9. enzimas
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¿Cuándo tiene lugar una reacción química? (1)
- Las reacciones que tienen lugar espontáneamente suelen serexotérmicas, esto es, con desprendimiento de calor.
- El calor que se desprende o absorbe en una reacción a presiónconstante recibe el nombre de Entalpía (DH). Las reacciones enlas que se desprende calor son exotérmicas y por convención, laentalpía se supone negativa: DH < 0
ΔH = ΔH productos- ΔH sustratos
- Sin embargo, hay reacciones endotérmicas que cursan espontá-neamente, DH > 0; por ejemplo, la disolución de sulfato amónicoen agua.
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¿Cuándo tiene lugar una reacción química? (2)
- La disolución de sulfato amónico en agua es un proceso porel cual se pasa de un sistema altamente ordenado, cual es elestado cristalino, a otro de mucho mayor desorden molecular.
- La función termodinámica que mide el desorden de un sistemarecibe el nombre de Entropía (DS). Puede observarse que muchasreacciones que cursan espontáneamente lo hacen con incremento
positivo de entropía: DS > 0.
- Sin embargo, hay procesos espontáneos que cursan con dismi-nución de entropía, p.e.: la solidificación del agua a 0ºC.
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¿Cuándo tiene lugar una reacción química? (3)
- Ni la entropía ni la entalpía valen como criterio único paradefinir la espontaneidad de una reacción.- Existe otra función termodinámica de estado que agrupa alas dos en procesos a presión constante, la Energía Libre deGibbs, que se define así:
DG = DH - TDS
- La energía libre de Gibbs es un criterio válido para verificarla espontaneidad de una reacción. Pueden cursar espontánea-mente aquellos procesos en los que se desprende energía libre,exergónicos, (DG < 0). No pueden hacerlo, sin embargo,aquellos procesos en los que se absorbe energía libre,endergónicos (DG > 0)
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Sea un sistema
A BLa reacción cursará de izquierda a derecha cuando las concentra-ciones de A y B sean tales que la energía libre del sistema seanegativa. La energía libre del sistema viene dada por:
DG = DG0 + RT ln[A] [B]
Donde DG0
es la Energía Libre Standard de la reacción: la energíalibre del sistema con los reactivos a concentración unidad, en condi-ciones STP. Hay tablas que nos dan la DG0 para toda reacción. A
partir de las mismas podemos calcular si un proceso puede tenerlugar espontáneamente o no en unas determinadas condiciones.
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Ejemplo:
Calcular la energía libre del proceso de descomposición del
éster Glucosa-6-fosfato a Glucosa y fosfato inorgánico en lascondiciones intracelulares, que son:
Temperatura: 37 ºC, equivalentes a 310 ºK[Glucosa-6-fosfato], 1 mM[Glucosa], 0.01 mM[fosfato], 10 mM
La reacción es:
G6P + H2O G + Pi
La Energía Libre Standard de la reacción es de -3250 cal/mol
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La expresión que nos da la Energía Libre es:
DG = DG0 + RT ln[Glucosa] [Fosfato]
[Glucosa-6-fosfato]
(No se tiene en cuenta el agua porque su concentración seconsidera constante)
Sustituyendo, obtenemos:
DG = -3250 + 1.98*310*2.303* log 10-5*10-3
10-2= -8900 cal/mol
Por lo tanto, en las condiciones intracelulares el proceso puede tener lugar espontáneamente.
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La expresión que nos da la energía libre de un proceso tieneotra importante derivación. Para la reacción
DG = DG0 + RT ln
[A]
[B]
A BEsta expresión es:
En el equilibrio, DG = 0; por tanto,
0 = DG0 + RT ln[Aeq]
[Beq]
Pero[Aeq] [Beq] = K eq Por tanto, DG0 = -RT ln K eq
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En general, podemos decir:
Reacciones catabólicas: DG < 0
Reacciones anabólicas: DG > 0
Supongamos una reacción anabólica mediante la cual se formaun enlace químico entre A y B; esquemáticamente,
A + B A-B ( DG > 0)
La reacción no puede tener lugar espontáneamente. ¿Cómo puede entonces tener lugar en el metabolismo?
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Lo que ocurre en el metabolismo es que las reaccionesendergónicas (DG > 0) se acoplan a reacciones exergónicas(DG < 0) de manera que :
1. La energía desprendida en una de las reacciones es absorbida por la otra.
2. La suma total de energías libres de una y otra reacción da unaDG < 0, por lo que el proceso en conjunto tiene lugar espontánea-
mente.
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El polifosfato mayoritario en las reacciones de acoplamiento
energético es el ATP, 5’-Adenosina trifosfato:
OCH2 N
N
N
N
NH2
OHOH
OPOPOP-O
O O O
O-O-O-
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De esta manera, los procesos catabólicos productores de energíageneran ATP, que se empleará en todas aquellas reacciones ender-
gónicas en las que sea requerido.En general, el ATP se produce de dos maneras:
1. Por fosforilación a nivel de substrato(procesos anaeróbicos, fermentativos)Por ejemplo: La Glicolisis
2. Por fosforilación oxidativa
(procesos aeróbicos, oxidativos)Por ejemplo: Ciclo de Krebs, - b oxidación, etc.
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Los dos enlaces anhídrido del polifosfato del ATP son el ejemplode configuraciones de alta energía de hidrólisis:
OPOPOP-O
O O O
O-O-O-
R
Existen otras configuraciones de alta energía, por ejemplo:
Fosfoenolpiruvato
O-PO
O
O-
C
CH2
COO-
O-P
O
O-
NHC
NH
N
CH3
CH2
C
O
-O
Fosfocreatina
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O-P
O
O-OC
O
H2N
Carbamilfosfato
R C
O
S CoA
Tioésteres de Coenzima A
Otras configuraciones de alta energía de hidrólisis
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Consideremos ahora la reacción de degradación aeróbica de la glucosa:
C6H12O6 + 6O2 6CO2 + 6H2O DG0’ = -684 kcal/mol
Según lo hasta ahora expuesto, esta reacción es fuertementeexergónica, por lo que debería cursar espontáneamente.
Sin embargo, la glucosa en presencia de oxígeno es perfectamenteestable y no entra espontáneamente en combustión.
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Ello es debido a que los reactivos han de superar una barreraenergética, la Energía de Activación:
Energía
Coordenadade reacción
Ea G + O2
CO2 + H2ODG0
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La barrera energética que separa al papel del CO2 es de 451ºF o 233ºC. A
esta temperatura todas las moléculasdel papel se transformanespontáneamente a producto.A temperatura ambiente existe unaamplia distribución de energía en lasmoléculas de papel y sólo algunas deellas alcanzan a romper la barreraenergética lo que hace que el papel sevaya destruyendo a muy bajavelocidad pero en forma constante.(Todos los papeles con el tiempo se
tornan amarillos, luego se convertiránen polvo).Un catalizador como el ácidosulfúrico hará que la reacción seainmediata.
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Introducción a la Enzimología
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DG
Ea
DG
Ea’
Reacciónno catalizada
Reaccióncatalizada
Catálisis
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Enzima: Proteína dotada de actividad catalítica
- Enzimas proteolíticas- Desnaturalización de enzimas- Purificación de enzimas
- Síntesis completa de una enzima
A partir de 1982, se sabe que no todas las enzimas son
proteínas; existen moléculas de RNA con actividad cata-lítica, las llamadas ribozimas
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En la catálisis química se distingue entre:
- Catálisis homogénea, cuando catalizador y reactivosestán en la misma fase físicoquímica: Por ejemplo, lahidrólisis ácida de la sacarosa.
- Catálisis heterogénea, cuando catalizador y reactivosestán en distinta fase físicoquímica: por ejemplo, lareacción en fase gaseosa entre N2 y H2 para formar amoníaco(proceso Haber), que es catalizada por metales (sólidos)
La catálisis enzimática tiene características de ambas
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Los siguientes hechos:
- Especificidad de la reacción enzimática- Carácter heterogéneo de la catálisis enzimática
Nos llevan a postular la existencia de un Centro Activo enla molécula de enzima, capaz de:
- Fijar específicamente al substrato
- Transformarlo catalíticamente.
