa.

De hecho, la apariencia de la fosfoglicerato cinasa (PGK)

es notablemente similar a la de la hexocinasa, aun a pesar de que las estructuras de estas dos proteínas

no están relacionadas.

Acoplamiento entre las reacciones de la GAPDH y fosfoglicerato cinasa (PGK) .

Una reacción ligeramente desfavorable puede acoplarse a una altamente favorable de modo que

la acción conjunta de ambas reacciones se produzca en la dirección de progresión. En el caso de las reacciones sexta y séptima de la glucólisis,

el 1,3-BPG es el intermediario común cuyoconsumo en la reacción de la fosfoglicerato cinasa

(PGK) “jala” de la reacción de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) hacia su progresión.

Los requerimientos energéticas del par de reacciones enforma global son

A pesar de que la reacción de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) es endergónica,

la naturaleza fuertemente exergónica de la transferencia de un grupo fosforilo desde el

1,3-bisfosfoglicerato  (1,3-BPG)hasta el adenosín difosfato (ADP) hace

favorable la síntesis global de NADH y el ATP a partir de gliceraldehído-3-fosfato (GAP), Pi, NAD+

y ADP.

Esta producción de ATP, que no involucra al O2, es un ejempla

defosforilación a nivel de sustrato. La oxidación subsecuente del NADH

producido en esta reacción por el O2 genera ATP adicional por medio de la

fosforilación oxidativa.

Video Paso 6

8.- Fosfoglicerato mutasa

En la reacción 8 de la glucólisis el 3-fosfoglicerato (3PG) se convierte en 2-fosfoglicerato (2PG) por medio de la enzima fosfoglicerato mutasa (PGM):

Una mutasa cataliza la transferencia de un grupo funcional desde una posición hacia otra

en una molécula. Esta reacción casi energéticamente neutra es necesaria para la

preparación de la próxima reacción de la glucólisis que produce

un compuesto fosforilo de “alta energía”.

Mecanismo de reacción de la fosfoglicerato mutasa.

A primera vista la reacción catalizada por la fosfoglicerato mutasa parece ser una simple transferencia intramolecular

del grupo fosforilo. Sin embargo, este no es el caso. La enzima

activa tiene un grupo fosforilo en su sitio activo, unido a la His 8.

El grupo fosforilo se transfiere al Sustrato para formar un bisfosfo intermediario.

Luego, este intermediario fosforila nuevamente a la enzima para formar el producto y regenerar la fosfoenzima activa. En la estructura determinada por difracción de rayos X de la

enzima se muestra la proximidad de la His 8 al sus-Trato.

El proceso catalítico de la fosfoglicerato mutasa se produce de la manera siguiente:Paso l El 3-fosfoglicerato (3PG) se une a la fosfoenzima en la que la His 8 está fosforilada.Paso 2 El grupo fosforilo de la enzima se transfiere al sustrato lo que resulta en un complejo intermediario 2,3-bisfosfoglicerato-enzima.Paso 3 y 4 El complejo se descompone para formar el producto 2-fosfoglicerato (2PG) y regenerar la fosfoenzima.

Mecanismo de reacción propuesto para la

fosfoglicerato mutasa .La forma activa de la

enzima contiene residuo fosfo-His en el sitio activo.

1. Formación del complejo 2. Transferencia del

sustrato de un grupo fosforilo unido a la enzima

3. Refosforilacion de la enzima por el otro grupo fosforilo del sustrato

4. Liberación del producto, que regenera la fosfoenzima activa

9. Enolasa: formación del segundo intermediario de “alta energía"

En la reacción 9 de la glucólisis, el 2-fosfoglicerato (2PG) se deshidrata a

fosfoenolpiruvato (PEP) en una reacción catalizada por la enolasa:

La enzima forma un complejo con un catión divalente como el Mg 2+ antes de

que se una el sustrato, El ión fluoruro inhibe la glucólisis por medio del bloqueo de la actividad de la enolasa (el F fue uno de los inhibidores metabólicos que se utilizó para

la dilucidación de la vía glucolítica). En presencia de Pi, el F bloquea la unión del sustrato a la enolasa por medio de la formación de un complejo con el

Mg2+ unido en el sitio activo de la enzima. Por consiguiente, el sustrato de la enolasa, el 2-fosfoglicerato (2PG) , se acumula, y mediante la acción de la fosfoglicerato

mutasa (PGM): el 3-fosfoglicerato (3PG) también.

 10.-Piruvato cinasa:

producción del segundo ATP

En la reacción 10 de la glucólisis, su reacción final, la piruvato cinasa (PK)acopla la energía libre de la hidrólisis

del PEP a la síntesis del ATP para formar

Piruvato.

Oscar RomoLuis Sedano