analisis microscopico del semen

www.fertimexico.com

2hmanuelrh@yahoo.com.mx

97-99-2000

Manual de Análisis Básico2002 NAFA - ESHRE

Génesis del nuevo Manual

4´ EDICION OMS 5 ´EDICION OMS

PARAMETRO VALOR DE REFERENCIA VALOR DE REFERENCIA

Volumen 2.0 mL o más 1.5 mL o más

pH 7.2 o más 7.2 o más

Concentración Espermática

20 millones/mL. o más 15 millones/mL. o más

Número Total de Espermatozoides

40 millones/Eyaculado o más 39 millones/Eyaculado o más

Movilidad 50% o más con movilidad A y B

25% o más con movilidad A

MP= 32%

MT (MP+MNP)= 40%

Morfología Consenso en Proceso (>14%) >4%

Viabilidad 50% de vivos o más 58% vivos o más

Leucocitos Menos de 1 millón/mL. Menos de 1 millón/mL.

Licuefacción 15 min-60 min. 15 min-60 min.

Viscosidad >2cm >2cm

Aglutinación (grados

esperma)

>10% 1:<10, 2:10-50, 3:>50, 4:aglu totales

EXAMENMACROSCOPICO

VISCOSIDAD ASPECTO VOLUMEN pH

VITALIDAD

EXAMENMICROSCOPICO

CONCENTRACION

MOTILIDADAGLUTINACION YAGREGACION

OTRAS CELULAS

MORFOLOGIA

ESPERMATICA

ANTICUERPOSANTI-ESPERMATOZOIDES

ANALISIS DEL SEMEN

LICUEFACCION

hmanuelrh@yahoo.com.mx

El semen es viscoso

Área 1 elevada concentración de espermatozoidesespermatozoides rápidosbuena morfología

Área 2 baja concentración de espermatozoides

espermatozoides lentos -mala morfología

• Mezclar bien la muestra• Coger dos alicuotas• Contar 2×200 espermatozoides (cuando sea posible)• Comparar por duplicado

Distribución de Poisson (número de espermatozoides/leucocitos)Distribución Binomial (% motilidad, % morfología, % vitalidad)

A: Movilidad Progresiva RápidaB: Movilidad Progresiva LentaC: Movilidad No progresivaD. Inmóviles.

Movilidad Progresiva (MP)

Movilidad No Progresiva (NP)

Inmóviles (IM)

“La movilidad progresiva esta relacionada con las tasas de embarazo

(Jounnet et al., 1988., Zinaman et al., 2000; Larsen)

“licuada la muestra <30

minutos”.

Difícil separar movilidad A y B con exactitud (Cooper and yeung, 2006)

MP= 32% MT (MP+MNP)= 40%

EJEMPLOConteo total de espermatozoides= 200 por duplicadoCONTEO 1 CONTEO 2PR= 37% PR= 28%NP= 3% NP= 6%IM= 60% IM= 66% = promedio 63% ; diferencia 6%

Los resultados son aceptados y se reportan los promedios:PR= 33%, NP= 4%, IM= 63%

PORCENTAJE DIFERENCIA

ACEPTABLE

PORCENTAJE DIFERENCIA

ACEPTABLE

0 1 66-76 9

1 2 77-83 8

2 3 84-88 7

3-4 4 89-92 6

5-7 5 93-95 5

8-11 6 96-97 4

12-16 7 98 3

17-23 8 99 2

24-34 9 100 1

35-65 10

(Rose et al., 1976)

Adherencia entre los espermatozoides móviles.

Agregaciones: adherencia de espermatozoides (inmóviles o móviles) a células no espermáticas o detritos

Aglutinaciones: espermatozoides móviles adheridos a otros espermatozoides móviles

Vitalidad utilizando Eosina-Nigrosina.

Permite almacenar las placas para re-

evaluación y propósitos de control de

calidad. Björndahl et al., 2003)

Test hipo osmótico (Jeyendran et al., 1984)

Espermatozoides con membranas intactas se hinchan y sus forma

flagelar cambia dentro de los 30 minutos.

Hossain et al., 1998.

Fundamental en muestras con < 40 % de espermatozoides móviles.Se realiza inmediatamente licuada la muestra (de preferencia a los 30 minutos).

