28/4. galactomanano. dra. iris agorio

Iris Agorio

Laboratorio de Microbiología

Micología

Hospital Británico de Buenos Aires

SOSPECHA CLÍNICA

ENFERMEDAD DE BASE

ESTADO INMUNE

TRATAMIENTO PREVIO - ATB ó ATF

ANTECEDENTES EPIDEMIOLÓGICOS

COMPLEMENTADO CON:

DIAGNÓSTICO POR IMÁGENES

DIAGNÓSTICO MICOLÓGICO

EXAMEN MICROSCÓPICO DIRECTO

CULTIVO

ESTUDIOS HISTOPATOLÓGICOS

DETECCIÓN de ANTICUERPOS

CLÁSICO

DIAGNÓSTICO MICOLÓGICO NUEVAS METODOLOGÍAS

Aspergillus especies

¿Donde lo encontramos?

•Aire

•Polvo de habitación y AMBIENTAL

•Productos Alimentarios

•Condimentos: ej. pimienta

•Filtros de aire acondicionado

•Biofilm en conductos de agua

•Plantas ornamentales y hojas secas

•Yerba mate

•Mayor exposición durante obras de demolición y construcción

Factores predisponentes

• Edad avanzada

• Enfermedad de base

• Trasplante (Médula ósea - pulmón- higado etc.)

• Infección por virus respiratorios

• Número de transfusiones

• Neutropenia profunda y prolongada

• Enfermedad de injerto contra hospedero

• Infección por CMV

• Corticoterapia

Fisiopatogenia

Patogenia Diámetro de las esporas

> 10 – 20 µm

5 – 7 µm

3 – 5 µm

< 3 µm

Fosa nasal

Alvéolos

NEUTROPENIA

Fisiopatogenia

Patogenia Diámetro de las esporas

> 10 – 20 µm

5 – 7 µm

3 – 5 µm

< 3 µm

Fosa nasal

Alvéolos

NEUTROPENIA

Habitualmente la inmunidad innata es suficiente para eliminar a los conidios inhalados. Las células epiteliales de la vía aérea y los macrófagos alveolares realizan el aclaramiento de las conidias, tras reconocer determinados antígenos fúngicos de la pared, secretan mediadores inflamatorios que favorecen el reclutamiento de NEUTRÓFILOS y la activación de la inmunidad celular. Paso determinante en la eliminación de hifas y en la constitución de la respuesta inmunológica.

Conidias inhaladas

Germinación

Masa de hifas fase estacionaria

Elongación de la hifa filamento y ramificación

Aspergillus: Ciclo de vida

PRESENTACIÓN CLÍNICA Factores predisponentes

INVASORA

Alteración fagocitosis

Neutropenia (quimioterapia,

enf. oncohematológicas)

Trasplante

Glucocorticoides

Infec. por Citomegalovirus

Enf. Injerto contra huésped

Enf. Granulomatosa Crónica

POR HIPERSENSIBILIDAD

Asma: Individuos atópicos

Pacientes asmáticos y con enfermedad

granulomatosa crónica.

INTRACAVITARIA

Cavidades preformadas:

Tuberculosis, Sarcoidosis,

Bronquiectasias,

Senos paranasales.

Exposición a esporos de

Aspergillus spp.

PREVENCIÓN

¿Cómo?

Dirigida a

Evitar la exposición:

Alimentos crudos

Construcciones

Plantas, flores, polvo

Pacientes de alto

riesgo de AI

Aire filtrado:

•Filtros HEPA

•Flujo Laminar

•Presión Positiva

•Recambio > 12/hora

Agentes

quimiofluorescentes

Esputo

Biopsias

Líquidos

MUESTRAS Examen en fresco

Microscopio Óptico

Luz brillante

Contraste de fase

Examen en fresco

Microscopio Fluorescencia

Coloraciones

Examen en fresco (EF)

