aplicaciones de la ingeniería genética a la cría y salud animal. bases fundamentales de la...

Aplicaciones de la ingeniería genética a la cría

y salud animal.

Aplicaciones de la ingeniería genética a la cría

y salud animal.Bases fundamentales de la terapia génica. Aplicaciones en salud animal.

-Formas de actuación mediante terapia génica.

-Mecanismos de introducción del gen terapéutico. Terapia génica “in vivo” y “ex vivo”. Ingenieria Tisular.

- Enfermedades candidatas para un tratamiento con terapia génica.

Bases fundamentales de la terapia génica. Aplicaciones en salud animal.

-Formas de actuación mediante terapia génica.

-Mecanismos de introducción del gen terapéutico. Terapia génica “in vivo” y “ex vivo”. Ingenieria Tisular.

- Enfermedades candidatas para un tratamiento con terapia génica.

¿QUÉ es la Terapia génica?¿QUÉ es la Terapia génica?

“Proceso por el cual un nuevo gen es introducido en células de un individuo

para producir un efecto terapéutico.”

DNA como medicamento o Curar con genes

¿QUÉ es Gene Marking?¿QUÉ es Gene Marking?

“Proceso que utiliza técnicas comunes a la

Terapia Génica pero sin buscar un efecto

terapéutico.”Ej. Seguir la pista a determinadascélulas en el organismo.

““Suprimir función”Suprimir función”

““Añadir función”Añadir función”

Terapia GénicaTerapia Génica

““Añadir función”Añadir función”

Terapia GénicaTerapia Génica

•Sustitución del gen deseado.Sustitución del gen deseado.

•Reparación de una mutación. Reparación de una mutación. •Añadir un genAñadir un gen

Añadir funciónAñadir funciónAñadir funciónAñadir función

•Recombinación homológa Recombinación homológa (sustitución o reparación puntual)(sustitución o reparación puntual)

• Introducción del transgen Introducción del transgen al azar al azar

(añadir un gen)(añadir un gen)

Añadir funciónAñadir funciónAñadir funciónAñadir función

““Suprimir función”Suprimir función”

Terapia GénicaTerapia Génica

•Muerte celular (suicidio Muerte celular (suicidio de las células) de las células)

•Oligonucleótidos Oligonucleótidos antisentido (expresión).antisentido (expresión).

•Ribozimas (Ruptura). Ribozimas (Ruptura).

Suprimir funciónSuprimir funciónSuprimir funciónSuprimir función

OLIGONUCLEÓTIDOS ANTISENTIDOiRNA: RNA de interferencia

MODOS DE INTRODUCCIÓN

MODOS DE INTRODUCCIÓN

““Ex vivo”Ex vivo”

““In vivo”In vivo”

Terapia GénicaTerapia Génica

DIRECTAMENTE EN EL INDIVIDUO ADULTO REALIZABLES EN CULTIVOS CELULARESDIRECTAMENTE EN EL INDIVIDUO ADULTO REALIZABLES EN CULTIVOS CELULARES

IN VIVO/EX VIVOIN VIVO/EX VIVOIN VIVO/EX VIVOIN VIVO/EX VIVO

EX VIVOEX VIVOEX VIVOEX VIVO

SOLO EN CULTIVOS CELULARESSOLO EN CULTIVOS CELULARES

EX VIVOEX VIVOEX VIVOEX VIVO

•DIRECTOS•DIRECTOSDNA desnudoDNA desnudo

IN VIVO/EX VIVOIN VIVO/EX VIVOIN VIVO/EX VIVOIN VIVO/EX VIVO

• Inyección de la molécula de DNA.Inyección de la molécula de DNA.• Músculo , Piel, Mucosas y Timo.Músculo , Piel, Mucosas y Timo.• Introducción por “nuclear pore Introducción por “nuclear pore

complex”.complex”.

- Talla ILIMITADA.Talla ILIMITADA.- Bajo porcentaje de transfecciónBajo porcentaje de transfección- No hay integración en el genoma.No hay integración en el genoma.- No hay amplificación del DNA.No hay amplificación del DNA.

DNA desnudoDNA desnudoDNA desnudoDNA desnudo

EX VIVOEX VIVOEX VIVOEX VIVO

•INDIRECTOS•INDIRECTOS--

•DIRECTOS•DIRECTOSDNA desnudoDNA desnudo

IN VIVO/EX VIVOIN VIVO/EX VIVOIN VIVO/EX VIVOIN VIVO/EX VIVO

Mediados por vectoresMediados por vectores

• ““Son sistemas que ayudan en Son sistemas que ayudan en el proceso de transferencia de el proceso de transferencia de

un gen exógeno a la célula, un gen exógeno a la célula, facilitando la entrega, facilitando la entrega,

biodisponibilidad intracelular biodisponibilidad intracelular del mismo de modo que pueda del mismo de modo que pueda

funcionar correctamente”funcionar correctamente”

¿Qué es un vector?¿Qué es un vector?¿Qué es un vector?¿Qué es un vector?

