bio034 201210 clase 13 cromosomas, regulacion de la expresion genica y tecnologia del dna

Sitios de unión de RNA en el ribosoma

Aminoacil-tRNA

Peptidil-tRNA

Salida (Exit)

Lugar de uniónal RNAm

Subunidadribosomal

grande

Subunidadribosomalpequeña

La subunidad pequeña une el tRNA al codón correspondiente en el mRNA y la subunidad grande cataliza la formación de los enlaces peptídicos. Ambas

subunidades se unen en el mRNA y se separan cuando se termina de sintetizar la proteína.

Inicio de la traducción

Subunidad pequeña del ribosoma con factores de iniciación unidos (no mostrados)

Unión al RNAm (reconocimeinto de CAP 5’)

El RNAt de iniciación se desplaza a lo largo del RNAm buscando el primer AUG

tRNA de iniciación

Los factores de iniciación se disocian y se une la subunidad ribosomal grande

Unión del aminoacil-tRNA al

sitio A (paso 1)Formación del primer enlace peptídico (paso 2)

Los codones del mRNA (codón de inicio y codones de término) indican dónde comenzar y dónde finalizar la traducción

El tRNA de inicio lleva metionina y es diferente al que normalmente une metionina. Es el único tRNA que se une al ribosoma en el sitio P

Traducción de un mRNA

1. Unión de un nuevo aminoacil-tRNA en el sitio A

2. Formación de un nuevo enlace peptídico (peptidil transferasa)

3. La subunidad grande avanza quedando el tRNA vacío en el sitio E y el péptido en el sitio P

4. La subunidad pequeña avanza, el sitio A queda vacío y el tRNA vacío sale

El ciclo vuelve a comenzar con la unión de un nuevo tRNA al sitio A

La traducción ocurre de 5’ a 3’ y la proteína se sintetiza desde el extremo amino al carboxilo terminal

Término de la traducción

Término

Unión de un factor de liberación al sitio A

Codones de término UAA, UAG o UGA señalan el fin de la síntesis proteica. A ellos se une un factor de liberación (sitio A).

Finalmente el polipéptido terminado es liberado y las dos subunidades del ribosoma se disocian

RNA procarionte es policistrónico

En bacterias un mRNA puede codificar varias proteínas (policistrónico)

La unión del ribosoma al mRNA se produce en secuencias específicas que señalan los sitios de unión al ribosoma y se encuentran antes del

codón de inicio AUG

Polirribosomas en procariontes y eucariontes

Una molécula de mRNA es traducida simultáneamente por varios ribosomas

Síntesis de una proteína eucarionte

Degradación de proteínas regulada en el citosol de los eucariontes

El proteosoma es un complejo de enzimas proteolíticas. Al interior del cilindro las proteasas presentan los sitios activos

Proteínas mal plegadas, con aa oxidados o alterados, proteínas de vida media corta son degradadas por este sistema

La proteína que vaa ser degradada es marcada

covalentemente con ubiquitina

La maquinaria importadora reconoce

ubiquitina

Cromosomas y regulación de la expresión génica

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICASDEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

BIO034

Dra. Ximena Ortega A.Dr. Enrique Vinés V.

Estructura del núcleo

Retículo endoplásmico

Heterocromatinaperiférica

EucromatinaRNA y proteínas

Nucleolo

Centrosoma

Microtúbulos

Lámina nuclear

Membrana externaMembrana interna

Envolturanuclear

Poro nuclear

Nucleoplasma

En el núcleo el DNA se distribuye en diferentes cromosomas

Cromosomas humanos

Las células humanas poseen dos copias de cada cromosoma, uno heredado del padre y otro de la madre. Este par de cromosomas se llaman cromosomas homólogos. La disposición ordenada de los cromosomas se

llama cariotipo

Cromosomashomólogos

Cromosomas humanos

La posición del centrómero y el tamaño varían en los diferentes cromosomas

Colorantes que se unen a regiones ricas en AT (colorante de Giemsa) producen bandas oscuras que permiten distinguir los 23 pares de cromosomas

El estado de condensación de los cromosomas varía durante el ciclo celular

Interfase Fase M Interfase

Tres elementos de secuencias de DNA básicas para la replicación y repartición

Aseguran que la replicación ocurra en forma eficiente

Telomerasa

Los telómeros son secuencias nucleotídicas repetidas que permiten la replicación de los extremos de los cromosomas y dan protección contra degradación por acción de nucleasas. Son agregados por la telomerasa

La telomerasa agrega los telómeros usando un templado de RNA que ella posee

Regulación génica

La diferenciación celular es producto de la regulación de la expresión génica

Las diferentes células de un organismo tienen el mismo DNA, sin embargo no expresan de igual forma sus genes y

tienen diferentes proteínas

Neurotransmisores Anticuerpos Hemoglobina

La diferenciación es producto de la regulación en la expresión de los genes

La información contenida en el núcleo de una célula diferenciada posee todas las instrucciones para controlar la expresión génica