Microscopio Óptico

Luz brillante

Contraste de fase

Microscopía directa

MICROSCOÍA DIRECTA BAL Hongo de micelio hialino, ramificado y tabicado

Examen en fresco c/ líquido de montaje KOH AL 10%

Agentes quimiofluorescentes

Calcoflúor

Microscopio de fluorescencia

Tinción

Coloración Argéntica

Histopatología

Agentes

quimiofluorescentes

Esputo

Biopsias

Líquidos

MUESTRAS

Cultivo

Examen en fresco

Microscopio Óptico

Luz brillante

Contraste de fase

Examen en fresco

Microscopio Fluorescencia

Coloraciones

Sabouraud Aislamiento primario

Czapek Dox

Agar Malta

Estructuras morfológicas de género Aspergillus Cabezas conidiales

Células de Hülle

Radial Columnar

Conidióforo

Célula “pie”

Vesícula

Métula

Fialides

Conidias

Uniseriado Biseriado

ASPERGILOSIS: CULTIVO Aspectos de las colonias y observación microscópica

Agentes: Aspergillus fumigatus (85%)/Aspergillus flavus (5-10%) / Otros: A. niger, A. terreus, A. nidulans, etc.

A.fumigatus A.flavus

A.niger

CULTIVO

Estudio de vigilancia (Inmonocomprometido) Hisopado nasal

Baja especificidad Inmunocomp. No Neutropénicos

Pacientes tratados con esteroides

Colonización con Aspergillus esta aumentada en Fumadores y

Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica

Tiene un valor

predictivo alto de

Aspergilosis Invasora

Leucemia aguda

Neutropénicos

Trasplante de Pulmón

Muy Buena

especificidad

Nunca se asocia con

Aspergil. pulmonar

Grupos de alto riesgo BAL

No inmunocomprometidos

Tumor sólido no neutropénicos

Cultivo de

Esputo Positivo

Según Tipo de Muestras

MUESTRA Suero Inmunodifusión

Inmunocompetentes

Especie específica

Aspergillus sección Fumigati Aspergillus sección Flavi

Aspergillus sección Terrei

Aspergillus sección Nigri

Aspergilosis invasora

Agentes causales

Aspergillus fumigatus 56%

Aspergillus flavus 9%

Aspergillus niger 7%

Aspergillus terreus 5%

Aspergillus nidulans

Aspergillus ustus

Múltiples especies 23%

* Transplant Associated Infection Surveillance Network (TRANSNET) Study 2001-2006

Epidemiología por Infección fúngica

por hongos filamentosos IC en Argentina.

Enfermedad de base.

Revisión y experiencia.

2007-2011

M. C. Dignani, G. Davel y col. REMIIN / Red Micología

Oncohematológicos

Trasplante órgano sólidos

Diabetes

Enf. granulomatosa crónica

Cancer órgano sólido

Trat inmunosup no cancer

Oncohemato 67%

TOS 10%

HIV 6%

Diabetes 4%

Hialohifomicosis

Mucoramicosis

Feohifomicosis

Epidemiología por Infección fúngica

por hongos filamentosos IC en Argentina.

Agentes etiológicos.

Revisión y experiencia.

2007-2011

M. C. Dignani, G. Davel y col. REMIIN / Red Micología

Hialohifomicosis 60%

Mocoramicosis 28%

Feohifomic.18%

Otros 8% Aspergillus 55

Fusarium 15

Paecilomyces 5

Scedosporium 2

Sarocladium 2

Scopulariopsis 2

Rendimiento de las técnicas

Hospital Británico

Paciente oncohematológico

Microscopía directa (montaje húmedo)

Campo brillante

Calcoflúor 17 / 17

6 / 17 (35 %) Cultivo

8 / 17 (47 %)

CULTIVO

Estudio de vigilancia (Inmonocomprometido) Hisopado nasal

Baja especificidad Inmunocomp. No Neutropénicos

Pacientes tratados con esteroides

Colonización con Aspergillus esta aumentada en Fumadores y

Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica

Tiene un valor

predictivo alto de

Aspergilosis Invasora

Leucemia aguda

Neutropénicos

Trasplante de Pulmón

Muy Buena

especificidad

Nunca se asocia con

Aspergil. pulmonar

Grupos de alto riesgo BAL

No inmunocomprometidos

Tumor sólido no neutropénicos

Cultivo de

Esputo Positivo

Según Tipo de Muestras

PACIENTES NEUTROPÉNICOS ADULTOS DE ALTO RIESGO

Br. J. Haematol. 2000; 110: 273-284

Prentice y col.