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Lisozima y susubstrato
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Substrato: molécula(s) sobre la(s) que actúa la enzima
Actividad enzimática: velocidad a la que cursa la reacciónenzimática
Velocidad: variación de la concentración en la unidadde tiempo
Unidades:katal: moles.s-1 U.I.: mmoles.min-1 (a 25ºC)
La velocidad es directamente proporcional de la concentraciónde enzima; por tanto, la velocidad es una medida de la concen-tración de enzima en una preparación.
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Cofactor (Coenzima):
Átomo, ion o molécula que participa en el procesocatalítico sin ser enzima ni substrato.
Los cofactores participan de dos maneras distintas:
1. A través de una fijación muy fuerte a la proteína y salensin ser modificados del ciclo catalítico
2. Como un segundo substrato; salen modificados del ciclocatalítico y por lo general requieren otra enzima para volveral estado original.
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R CH
NH3+
COO- + O2 + H2O R CO COO- + H2O2 + NH4
+
Aminoácido CetoácidoLAO
LAO: L-aminoácido oxidasa: es una flavoproteína
Las flavoproteínas tienen un grupo prostético flavínico,que interviene en el proceso catalítico sin salir modificadodel mismo
NH
N NH
N O
H3C
H3C
O
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COO-
C O
CH3
COO-
CHO H
CH3
NADH + H+ NAD+
Piruvato L-Lactato
LDH
LDH: Lactato deshidrogenasa
Utiliza como cofactor NADH, el cual sale de la reacción
oxidado a NAD+. La regeneración a NADH requeriría otraenzima.
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Los cofactores que están unidos a la enzima en forma covalentereciben el nombre de grupo prostético.
Las enzimas unidas al su grupo prostético se conocen comoHOLOENZIMAS, poseen actividad.
Las enzimas carentes de su grupo prostético se conocen como
APOENZIMAS, y no presentan actividad.
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Isoenzimas: formas moleculares distintas de una enzima dentro
del mismo organismo
Hexokinasa: Presenta, al menos, cuatro formas distintas
- Hepática- Cerebral- Muscular- Eritrocitaria
Las isoenzimas representan formas que tienen que ver conla diferenciación celular, presentando distintas característicasfuncionales.
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Especificidad de las enzimas, 1
Especificidad absoluta:
Enzima:
Fumarato hidratasa
Específica para elisómero trans- porun lado y para elL- por otro.
COO-
CHCH
COO-
H2O COO-
CHCH2
COO-
HO
Fumarato(trans-) L-Malato
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Especificidad de las enzimas, 2
Especificidad de grupo:
R CO O R' + H2O R COOH + HO R'
Esterasa
Las carboxilesterasas hidrolizan todo tipo de ésteres, independien-temente de la naturaleza de R o R’
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Otras características de la acción enzimática
Eficiencia catalítica
En ocasiones llega a ser enorme; con números de recambiodel orden de 108 s-1
Las enzimas que han llegado a este límite reciben el nombrede Enzimas plenamente evolucionadas, ya que un incrementoen la actividad no tendría sentido al superar la velocidad dedifusión de los substratos.
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Teorías de la acción enzimática, 1
Modelo de Llave y Cerradura (Emil Fischer)
Substrato y enzima se acoplan de forma estereospecífica,de la misma manera que una llave se ajusta a su cerradura.
Modelo aceptado durante mucho tiempo; hoy se considera
insuficiente al no explicar algunos fenómenos de la inhibi-ción enzimática, por ejemplo
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Teorías de la acción enzimática, 2
Modelo de Ajuste Inducido (Koshland)
Tanto la enzima como el substrato sufren una alteración
en su estructura por el hecho físico de la unión.
Está mucho más de acuerdo con todos los datos experimen-tales conocidos hasta el momento.
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Teorías de la acción enzimática, 3
La teoría del Ajuste Inducido se amplía en la actualidaddefiniendo la acción enzimática como
Estabilización del Estado de Transición
Según lo cual, el Centro Activo enzimático es en realidadcomplementario no al substrato o al producto, sino al
estado de transición entre ambos.
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R C
O
O R' Substrato: un éster
R C O R'
O-
O-
Estado de transición:
intermediario tetraédrico,inestable
R C
O
O- HO R' Productos
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R P O
O-
O-R'
Análogo de Estado de Transición
Derivado fosforilado, que no es substratode la reacción, pero que por su analogíaestructural ocupa el centro activo de laenzima e inhibe fuertemente a la reacción
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Clasificación y nomenclatura de enzimasReacciones enzimáticas
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ATP: hexosa fosfotransferasa
Nombre sistemático:
Donador Aceptor
Grupo transferido
EC 2.7.1.1
Número sistemático
EnzymeComission
Grupo Subgrupo
Sub-subgrupo Enzima
Nombre común: Hexokinasa
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1. Oxidorreductasas
2. Transferasas
3. Hidrolasas
4. Liasas
5. Isomerasas
6. Ligasas
Clasificación de enzimas:Grupos
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Cinética de las reacciones enzimáticas
C d l id d i i i l
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t
s
p [ ]
Concepto de velocidad inicial
d[ ]dtv = , t -> 0
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Variables que influyen en la velocidad de unareacción enzimática
1. Concentración de enzima
2. Concentración de substrato
3. pH
4. Temperatura
5. Efectores (Activadores e Inhibidores)
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S
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S
EES
P
EP
Ciclo catalíticode una enzima
Una cinética lineal implicaun proceso regenerativo,
cíclico
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v
[s]
Efecto de la concentración de substrato
.
.
. . . . ..
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E + S ES E + Pk +1
k -1
k +2
Una cinética hiperbólica implica un proceso saturante:
Hay un número limitado de sitios en la enzima para fijar substrato; una vez que están ocupadostodos, por mucho que aumente la concentración
de substrato, la velocidad permanecerá constantetendiendo a un valor asintótico
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E + S ES E + Pk +1
k -1
k +2
s = [S]x = [ES]
e = [E]e0 = [ES] + [E] = x + e
ds/dt = - k +1es + k -1xde/dt = - k +1es + (k -1 + k +2) x
dx/dt = k +1es - (k -1 + k +2) xdp/dt = k +2 xe0 = e + x
Descripción dinámica de la catálisis enzimática
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El sistema de ecuaciones diferenciales que describe la dinámicadel sistema
E + S ES E + Pk +1
k -1
k +2
No admite solución analítica. Para describirlo recurrimos a:
- Simulaciones numéricas
- Hipótesis que lo simplifiquen
Simulación numérica del sistema
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Simulación numérica del sistema
E + S ES E + Pk +1
k -1
k +2
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Hipótesis de estado estacionario
Según veíamos en la simulación numérica, hay un tiemporelativamente prolongado en el curso de la reacción en elque la variación de complejo [ES] es prácticamente iguala cero:
dx/dt = k +1es - (k -1 + k +2) x = 0
A partir de esta expresión podemos llegar a obtener una
expresión que nos da la velocidad para la concentraciónde substrato
d
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dx
dt k es k k x
0 1 1 2
k es k e x s k k x 1 1 0 1 2
xe s
k k
k s
e s
K sm
0
1 2
1
0
v V s K sm
max
v k x 2 k e V 2 0 max
Hipótesis deestado estacionario
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Tanto con las suposiciones de Michaelis-Menten como conLas de estado estacionario, llegamos a la ecuación
v =Vmaxs
K m + s
La única diferencia radica en el significado de K m:
K m = k -1/k +1 en mecanismo de M.M.
K m = (k -1 + k +2)/k +1 en mecanismo de E.E.