• EspecificidadEspecificidad de órgano o tejido. de órgano o tejido.• ProtecciónProtección del DNA. del DNA.• Elevada Elevada disponibilidad.disponibilidad.• ExpresiónExpresión eficaz. eficaz.• No inmunógeno/sin repuestas No inmunógeno/sin repuestas

inflamatorias.inflamatorias.• SeguroSeguro paciente/entorno. paciente/entorno.

Características del vector idealCaracterísticas del vector idealCaracterísticas del vector idealCaracterísticas del vector ideal

EX VIVOEX VIVOEX VIVOEX VIVO

•INDIRECTOS•INDIRECTOS

- Retrovirus

-Adenovirus

- Adenovirus asociados

- Liposomas

- Fragmentos

específicos

- Retrovirus

-Adenovirus

- Adenovirus asociados

- Liposomas

- Fragmentos

específicos

•DIRECTOS•DIRECTOSDNA desnudoDNA desnudo

IN VIVO/EX VIVOIN VIVO/EX VIVOIN VIVO/EX VIVOIN VIVO/EX VIVO

• Una cadena de RNA.Una cadena de RNA.• Protegidos por una cápside.Protegidos por una cápside.• Talla de 80 a 130 nm.Talla de 80 a 130 nm.• Tres genes importantes:Tres genes importantes:

– gag: gag: proteínas de la cápsideproteínas de la cápside

– pol: pol: transcriptasa inversa e integrasatranscriptasa inversa e integrasa

– Env: Env: proteínas de envoltura y reconocimiento de proteínas de envoltura y reconocimiento de receptorreceptor

– Zonas LTR: Zonas LTR: Long Terminal RepeatLong Terminal Repeat

VECTORES RETROVIRALESVECTORES RETROVIRALESVECTORES RETROVIRALESVECTORES RETROVIRALES

Construcción RetroviralConstrucción RetroviralConstrucción RetroviralConstrucción Retroviral

MMLV: Moloney Murine Leukemia VirusMMLV: Moloney Murine Leukemia Virus

CÉLULAS CÉLULAS EMPAQUETADORAS EMPAQUETADORAS

(helper free)(helper free)

RNA

Producción de Producción de vectores retroviralesvectores retrovirales

Producción de Producción de vectores retroviralesvectores retrovirales

CÉLULAS EMPAQUETADORAS CÉLULAS EMPAQUETADORAS (helper free) (helper free)

Retrovirus Recombinantes

Producción de Producción de vectores retroviralesvectores retrovirales

Producción de Producción de vectores retroviralesvectores retrovirales

• Alta eficacia de transducción.Alta eficacia de transducción.• Tamaño del inserto 8Kb.Tamaño del inserto 8Kb.• Alta expresión una vez introducido en el Alta expresión una vez introducido en el

genoma.genoma.• Sistema muy bien estudiado.Sistema muy bien estudiado.• Proteínas del vector no se expresan en el Proteínas del vector no se expresan en el

huésped.huésped.• Necesita células en división.Necesita células en división.• Se consiguen títulos muy bajos de virus.Se consiguen títulos muy bajos de virus.• Integración al azar en el genoma.Integración al azar en el genoma.• Transducción “in vivo” poco efectiva.Transducción “in vivo” poco efectiva.

Características de los Características de los vectores retroviralesvectores retroviralesCaracterísticas de los Características de los vectores retroviralesvectores retrovirales

EX VIVOEX VIVOEX VIVOEX VIVO

•INDIRECTOS•INDIRECTOS

- Retrovirus

-Adenovirus

- Adenovirus asociados

- Liposomas

- Fragmentos

específicos

- Retrovirus

-Adenovirus

- Adenovirus asociados

- Liposomas

- Fragmentos

específicos

•DIRECTOS•DIRECTOSDNA desnudoDNA desnudo

IN VIVO/EX VIVOIN VIVO/EX VIVOIN VIVO/EX VIVOIN VIVO/EX VIVO

• DNA lineal de cadena doble.DNA lineal de cadena doble.• Más complejos que los Más complejos que los

retrovirus.retrovirus.• Tres genes importantes:Tres genes importantes:

– E1: E1: rescata células de la quiescencia.rescata células de la quiescencia.