< 100 neutrófilos / mm3 > 3 semanas

Trasplante de médula ósea no relacionado

Enfermedad injerto contra huésped

Neutropenia < 500 neutrófilos / mm3 > 5 semanas

Corticosteroides > 2 mg/kg > 2 semanas

Corticosteroides > 1mg/kg con neutropenia

AraC a altas dosis

Fludarabina

Alemtuzumab

UTILIDAD DIAGNÓSTICA DE GALACTOMANANO

Br. J. Haematol. 2000; 110: 273-284

Prentice y col.

Receptores de trasplante de órganos sólidos

Enfermedad granulomatosa crónica

Neoplasias de órgano sólido

Grandes quemados

GALACTOMANANO EN SUERO

UTILIDAD DIAGNÓSTICA RELATIVA EN:

Factores predisponentes

de Aspergilosis invasora • Leucocitos polimorfonucleares entre

500/mm3 y 100/mm3 .

• Neutropenia prolongada (12 – 15 dias).

• Infección por Citomegalovirus

(trasplantes de pulmón / TMO).

• Terapia con corticoides.

DIAGNÓSTICO MICOLÓGICO PRECOZ EN EL

PACIENTE NEUTROPÉNICO FEBRIL,

SE ASOCIA CON AUMENTO DE LA

SUPERVIVENCIA.

FACTOR TIEMPO

JUEGA UN ROL MUY IMPORTANTE

BIOMARCADORES

BÚSQUEDA

TÉCNICAS ALTRNATIVAS

Énfasis en vigilancia

Directo y Cultivo Positivo

Diagnóstico IFI en Neutropenia profunda prolongada

Sitios estériles

Diagnóstico de IFI

HEMOCULTIVO Baja sensibilidad < 1%

NO se accede a la BIOPSIA Enf crítico

plaquetopénico sitio no abordable

SI se accede a la BIOPSIA carga fúngica baja ó no

viable

Sitios estériles

Sitios NO estériles

Esputo-Hisopado nasal POSITIVOS

Colonzación del paciente crítico

Mananos (polímeros de D manosa)

Manoproteínas

Quitina (poliacetilamino hexosa)

Membrana celular

Bicapa de fosfolípidos

Ergosterol

Célula fúngica

Beta (1,3)-glucanos

(polímeros de D glucosa)

Beta (1,6)-glucanos

Ribosomas 80 S

Mitocondrias

Núcleo

Retículo endoplásmico R y L

Aparato de Golgi

Lisosomas

Lisis de

constituyentes

de la hifa

Vacuolas

Glucógeno

Lípidos

Aminoácidos

Polifosfatos

ATPasa

Glucosa K+

ATP ADP K+

Bomba de

extrusión de protones

Glucosa Iones de H/protones

ZONA DE

SENESCENCIA ZONA DE

ALMACENAMIENTO

ZONA DE

ABSORCIÓN ZONA DE CRECIMIENTO APICAL

Adaptado de Jennings & Lysek, 1999 - Piontelli

Pared celular

Específico de Aspergillus spp.

NO Específico

de Aspergillus spp.

Galactomananos

(1 - 3) β-D-glucanos

CITOPLASMÁTICOS: ADN

Clearence renal/hepático

Número de epitopes

Experiencia

Cut-off

Pre-tratamiento

Conservación

Factores involucrados en la realización del ELISA diagnóstico de aspergilosis invasora en SUERO

The Lancet Infectious Diseases. Vol 4 June 2004 349-357 Mennink-Kersten y col.

GM 20 kDa

GM/galf-glicoprot 35-94 kDa

Lipopéptido GM >100 kDa

Ac anti-Aspergillus

Factores paciente edad

Cond. subyacentes citoquinas

Antifúngicos/Atb beta lactámicos

Antígenos GM/galf circulantes

Frecuencia de muestreo

Glucosa

Neutrófilos circulantes

Sitio de Infección Sangre circulante Laboratorio

Especie

Ramificaciones

Experiencia

Cut-off

Pre-tratamiento Conservación

The Lancet Infectious Diseases. Vol 4 June 2004 349-357. Mennink-Kersten y col. Agca H. et al. Mycoses 2014, 57, 169-175

GM 20 kDa

GM/galf-glicoprot 35-94 kDa

Lipopéptido GM >100 kDa

Antifúngicos?

