aplicaciones biol ógicas de la espectrometría de masa

Aplicaciones Biológicas de la Espectrometría de Masa

Matías Möller

2

MS/MS

Espectrometría en Tándem: Secuenciación de péptidos

Espectrometría de masa

3

MS/MS: Espectrometría en Tándem

Espectrometría de masa

Seleccionar uno de los iones de la muestra, fragmentarlo y estudiar la formación de iones “hijos”

mp+ md

+ + mn0

Aplicaciones:Identificación de moléculas

Secuenciación de péptidos “al vuelo”

Modificaciones posttraduccionales

4

MS/MS: Espectrometría en Tandem

Espectrometría de masa

ESI-QQ1Q2Q3: Triple Cuadrupolo. Q1 y Q3 separan iones moleculares,mientras Q2 sirve de cámara de colisión: Se introduce un gas para que los iones acelerados choquen y se fragmentenCID: Collision Induced Dissociation

Se usa mucho para realizar cuantificaciones por LC-MS-MS

MassAnalysis

peptides

protein

peptides

++

+

+

++++

IonizationDigestion

m/z

MS

Ionization Isolation Fragmentation MassAnalysis

protein

peptidefragments

Digestion

peptides

+++

+

++

++ ++

+++

+

+

++++ +

m/zm/z

MS MS/MS

m/z

Isolation

MS/MS

Select Parent Fragment Analyse Fragment

Masses

Analyse Parent Masses

MS

Tandem en el espacio

8

MS/MSSecuenciación peptídica

Espectro MS/MS:masa de los fragmentos

Mezcla de péptidos

MS/MS+

+

+

++

+

1 péptido seleccionado para MS/MS

Espectro MS

Carlos Cerveñansky

9

MS/MS: Espectrometría en Tandem

ESI-ITIT: Trampa de IonesLa trampa de iones puede analizar los iones de una muestra MS

También puede seleccionar uno, y concentrarlo en la trampa

Luego se introduce Helio para que los iones acelerados choquen y se fragmenten

Luego se analizan los iones hijo

CID: Collision Induced Dissociation

Las trampas de iones tienen capacidad de hacer MSn se seleccionan iones hijo se fragmentan, analizan, seleccionan uno fragmentan, analizan, seleccionan uno hasta que les de la sensibilidad

MS2

Fragment 426.7

Isolate Parent Ion

Intact ions

Intact ion

Daughters

This analysis/isolation/fragmentation can be carried out in an ion trap

Tandem en el tiempo

11

MS/MS: Espectrometría en Tandem

Espectrometría de masa

MALDI-TOFIones moleculares que se fragmentan durante el vuelo llegan juntos al “reflector” y pueden ser analizados por el mismo. PSD: Post Source Decay

ESQUEMA:

Instrumento de tecnología MALDI-TOF

Camera

Laser

plate

Pumping Pumping

Beam guide

Timed ion selector Reflector

Linear detector

Extractiongrids

Reflectordetector

H2N CH C

R1

O

HN CH C

R2

O

HN CH C

R3

OH

O

b1

y2

b2

y1

N-terminal

C-terminal

y ionsb ions

b1

b2

b3

b4

y4

y3

y2

y1

http://db.systemsbiology.net:8080/proteomicsToolkit/FragIonServlet.html

b1

b2

b3

y1

y2

y3

LF

K

G

G L

K

F

Rela

t ive I

nte

nsit

y

m/z

F L G K++

F L G K++

F L G K++

CID

F L G K++

F L G K++

F L G K++

b1

b2

b3

y3

y2

y1 F L G K++

F L G K+

Peptide Fragmentation by MS/MS

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rel

ativ

e A

bu

nd

ance

395.2

y9

b4

400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400

m/z

887.6

986.6

774.5

1186.7494.31168.7

1085.7607.4 1243.7

673.5

1006.6 1119.6779.5476.3 589.3984.6708.4

466.3

885.61184.7

772.5

y13

y12

y12*y11

y10

y8

y7

b13

b12b11

b10

b8

b7

b6

b5

b6*b5*

a5 a12

His-Gly-Thr-Val-Val-Leu-Thr-Ala-Leu-Gly-Gly-Ile -Leu-Lysb1 b4b3 b5 b6 b7 b8 b9 b10b2 b11 b12 b13

