actividad anti-cáncer de los extractos y sus compuestos activos obtenidos de productos naturales...

Actividad anti-cáncer de los extractos y sus Actividad anti-cáncer de los extractos y sus compuestos activos obtenidos de productos compuestos activos obtenidos de productos

naturalesnaturales

João Ernesto de CarvalhoJoão Ernesto de Carvalho

RIBECANCER

Itajaí – SC - BR26 – 28/11/2012

RIBECANCER

Búsqueda de nuevos medicamentos contra el cáncerBúsqueda de nuevos medicamentos contra el cáncer

Triage (screening) inicial en cultura de células tumorales humanasTriage (screening) inicial en cultura de células tumorales humanas

Estudios de los mecanismos de acciónEstudios de los mecanismos de acción

Modelos experimentales de cáncer en animales de laboratorioModelos experimentales de cáncer en animales de laboratorio

Estudios de toxicidadEstudios de toxicidad

Estudios clínicos Estudios clínicos

Triage (screening) inicial: Triage (screening) inicial: líneas celulares de cáncer humanolíneas celulares de cáncer humano

Leucemia (K 562) Pulmón (NCI H460) Mama (MCF 7) Ovario con fenotipo de resistencia a múltiplos fármacos (NCI ADR) Melanoma (UACC 62) Riñón (786 0) Colon (HT 29) Ovario(OVCAR 03) Próstata (PCO 3) Glioma (U251)

Triage Triage in vitroin vitroInoculaciónInoculaciónplacas de 96placas de 96

pocillospocillos

InoculaciónInoculaciónplacas de 96placas de 96

pocillospocillos

Adición de las Adición de las muestrasmuestras

Adición de las Adición de las muestrasmuestras

Fijación ácidaFijación ácidade la placa controlede la placa controle

(tiempo cero)(tiempo cero)

Fijación ácidaFijación ácidade la placa controlede la placa controle

(tiempo cero)(tiempo cero)

Fijación:Fijación:adición deadición de

ácidoácido

Fijación:Fijación:adición deadición de

ácidoácido

ColoraciónColoraciónSRBSRB

ColoraciónColoraciónSRBSRB

SolubilizaciónSolubilizacióndel colorantedel colorante(trizma base)(trizma base)

SolubilizaciónSolubilizacióndel colorantedel colorante(trizma base)(trizma base)

DensidadDensidadóptica óptica 540 nm540 nm

DensidadDensidadóptica óptica 540 nm540 nm

IncubaciónIncubación24 horas24 horas

IncubaciónIncubación24 horas24 horas

IncubaciónIncubación48 horas48 horas

IncubaciónIncubación48 horas48 horas

RPMI +RPMI +soro fetal bovinosoro fetal bovinoRPMI +RPMI +soro fetal bovinosoro fetal bovino

ContrContrcélulacélula

Branco Branco meiomeio

Branco substância testeBranco substância teste

11

D1D1 D2D2 D3D3

Branco substância testeBranco substância teste

22

44 5533

DoxorrubicinaDoxorrubicina

Holbeck, S.L. Update on NCI in vitro drug screen utilitiesEuropean Journal of Cancer 40 (2004) 785–793

UNIVALI/RIBECANCERUNIVALI/RIBECANCER

10-3 10-2 10-1 100 101 102

-100

-75

-50

-25

0

25

50

75

100

250252,5

Cre

scim

ento

Cel

ular

(%

)

U251 UACC-62 MCF7 NCI/ADR-RES 786-0 NCI-H460 PC-3 HT29 K-562 HaCaT

120806 Ext MeOH G. achachairu galhos

0,25 10-3 10-2 10-1 100 101 102

-100

-75

-50

-25

0

25

50

75

100

250252,5

Cre

scim

ento

Cel

ular

(%

)

U251 UACC-62 MCF7 NCI/ADR-RES 786-0 NCI-H460 PC-3 HT29 K-562 HaCaT

120806 Ext MeOH G. achachairu folhas

0,25

10-3 10-2 10-1 100 101 102

-100

-75

-50

-25

0

25

50

75

100

250252,5

Cre

scim

ento

Cel

ular

(%

)