-Espermatozoides vitales pero inmóviles puede deberse a un defecto estructural del flagelo. (Chemes and Rawe, 2003).

-Evaluar en duplicado 200 espermatozoides.

•NOTA: El Porcentaje de Viabilidad debe ser mayor o igual al porcentaje de movilidad total, cuando sucede lo contrario se deben verificar ambas mediciones.

>58% vivos

Es imposible caracterizar la calidad del semen masculino al evaluar

solo una muestra del paciente.

Es recomendable examinar 2 o 3 muestras para obtener datos confiables y

una media. Carlsen et al., 2004 Castilla et al., 2006.

OMS´5: Cámara de recuento de espermatozoides

No recomendado:Cámaras de pequeño volumen: demasiados pocos espermatozoides Cámaras llenadas por capilaridad: llenado desigual

Numero de

espermatozoides

contados por

campo con el

objetivo de 40X

Numero de

espermatozoides

contados por

campo con el

objetivo de 20X

Dilución

(Semen +

Diluyente)

Diluyente

Cámar

***Numer

cuadro

que debe

contado

>101 >404 1:20(1+19) 50 950 Neubau

16-100 64-400 1:5 (1+4) 50 200 Neubau

2-15 8-60 1:2 (1+1) 50 50 Neubau

<2 <8 1:2 (1+1) 50 50 Neubau

(toda la

camara)

cuadros

completos

Conteo espermático

o Media de 3 camposoPreparación x duplicado de la dilución (tabla 1)oPreparación del HemocitometrooContar mínimo 200 células/ por duplicadooComparar las diferencias de los conteosoCalcular C=(N/n) x (1/profundidad de la camra)X factor dilucón(espermas/nL)oReportar Mill/mL

dilución 1+1 (1:2),C=(N/n)x (1/100)x2 espermatozoides/nlC= (N/n)x (1/50) espermatozoides/nl.

dilución 1+1 (1:2),C=(N/2)x (1/900)x2 espermatozoides/nlC= (N/1800) espermatozoides/nl.C=(N/1.8uL)2 esperma/nl

Sensibilidad56,000/ ml

0.25 esperma/nl=250/uL=250000/ml

Concentración espermática: cámara Neubauer Improved

Cámara de 100 µl de profundidad

9 rejillas de 100nl

Rejilla central 25 cuadrados grandes de 4nl

Cada cuadrado grande 16 cuadrados pequeños de 250pl

dilucion 1+4 (1:5), C=(N/n)x(1/20)x5 espermatozoides por nlC= (N/n)x(1/4) espermatozoide/nl ( o 106x ml de semen).

dilucion 1+19 (1:20),C=(N/n)x(1/20)x20 espermatozoides por nlC= (N/n)x espermatozoide/nl ( o 106x ml de semen).

dilucion 1+50 (1:49),C=(N/n)x(1/20)x50 espermatozoides por nlC= (N/n)x2.5 espermatozoide/nl ( o 106x mL de semen).

Si se observan < 25 espermatozoides, state:

“< 56,000 /ml” o “< 2,000 /ml”

Suma Diferencia

Aceptable *

Suma Diferencia Aceptable *

144-156 24 329-346 36

157-169 25 347-366 37

170-182 26 367-385 38

183-196 27 386-406 39

197-211 28 407-426 40

212-226 29 427-448 41

227-242 30 449-470 42

243-258 31 471-492 43

259-274 32 493-515 44

275-292 33 516-538 45

293-309 34 539-562 46

310-328 35 563-587 47

EJEMPLOCon una dilución 1+19 (1:20).Conteo 1: 98 espermatozoides;15 filas de cuadriculas (cuadros 5,4 y 6)Conteo 2: 114 espermatozoides;15 filas de cuadriculas (cuadros 5,4 y 6)(98+114)= 212 en 30 filas : diferencia (114-98) =16

De acuerdo a la tabla 2.C=(N/n)x(1/20)x20C=(N/n)x espermatozoide nl ( o 106x ml de semen).(212/30)x1.00=7.07 espermatozoides/nl(212/30)x1.00=7.07 106 espermatozoides/mL.

>15 mill/mL>39 mill eyaculado

Limite de referencia inferior: >4 %

Similares a los reportados para fertilización in vitro (Coetzee et al., 1998), inseminación intrauterina (Van Waart et al., 2001)y fertilidad in vivo (Van der Merwe et al., 2005)

Valor en la población general: Entre 0 y 30 % (Menkveld et al., 2001).