Significado de la constante K
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Significado de la constante K m
1. Constante de equilibrio de disociación del complejo ES(en condiciones de equilibrio rápido)
2. Medida inversa de la afinidad de la enzima por el substrato(en condiciones de equilibrio rápido)
3. Mide la función de fijación (en cond.de equilibrio rápido)
4. Concentración de substrato para la que la velocidad se hace
igual a la mitad de la máxima (s0.5)
5. Se define para una pareja enzima-substrato
6. Se mide en unidades de concentración
Significado de la constante V = k e
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Significado de la constante Vmax = k +2 e0
1. Velocidad asintótica para s
2. Directamente proporcional a la concentración de enzima
(hoy se prefiere caracterizar a la enzima por k +2)
3. Mide función de transformación catalítica
4. Se expresa en unidades de velocidad
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Representación directa
s
0 20 40 60 80 100
v
0
20
40
60
80
100
Km
Vmax
vV s
K smx
m
Representación recíproca doble
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Representación recíproca doble(Lineweaver - Burk)
1/s
-0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6
1/v
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
1 1 1
v
K
V s V m
mx mx
-1/K m
1/Vmax
-
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Efecto del pH
pH
v
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1. Sobre la fijación del substrato al centro activo:- Grupos disociables de la enzima- Grupos disociables del substrato
2. Sobre la transformación catalítica del substrato
3. Sobre la estructura de la proteína enzimática
Efecto del pH
NH A
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Succinato ycentro activo de SDH
pH 7
COO-
CH2
CH2
COO-
+H3NC
NH
NH
CH
+H3N
CH
Arg
Lys
-
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Succinato ycentro activo de SDH,
pH 2
COOHCH2
CH2
COOH
+H3NC
NH
NH
CH
+H3N
CH
NH
-
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COO-
CH2
CH2
COO
-
H2N
C
NH
NH
CH
H2N
CH
Succinato ycentro activo de SDH,
pH 13
-
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Efecto de la temperatura
v
T
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En el efecto de la temperatura hay dos componentes:
1. Aceleración de la reacción según la ecuaciónde Arrhenius
k = A exp (-Ea/RT)
2. Desnaturalización térmica de la proteína
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Inhibición enzimática
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Inhibidor:
Efector que hace disminuir la actividad enzimática, a través deinteracciones con el centro activo u otros centros específicos(alostéricos).
Esta definición excluye todos aquellos agentes que inactivan ala enzima a través de desnaturalización de la molécula enzimática
De esta forma, habrá dos tipos de inhibidores:
I. Isostéricos: ejercen su acción sobre el centro activoII. Alostéricos: ejercen su acción sobre otra parte de la
molécula, causando un cambio conformacional conrepercusión negativa en la actividad enzimática.
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Los inhibidores isostéricos pueden ser de dos tipos:
1. Inhibidor reversible: establece un equilibrio con la enzima libre,con el complejo enzima-substrato o con ambos:
E + I EI
2. Inhibidor irreversible: modifica químicamente a la enzima:E + I E’
ES + I ESI
Inhibición reversible
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Inhibición reversible
(a) El inhibidor se fija al centro activo de la enzima libre,impidiendo la fijación del substrato: Inhibición Competitiva
(b) El inhibidor se fija a la enzima independientemente de que lo
haga o no el substrato; el inhibidor, por tanto, no impide lafijación del substrato a la enzima, pero sí impide la accióncatalítica: Inhibición No Competitiva
(c) El inhibidor se fija únicamente al complejo enzima-substrato
una vez formado, impidiendo la acción catalítica; este tipose conoce como Inhibición Anticompetitiva
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E ES
EI
I
S
E + PInhibición
Competitiva
Las fijaciones de substrato e inhibidor sonmutuamente exclusivas; el complejo EI no es productivo
-
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E ES
EI
I
S
E + PI
ESI
SInhibición
No Competitiva
El inhibidor se fija indistintamente a la enzima libre Ey al complejo enzima-substrato ES; ni el complejo EIni el complejo ESI son productivos
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E ES
S
E + PI
ESI
Inhibición
Acompetitiva
El inhibidor sólo puede fijarse al complejo ES;el complejo ESI no es productivo
Inhibición Competitiva
-
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E ES
EI
I
S
E + P
Características:- Las fijaciones de substrato e inhibidor son mutuamente exclusivas
- A muy altas concentraciones de substrato desaparece la inhibición- Por lo general, el inhibidor competitivo es un análogo químico del
substrato.- El inhibidor es tan específico como el substrato
Se define una constante deequilibrio de disociación delinhibidor: K i =
[E] [I]
[EI]
Inhibición Competitiva
E di i d ilib i á id ll d l ió
-
8/16/2019 9. Enzimas
81/230
En condiciones de equilibrio rápido, llamando y a la concentracióndel complejo EI, para la inhibición competitiva obtenemos el siste-ma de ecuaciones
vV s
K i
K s
mx
m
i
1
K e x y s
x
K e x y i y
m
i
( )
( )
0
0
Que resuelto para x nos da
xe s
K i
K sm
i
0
1
De donde
-
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82/230
Por tanto, en la inhibición competitiva,
1. El efecto cinético del inhibidor es el aumento aparente de laK m, que aparece multiplicada por el factor (1 + i/K i)
2. La Vmax no aparece modificada; para concentraciones muyaltas del substrato, v = Vmax, igual que en ausencia de inhibidor
3. Cuanto más pequeño sea el valor de K i mayor será la potenciadel inhibidor competitivo.
-
8/16/2019 9. Enzimas
83/230
Representación directaInhibición competitiva
s
0 20 40 60 80 100 120
v
0
20
40
60
80
100
120
Inhibición competitiva - Representación recíproca doble
-
8/16/2019 9. Enzimas
84/230
1/s-0.3 -0.2 -0.1 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
1/v
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.07
-1/K m
-1/(K m
(1 + i/K i))
1/Vmax
Inhibidores
-
8/16/2019 9. Enzimas
85/230
COO-
CH2
CH2
COO-
FAD FADH2 COO
-
CH
CH
COO-
Succinato Fumarato
SDH
Succinato deshidrogenasa COO-
CH2
COO-
Malonato
COO-
C O
CH2
COO-
Oxalacetato
competitivos
-
8/16/2019 9. Enzimas
86/230
COO-
CH2
CH2
COO-
Succinato
COO-
C O
CH2
COO-
Oxalacetato
Inhibidores competitivos
como ánalogos estructuralesdel substrato
OO
-
8/16/2019 9. Enzimas
87/230
H2N S
O
NH2H2N C
O-
4-aminobencenosulfonamida
4-aminobenzoato
N NH2NH
-
8/16/2019 9. Enzimas
88/230
N
N
N
N
H2N
N
C NH
O
C H
COO-
CH2CH2
CO OH
CH3
n
Ác. Fólico
Methotrexate
NN
OH
N
C NH
O
C H
COO-
CH2
CH2
CO OH
H
n
-
8/16/2019 9. Enzimas
89/230
NH
HN
O
O
CH3
NH
HN
O
O
Br
Timina
5-Bromouracilo
Análogos de base
NH
-
8/16/2019 9. Enzimas
90/230
OHOCH2
OH
N
O
NH2
OH
OHOCH2
OH
N
O
NH2
OH
Citidina
Citosinaarabinósido
Análogos denucleósido
-
8/16/2019 9. Enzimas
91/230
Un paso más allá en el desarrollo de inhibidores potentes
es el concepto de Análogo de Estado de Transición (AET)
- El inhibidor no es estrictamente análogo del substrato,
sino del Estado de Transición de la reacción.
- La afinidad de las enzimas por los AET es enorme, delorden nM o pM, con lo que la fijación es tan fuerte que
puede considerarse irreversible
C
O
N+H3C
CH S bt t
-
8/16/2019 9. Enzimas
92/230
O2N OC
ON CH3
CH3
O2N OP
ON+
H3C
CH3
CH3
-O O-
Susbtrato
O2N OC
ON+
H3C
CH3
CH3
-O O-
Estado de transición
O2N OH + ON+
H3C
CH3
CH3
C
O
HO Productos
Análogo deestado de transición
-
8/16/2019 9. Enzimas
93/230
Substrato
Estado detransición
Análogo deestado de transición
Aspartato
-
8/16/2019 9. Enzimas
94/230
COO-
H2CNH
-OOCO
NH2
O-
PO O-
O-
PO O-
O-
CH2
COO-
H2C
NH-OOC
O
transcarbamilasa
Estado detransición
Análogo deestado de transición:
N-fosfonoacetil L-aspartato(PALA)
Angiotensinógeno
-
8/16/2019 9. Enzimas
95/230
Angiotensina IDRVYIHPFHL
Angiotensina IIDRVYIHPF
HL
Renina
Enzima convertidora
de Angiotensina, ECA
Hipotensión,
hipovolemia,
ortostatismo
Aumento de la presión arterial
Análogos de Estado de Transición: Captopril
-
8/16/2019 9. Enzimas
96/230
C O
HNCH COO-
R
C HR'NH
C-O C
HO
+
Zn2+
+
Zn2+
C O
NCH COO
-
CH3C H
CH-S
H
Estado de transiciónde la ECA
CaptoprilEnalapril
Ramipril
Inhibición Irreversible
-
8/16/2019 9. Enzimas
97/230
- Los inhibidores irreversibles reaccionan con un grupo
químico de la enzima, modificándola covalentemente
- Su acción no se describe por una constante de equilibrio K i,sino por una constante de velocidad k i:
E + I E’
- A diferencia de la inhibición reversible, el efecto de losinhibidores irreversibles depende del tiempo de actuación
del inhibidor.