– E2: E2: proteínas relacionadas con la replicación del DNA.proteínas relacionadas con la replicación del DNA.

– E3: E3: defensa ante el sistema inmunitario.defensa ante el sistema inmunitario.

– E4: E4: regulación de la transcripción.regulación de la transcripción.

VECTORES ADENOVIRALESVECTORES ADENOVIRALESVECTORES ADENOVIRALESVECTORES ADENOVIRALES

VIRUS RECOMBINANTES E1 Y E3 ELIMINADOS

• Eficaces a la hora de transferir el gen Eficaces a la hora de transferir el gen episomal a una gran cantidad de células.episomal a una gran cantidad de células.

• Fácil producción en el laboratorio.Fácil producción en el laboratorio.

• Gran respuesta inmunitaria.Gran respuesta inmunitaria.

• Dificultad para repetir la inyección de Dificultad para repetir la inyección de virus.virus.

Características de los Características de los vectores adenoviralesvectores adenoviralesCaracterísticas de los Características de los vectores adenoviralesvectores adenovirales

EX VIVOEX VIVOEX VIVOEX VIVO

•INDIRECTOS•INDIRECTOS

- Retrovirus

-Adenovirus

- Adenovirus asociados

- Liposomas

- Fragmentos

específicos

- Retrovirus

-Adenovirus

- Adenovirus asociados

- Liposomas

- Fragmentos

específicos

•DIRECTOS•DIRECTOSDNA desnudoDNA desnudo

IN VIVO/EX VIVOIN VIVO/EX VIVOIN VIVO/EX VIVOIN VIVO/EX VIVO

• DNA lineal de cadena doble.DNA lineal de cadena doble.• Se insertan en el genoma.Se insertan en el genoma.• Dos genes :Dos genes :

– rep: rep: replicación e integración del virus.replicación e integración del virus.

– cap: cap: tres proteínas estructurales víricas.tres proteínas estructurales víricas.

– TR: TR: repeticiones terminales-145 nucleótidos.repeticiones terminales-145 nucleótidos.

VECT. ADENOASOCIADOSVECT. ADENOASOCIADOSVECT. ADENOASOCIADOSVECT. ADENOASOCIADOS

VIRUS RECOMBINANTES SOLO CONTIENEN TRCélulas que poseen los genes rep y cap.

• Expresión a largo plazo.Expresión a largo plazo.

• No hay respuesta inmunitaria.No hay respuesta inmunitaria.

• Talla limitada del gen a introducir (aprox Talla limitada del gen a introducir (aprox 5 Kb).5 Kb).

• Dificultad para obtener grandes Dificultad para obtener grandes cantidades.cantidades.

Características de los Características de los vectores adeno-asociadosvectores adeno-asociadosCaracterísticas de los Características de los vectores adeno-asociadosvectores adeno-asociados

http://140.116.60.1/mdlai/Handout/cancer-gene-therapy/sld014.htm

EX VIVOEX VIVOEX VIVOEX VIVO

•INDIRECTOS•INDIRECTOS

- Retrovirus

-Adenovirus

- Adenovirus asociados

- Liposomas

- Fragmentos

específicos

- Retrovirus

-Adenovirus

- Adenovirus asociados

- Liposomas

- Fragmentos

específicos

•DIRECTOS•DIRECTOSDNA desnudoDNA desnudo

IN VIVO/EX VIVOIN VIVO/EX VIVOIN VIVO/EX VIVOIN VIVO/EX VIVO

• CATIÓNICOSCATIÓNICOS– Su carga positiva reacciona con la

negativa del DNA formando un complejo.

• pH SENSIBLE O ANIÓNICOpH SENSIBLE O ANIÓNICO– Mediante una desestabilización por

bajo pH el DNA entra en “núcleo del liposoma”.

LIPOSOMASLIPOSOMASLIPOSOMASLIPOSOMAS

POSIBILIDAD DE UNIR RECEPTORES ESPECÍFICOS

– Protegen al DNA– No hay limite de tamaño– Enviar a lugares específicos.– Baja eficacia – Expresión transitoria.– Toxicidad celular– Inhibición por componentes

séricos.