Que es un espermatozoide normal?????

CABEZA CUELLO Y PIEZA

•4-5 μm Longitud.

•2.5-3.5 µm. Ancho.

•40-70%, Acrosoma.

•Oval y Uniforme.

•5 µm Longitud.

•1 µm Ancho.

•<1/2 Cabeza, Gota

Citoplasmica.

•45 µm

largo.

•Derecha y

Uniforme.

MORFOLOGÍA NORMAL DE LOS ESPERMATOZOIDES

O.M.S Criterio Estricto > 14% (Kruger)

Se asocia a alteraciones de la concentración y movilidad.

Teratozoospermia Causas:

Varicocele, la sepsis seminal, el estrés y la exposición a agentes externos nocivos.

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Genital exposure

to heat stressTemperature peaks:

Sauna, hot baths,heated car seat,

electric blanket, fever

Profession:Boilerman, welder,

foundry worker, baker...

Constitutional:Varicocele,

undescended testicle,retractile testis

Clothing:Tight trousers/underpants,

pyjamas,down-filled duvet

Physical inactivity:Car, desk, computer,

TV; paraplegia

El grosor de la extensión de semen dependerá de:

• volumen de la alicuota (5-10 µl) pequeño espermatozoides separados

• ángulo de arrastre del portaobjetos (45º) mayor extensión más fina

• velocidad de la extensión (~1s) más alta extensión más gruesa

• Estirar la gota de semen sobre un portaobjetos• No estirar hacia delante• No dejar que la gota se seque

Se pueden hacer dos extendidos por cada muestra fresca previniendo roturas o mala tinción. La evaluación se hará en replicados preferentemente en cada replicado

Es preferible dejar secar, fijar y teñir las muestras.

Sin embargo sabemos que esto se asocia a cambios en las dimensiones del

esp. ya que teñidos, resultan más pequeños que los que están frescos.

Expansión de cabezas inmaduras.

Pérdida de gota citoplasmática sensible a cambio osmótico.

Muestras de baja concentración (< 2 x 10 6/ml)

Centrifugar a 600 g x 10 min

Muestras de mucha viscosidad resulta un extendido muy grueso:

Diluir con solución salina

Ccf 10 min a 600 g

Descartar el sobrenadante

Resuspender el pellet en 20-40 ul

Chequear de que los espermatozoides esten bien distribuidos y no amontonados

Dejar secar

Centrifugar la muestra puede afectar la morfología y se debe dejar por escrito en el informe

(Analizador de Semen

Asistido por Computadora)

Espermatozoides anómalos se asocian a bajo potencial fértil y daño al DNA,

cromatina inmadura, aneuploidias, etc.

Esto se asocia con una espermatogénesis anormal

Los espermatozoides presentan un resto de citoplasma > 1/3 de su cabeza a veces asociado a una pieza media defectuosa.

Exceso de citoplasma residual (ERC)

Una frecuencia alta de colas enrolladas puede indicar que el espermatozoide ha estado sometido a un stress hipoosmótico o envejecimiento

Si hay más de un 20 % hay que informarlo

Esto se asocia con una espermatogénesis anormal

Los espermatozoides presentan un resto de citoplasma > 1/3 de su cabeza a veces asociado a una pieza media

defectuosa.

1000x bajo aceite

Analizar todos los espermatozoides en cada campo que tengan cabeza y cola

Evaluar normales y anormales

Evaluar 200 esp x duplicado

Calcular el valor medio y la diferencia de los duplicados

Si la diferencia es aceptable (ver Tabla) informar valor medio. Sino volver a evaluar.

Informar valores enteros.