- Los inhibidores irreversibles son, por lo general, altamentetóxicos.
Algunos tipos de inhibidores irreversibles
-
8/16/2019 9. Enzimas
98/230
Algunos tipos de inhibidores irreversibles
1. Reactivos de grupos -SH
2. Organofosfóricos
3. Ligandos de metales
4. Metales pesados
Reactivos de grupos -SH, 1
-
8/16/2019 9. Enzimas
99/230
(a) Agentes alquilantes
E SH E S CH2 COO-
ICH2 COO- IHYodoacetato
(b) Compuestos insaturados
N CH2 CH3
O
O
E SHE S
N CH2 CH3
O
O
N-Etil maleimida (NEM )
Reactivos de grupos -SH, 2
-
8/16/2019 9. Enzimas
100/230
g p
(c) Formadores de mercáptidos
HOHg COO-
E SH E S Hg COO-
p-Hidroximercuribenzoato
(d) Oxidantes
Promueven la oxidación de dos tioles a un disulfuro
Organofosfóricos
-
8/16/2019 9. Enzimas
101/230
CH CH2 OHSer
PF O
CH
CH
H3C CH3
CH3H3C
CH CH2 O P O
CH
CH
H3C CH
3
CH3H3C
Ser
DFP:
diisopropil
fluorofosfato
- Actúan sobre enzimas serínicas
- Únicamente sobre la Ser activa- Insecticidas: Parathion, Malathion- Inhibidores de la Acetilcolinesterasa- Neurogases
Ligandos de coordinación de metales
-
8/16/2019 9. Enzimas
102/230
Ligandos de coordinación de metales
Es el caso del ion cianuro, CN-
Se fija con gran afinidad a la sexta posición de coordinacióndel Fe hemínico, impidiendo toda modificación posterior.
Por ello actúa sobre sistemas de Fe hemínico con la sexta posición de coordinación libre, como la citocromo oxidasa,de lo que deriva su elevadísima toxicidad
Substratos suicidas
-
8/16/2019 9. Enzimas
103/230
Substratos suicidas
(Inhibidores activados enzimáticamente)
- Se trata de moléculas que se unen al centro activo de maneraespecífica, igual que el substrato o los inhibidores competitivos
- Una vez unidos al centro activo, la enzima transforma lamolécula en una especie química muy reactiva que modificacovalentemente a la enzima, inactivándola
- Tienen por tanto (a) la especificidad del inhibidor competitivoy (b) la potencia de los inhibidores irreversibles
Modo de acción de los inhibidores suicidas
-
8/16/2019 9. Enzimas
104/230
E + I EI EI* E’ + I*
Modo de acción de los inhibidores suicidas
1 2 3
1. El inhibidor se fija a la enzima igual que el substrato o uninhibidor competitivo convencional
2. La acción catalítica de la enzima convierte al inhibidor I
en una especie altamente reactiva I*
3. I* modifica covalentemente a la enzima, inactivándolade forma definitiva al igual que un inhibidor irreversible.
Ejemplos de inhibidores suicidas, 1
-
8/16/2019 9. Enzimas
105/230
- Sistema de la b-lactamasa bacteriana
La utilización masiva de antibióticos b-lactámicos (penicilinas,sus derivados semisintéticos y cefalosporinas) ha conducido ala aparición de resistencias a los mismos.
Los microorganismos resistentes a estos antibióticos lo son por producir una enzima, la b-lactamasa, que inactiva a los antibió-ticos b-lactámicos.
S
Penicilina (activa)
-
8/16/2019 9. Enzimas
106/230
R CO NH S
N
O
CH3
CH3
COO-
R CO NH S
HN
CH3
CH3
COO-
CO
O-
-Lactamasa
Ác.peniciloico (inactivo)
Muy a menudo los preparados de penicilinas o penicilinassemisintéticas se formulan añadiendo un inhibidor suicida
-
8/16/2019 9. Enzimas
107/230
semisintéticas se formulan añadiendo un inhibidor suicidade la b-lactamasa, el ácido clavulánico
O
N
OCOO-
C
CH2OH
H -Lactamasa
O
HN
COO-
C
CH2OH
H
C
O
O-
O
HN
COO-
C CH2OH
H
C
O
OCH2CH
Ser
Esta moléculareacciona con la
serina activa de la
b-lactamasa, produciendo suinactivación
Ác.clavulánico
Ejemplos de inhibidores suicidas, 2
-
8/16/2019 9. Enzimas
108/230
j p
- Sistema de la monoamino oxidasa (MAO) cerebral
Los estados depresivos, en general, están relacionados con undescenso en la concentración de neurotransmisores adrenérgicos(dopamina, noradrenalina, etc.) en determinadas regiones del
cerebro.
Una de las enzimas encargadas de la degradación de estosneurotransmisores es la monoamino oxidasa (EC 1.4.3.4).
Por tanto, la inhibición de la monoamino oxidasa se emplea comoterapéutica de los estados depresivos. Se han desarrollado muchosinhibidores suicidas de la MAO
HO
Noradrenalina
-
8/16/2019 9. Enzimas
109/230
HO CHOH CH2 NH2
O2 + H2O
NH3 + H2O2
HO
HO
CHOH CHO
Dihidroxifenilglicol
Monoamino
oxidasa
La MAO es una flavoproteína:tiene un grupo prostéticoflavínico (FAD) fundamental
para la catálisis. Los inhibidoressuicidas de la MAO inactivanal cofactor FAD.
NH3C
O N,N’ dimetil
-
8/16/2019 9. Enzimas
110/230
HC C CH N+CH3
CH3
N
NNH
N
H3C
H2C OSE
R
N
NNH
NH
H3C
H2C
O
OSE
R
CH
CHCHN+
H3C
H3C
Flavina
Flavina modificada
propargilamina(pargilina)
Inhibición suicida de laMAO mediante Pargilina
Selegilina
(antiparkinsoniano
y antidepresivo)
-
8/16/2019 9. Enzimas
111/230
Cofactores enzimáticos (Coenzimas)
Cofactor (Coenzima):
-
8/16/2019 9. Enzimas
112/230
Cofactor (Coenzima):
Átomo, ion o molécula que participa en el procesocatalítico sin ser enzima ni substrato.
Los cofactores participan de dos maneras distintas:
1. A través de una fijación muy fuerte a la proteína y salensin ser modificados del ciclo catalítico
2. Como un segundo substrato; salen modificados del ciclocatalítico y por lo general requieren otra enzima para volveral estado original.
-
8/16/2019 9. Enzimas
113/230
Los cofactores enzimáticos suelen ser moléculas complejas,que nuestro organismo no puede sintetizar, por lo general.
Por esa razón muchos cofactores enzimáticos deben ser, en
todo en parte, ingresados con la dieta; muchos de ellos son, porlo tanto, vitaminas.
Ni todos los cofactores son vitamínicos ni todas las vitaminasson cofactores enzimáticos
Cofactores de naturaleza vitamínica; ejemplos
-
8/16/2019 9. Enzimas
114/230
1. Hidrosolubles
Tiamina Tiamina pirofosfato B1 Riboflavina Flavinas: FAD, FMN B2 Piridoxal Piridoxal fosfato B6 Cobalamina Coenzimas cobamídicos B12 Ác.Ascórbico Ac. Ascórbico C
Nicotinamida NAD+, NADP+ PPÁc.Lipoico LipoamidaÁc.Fólico Coenzimas folínicosÁc.Pantoténico Panteteínas (CoA, p.e.)
2. Liposolubles Naftoquinonas g-Carboxilación K
-
8/16/2019 9. Enzimas
115/230
Cofactores de naturaleza no vitamínica: ejemplos
Hemo Hemoenzimas, citocromosComplejos Fe-S Ferredoxinas
Quinonas Tr.electrónico mitocondrial y fotosintéticoGlutatión Redox; transporte de aminoácidosATP Transf.de fosfato y/o de energíaUTP Transf.de grupos glicosídicosPAPS Transf.de grupos sulfato
S-AM Transf.de grupos metiloCarnitina Transportador de grupos acil-
-
8/16/2019 9. Enzimas
116/230
Vitaminas que no forman parte de cofactores enzimáticos
Liposolubles
Retinoides vit. ACalciferoles vit. DTocoferoles vit. E
Cofactores redox
-
8/16/2019 9. Enzimas
117/230
Cofactores redox
Operan en procesos de transferencia electrónica, a vecescomo aceptores, a veces como donadores.
