actualización en el diagnóstico de...

Actualización en el Diagnóstico de MalariaDiagnóstico de Malaria

Claribel Murillo S. MScNoviembre 12 de 2010

Contenido

�Generalidades Malaria �Diagnóstico de malaria

– Tipos de diagnóstico– Pruebas diagnósticas

• Gota gruesa• Gota gruesa• Métodos fluorométricos• Moleculares• Pruebas inmuno-enzimáticas • Pruebas inmuno-cromatográficas

�Control de calidad

Un viejo conocido

Generalidades

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Malaria: victimas famosas

http://www.bbc.co.uk/mundo/ciencia_tecnologia/2010/02/100216_2236_tutankamon_adn_gz.shtml

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• “mala” “aria” = Mal aire

• “Palus” = Pantano

• Enfermedad causada por un parásito del genero Plasmodium, el cual se

transmite a través de la picadura del mosquito Anopheles.

• Agente causal identificado en 1888 por Charles Louis Alphonse Laveran.

Generalidades

•Quienes padecen malaria?

•Donde ?malaria?

•Donde ?

300 millones de casos clínicos al año

90% en niños menores de 5 años

http://www.elnuevoparquet.com/charts4fun/2010/07/18/cheryl-cole-se-recupera-de-la-

malaria/

90% en niños menores de 5 años

Incidencia estimada de malaria por 1000 habitantes, 2006

Africa 90% En América:

Brasil 40%

WHO/HTM/GMP/2008.1

Africa 90% Brasil 40%

Colombia 20%

Porcentaje estimado de casos de malaria por P. falciparum, 2006

La situación en Colombia…..

• 85% territorio colombiano cumple con las condiciones para transmisión de malaria.

• 18-24 millones de personas en riesgo.

• En el 2009: 85 mil casos aproximadamente.

Incidencia anual de malaria en Colombia (1959-2002)

600

700

800

900

1000

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2001

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Departamentos por número de casos 2010

�Antioquia�Córdoba�Chocó�Valle�Guaviare�Nariño

Número de casos y proporción acumulada por municipio

Instituto Nacional de Salud. 2010

Generalidades

• Factores que contribuyen al aumento de casos

– Conflicto armado

– Desplazamiento– Migración humana– Minería– Cepas resistentes– Cambio climático

•Quien la produce, cómo y donde ?

Esporozoito

Desarrollo de Gametos

Gameto

Cigoto

OoquinetoOocisto

FertilizaciónEsporogonia

5 especies

� P. falciparum

Na

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Ciclo de vida de PlasmodiumN

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Ciclo de vida de Plasmodium

Trofozoito

Esquizonte

Ciclo exoeritrocitico

Ciclo eritrocíticoMerozoito

Trofozoito

Merozoitos

Ezquizonte

Formación de

gametocitos

Gametocito

� P. falciparum�P. vivax�P. malariae�P. ovale�P. knowlesi

•Parásito de Macacos

•Ciclo de 24 horas

Extendido de un caso fatal de P. knowlesi en humano

http://www.sanger.ac.uk/about/press/2008/081008.html

Por qué es importante diagnosticarla?

– Prevenir la muerte– Manejo adecuado– Manejo adecuado– Prevenir la automedicación y generación de

resistencia– Epidemiología y estadísticas.

Cómo se diagnóstica?

Cómo se diagnóstica?

• Antecedente epidemiológico• Sintomatología• Prueba de diagnóstico positiva

Escalofrio, fiebre y sudoraciónAnemia

Dolor de cabezaMialgias

Esplenomegalia

Con que se diagnóstica ?

• Métodos Microscópicos• Gota gruesa• Métodos fluorométricos

• Métodos inmuno-cromatográficos/enzimáticos– Detección de antígenos parasitarios

• Métodos Moleculares– Detección de ADN

Microscópicos

Gota gruesa y extendido-Sangre periférica-Gota gruesa: varias capas celulares.

Detección.Detección.-Extendido: Monocapa celular.

Identificación.

Coloraciones derivadas de Romanowsky

•Field

•Giemsa

•Wright

http://analislaboratoriumkesehatan.blogspot.com/2010/03/thick-and-thin-blood-smears-for.html

irvingcrowley.com

www.udec.cl/ofem/neonat/svasc1b.htm

•Romanowsky modificada

Microscópicos

• Sensibilidad: 5-10 p/ul

• Su éxito depende de :• Coloración• Coloración• Equipo• Competencia-Habilidad del lector

Microscópicos

• QBC (Quantitative Buffy Coat )– Desarrollado por Becton & Dickenson.– Capilares con naranja de acridina– Microscopio con Luz UV.– Microscopio con Luz UV.

�Tan o más sensible que Gota Gruesa

�Menos tiempo de proceso

�Requiere equipo especial

�Dificultad para identificación de especie

�Falsos positivos por artefactos

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Inmuno-enzimaticos

• Detectan antígenos del parásito• Uso en bancos de sangre• Permite analizar varias muestras simultáneamente

Ac. Primario

Substrato

Conjugado

Inmuno-cromatográficas ó Pruebas de diagnóstico rápido (PDR)

• Detectan antígenos del parásito– Aldolasa– Enzima lactato deshidrogenasa (pLDH)– Proteína rica en histidina II (HRP2).– Proteína rica en histidina II (HRP2).

• Sensibilidad variable. – 200p/ul

• PDR son una alternativa diagnóstica para los lugares de difícil acceso.- Uso en brotes o epidemias.

- Auto diagnóstico en viajeros.

PDR

• Más de 40 fabricantes en el mundo.• Más de 150 pruebas diferentes.• Ventajas

– Infraestructura requerida es mínima.– Infraestructura requerida es mínima.– Simples de realizar e interpretar.– Fácil de aprender y enseñar.