La transcripción de un gen generalmente ocurre sólo en el tipo celular en el cual se expresa, por lo tanto

células diferentes tienen proteínas diferentes

Hígado

Riñón

Cerebro

RNA Proteínas

La expresión de un gen depende del tipo celular, medio ambiente, edad y señales extracelulares

Las células no difieren entre si porque tengan distintos genes, sino porque los expresan de distinta forma

Puntos de control de la expresión génica

Control de la síntesis proteica

1. Regulando el momento y la frecuencia de la transcripción de genes concretos (control transcripcional)

2. Controlando el modo de maduración o procesamiento de los transcritos primarios de RNA (control del procesamiento de RNA)

3. Seleccionando los mRNA maduros que van a ser exportados al citoplasma (control del transporte de RNA)

4. Seleccionando los mRNA citoplasmáticos que van a ser traducidos por ribosomas (control traduccional)

5. Desestabilizando selectivamente algunas moléculas de mRNA citoplasmático (control de la degradación de los mRNA)

6. Activando, inactivando o ubicando de modo selectivo las proteínas ya sintetizadas (control de actividad proteica)

La transcripción se controla con proteínas reguladoras que se unen al DNA en secuencias regulatorias

Las regiones regulatorias se encuentran en cada gen y son el lugar donde se unen las proteínas reguladoras tanto en procariontes como en eucariontes.

Pueden ser cortas (unos 10 nucleotidos) o muy largas (10.000 nucleotidos).

Diferentes proteínas reguladoras reconocen y se unen a diferentes secuencias de DNA.

Las proteínas reguladoras se unen al DNA en pares (dímeros) a través de estructuras específicas dentro de cada proteína llamadas motivos de unión al DNA

Interacción proteína - DNA

La proteína establece interacciones como puentes de hidrógeno, enlaces iónicos e interacciones hidrofóbicas con las bases del DNA

en el surco mayor (sin desenrollarlo)

Surcomenor

Surcomayor

Ejemplo de algunos motivos de unión al DNA presentes en proteínas reguladoras eucariontes

Homeodominio

Dedos de Zinc Cremallera o cierrede Leucina

Hélice-vuelta-hélice

Control Transcripcional en procariontesLas secuencias reguladoras son reconocidas por proteínas reguladoras

y están involucradas en la activación e inactivación de un gen

promotor

operadormolécula

de RNAm

Cromosoma de E. coli

Enzimas para la biosíntesis de triptofano

En procariontes

-El promotor es el lugar donde se une la RNA polimerasa

-El operador es el lugar donde se unen las proteínas reguladoras que pueden ser activadoras o represoras

-Proteínas represoras impiden el inicio de la transcripción

-Proteínas activadoras ayudan a la unión de la RNA polimerasa y promueven la transcripción

Los genes que se transcriben en un mismo RNAm constituyen un operón

Los operones represibles son habitualmente expresados (expresión constitutiva), pero cuando no son necesarios,

son reprimidos

En ausencia de triptofano el represor está inactivo, la RNA polimerasa se une al DNA, transcribe normalmente y se producen las enzimas necesarias para la síntesis de triptofano

En presencia de triptofano el represor está activo, la RNA polimerasa NO se une al DNA, no hay transcripción y NO se producen las enzimas necesarias para la síntesis de triptofano

Activación y desactivación de genes mediante una proteína activadora

Proteína activadora unida RNA polimerasa

Sitio de unión para la proteína

activadora

mRNA

Proteína

Funcionan en promotores que normalmente no son muy activos ya que la RNAS polimersas se une débilmente a ellos uniéndose a la enzima y ayudándola a iniciar la transcripción optimizando su funcionamiento

Operon lactosa (Jacob y Monod, 1961)

CAP (catabolite activator protein) inicia la transcripción de genes que permiten usar otras moléculas como combustible cuando la glucosa no está presente. Si los niveles de glucosa son altos los niveles de AMPc son bajos (represión por catabolito). En presencia de AMPc (producido en ausencia de glucosa) CAP se une al DNA, lo dobla y favorece la unión de la RNA polimerasa.

En ausencia de lactosa hay una proteína represora unida al operador.

Operón controlado por un activador y un represor

Los operones inducibles son expresados sólo cuando los genes que contienen son necesarios

• Existen tres RNA polimerasas

• Participan factores de transcripcióngenerales

• Proteínas represoras o activadoras pueden influir en la transcripción

• Las regiones reguladoras están a distancias grandes del promotor

• Tomar en cuenta el empaquetamiento del DNA

Transcripción en células Eucarointes

Genes transcritosTipo de RNA Polimerasa

RNA pol I Mayoría de los genes de RNA ribosomales (RNAr)

RNA pol II Todos los genes que codifican proteínas y algunos de RNA pequeños

RNA pol III Genes de RNAt (de transferencia), RNAr 50S (ribosomal) genes de algunos de RNAestructurales

pequeños

Las tres RNA polimerasa de las células eucariontes

Los factores de transcripción ubican a la RNA polimerasa correctamente en el promotor