- Cofactores piridínicos (NAD+, NADP+)
- Cofactores flavínicos- Cofactores hemínicos- Ferredoxinas- Quinonas
- Ác. Ascórbico- Ác. Lipoico- Glutatión
OON
N
NH2
N
CONH2
+
-
8/16/2019 9. Enzimas
118/230
O
O
H
H
OH
H
OH
CH2
H
OP
O-
OP
O-
OCH2 NN
NOH OH
N
O
O
H
H
O
H
OH
CH2
H
OP
O
O-
OP
O
O-
OCH2 N
N
N
N
NH2
OH OH
N
CONH2
P O-O
O-
+
Nicotinamida - Ribosa - P - P - Ribosa - Adenina
NAD+
NADP+
NAD+, NADP+ NADH, NADPH
-
8/16/2019 9. Enzimas
119/230
N
CONH2
N
H HCONH2
AH2 A + H+
(Formas oxidadas) (Formas reducidas)
AH2 + NAD(P)+ A + NAD(P)H + H+
-
8/16/2019 9. Enzimas
120/230
NH C
O
-
8/16/2019 9. Enzimas
121/230
O
H
H
OH
H
OH
CH2
H
OP
O
O-
OP
O
O-
O N
N
N
N
NH2
CH2
C
C
C
CH2
OHH
OHH
OHH
N
NNH
N
H3C
H3C O
FAD: Flavin Adenin Dinucleótido
NNH
H3C
O
-
8/16/2019 9. Enzimas
122/230
N
NH
N
3
H3C O
N
NNH
NH
H3C
H3C
O
O
N
NH
NH
NH
H3C
H3C
O
O
Forma oxidada
Semiquinona
(Radical libre)
Forma reducida
CH2
-
8/16/2019 9. Enzimas
123/230
NN Fe++
H3C
CH2
CH3
CH CH2CH2-
OOC N
CH3H2C
CH2
COO-
N
H3C CH
Citocromos
-
8/16/2019 9. Enzimas
124/230
Son proteínas de tamaño pequeño, que operan como
transportadores monoelectrónicos debido a una transición
Fe2+ Fe3+
Se distinguen tres tipos:
1. Citocromos A: Alto potencial redox (transportadores terminales)2. Citocromos B: Bajo potencial redox
3. Citocromos C: Potencial redox intermedio
(Se distinguen por su espectro característico de absorción)
-
8/16/2019 9. Enzimas
125/230
Citocromo c
-
8/16/2019 9. Enzimas
126/230
Cofactores quinónicos
-
8/16/2019 9. Enzimas
127/230
O
O
OH
OH
AH2 A
QuinonaHidroquinona
-
8/16/2019 9. Enzimas
128/230
O
O
CH3O
OCH3
CH3
CH3 n
Ubiquinona (Coenzima Q)
-
8/16/2019 9. Enzimas
129/230
OO
OHHO
CH2C
HO
HOH OO
OO
CH2C
HO
HOH
Ácido Ascórbico(vit. C)
A AH2
S S
COOH
Á
-
8/16/2019 9. Enzimas
130/230
S S
S S
CONH
CH Lys
CO NH CH
SH SH
Lys
AH2
A
Lipoamida
Dihidrolipoamida
Ác. Lipoico
Glutatión: g-Glu-Cys-Gly(forma reducida, GSH)
g-Glu-Cys-Gly
-
8/16/2019 9. Enzimas
131/230
COO-
C+H3N H
CH2
CH2
CO NH CH
CH2
SH
CO NH CH2 COOH
COO-
CH3N H
CH2
CH2
CO NH CH CO NH CH2 COO-
CH2
S
COO-
C+H3N H
CH2
CH2
CO NH CH
CH2S
CO NH CH2 COO-
S
Sg-Glu-Cys-Gly
Glutatión:forma oxidada, GSSG
2GSH + A GSSG + AH2
H3C
CH2 CH2OH
-
8/16/2019 9. Enzimas
132/230
N
N
H3C
CH2 N+ S
H3C
CH2 CH2 O P O P O-
O-O-
O O
Tiamina pirofosfato, TPP
N
N
H3C
CH2 N+
S
H3C
Tiamina (vit. B1)
CHO
-
8/16/2019 9. Enzimas
133/230
N
OH
CH3
HOH2C
N CH3
HOH2C
CHO
O P
O
O-
O-
Piridoxal (vit. B6)
Piridoxal fosfato
-
8/16/2019 9. Enzimas
134/230
N CH3
HOH2C
CHO
O P
O
O-
O
-
N CH3
HOH2C
CH2NH2
O P
O
O-
O-
Piridoxal fosfato Piridoxamina fosfato
Pteridina
-
8/16/2019 9. Enzimas
135/230
N
N
N
N
OH
H2N
N
C NH
O
C H
COO-
CH2
CH2
CO OH
H
n
Ác. Fólico
4-amino benzoico
Poliglutamato
N
N
N
N
H2N
NCO OH
H
-
8/16/2019 9. Enzimas
136/230
OH
C NH
O
C H
COO-
CH2
CH2
n
N
N
N
NH
OH
H2N
N
C NH
O
C H
COO-
CH2
CH2
CO OH
H
n
N
N
NH
NH
OH
H2N
N
C NH
O
C H
COO-
CH2
CH2
CO OH
H
n
Folato
reductasa
DHF Reductasa
Ác. Fólico
Ác.Dihidrofólico, DHF
Ác.Tetrahidrofólico, THFMethotrexate
N
N
NH
N
H2N
-
8/16/2019 9. Enzimas
137/230
N
OH H2C N
C NH
O
C H
COO-
CH2
CH2
CO OH
n
N
N
NH
N
OH
H2N
N
C NH
O
C H
COO-
CH2
CH2
CO
H
OH
COH
n
N5,N10 Metilen THF
N5 Formil THF
HH3C
CH3
CH2CONH2H
CH2CH2CONH2
-
8/16/2019 9. Enzimas
138/230
Cobalamina(vit. B12)
NH2COCH2CH2
HH
H CH2OHOH
H
CH3
CH3
H3C CH
CH2
NH
CO
CH2
CH2
NC
H3C
H
HCH3NH2COCH2
H3C
NH2COCH2
CH3
H
CH2CH2CONH2
CH3
CH3
CH2CH2CONH2
NN
NN
N
O
O
OP
O
O
N
Co+
NHHN Biotina
-
8/16/2019 9. Enzimas
139/230
NHHN
S COOH
NHN
S COOH
C
O
HO
CO2
Biotina
Carboxibiotina
-
8/16/2019 9. Enzimas
140/230
NHHN
S CONH
CH
CO
HNCH
OC
R
NHOC
CH
HN
R'Biotinil- proteína
Lys
Ác. Pantoico b-Alanina
-
8/16/2019 9. Enzimas
141/230
CH2OH C
CH3
CH3CHOH CO NH CH2 CH2 COOH
CH2OH C
CH3
CH3
CHOH CO NH CH2 CH2 CO NH CH2 CH2 SH
Ác. Pantoténico
Ác. Pantoténico Cisteamina
Panteteína
ADPPanteteína
-
8/16/2019 9. Enzimas
142/230
O
H
H
OH
H
OH
CH2
H
N
NN
N
NH2
OP
O
O-
OP
O
O-
O
H3C CH3
HO H
CN
CN
HS
O
H
O
H
ADP
Coenzima A
ON
N
NH2
O
-
8/16/2019 9. Enzimas
143/230
O
HH
OH
H
O
CH2
H
OP
O-
O NN
N
S
O
-O
P O
O-
-O
3’- Fosfoadenil 5’- Fosfosulfato
(PAPS)
CH3
-
8/16/2019 9. Enzimas
144/230
CH3 N
C 3
CH3
CH2 CHOH CH2 COOH
Carnitina
NH2
-
8/16/2019 9. Enzimas
145/230
O
H
H
OH
H
OH
CH2
H
OP
O
O-
OP
O
O-
O N
N
N
N
NH2
P
O
-O
O-
5’- Adenosina trifosfato (ATP)
-
8/16/2019 9. Enzimas
146/230
El Centro Activo Enzimático
- La evidencia cinética lleva a concluir que las enzimas
-
8/16/2019 9. Enzimas
147/230
funcionan a través de la formación de un complejo ES
- El complejo ES es estequiométrico: existe una relaciónentera entre número de moléculas de enzima y número demoléculas de substrato (1:1, 1:2, etc)
-La fijación de S a E es estereoquímicamente específica, y S puede ser desplazado de su fijación por análogos estructurales(inhibidores competitivos)
-De todo lo cual se deduce que el substrato se fija a una regiónespecífica de la molécula enzimática, llamada Centro Activo
Pruebas experimentales de la existencia del Centro Activo, 1
-
8/16/2019 9. Enzimas
148/230
1. Formación de complejo ES evidenciable cinéticamente
2. Presencia de grupos prostéticos que participan en la catálisis
3. Fenómeno de la inhibición competitiva y efecto de los análogosde estado de transición
4. Efecto de inhibidores irreversibles:
- Organofosfóricos sólo reaccionan con Serina “activa” - Clorometilcetonas sólo reaccionan con Histidina “activa”
Pruebas experimentales de la existencia del Centro Activo, 2
-
8/16/2019 9. Enzimas
149/230
5. Estudios filogenéticos en secuencias de aminoácidos en enzimas
Tripsina CQGDSGGPV
Quimotripsina CMGDSGGPLElastasa CQGDSGGPL
Trombina CEGDSGGPF
Plasmina CQGDSGGSW
Pr. Sorangium GRGDSGGST
Pr. St.griseus CQGDSGGPV
-
8/16/2019 9. Enzimas
150/230
-
8/16/2019 9. Enzimas
151/230
-
8/16/2019 9. Enzimas
152/230
Número de centros activos
1. Estudios de fijación de ligandos2. Número de grupos prostéticos3. Reactivos específicos de centro activo (Organofosfóricos)4. Titulación directa del centros activos
E t di d fij ió d li d
-
8/16/2019 9. Enzimas
153/230
Estudio de fijación de ligandos
Consisten en incubar la enzima con un análogo del substratodebidamente marcado (radioactivo, fluorescente, etc.), a dife-Rentes concentraciones de ligando.