Definición de positivo

Glucosa

Sitio de Infección Sangre circulante Laboratorio

Especie Cepa

Ramificaciones Neutropenia?

Factores involucrados en la realización del ELISA diagnóstico de aspergilosis invasora en BAL

Volumen de muestra

recolectado?

FACTORES QUE INFLUENCIAN LA DETECCIÓN DE ANTÍGENO

EN ASPERGILOSIS INVASORA

EQUIPO COMERCIAL

Galactomananos

EQUIPO COMERCIAL

Galactomananos

Kit Nuevo - 2012 Argentina

Nombre Platelia Aspergillus Ag

Código 62794

Detección de antígeno

galactomanano en suero de adultos,

pediátricos, BAL, otros líquidos

biológicos

Composición

R1 Microplaca sensibilizada 96 pocillos

(12 tiras de 8 pocillos)

R2 Sln. lavado 20x proclin

R3 / R4 / R5 Controles Listo para su uso .

Conservante <1,5% proclin TM 300

Conjugado Ac monocl. Anti GM

marcado peroxidasa. Conservante:

<1,5% proclin TM 300

R7 Solución tratamiento de muestra:

Cromógeno TMB listo para usar

3,3´,5,5´-tetramethilbenzidine (<0,1%),

H2O2 < 1%

R10 Ácido sulfúrico (H2SO4) 1 N

Desarrollado US 1 inserto internacional

DESARROLLO EN LA DETECCIÓN DE

GALACTOMANANOS (GM) EN FLUÍDOS

BIOLÓGICOS

Estructura química del antígeno

[- M - M - M - M -]n

M: Manano

G: Galactofurano

n = 10

[G]R [G]

Selección de anticuerpos

monoclonales, específicos contra

la cadena lateral de

Galactofuranos (G) ausente en

humanos

Ac monoclonal

Clin Microbiol. Rev 1999; 12:310-350 Latgé

Galactofurano

Pasos de la técnica

Precipitación de proteínas con EDTA y calentamiento en bloque térmico o ebullición 3 minutos.

Centrifugación a > 10.000 rpm 10 – 20 minutos

Extracción de sangre en campo estéril igual que hemocultivos

Guardar el suero a 4°C si se usa dentro de 24 horas. Frezar a -18°C de lo contrario.

Utilizar tips y tubos estériles apirógenos. Los tubos con tapa a rosca

M. A. S. H. Mennink-Kersten, J. P. Donnnelly and P. E. Verweij The Lancet Infectious Diseases Vol4 June 2004

EIA en suero para Galactomananos

Galactomananos (GM)

Microplaca

Galactomananos (GM)

Microplaca

Ac EBA-2 GM Peroxidasa

Galactomananos (GM)

Microplaca

Cromógeno

Galactomananos (GM)

Microplaca

Cromógeno

M. A. S. H. Mennink-Kersten, J. P. Donnnelly and P. E. Verweij The Lancet Infectious Diseases Vol 4 June 2004

Galactomananos (GM)

Microplaca

Cromógeno

PLACA DE LECTURA DE ELISA ASPERGILLUS

Control NEGATIVO

CUT-OFF

Control POSITIVO

CUT-OFF

• RESULTADO

Se expresa como ÍNDICE (I)

I = DO muestra / DO cut-off

Cociente entre:

DO muestra / DO cut-off

2 muestras consecutivas

I ≥ 0,5

POSITIVO

Detección de galactomananos por ELISA

Niveles de punto de corte

Fabricante del equipo PlateliaR Bio-Rad, hasta marzo 2007

I ≥ 1,5 (2 muestras consecutivas) Presencia de GM

I entre 1,0 - 1,5 Indeterminado

I < 1,0 Ausencia de GM

Propuesta en adultos Maertens et al.* (2004)

Punto de corte estático I ≥ 0,8 (1muestra)

Punto de corte dinámico I ≥ 0,5 (2 muestras consecutivas)

* Maertens et al. B. J. Haematology 2004; 126: 852-860. ** Mennink-Kersten et al. The Lancet Infectious Diseases. Vol 4 June 2004 349-357.