U251 UACC-62 MCF7 NCI/ADR-RES 786-0 NCI-H460 PC-3 HT29 K-562 HaCaT

120806 Ext MeOH G. achachairu sementes

0,25

10-3 10-2 10-1 100 101 102

-100

-75

-50

-25

0

25

50

75

100

250252,5C

resc

imen

to C

elul

ar (

%)

U251 UACC-62 MCF7 NCI/ADR-RES 786-0 NCI-H460 PC-3 HT29 K-562 HaCaT

120806 DCLNFM

0,25

Colecta y IdentificaciónColecta y IdentificaciónColecta y IdentificaciónColecta y Identificación

Material vegetalMaterial vegetalMaterial vegetalMaterial vegetal

Extracto orgânicoExtracto orgânicoExtracto orgânicoExtracto orgânico Material vegetalMaterial vegetalMaterial vegetalMaterial vegetal

ExtractoExtractohidroalcoólicohidroalcoólico

ExtractoExtractohidroalcoólicohidroalcoólico

diclorometanodiclorometano

etanol 70%etanol 70%

Teste de actividadTeste de actividadanticâncer anticâncer in vitroin vitro

5-10 mg5-10 mg

Teste de actividadTeste de actividadanticâncer anticâncer in vitroin vitro

5-10 mg5-10 mg

segundasegundacolectacolecta

segundasegundacolectacolecta

FraccionamientoFraccionamientode los extractos activosde los extractos activos

FraccionamientoFraccionamientode los extractos activosde los extractos activos

FraccionamentoFraccionamentoDe los extractos activosDe los extractos activos

FraccionamentoFraccionamentoDe los extractos activosDe los extractos activos

Teste de actividadTeste de actividadanticâncer anticâncer in vitroin vitro

5-10 mg5-10 mg

Teste de actividadTeste de actividadanticâncer anticâncer in vitroin vitro

5-10 mg5-10 mg

AislamientoAislamientoprincípios activosprincípios activos

AislamientoAislamientoprincípios activosprincípios activos

Teste atividadeTeste atividadeantiproliferativaantiproliferativaTeste atividadeTeste atividadeantiproliferativaantiproliferativa

IdentificaciónIdentificaciónprincípios activosprincípios activos

IdentificaciónIdentificaciónprincípios activosprincípios activos

Estudios agronômicosEstudios agronômicosy cultivoy cultivo

Estudios agronômicosEstudios agronômicosy cultivoy cultivo

IdentificaciónIdentificaciónprincípios activosprincípios activos

IdentificaciónIdentificaciónprincípios activosprincípios activos

Extración y aislamientoExtración y aislamientoen gran cuantidaden gran cuantidad

Extración y aislamientoExtración y aislamientoen gran cuantidaden gran cuantidadsíntesissíntesissíntesissíntesis

MecanismoMecanismode acciónde acción

MecanismoMecanismode acciónde acción

Testes en Testes en animales de laboratorioanimales de laboratorio

0,1 – 100 gramos0,1 – 100 gramos

Testes en Testes en animales de laboratorioanimales de laboratorio

0,1 – 100 gramos0,1 – 100 gramos

FormulaciónFormulaciónfarmacéuticafarmacéuticaFormulaciónFormulaciónfarmacéuticafarmacéutica

ToxicologíaToxicologíapre-clínicapre-clínica

ToxicologíaToxicologíapre-clínicapre-clínica

Estudios clínicosEstudios clínicosFases I, II, III e IVFases I, II, III e IVEstudios clínicosEstudios clínicosFases I, II, III e IVFases I, II, III e IV

Testes in vivo

EBD - EBD - Pothomorphe umbellata Pothomorphe umbellata (Piperaceae) - pimienta(Piperaceae) - pimienta