Ligando libre y ligando unido pueden separarse por:
- Diálisis de equilibrio- Ultrafiltración- Cromatografía de exclusión en gel.
Aminoácidos presentes en el centro activo de enzimas
-
8/16/2019 9. Enzimas
154/230
- Serina: enzimas inhibidas por organofosfóricos- Histidina: enzimas inhibidas por clorometilcetonas- Cisteína: enzimas inhibidas por reactivos – SH
- Lisina: enzimas que forman bases de Schiff- Aspartato y Glutamato: dependencia de pH
Mecanismos de acción enzimática, 1
-
8/16/2019 9. Enzimas
155/230
1. Efectos de proximidad y orientación
Las enzimas logran en su centro activo una concentraciónlocal de reactivos mucho mayor que cuando éstos están
en solución (efecto de proximidad)
Además, la fijación al centro activo se hace en la orienta-ción correcta (efecto de orientación)
Colisionesno productivas
-
8/16/2019 9. Enzimas
156/230
Colisión productiva
En la superficie de la enzima,los reactivos se encuentranen la orientación correcta y auna concentración local muchomayor que en solución
Mecanismos de acción enzimática 2
-
8/16/2019 9. Enzimas
157/230
Mecanismos de acción enzimática, 2
2. Catálisis general ácido-base
3. Formación de intermediarios covalentes
4. Otros efectos (efectos cuánticos, por ejemplo)
Mecanismo de la ribonucleasa pancreática, 1
-
8/16/2019 9. Enzimas
158/230
O
O
PO CH2
O
O
P
O CH2
O
O
P
O CH2
OH
OH
OH
B
Py
B
O
O
O
O-
O-
O-
HN NH+
:N NHNH3
+
His 12
His 119
Lys 41
O
O
O
O
P
O CH2
OH
O
B
PyO
O-
PO
O
O
O
PO CH2
CH2
OH
B
O
O-
H
HN N:
HN NHNH3
+
His 12
His 119
Lys 41+
Mecanismo de la ribonucleasa pancreática, 2
-
8/16/2019 9. Enzimas
159/230
O
O
O
P
O CH2
OH
B
PyO
O-
O OP
-O O
HN N:
HN NHNH3
+
His 12
His 119
Lys 41
O
O
PO CH2
HOCH2
OH
B
O
O-
+
H
OH
O
O
O
PO CH2
OH
B
PyO
O-
HO O
P O-
O
O-
HN NH+
:N NHNH3
+
His 12
His 119
Lys 41
O
O
PO CH2
HOCH2
OH
B
O
O-
Mecanismo de las serinproteinasas
-
8/16/2019 9. Enzimas
160/230
CH2
OH
CH
Ser
:N NH
CH2
CH His
C-O O
CH
R C NH R'
O
Asp
CH2
O-
CH
Ser
HN NH
CH2
CH His
C
-O O
CH
R C NH R'
O
+
Asp
1 2
Mecanismo de las serinproteinasas
-
8/16/2019 9. Enzimas
161/230
Ser
HN NH
CH2
CH His
C
-O O
CH
R C NH R'
CH2
O
CH
O-
+
Asp
Ser
:N NH
CH2
CH His
C
-O O
CH
CH2
O
CH
C
O
R NH2 R'
Asp
3 4
Mecanismo de las serinproteinasas
-
8/16/2019 9. Enzimas
162/230
Ser
:N NH
CH2
CH His
C
-
O O
CH
CH2
O
CH
C
O
R
Asp
OHH
Ser
HN NH
CH2
CH His
C-O O
CH
CH2
O
CH
C
O
R
Asp
H
-
O
+
65
Mecanismo de las serinproteinasas
-
8/16/2019 9. Enzimas
163/230
Ser
HN NH
CH2
CH His
C
-
O O
CH
CH2
O-
CH
Asp
+
R C
O
OH
Ser
:N NH
CH2
CH His
C
-
O O
CH
CH2
OH
CH
Asp
87
-
8/16/2019 9. Enzimas
164/230
His 57Asp 102
Ser 195
Configuración en el centroactivo de la Quimotripsina,con un inhibidor
-
8/16/2019 9. Enzimas
165/230
Regulación de la actividad enzimática, 1
Regulación de la actividad enzimática
-
8/16/2019 9. Enzimas
166/230
v =k +2e0 s
K m + s
I. Sobre e0: Regulación de la concentración enzimática
II. Sobre K m y k +2: Regulación de la actividad intrínsecade la enzima
1. Regulación alostérica2. Regulación por modificación covalente
=Vmax s
K m + s
Regulación alostérica
-
8/16/2019 9. Enzimas
167/230
Procesos a nivel celular; regulación de ajuste finode la actividad enzimática, a través de efectos deretroalimentación (negativa o positiva)
Regulación por modificación covalente
Procesos a nivel supracelular (orgánico); regulacióna gran escala de actividades enzimáticas, a través demodificación covalente de enzimas, provocadas porseñales (transducción de señales)
Retroalimentación negativa en vías metabólicas, 1
-
8/16/2019 9. Enzimas
168/230
Thr a-cetobutirato IleTreonina
desaminasa
Síntesis de Isoleucina
El producto final de la ruta, Isoleucina, inhibe a la primeraenzima de la misma, Treonina desaminasa
Retroalimentación negativa en vías metabólicas
Síntesis de pirimidinas
-
8/16/2019 9. Enzimas
169/230
Asp + CP Carbamil aspartato CTP
Síntesis de pirimidinas
ATCasa
El producto final de la vía, CTP (citidin trifosfato) inhibe a la
primera enzima de la ruta metabólica, Aspartato transcarbamilasa
Al mismo tiempo, dicha enzima puede ser activada por ATP
ATP+
Rutas metabólicas controladas por retroalimentación
-
8/16/2019 9. Enzimas
170/230
Glicolisis Fosfofructokinasa ATP Neoglucogénesis FBP fosfatasa AMP
Bios. Ács. Grasos AcetilCoA carboxilasa AcilCoABios. Colesterol HMGCoA reductasa ColesterolBios. Purinas PRPP sintetasa AMP,GMP,IMP
Ruta Enzima Inhibidor
En el estudio de las enzimas controladas por realimentaciónnegativa, se comprobaron una serie de regularidades en las mismas:
-
8/16/2019 9. Enzimas
171/230
negativa, se comprobaron una serie de regularidades en las mismas:
1. Primer paso de una ruta metabólica o punto de ramificación2. Enzimas de naturaleza compleja: subunidades; la enzima puede
desensibilizarse a sus inhibidores por diversos métodos.3. Los inhibidores se comportan como competitivos (elevan el valor
de la K m aparente, pero sin embargo no son análogos estructuralesdel substrato
Estas últimas características lleva al concepto de alosterismo:
Una acción sobre la actividad enzimática que se desarrollafuera del Centro Activo (Jacob y Monod, 1960)
-
8/16/2019 9. Enzimas
172/230
Otra característica importante de las enzimas alostéricast i éti ó l l t
-
8/16/2019 9. Enzimas
173/230
es que presentan cinéticas anómalas, normalmente
cinéticas sigmoides:
v
s
La presencia de unasigmoide implicala existencia decooperatividad en la
fijación del substrato
La cooperatividad (positiva) consiste en que la fijación de unamolécula de substrato favorece la fijación del siguiente y así
-
8/16/2019 9. Enzimas
174/230
molécula de substrato favorece la fijación del siguiente, y así
hasta ocuparse toda la molécula
s s s ss s
s
s
s s
+ + +
1 2 3
En términos de Km veríamos que K m1 > K m2 > K m3
Existe también cooperatividad negativa, cuando la fijación deuna molécula de substrato dificulta la fijación del siguiente.