*** Kawazu et al. JCM, June 2004, p.2733-41. **** US Food and Drug Administration (FDA Upton A. et al. J.Clin.Microbiol

2005;43:4796-4800. *****Maertens J. A.et al. Optimization of the Cutoff Value for the Aspergillus Double-Sandwich Enzyme

mmunoassay. Clin. Infect. Dis 2007; 44: 1329-1336.

Propuesta Mennink-Kersten et al. ** (2004)

I ≥ 0,7

Propuesta Kawazu et al. *** (2004)

I ≥ 0,6

Propuesta US Food and Drug Administration **** (2005)

I ≥ 0,5

Valores de cut-off

Propuesta Maertens et al ***** (2007)

I ≥ 0,5 (2 muestras consecutivas)

Detección de Galactomananos

Falsos Negativos

Falsos Positivos

Profilaxis antifúngica

Población no seleccionada

Encapsulación de la infección

Formación de inmunocomplejos: Ac. anti-Aspergillus

Antibióticos de Origen fúngico: Pip-Tazo / AMCla.

Reacción cruzada con antígenos de otros géneros: Penicillium, Fusarium spp. Paecilomyces, Alternaria, Geotrichum, Histoplasma y Candida

Rn cruzada por bacteriemias

Contaminación con algodón

Mucositis intensa

Colonización masiva intestinal por Aspergillus

Transfusiones

Es un ensayo inmunoenzimático

Validado para muestras de suero y BAL

Es una prueba que cuando se utiliza junto

con otros procedimientos diagnósticos

puede usarse como ayuda en el diagnóstico de la aspergillosis invasiva

Tortorano et el. 2012. JCM.

• Los resultados son expresados como índice (GM)

• Un índice > a 0.5 en dos muestras consecutivas se

interpreta como RESULTADO POSITIVO

PRIMEROS ESTUDIOS PROSPECTIVOS GM

Maertens

et al. (1)

Maertens

et al. (2)

Sulahian

et al. (3)

Punto de corte

( Nº de muestras positivas )

Aspergilosis invasora

(Probada+Probable) (n) 33 39 53

Sensibilidad (%) 93 90 91

Especificidad (%) 95 98 94

VPP (%) 93 87 SD

VPN (%) 95 98 SD

Falsos positivos (%) 8 14 12

Precocidad en días (%) 6 (54) 5 (68) 7 (40)

Eficacia global (%) 94 95 SD

1) J Clin Microbiol 1999; 37:3223-28. Maertens et al.

2) Blood 2001; 97:1604-10. Maertens et al.

3) Cancer 2001; 91: 311-18. Sulahian et al.

VPP: Valor predictivo positivo

VPN: Valor predictivo negativo

SD: Sin datos

CID 2006-42; 1417.1427. Pfeiffer y col.

CID 2006-42; 1428-1429. John H. Rex.

GALACTOMANANOS VERSUS

DIAGNÓSTICO DE ASPERGILOSIS DATOS GLOBALES DE 27 ESTUDIOS DESDE 1966 HASTA FEBRERO 2005

Probada Sensibilidad: 61%

Especificidad: 89%

Probada + Probable Sensibilidad: 71%

Especificidad: 93%

VPN: 98%

VPN: 95%

VPP: 26%

VPP: 53%

ANTIGENEMIA de ASPERGILLUS

Detección de Galactomananos

Investigación comienza: al inicio de la neutropenia

Frecuencia: 2 muestras semanales

CID 2002; 34:7-14. Definición Infección Fúngica Invasora. Consenso EORTC/MSG

Método: ELISA

Consenso EORTC/MSG 2002 Propone su uso

Clasificando Dos Resultados Consecutivos

Positivos en la Categoría de “Infección Probable”

Selección de entidad/es clínica/s en las que se realizará la

prueba

GALACTOMANANOS VERSUS DIAGNÓSTICO DE ASPERGILOSIS

Maertens J. A., et al.

Optimization of the Cut off Value for the Aspergillus Double-Sandwich

Enzyme Immunoassay. Clin. Infect. Dis 2007; 44: 1329-1336.