y13 y10y11 y9 y8 y7 y6 y5 y4y12 y3 y2 y1

17

18

19

MS/MS: Espectrometría en Tandem

Espectrometría de masa

Fragmentación peptídica

22

Identificación de proteínas

Peptide mass fingerprinting y proteomica

23

Identificación de proteínas

Mapeo peptídico por EM(Peptide Mass Fingerprinting/MS)

MEMEKEFEQIDKSGSWAAIYQDIRHEASDFPCRVAKLPKNKNRNRYRDVS

PFDHSRIKLHQEDNDYINASLIKMEEAQRSYILTQGPLPNTCGHFWEMVW

EQKSRGVVMLNRVMEKGSLKCAQYWPQKEEKEMIFEDTNLKLTLISEDIK

SYYTVRQLELENLTTQETREILHFHYTTWPDFGVPESPASFLNFLFKVRE

SGSLSPEHGPVVVHCSAGIGRSGTFCLADTCLLLMDKRKDPSSVDIKKVL

LEMRKFRMGLIQTADQLRFSYLAVIEGAKFIMGDSSVQDQWKELSHEDLE

PPPEHIPPPPRPPKRILEPHNGKCREFFPNHQWVKEETQEDKDCPIKEEK

GSPLNAAPYGIESMSQDTEVRSRVVGGSLRGAQAASPAKGEPSLPEKDED

HALSYWKPFLVNMCVATVLTAGAYLCYRFLFNSNT

proteína intacta enzima

proteolítica

péptidos

5000 7000 9000 11000 13000 15000

Mass (m/z)

0

6.0E+4

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% I

nte

nsi

ty

Voyager Spec #1=>BC=>NF0.9[BP = 12364.9, 60367]

12366.46

6187.17

12583.58

12326.17

6292.68

12784.48

Espectro de masa del citocromo c de caballo

A. Molécula entera. Matriz: ácido sinapínico

1000 1160 1320 1480 1640 1800

Mass (m/z)

0

2.0E+4

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% In

ten

sity

Voyager Spec #1=>MC=>BC[BP = 1633.6, 19883]

1168.61

1190.54

1212.53 1433.76

1655.591170.181213.531296.681152.361046.18 1631.621350.70

1478.821124.52 1230.50

1633.82

B. Molécula digerida con tripsina. Matriz: ácido -ciano hidroxicinámico

Masa Teorica (Da)

Masa Medida (Da)

Error (Da) Residuos Secuencia

1168.61 1168.61 0.00 28-38 TGPNLHGLFGR 1296.71 1296.68 0.03 28-39 TGPNLHGLFGRK 1350.72 1350.69 0.03 89-99 TEREDLIAYLK 1433.77 1433.76 0.01 26-38 HKTGPMLHGGLFGR 1470.68 1470.67 0.01 40-53 TGQAPGFTYTDANK 1478.82 1478.82 0.00 89-100 TEREDLIAYLKK 1478.82 1478.82 0.00 88-99 KTEREDLIAYLK 1633.81 1633.82 0.01 9-22 IFVQKCAQCHTVEK

Niveles de información……… en la caracterización de proteínas por MS.