El comportamiento cooperativo implica:
-
8/16/2019 9. Enzimas
175/230
1. Que hay más de un sitio de fijación de substrato por molécula de enzima (estr.cuaternaria)
2. Que hay interacciones entre los sitios de fijación
Un sistema alostérico clásico es la Hemoglobina:
-
8/16/2019 9. Enzimas
176/230
1. La fijación de su “substrato”, O2, es de tipo sigmoide
2. La fijación del “substrato” puede inhibirse por efectores (H+, CO2, 2,3-BPG) que no actúan sobre el “Centro Ac-
tivo” (grupo hemo)
3. Las subunidades, por separado, presentan cinéticamichaeliana en la fijación de O2
Cinéticas michaeliana y sigmoide:Mioglobina y Hemoglobina
1.0
-
8/16/2019 9. Enzimas
177/230
s
0 2 4 6 8 10 12
Y
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8 Mioglobina
Hemoglobina
Efecto del pH sobre la saturación de la hemoglobina
100
(Efecto Bohr)
-
8/16/2019 9. Enzimas
178/230
PO2, mmHg
0 20 40 60 80 100
SaturacióndeO2,%
0
20
40
60
80
100
pH 7.4 pH 7.0
pH 6.6
Efecto del 2,3-bisfosfoglicerato (2,3-BPG)sobre la saturación de la hemoglobina
-
8/16/2019 9. Enzimas
179/230
PO2, mmHg
0 20 40 60 80 100
Saturación
deO2,%
0
20
40
60
80
100
0 0.1 mM
1 mM
Inhibidores y activadoresalostéricos
1 0
-
8/16/2019 9. Enzimas
180/230
s
0 2 4 6 8 10 12
Y
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
(+ Inhibidor)
(+ Activador)
(sin efectores)
V+
V0
V-
Los efectores alostéricos operan sobre el grado dei id d d l i
-
8/16/2019 9. Enzimas
181/230
cooperatividad del sistema:
- Los inhibidores alostéricos aumentan el grado decooperatividad
- Los activadores alostéricos disminuyen el grado decooperatividad; a concentraciones elevadas de activador,la cinética pasa a ser michaeliana, y deja de ser sigmoide.
Ecuación de Hill
h > 1 cooperatividad positiva
-
8/16/2019 9. Enzimas
182/230
y Ks Ks
h
h
_
1
Obsérvese que para h=1, esta ecuación se reduce a una formanormalizada de la ecuación de Michaelis-Menten:
h > 1, cooperatividad positiva
h = 1, no hay cooperatividad
h < 1, cooperatividad negativa
yv
V
k x
k e
s
K s
K s
K s
K s
K smx m
m
m
a
a
_
2
2 0
1
1 1 1
Forma RModelo MWC
-
8/16/2019 9. Enzimas
183/230
ss s s s ss s ss
L
ii i i i i
i i i
i
Forma T
n _
a a 11
-
8/16/2019 9. Enzimas
184/230
y
Ln
a 1
: Concentración normalizada de substrato, s/K m
L: Constante alostérica: a mayor valor de L, mayorgrado de cooperatividad (positiva)
n: Número de sitios de fijación de substrato
-
8/16/2019 9. Enzimas
185/230
Regulación de la actividad enzimática, 2
-
8/16/2019 9. Enzimas
186/230
Suele haber fenómenos de modificación covalente deenzimas en la respuesta celular a señales químicas:
1. Neurotransmisores2. Hormonas
3. Factores de crecimiento4. Estímulos morfogenéticos y de diferenciación5. Muerte celular programada (apoptosis)6. Estímulos antigénicos
7. Luz y otros agentes físico-químicos
Formas de modificación covalente, 1
Fosforilación: Protein kinasas
-
8/16/2019 9. Enzimas
187/230
Sobre residuos de Ser, Thr y Tyr
Ser
ATP ADP
Ser
C
N
C
CN
C
C
N
CH2OH
O
H
R
H
O
R'
H
H
H
H
C
N
C
CN
C
C
N
CH2O
O
H
R
H
O
R'
H
P O
-
O
O-
H
H
H
Formas de modificación covalente, 2
Defosforilación: Protein fosfatasas
-
8/16/2019 9. Enzimas
188/230
Sobre residuos previamente fosforilados: Ser-P, Thr-P, Tyr-P
Ser Ser
C
N
C
CN
C
C
N
CH2OH
O
H
R
H
O
R'
H
H
H
H
C
N
C
CN
C
C
N
CH2O
O
H
R
H
O
R'
H
P O-
O
O-
H
H
H
H2O Pi
Formas de modificación covalente, 3
Adenilación: Sistema de la Glutamina sintetasa
-
8/16/2019 9. Enzimas
189/230
Tyr O
OH OH
N
N N
N
H2NC
N
C
C
N
C
C
N
O
H
R
H
O
R'
H
CH2 O P
O
O-O CH2
H
H
H
-
8/16/2019 9. Enzimas
190/230
Formas de modificación covalente, 5
-
8/16/2019 9. Enzimas
191/230
Rotura proteolítica:
Proteinasaespecífica
+
N C
N N CC
Zimógeno
Enzima activada
La mayoría de las señales químicas operan sobre un
Concepto de Segundo Mensajero
-
8/16/2019 9. Enzimas
192/230
receptor situado en la parte externa de la membrana.Al operar sobre este receptor determinan la aparición en elinterior celular de un segundo mensajero, que desencadenala respuesta celular a la señal.
Algunos segundos mensajeros:
- Nucleótidos cíclicos: cAMP, cGMP
- Ca++- Diacilglicerol- Inositolfosfatos- Óxido nítrico, etc.
E II E
-
8/16/2019 9. Enzimas
193/230
R R
Efector
E I
X
P
I E
OH
HOH
HH
CH2OH
OHO
OH
HOH
HH
CH2OH
O
OH
HOH
HH
CH2OH
O ....
Glucógeno (n)
-
8/16/2019 9. Enzimas
194/230
OHH
O
OHH
O
OHH
O
+
OH
H
OH
OH
H
HH
CH2OH
HO O P
O
O-
O-
OH
H
OH
OH
H
HH
CH2OH
OOH
OH
H
OH
OH
H
HH
CH2OH
O ....