Sacoman et al. Braz. J. Medical Biological Res. 41: 411, 2008 Sacoman et al. Braz. J. Medical Biological Res. 41: 411, 2008

Tumor ascitico de Ehrlich en ratones

Inoculación 0,5 mL 104 celulas del tumor de Ehrlich en el abdomen de ratones

Inoculación 0,5 mL 104 celulas del tumor de Ehrlich en el abdomen de ratones

ip. viaip. viaTratamientos: 40, 110 y 180diaControle negativo: salinaControle positivo: doxorrubicina 5 mg/ kg EBD 100, 200 y 400 mg/ kg

Tratamientos: 40, 110 y 180diaControle negativo: salinaControle positivo: doxorrubicina 5 mg/ kg EBD 100, 200 y 400 mg/ kg

Pós-inoculación

Numero y fechas de las muertes ANOVA y curva

de sobrevida Kaplan-Meier

Numero y fechas de las muertes ANOVA y curva

de sobrevida Kaplan-Meier

n=10n=10

Sacoman et al. Braz. J. Medical Biological Res. 41: 411, 2008Sacoman et al. Braz. J. Medical Biological Res. 41: 411, 2008

Tumor ascítico de Ehrlich: curva de sobrevida

Tumor sólido Ehrlich en ratonesTumor sólido Ehrlich en ratones

Las celulas del tumor de Ehrlich son inoculadas en la pata Las celulas del tumor de Ehrlich son inoculadas en la pata

Evaluación:Evaluación:

– medida del volumen de la patamedida del volumen de la pata

– peso relativo del tumorpeso relativo del tumor

– analises histológicasanalises histológicas

– aumento de peso de los animales aumento de peso de los animales

Pletismometro: determinación del volumen tumoral Pletismometro: determinación del volumen tumoral

Tumor sólido de Ehrlich en ratonesTumor sólido de Ehrlich en ratones

Dosis de 30 mg/kg inibición de crecimiento

Metástasis pulmonar inducida pela linaje B16-F10 (melanoma)

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

conc

entr

ação

de

mel

anin

a/m

assa

pul

mão

veículo rac-GTN 100mg/kg

*

Fibra semipermeable (Hollow-fiber)Fibra semipermeable (Hollow-fiber)

- - Encapsulamiento de la linaje tumoral y Encapsulamiento de la linaje tumoral y incubación por incubación por 24 horas24 horas

- Implante de las fibras en ratonesImplante de las fibras en ratones Balb-C, tBalb-C, tejido subcutáneo dorsal y ejido subcutáneo dorsal y

abdomenabdomen

TratamientosTratamientos

- - Sacrificio en el 14º. día para evaluación Sacrificio en el 14º. día para evaluación de la viabilidad celular por de la viabilidad celular por MTTMTT

Fibra semipermeable: tejido subcutáneo dorsal y abdomenFibra semipermeable: tejido subcutáneo dorsal y abdomen

Hollow-Fiber – Hollow-Fiber – K. coriaceaK. coriacea (Fr7) (Fr7)

Salina Doxorrubicina Fr7

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

**

**

****

Ab

sorb

an

ce MCF7 NCIADR OVCAR

Hollow-fiber: Hollow-fiber: abdomen abdomen Hollow-fiber: Hollow-fiber: abdomen abdomen

Hollow-FiberHollow-Fiber model – model – K. coriaceaK. coriacea ( (Fr7)Fr7)

Salina Doxorrubicina Fr70,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

****

Ab

so

rba

nce

MCF7 NCIADR OVCAR

Hollow-fiber: Hollow-fiber: subcutáneo dorsal subcutáneo dorsal Hollow-fiber: Hollow-fiber: subcutáneo dorsal subcutáneo dorsal

Metodologías en desarrolloMetodologías en desarrollo

Tumor xenográficoTumor xenográficoCitometria de flujoCitometria de flujo

GraciasGraciasJoão Ernesto de Carvalho

Divisão de Farmacologia e ToxicologiaCPQBA – Unicamp

carvalho@cpqba.unicamp.br