Punto de corte: I ≥ 0,5 Sensibilidad: de 76,3% a 97,4% Especificidad: de 97,5% a 90,5%

DATOS 2007

Índice de Galactomananos como

Monitoreo de Respuesta al Tratamiento

Antifúngico

Marr K. A. Aspergillus galactomannan index: a surrogate end point to asses outcome of

therapy?. Clin Infec Dis 2008; 46:1423-5.

Disminución de I de GM se asocia con buena

respuesta al tratamiento.

Valores persistentes o aumentados indican

aspergilosis progresiva.

Miceli M. H.,Grazziotti M. L., et al. Strong correlation between serum Aspergillus

galactomannan index and outcome of aspergillosis in patients with hematological

cancer: clinical and research implications. Clin Infec Dis. 2008; 46:1412-1422.

Índice de Galactomananos en suero

Hospital Británico 2004 a 2008

Natalia Enriquez, Gustavo Mendez, Rosana Jordán, Ernesto Efron, Amalia Schiel, Iris Agorio.

Datos no publicados

Sensibilidad: 81,8%

Especificidad: 81,9%

Valor Predictivo Positivo: 28,1%

Valor Predictivo Negativo: 98,1%

Total 138 pacientes 641 GM

Promedio de 5 por paciente

GALACTOMANANOS

en suero

Útil para discernir entre:

•síndrome de reconstitución inmune cuando

se recuperan neutrófilos

•Progresión de la enfermedad invasora

GALACTOMANANOS

Muestras distintas a suero

En lavado broncoalveolar

J. Maertens propone el uso de un Cut-off ≥ 1,0.

Se investiga también en muestras obtenidas de

sitios estériles, biopsias, líquidos de punción.

CID 2009; 49:1688-1693. J. Maertens y col.

Utilidad del Galactomanano en BAL

Maertens J. et al. CID 2009; 49: 1688-93. GM en BAL para diagnóstico API en pacientes con enfermedad hematológica

Categorías

1 Más alto Cut-off = 0,7

Más bajo Cut-off = 0,5

Tiende a disminuir la sensibilidad en pacientes con

profilaxis.

Utilidad del Galactomanano en BAL

GM en BAL diagnóstico API en pacientes enf. Hematológica Maertens J. et al. CID 2009; 49: 1688-93.

SENSIBILIDAD

GM en BAL 91,3 % (I ≥ 1,0)

CULTIVO 50 %

MICROSCOPÍA 53,3%

GM en BAL (I ≥ 1,0)

VPP 76 %

VPN 96 %

Agca H. et al. Mycoses 2014, 57, 169-175

- GM no es afectado por el estado inmune del paciente - GM Cut Off > 1,0 correlacionó mejor con cultivo positivos

MICROSCOPÍA CULTIVO GM SUERO GM BAL Referencia

SENSIBILIDAD 53% 50% 55% 100% Maertens CID 2009

Cut-off 1,0 ESPECIFICIDAD 88%

SENSIBILIDAD 40% 69% 40% 100% Hsu BMC I. Dis 2010

Cut-off 0,5/1,0 ESPECIFICIDAD 100% 100% 73/98%

SENSIBILIDAD 58% 69% 58% 100% Luong Diag Micro Inf

Dis 2010

SENSIBILIDAD 55% 69% 72% 58% Bergeron Chest 2010

SENSIBILIDAD 78% 78% Desai Pediat Inf Dis J

Cut-off 0,98 ESPECIFICIDAD 100% 92%

SENSIBILIDAD 29% 57% 79% 64% Paugan Pathol Biol 2010

Chadi A. et al. Current Opinion in Pulmonary Medicine 2011, 17: 167-171.

COMPARACIÓN DE MÉTODOS PARA DIAGNÓSTICO

ASPERGILOSIS

GM Negativo 5 (30%)

GM Positivo 12 (70%)

Índice de Galactomananos

en suero versus cultivo positivo

para Aspergillus spp. Hospital Británico 2004 a 2009

Pacientes oncohematológicos y trasplante de

células progenitoras hematopoyéticas.

Cultivo Positivo para especies de Aspergillus 17

Mendez G., Jordan R., Martinez J, Enriquez N, Verbanaz S, Giorgio P, Efron E.