En eucariontes la transcripción también requiere de proteínas reguladoras

Proteína activadora eucarionte

Incrementador (enhancer) sitio de unión para la proteína activadora

Inicio de la transcripción

Caja TATA

Unión de factores de transcripción generales, mediador y RNA polimerasa

Proteína activadora

Mediador

RNA polimerasa II

Se inicia la transcripción

Factores de transcripción

generales

Los genes eucariontes son regulados porcombinaciones de proteínas

La expresión de distintos genes puede estar coordinada por una sola proteína

* En procariontes existen los operones

Procariontes

Proteína activadora unida RNA polimerasa

Sitio de unión para la proteína activadora

mRNA

Proteína

Proteína activadora

Mediador

RNA polimerasa II

Se inicia la transcripción

Factores de transcripción

generales Eucariontes

El control combinatorio puede generar distintos tipos celulares

Los patrones estables de expresión génica son heredados a las células hijas

Un ciclo de retroalimentación positiva puede producir memoria celular

La proteína A es una proteína reguladora de genes que activa su propia transcripción. Todos los descendientes de la célula original “recordarán” que la célula progenitora recibió una señal temporal que inició la producción de la proteína

La proteína A no se produce porque es necesaria para

estimular su propia transcripción

Señal temporal activa la expresión de la proteína A

El efecto de la señal temporal es “recordado” por las células hijas

(decendientes de la célula original)

Propagación exacta de la estructura condensada de la cromatina

La expresión de una sola proteína reguladora puede inducir la formación de un órgano completo

Expresión del gen Ey en células precursoras de la pata de D. melanogaster

En resumen

Las células regulan la expresión génica

En las células eucariontes el inicio de la transcripción es un proceso complejo

La transcripción está controlada por proteínas que se unen a regiones reguladoras del DNA

Las RNA polimerasas eucariontes requieren factores de transcripción generales

Existen proteínas moduladoras (activadoras o represoras) que regulan la expresión de los genes

Las proteínas reguladoras de las células eucariontes controlan la expresión de los genes a distancia

El empaquetamiento del DNA promotor en los nucleosomas puede afectar el inicio de la transcripción

Los genes eucariontes son regulados por combinaciones de proteínas

La expresión de diferentes genes puede estar coordinada por una sola proteína

El control combinatorio puede dar origen a diferentes tipos celulares

Una sola proteína reguladora puede inducir la formación de un órgano completo

Tecnología del DNA

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICASDEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

BIO034

Dra. Ximena Ortega A.

Endonucleasas de restricción

Extremos romos

Extremos escalonados

Son enzimas de origen bacteriano que cortan el DNA en secuencias específicas (palíndromes)

Los fragmentos generados con endonucleasas de restricción se pueden volver a unir usando la ligasa

Unión de extremos escalonados complementarios

Unión de extremos romos

Electroforesis en gel de Agarosa

Permite determinar el tamaño de los fragmentos de DNA obtenidos de la digestión con una enzima de restricción

Hibridación

Doble hélices de DNA Denaturación a hebras simples por ruptura de

puentes de hidrógeno entre las bases nitrogenadas

AltaTemp

AltopH

Enfriar lento

Bajar el pH

Renaturación o hibridación, se reestablecen las doble

hélices de DNA, (se vuelven a formar los

puentes de hidrógeno entre las bases nitrogenadas)

Detección de anemia falciforme por hibridación

Una sonda es un DNA corto de cadena sencilla que se utiliza en una reacción de hibridación para detectar moléculas de DNA que tienen una secuencia complementaria. Están marcados y se pueden detectar

El individuo 1 tiene dos genes deβ-globina normales

El individuo 2 tiene dos genes de β-globina falciforme

El individuo 3 tiene un gen normal y el otro falciforme

Southern blot

La hibridación in situ permite determinar la localización de los genes en los distintos cromosomas

PCR, Polymerase Chain Reaction

Secuencia conocida

DNA dedoble hebra

Separar la doble hebra

por calor

Hibridación con

partidores

DNApolimerasa+dATP+dGTP+dCTP+dTTP

Síntesis de DNA a partir de los partidores

Separar las hebras de DNA y unir los

partidores

Separar las hebras de DNA y unir los

partidores

Separar las hebras de DNA y unir los

partidores

Síntesisde DNA

Síntesisde DNA

Síntesisde DNA

Región de DNA de doble hebra a

amplificar

Partidores de DNA

Primer ciclo2 moléculas de DNA de

doble hebra

Segundo ciclo4 moléculas de DNA de

doble hebra

Tercer ciclo8 moléculas de DNA de

doble hebra

Detección de RNA viral por PCR

Clonamiento de DNASe usan plasmidios bacterianos (moléculas circulares pequeñas de DNA de hebra doble) para clonar genes de interés. Se necesita un origen de replicación, un sitio de corte para una endonucleasa y una propiedad seleccionable, por ejemplo, resistencia a un antibiótico

Permite obtener muchas copias idénticas y aislar un gen en particular