• Desventajas– Incapacidad para cuantificar densidad parasitaria y diferenciar entre

estadios asexuales y sexuales.– Variabilidad de resultados entre lotes– Variabilidad en el antígeno blanco

PRINCIPIO DE LAS PRUEBAS DE DIAGNÓSTICO RÁPIDO (PDR)

Modificado de New Perspectives Malaria Diagnosis, 2000

PROCEDIMIENTO

Modificado de New Perspectives Malaria Diagnosis, 2000

PDR

Modificado de New Perspectives Malaria Diagnosis, 2000

Especificidad, sensibilidad, depende del antígeno b lanco

NECESIDAD DE UN SISTEMA DE CONTROL DE CALIDAD.

Reducir la posibilidad de diagnósticos errados.

Aseguramiento de la calidad de las PDR.

Generar confianza en los pacientes y los trabajadores de la salud.Generar confianza en los pacientes y los trabajadores de la salud.

Puntos Críticos: Transporte y almacenamiento

Degradación por humedad y calor.

FABRICANTEBPM

Evaluación del producto.

LAB. NACIONAL/REGIONALEvaluación de lotes.

ÁREAS REMOTAS / DISTRITOS

Tamizaje de sensibilidad

USUARIO FINALEntrenamiento y

supervisión.

REQUISITOS PARA UN ADECUADO SISTEMA NACIONAL DE ASEGURAMIENTO DE LA

CALIDAD DE PDR-MALARIA.

producto. Tamizaje de sensibilidadsupervisión.

TRANSPORTE Y ALMACENAMIENTO

Control y monitoreo de la temperatura

Adaptado de Bell, 2006

Moleculares

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

•Detectan blancos genéticos del parásito.•Altamente sensibles

Extracción de ADN

Principal blanco:

18s Ribosomal

Requieren equipo especial:

Termocicladores, equipo para electroforesis

Loop-Mediated Isothermal amplification (LAMP)

• Requiere extracción de ADN.• Blanco: ADN mitocondrial

Moleculares

• Blanco: ADN mitocondrial• No requiere termociclador (no cambios de temperatura

durante la reacción).• Altamente sensible.• Actualmente no es de uso convencional pero con futuro

para uso en campo.

PCR Convencional

LAMP

http://nar.oxfordjournals.org/content/28/12/e63/F1.expansion

http://www.flmnh.ufl.edu/cowries/amplify.html

LAMP• Producción de pirofosfato en la reacción,

este se une a un ión metálico divalente formando una sal insoluble.

• 30-40 minutos• Turbidimetría ó

•Mariangela

• Turbidimetría ó• Fluorescencia

http://www.nature.com/nprot/journal/v3/n5/full/nprot.2008.57.html

Bonizzoni, A

m.J. T

rop. Med. H

yg., 81(6), 2009, pp. 1030–1034

Conclusiones

• Enfermedad mortal sino se diagnóstica a tiempo.

• Tiene cura.• Fácil de diagnosticar.• Fácil de diagnosticar.• Prevalente y ampliamente distribuido en el

país.• Métodos de diagnóstico no complicados.• Métodos alternativos recientes sensibles y

factibles de aplicar en campo.

Conclusiones

• Estándar diagnóstico sigue siendo la microscopia.

• Entrenamiento y re-entrenamiento son necesarios.necesarios.

Referencias

•http://www.bbc.co.uk/mundo/ciencia_tecnologia/2010/02/100216_2236_tutankamon_adn_gz.shtml•World Health Organization RBM, UNICEF. (2005) World Malaria Report 2005. 326•World Health Organization RBM, UNICEF. (2005) World Malaria Report 2009

•WHO 2010. Basic Malaria Microscopy Part I. 2nd edition.. •Disponible en http://www.searo.who.int/LinkFiles/Malaria_malaria_microscopy_Learners_guide2010.pdf

•World Health Organization RBM, UNICEF. (2005) World Malaria Report 2009•Guía de atención de la malaria No. 19. Guías y Normas 412 - Tomo 3Final.p65. Disponible en: http://www.nacer.udea.edu.co/pdf/libros/guiamps/guias19.pdf•Pain A, Böhme u, Berry A. The genome of the simian and human malaria parasite Plasmodium knowlesi. 2008. Nature 455, 799-803.•OPS. Guía para la implementación de un sistema de gestión de calidad en el diagnóstico microscópico de malaria: Estandarización de procedimientos y herramientas sobre el control de calidad y la evaluación externa del desempeño en las redes de laboratorio. 2004. OPS/DPC/CD/M/393/06.• WHO/RBM WHO-RBM. The Use of Malaria Rapid Diagnostic Tests . Geneve-Switzerland: WHO 2003•Bell D, Wongsrichanalai C, Barnwell J. Ensuring quality and access for malaria diagnosis: how can it be achieved? Nat Rev Microbiol. 2006 Sep;4(9 Suppl):S7-20.•World Health Organization. New perspectives malaria diagnosis . Geneva: WHO; 2000.•Murray C, Gasser R, Magill J. and Miller R. Update on Rapid Diagnostic Testing for Malaria . Clinical Microbiology Reviews. Jan. 2008, p. 97–110. •Polley S, Mori Y, Watson J,Perkins M, Gonzalez I. Notomi T, Chiodini P, and Sutherland C. Mitochondrial DNA Targets Increase Sensitivity of Malaria Detection Using Loop-Mediated Isothermal Amplification. Journal of Clinical Microbiology. 2010.p. 2866–71•Tang T, Salas A, Tammam M, Martínez M, Lanza M, Arroyo E, Rubio J. First case of detection of Plasmodium knowlesi inSpain by Real Time PCR in a traveller from Southeast Asia. Malaria Journal 2010, 9:219.