Aspergillus

Fusarium

Mucorales

Histología

Histología + GM

Aspergillus spp. 43%

Fusarium spp. 13% Mucorales 6%

GM 12%

Otros 15%

Histopatología 8%

Histopatología + GM 3%

Diagnóstico en 51 (75%) pacientes

sólo 1 prueba positiva

Cultivo: 38

Histopatología: 4

Diagnóstico de Micosis por Hongos

Filamentosos en inmunocomprometidos en

Argentina. REMIIN 2010 - 2012

Diagnóstico en 17 (25%) pacientes

mas de 1 prueba positiva

Dignani MC, Davel G y col. Grupo REMIIN (registro de micosis invasoras)

3er Simposio de la Sociedad Argentina de Hematología. [Abstract 13]. 2012;16:125

Total 68 pacientes

Aspergillus Lateral-Flow Device

Método: Suero y BAL hemorrágico

Se busca antígeno JF5 es manoproteína Punto corte aprox 30 ng/ml

Aspergillus Lateral-Flow Device

Multicéntrico Cut off BAL ≥ 1,0 VPN 97

El SIGNO HALO es transitorio (dentro de las 24 hs.), aumenta

de tamaño durante la neutropenia

y luego

SIGNO del AIRE CRECIENTE (4 días) al recuperar neutrófilos.

Evolución radiográfica de la neumonía por

Aspergillus spp.

TAC de alta resolución tomada en forma secuencial

Signo del Halo alrededor de una imagen

nodular

Angioinvasión

de pequeños

Recomendaciones Biomarcadores Método Indicado Recomendación

Galactomanano

Temprana

detección

de aspergilosis

Suero seriado + Tomografía de alta resolución,

en adultos neutropénicos bajo quimio. por

leucemia ó TMO alogeneico

Cut-off un solo resultado I > 0,7

Cut-off dos mtras consecutivas I > 0,5

J Antimicrob Chemother 2011;66 Suppl 1: i15-24. Cuenca-Estrella

Galactomanano

Temprana

detección

de aspergilosis

En ptes no-neutropénicos GM en suero NO

tiene el mismo valor diagnóstico y pronóstico

Recomendaciones Biomarcadores Galactomanano Indicado Recomendación

Galactomanano

Temprana

detección

de aspergilosis

En ptes no-neutropénicos GM en suero no

Suero es útil en ptes neutropénicos pediátricos

Galactomanano

Temprana

detección

de aspergilosis

Valores > 1 en ptes adultos y pediátricos

tratados, se considera un signo de falla

terapéutica

Galactomanano

Temprana

detección

de aspergilosis

Valores > 1 en ptes adultos y pediátricos

tratados, se considera un signo de falla

terapéutica

Ptes neutropénicos y no-neutropénicos puede

ser útil BAL cut-off > 1 LCR cut-off > 0,5 (BIII)

Pacientes críticos

Pacientes neutropénicos

CONCLUSIÓN

Aspergilosis

GM suero

Técnica mas reproducible que BG

Tiene alta especificidad

Galactomanano

Integrar signos clínicos, estudios radiológicos (TC) y microbiológicos.

Monitoreo de la respuesta al tratamiento antifúngico

Monitoreo de la respuesta al tratamiento antifúngico, Síndrome de

reconstitución inmune

Pacientes críticos

(1 3)-β-D-glucano

Puede ser usado para excluir AI en un entorno clínico con GM negativo

Para aumentar la certeza de AI en la presencia de un GM

positivo ó un aislamiento positivo de un sitio no estéril

Aspergilosis

GM suero BD suero

CONCLUSIÓN

Pacientes críticos

Aspergilosis

GM suero BD suero

Aspergilosis

Candidiasis Neumocistosis

BD suero

Parece ser mas sensible que GM en la detección de AI, no

obstante carece de especifcidad micológica intrínseca,

requiere integración de datos clínicos, radiológicos y

microbiológicos para una correcta interpretación.