• medida de masa de una molécula entera 1 valor experimental

• medidas de masas en mapeo peptídico 5-20 valores experimentales

• secuenciado de péptidos por MS/MS más de 100 valores experimentales

…mejora en cantidad y calidad de la información

Peptide fragmentation fingerprinting

Enzymaticdigestion

In-silicodigestion

Protein(s) Peptides340.695086676.96063498.8283545.5641171.967066261.107346342.51458456.727405363.268365

MS/MS spectra of peptides

Ions peaklists

…MAIILAGGHSVRFGPKAFAEVNGETFYSRVITLESTNMFNEIIISTNAQLATQFKYPNVVIDDENHNDKGPLAGIYTIMKQHPEEELFFVVSVDTPMITGKAVSTLYQFLV …

- MAIILAGGHSVR- FGPK- AFAEVNGETFYSR- VITLESTNMFNEIIIK- YPNVVIDDENNDK…

Sequence database entry

361.107346338.695086676.96063498.82831045.5641171.967066342.51458457.827405263.268453

Theoretical peaklist

Theoretical proteolytic peptides

Match

Result: ranked list of peptide

and protein

candidates

Theoretical fragmented

peptides

-MAIILAG-MAIILA-MAIIL-MAII-MAI-M-M-AIILAG

In-silicofragmentation

PFF = ion search MS/MS database matching

Proteoma

• Producto final del genoma más variedad• Es una entidad dinámica Fenotipo• Modificaciones posttraduccionales• No todos los genes se expresan como proteínas

en todos los estadios/tipos celulares

1 gen = 1proteina?

• 1 gen ya no equivale a una proteina

• La definición de gen es debatible (ORF, promotor, pseudogen, producto de gen, etc)

• 1 gen = cuántas proteinas? (no sabemos)

Sujetos de estudio de la Proteómica

• Identificación de Proteínas (pept mass fingerprint)• Comparación de niveles de expresión de Proteinas• Función de Proteinas• Modificaciones posttraduccionales de Proteinas• Localización y Compartimentalización de Proteinas • Interacciones Proteina-Proteina

Quantitative proteomics

Quantitative proteomics

Identificación de sitios de modificación

Oxidación de citocromo c

Y74

Y67

Y48Y97

Y74

Y67

Y48Y97

Located in mitochondria, plays an important role in apoptosis intrinsic pathway and has been linked to oxidative stress responses

[H2O2]

37°C,1 Hr

aPLPC

TOCL

sh_2025_MM_102010p_alpha_PLPC #3206 RT: 29.05 AV: 1 NL: 6.69E2F: ITMS + c NSI d Full ms2 498.94@cid35.00 [125.00-1510.00]

200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200m/z

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rela

tive A

bundance

744.39567.35

638.40

415.40

480.27

631.47

857.32751.40

376.42

358.72 620.49 815.44235.14319.73 684.20484.34

265.93 928.57489.64 1220.79216.16783.42 996.71859.49 1108.26

b10y9

b8

b7

b6

y5

y4

b5y7(2+)

y5(2+)

y6(2+)

b7-CO(2+)

y12 y11 y10 y9 y8 y7 y6 y5 y4 y3 y2 y1T---E---R---E---D---L---I---A---Y*--L---K---Kb1 b2 b3 b4 b5 b6 b7 b8 b9 b10 b11 b12

Y+16

GAPDHReaction withNitro-oleic acid

Batthyany J.Biol.Chem. 2006, p.20450

MS-Imaging

MS-Imaging

• Mass is given as m/z which is the mass of the ion divided by its charge

• Monoisotopic mass is the mass of an ion for a given empirical formula calculated using the exact mass of the most abundant isotope of each element (C=12.00000, H=1.007825 etc)

• Average mass is the mass of an ion for a given empirical formula calculated using the average exact mass for each element (C=12.01115, H=1.00797 etc)

• Nominal mass is the mass of an ion for a given empirical formula calculated using the integer mass of the most abundant isotope for each element (C=12, H=1 etc)

Electrospray Ionisation and Charge

Substance P

300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300

Da/e0

100

%

674.7

666.1600.4462.8

685.7

693.6 1347.7

[M+2H]2 +

[M+H] +

520 521 522 523 524 525 526 527 528 5290

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

524.3

525.3

526.2

Determining Charge State

Double Charge StateDelta = 0.5 amu

Determining Charge State

Delta = 0.5 amu

258 259 260 261 262 263 264 265 266 2670

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

262.6

263.1

263.6

Delta = 0.5 amu