Características de los liposomasCaracterísticas de los liposomasCaracterísticas de los liposomasCaracterísticas de los liposomas

EX VIVOEX VIVOEX VIVOEX VIVO

•INDIRECTOS•INDIRECTOS

- Retrovirus

-Adenovirus

- Adenovirus asociados

- Liposomas

- Fragmentos

específicos

- Retrovirus

-Adenovirus

- Adenovirus asociados

- Liposomas

- Fragmentos

específicos

•DIRECTOS•DIRECTOS

•QUIMICOS•QUIMICOS

•FISICOS•FISICOS

Precipitación con fosfato de calcioPrecipitación con fosfato de calcio

ElectroporaciónElectroporación

DNA desnudoDNA desnudo

IN VIVO/EX VIVOIN VIVO/EX VIVOIN VIVO/EX VIVOIN VIVO/EX VIVO

MÉTODOS “EX VIVO”MÉTODOS “EX VIVO”(Cultivos celulares)(Cultivos celulares)

MÉTODOS “EX VIVO”MÉTODOS “EX VIVO”(Cultivos celulares)(Cultivos celulares)

Las células modificadas Las células modificadas genéticamente deberán genéticamente deberán

ser introducidas ser introducidas posteriormente en el posteriormente en el

enfermoenfermo

MECANISMO “EX VIVO”MECANISMO “EX VIVO”MECANISMO “EX VIVO”MECANISMO “EX VIVO”

MODO DE INTRODUCCIÓNMODO DE INTRODUCCIÓN

•Enfermedades Enfermedades monogénicas. monogénicas.

•Cancer.Cancer.•Enfermedades infecciosas o Enfermedades infecciosas o

parasitarias. parasitarias. •Enfermedades Enfermedades

neurodegenerativasneurodegenerativas

Algunas...Algunas...Algunas...Algunas...

Enfermedades Monogénicas

- Conocidas por la mayoría como las únicas candidatas para el tratamiento.

- Aporte de la proteína/enzima

deficitaria.

- Posibilidad de realizar terapia

génica germinal..

Algunas...Algunas...Algunas...Algunas...

Deficiencia Inmune Severa CombinadaDeficiencia Inmune Severa Combinada ligada al cromosoma XFibrosis Quística Enfermedades lisosomales (Gaucher, etc.)

Deficiencia Inmune Severa Combinada

- Deficiencia en la enzima Adenosin Desaminasa.

- 1/100.000 (25% de

mortalidad).

- Fragilidad de los linfocitos T..

INMUNOSUPRESION

David "niño burbuja",

(Fuente: M.R. Cummings. Herencia humana (3ª ed.), Interamericana (1995)

Tratamientos

- Aportación de la enzima recombinante:

ADAPEG-ADA

- Transplante de médula osea.

1ª Experiencia de Terapia génica: Deficiencia Inmune Severa

Combinada

- 1990. Dr Blaese (EEUU)Dr. Bordignon (Italia)

-1995 Demuestran la eficacia del tratamiento

Ashanti de Silva tratada a los cuatro años de edad.(Fuentes: W.F. Anderson, Scient. Amer., 273(3):96-98(1995).

X-SCI Imunodeficiencia Severa combinada

-Mutación en el Cromosoma X

- Deficiencia en la cadena del

receptor para la interleukina

IL2RG

- Hospital Necker de Paris (11

niños)

X-SCI Imunodeficiencia Severa combinada

-3 de los niños sufrieron una leucemia.- ¿Por qué?

-Efecto posición (LMO2)-2003-Efecto sobreexpresión- 2006

Fibrosis Quística

- Deficiencia en el CTFR (Cystic factor transmembrane receptor).

- 1/2.800 (Muerte a los 29).

- No hay tratamiento.

Problemas para clonar el

CTFR

2.-Tumores

- - Muerte celular- Genes supresores de tumores.- Producción de linfoquinas- Inmuno Terapia con antígenos MHC

Los más tratados:Melanoma.Leucemias GlioblastomaTumores de pulmón, hígado, etc.

3.- INFECCIOSAS Y/O PARASITARIAS

- - Estimular el sistema inmunitario.- Vacunas de DNA desnudo con

antígenos.- Linfocitos recombinantes para los

anticuerpos que actuan contra el virus.

Algunos ejemplos:SIDAVacunas de DNA desnudo en animales.

4.- Enfermedades neurodegenerativas

- - Inhibición de apoptosis neuronal.- Producción de L-dopa o factores

neurotróficos en cerebro.

Algunos ejemplos:Enfermedades de la motoneurona(E.L.A. Y E.M.)Parkinson y Alzheimer.

ENFERMEDADES TRATADASENFERMEDADES TRATADAS

¿FASES?¿FASES?

¿Dónde se están tratando?¿Dónde se están tratando?

CIFRAS POR PAISESCIFRAS POR PAISES

CIFRAS POR CONTINENTESCIFRAS POR CONTINENTES