Pi
Glucógeno (n-1)Glucosa-1-fosfato
Glucógeno fosforilasa
-
8/16/2019 9. Enzimas
195/230
Subunidad de la glucógeno fosforilasa
-
8/16/2019 9. Enzimas
196/230
OCH2 N
N
N
N
NH2
OPOPOP-O
O O O
OOO
-
8/16/2019 9. Enzimas
197/230
OHOH
O-O-O-
O N
N
N
N
NH2
OHO
P O
O
-O
ATP
cAMP
Adenilato
ciclasa
Formación de cAMPa partir de ATP
+Proteínas G
-
8/16/2019 9. Enzimas
198/230
-
8/16/2019 9. Enzimas
199/230
RL Ga AC cAMP PKA FK F
N
NN
NH2
-
8/16/2019 9. Enzimas
200/230
O N N
OH
O
P O
O
-O
OCH2 N
N
N
N
NH2
OHOH
OP-O
O
O-
cAMP
fosfodiesterasa
Metilxantinas(p.e. cafeína)
-
cAMP
-
8/16/2019 9. Enzimas
201/230
Protein kinasa A
GlucógenoFosforilasa
Proteinfosfatasas
cAMP
fosfodiesterasa
Glucógenosintetasa
- +
+ -
-
Protein kinasas
-
8/16/2019 9. Enzimas
202/230
1. Protein kinasas A (Activadas por cAMP)
2. Protein kinasas G (Activadas por cGMP)
3. Protein kinasas A (Activadas por DAG)
4. Protein kinasas dependientes de Ca++-Calmodulina
5. Protein tirosin kinasas (Factores de crecimiento, etc.)
-
8/16/2019 9. Enzimas
203/230
Activaciones proteolíticas
N
C
Pepsinógeno
-
8/16/2019 9. Enzimas
204/230
C
N pH < 5
Pepsina
Activación del
pepsinógeno
Protrombina (II)
Precursores,vía intrínseca
-
8/16/2019 9. Enzimas
205/230
Fibrinógeno (I)Monómero
de fibrina (Ia)Polímerode fibrina
Trombina (IIa)
Protrombinasa
Precursores,vía extrínseca
Fase 1Fase 2
Fase 3
Vía extrínseca
-
8/16/2019 9. Enzimas
206/230
VII VIIa
X Xa
V VaCa++
Complejo
protrombinasa
XII XII
-
8/16/2019 9. Enzimas
207/230
XII XIIa
XI XIa
IX IXa
VIII VIIIa
X Xa
V Va
Complejo
protrombinasa
Vía intrínseca
Ca++
Ca++Trombina
+
S
S
VaXa
Ca++Complejo
protrombinasa
Protrombina
-
8/16/2019 9. Enzimas
208/230
S
PLP
protrombinasa
S
S H
L
Trombina
-
8/16/2019 9. Enzimas
209/230
-
8/16/2019 9. Enzimas
210/230
- + - Monómero de fibrina
-
8/16/2019 9. Enzimas
211/230
- + -+ -
- + -
- +- + -- + -- + -- + - - ++ -
-
-
- + -+ -
- + -- +
- + -- + -
- + -
- + - - ++ - -
-
Fibrina (Unión no covalente)
CHNH2
HOOCCHLys
Glu
-
8/16/2019 9. Enzimas
212/230
NH2 Glu
CH NH
OC
CHLys
Glu
Factor XIII
(estabilizadorde la fibrina)
Formación deenlaces covalentesen la fibrina
-
8/16/2019 9. Enzimas
213/230
Enzimas en Medicina
Biotecnología enzimática
Enzimas en el diagnóstico clínico
-
8/16/2019 9. Enzimas
214/230
Existe en el suero sanguíneo una gran cantidad deactividades enzimáticas. De la relación
Vmax = k +2 e0
Se deduce que la medida en suero de la actividadenzimática es una medida directa de la concentraciónde enzima en dicho medio.
Alteraciones de la concentración enzimática en suero, 1
-
8/16/2019 9. Enzimas
215/230
1. Aumentos de la actividad enzimática
(a). Incremento patológico de la permeabilidad de membrana
(b). Muerte y destrucción celular
(c). Inducción enzimática
(d). Proliferación celular
Alteraciones de la concentración enzimática en suero, 2
-
8/16/2019 9. Enzimas
216/230
2. Disminuciones de la actividad enzimática
(a). Intoxicaciones
(b). Enfermedades crónicas
(c). Alteraciones del estado nutritivo
Algunas enzimas con interés diagnóstico
-
8/16/2019 9. Enzimas
217/230
1. Aminotransferasas2. Creatin kinasa3. Fosfatasa alcalina4. a-Amilasa5. Fosfatasa ácida6. Lactato deshidrogenasa7. g-Glutamil transferasa8. Seudocolinesterasa
Aminotransferasas (Transaminasas)
Catalizan la interconversión reversible de aminoácidosy cetoácidos Utilizan piridoxal fosfato como cofactor
-
8/16/2019 9. Enzimas
218/230
COOH
CHH2N
R1
+
COOH
C O
R2
COOH
CHH2N
R2
COOH
C O
R1
+
y cetoácidos. Utilizan piridoxal fosfato como cofactor
Su papel es importantísimo en el metabolismo deaminoácidos. En clínica se determinan las siguientes:
EC 2.6.1.1, Aspartato aminotransferasa (AST, GOT)EC 2.6.1.2, Alanina aminotransferasa (ALT, GPT)
COO- COO-
Aspartato aminotransferasa, EC 2.6.1.1 (AST, GOT)
-
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219/230
COO-
CH+H3N
CH2
COO-
+
COO
C O
CH2
CH2
COO-
COO-
C
CH2
COO-
O
COO
CH
CH2
CH2
COO
-
+H3N
+
Aspartato a-Cetoglutarato Oxalacetato Glutamato
Aparece en citosol y mitocondrias de tejidos metabólicamentemuy activos. Su nivel se eleva en el suero ante afeccioneshepáticas y miocárdicas.
-
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220/230
Creatin kinasa, EC 2.7.3.2 (CK, CPK)
-
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221/230
CH3N CH2 COOH
CHNNH2
ATP ADP CH3
N CH2 COCHN
NH2
O P O-
O-
O
CreatinaCreatin fosfato
Creatin fosfato es una forma de almacenamiento de enlacesricos en energía en el tejido muscular. Es el prototipo de los
compuestos conocidos como fosfágenos.
-
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222/230
Fosfatasa alcalina, EC 3.1.3.1
-
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223/230
R O P
O
O-
O-
+ H2O R OH + HO P O-
O
O-
Hidroliza con baja especificidad fosfomonoésteres, a un pHalto (de ahí el nombre). No se conoce con certeza cuál essu función metabólica. Aparece en gran cantidad de tejidos.
La fosfatasa alcalina presenta varias isoenzimas:
- Ósea
-
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- Hepática- Intestinal- Placentaria
Las más importantes son las dos primeras. Se pueden distinguir por su termoestabilidad, siendo la ósea más termolábil.
Ósea: Propia del tejido óseo en crecimiento y de enfermedadesque cursan con neoformación ósea
Hepática: Propia de las células del árbol biliar: se eleva en lascolestasis (obstrucciones biliares) asociada a partículasde elevado peso molecular
g-Glutamil transferasa, EC 2.3.2.2 (GGT)
GSH + aa g-Glu-aa + Cys-Gly
-
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225/230
g Cys Gly
Tiene un importante papel en el transporte de aminoácidosa través de membranas. Aparece, como la fosfatasa alcalina,
en obstrucciones biliares asociada a fracciones de alto pesoçmolecular.
Es una enzima inducible, y su concentración en suero aumenta
con xenobióticos (alcohol, drogas, etc.)
a-Amilasa, EC 3.2.1.1
-
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Es una enzima producida por las glándulas salivales y el páncreas.
Es un marcador muy importante de afecciones pancreáticas
agudas (pancreatitis). Puede incluso aparecer en la orina, debidoa su bajo peso molecular (amilasuria)
Fosfatasa ácida, EC 3.1.3.2
-
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R O P
O
O-
O-
+ H2O R OH + HO P O-
O
O-
Hidroliza fosfomonoésteres con baja especificidad. Presentavarias isoenzimas, una de las cuales (Fosfatasa ácida prostática)es un marcador muy fiable del cáncer de próstata y que se emplea
en el diagnóstico precoz del mismo.
Adagen (adenosine deaminase) Enzon, Inc.
Enzimas en Terapéutica: producidas por recombinación
-
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g ( ) ,
Autorizado su uso pediátrico en inmunodeficienciascongénitas.
Ceredase (alglucerase) Genzyme Corp.Autorizado su empleo en enfermedad de Gaucher tipo 1
Cerezyme (imiglucerase) Genzyme Corp.Autorizado su empleo en enfermedad de Gaucher tipo 1
Pulmozyme (Dnase) Genentech, Inc.Autorizado su empleo en fibrosis quística
Activase (recombinant alteplase) Genentech, Inc.Autorizado en infarto de miocardio y embolia pulmonar
-
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Biosensores
-
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Producto Membrana semipermeable
Memb rana de Teflon
Cáto do
Anodo
Esquema de un biosensor de glucosa
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