LRL: 4 % (IC 95 %: 3-4)

De acuerdo con Ward (1994), la descondensación del núcleo delespematozoide involucra una serie de eventos:

rearreglos topológicos de la cromatinatransición de las proteínas que envuelven a la cromatinamodificación en el patrón de la transcripciónpérdida de la estructura del nucleosomaadquisición de un arreglo condensado de la cromatina

Espermatozoide normal

% normales y % anormales

% Anomalías de cabeza

% Anomalías Pieza media

% Anomalías de cola

% Anomalías de exceso de citoplasma residual

Expresión de resultados

Ejemplos

N= 200, 18 %

N= 200, 9 %

Difer: 9, valor medio; 14 %

Aceptable hasta: 7

Descartar lecturas y repetir

N=200, 10 %

N= 200, 14 %

Difer. 4, valor medio 12%

Aceptable hasta 7:

Valor 12 % formas normales

Ejemplo

Normales: 36 esp. (18 %)

Anormales: 164

An.cabeza: 122

An. SI: 108

An.cola: 22

ECR: 36

Normales: 42 esp. (21 %)

Anormales: 158 esp.

An.cabeza: 140

An. SI: 102

An.cola: 30

ECR: 44

Ejemplo

Solo se compara el % de formas normales :21 % y 18 %= valor medio: 19, 5 % redondeado a 20 % y una diferencia de 3.

Voy a la Tabla y la diferencia aceptada es hasta 8.

Informe:Normales: 20 %Anormales: 80%An.cabeza: 140+122/400: 66 %An. SI: 102+108/400: 53 %An.cola: 30+22/400: 13 %ECR: 44 + 36/400: 20%

TZI > 1,6 se asocia a daño a DNA y mal

pronóstico de fecundar

Procedimientos opcionales: Indice de teratozoospermia, evaluación de anomalías múltiples

• Normal > 14% formas normales con buena tasa de fertilización• Buen pronóstico 4 a 14% formas normales con una tasa de fertilizaciónregular. • Mal pronóstico <4% formas normales con una tasa de fertilización muydisminuida.

OTROS TIPOS CELULARES PRESENTES EN EL SEMEN

Presencia de células no espermáticas Epiteliales y Redondas

Células Germinales Inmaduras (daño testicular) Leucocitos (inflamación de las glándula accesorias)

Prevalecía en relación con los espermatozoides

HEMOCITÓMETRO

Polimorfonucleares

-Escamosas, Cúbicas y Transcisionales.

100X, Tinción Diff-Quick.

ESPERMATOCITOESPERMATOGONIA ESPERMATIDE

CELULAS GERMINALES INMADURAS

LEUCOCITOS

C= N X S

C= Concentración celular

N= Cantidad de un tipo celular dado contado en los mismos campos que 200 espermatozoides.

S= Concentración espermática.

Ejemplo: 10 X 120 millones/mL = 6millones/mL

EVALUACION DE LAS CELULAS REDONDAS

Necrozoospermia o AstenozoospermiaFalsa (los datos no

concuerdan)

Patología o intervenciones

Recogida inadecuada

(coitus interruptus)

Posible

Contaminación

Abstinencia Prolongada

Transporte Inadecuado

Retraso en la Entrega de la

Muestra

Eyaculación

Fraccionada

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ESTUDIOS COMPLEMENTARIOS

Si el análisis de semen se encuadra en estudios de esterilidad:

•Si se aplica en RA (REM)

•Oligozoospermia (<5 mill/mL) y Azoospermia (cariotipo y microdeleccionesdel cromosoma Y)

•Hipospermia y/o pH<7, Leucocistospermia >10 mill/mL, aglutinaciones eneyaculado, Oligoastenoteratozoospermia, marcadores prostaticos (cultivo desemen)

•Azoospermia u Oligozoospermia: Agenesia bilateral de conductos deferente(estudios del gen de la fibrosis quísticas)

Si la estimación de la concentración de células Redonda Excede de 1 millon/ml

Deberá evaluar por la prueba de peroxidas (leucocitos marcados)

Las células de peroxidas positivas se tiñen de pardo y la peroxidasa negativas no secolorean.

Cuente por duplicado por lo menos 200 leucocitos peroxidas-positivos en elHemocitómetro y saque el porcentaje de peroxidasa positivas y negativas.

Cummings JM & Jequier AM (1994)

Treating male infertility needs more clinical andrology, not less.

Hum Reprod 9: 1214-1219

CONCLUSION

Los cambios en el manual de laboratorio de la OMS para elexamen de semen humano están enfocados a:

• aumentar la exactitud de los datos analíticos

• suministrar más detalles experimentales de métodos

comunes

Estos deberían ayudar a mejorar

• la estandarización entre laboratorios

• el valor diagnóstico de los resultados de los análisis de

• y llevar a cabo tratamientos terapéuticos

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