(1 3)-β-D-glucano

Herramienta de screening para vigilancia de AI y otras

infecciones fúngicas diseminadas, en poblaciones con riesgo

Realización mas compleja que GM con un costo mayor

CONCLUSIÓN

Pacientes críticos

Aspergilosis

GM suero BD suero

Aspergilosis

Candidiasis Neumocistosis

BD suero

GM BAL

Datos indican mas Sensibilidad que en suero

Galactomanano en BAL

CONCLUSIÓN

Grados de Evidencia de Recomendación sobre las Técnicas Diagnósticas

en la Infección Fúngica Invasora Categoría de la Evidencia Calidad de la Evidencia

Categoría A Útil y fiable Calidad I ≥1 estudio multicéntrico bien diseñado de casos controles o cohortes

Categoría B Utilidad moderada Calidad II ≥1 estudio de casos controles o cohortes realizados en 1 sólo centro de múltiples series o de series no controladas

Categoría C Sin utilidad Calidad III Opiniones de expertos basadas en experiencias clínicas o estudios descriptivos

(1 3) - β - D - Glucano B III o Usualmente positivo pero no específico.

Diagnóstico Grado de Evidencia

Basados en los resultados obtenidos con criterios EORTC/MSG para definir Inf Fúngica Diseminada,

integrando signos clínicos, radiológicos y microbiológicos.

Galactomanano A II / B II o Cuando es positivo puede ser útil para seguimiento.

Bone Marrow Transplantation (2012) 47,846-854. Recomendaciones ECIL-3

Uso Biomarcadores en Diag Enf. Fúngica Invasora en Leucemia y TMO.

El diagnóstico convencional sigue siendo el método de referencia

CONCLUSIONES Marcadores biológicos

Aún no se tienen evidencias sólidas .

Combinar técnicas sería la mejor opción, tanto para diagnóstico temprano como para seguimiento de

paciente.

El diagnóstico temprano sigue siendo dificultoso y por lo tanto requiere enfoque

multidisciplinario.

MUCHAS GRACIAS…

(1 3)-β-D-GLUCANO

Es un constituyente de la pared celular de

la mayoría de los hongos de importancia

médica

Excepción: Cryptococcus y Zygomycetes

Detecta picogramos

Fungitec G-Test

Β-glucan Test

Wako B-G Star Fungitell

Fabricante Seikagaku

Corporation

Wako Pure

Chemical

Maruha

Corporation

Associates of

Cape Code

País Japón Japón Japón USA

Año aprobado 1995 1996 2001 2004

Método Cinética

cromogénica

Cinética

turbidimétrica

Punto final

cromogénico

Cinética

cromogénica

Muestra Suero o Plasma Suero o Plasma Suero o Plasma Suero

Pretratamiento Álcali Dilución y

calentamiento

Dilución y

calentamiento Álcali

Standard

β-glucan Pachyman

Carboxymethyl-

curdlan Lentinan Pachyman

Origen Tachypleus

tridentatus

Limulus

polyphemus

Tachypleus

tridentatus

Limulus

polyphemus

Cutoff pg/mL 20 11 11 60 o 80

Rango pg/mL 3,9 - 500 6 - 600 1,2 – 120 31,25 - 500

Tpo. minutos 30 90 30 40

CID 2008:46 (15 June). Obayashi y col.

(1 3)-β-D-GLUCANO

Frecuencia: 2 a 3 veces por semana

Diferentes equipos, diferentes géneros de cangrejos

• Fungitell (Glucatell) (Limulus polyhemus)

Distintos puntos de corte ≥ 60 / ≥80 / ≥ 120 pg/mL

• FungiTec-G (Tachypleus tridentatus) Cut-off 20 pg/mL

Muestra: suero o plasma

Muestras no aptas para procesar son sueros:

• Lipémicos

• Hemolizados

• Presencia de bilirrubina

• Turbios

FACTOR C

ENDOTOXINA (LPS)

FACTOR C ACTIVADO

ENZIMA DE COAGULACIÓN

INACTIVA

FACTOR B ACTIVADO FACTOR B

ENZIMA DE COAGULACIÓN

ACTIVA

SUSTRATO CROMOGÉNICO CROMÓFORO Abs 405 nm

FACTOR G ACTIVADO FACTOR G

( 13 ) - - D - GLUCANO

ENSAYO COLORIMÉTRICO

Camino metabólico de coagulación cangrejo de herradura

DETECCIÓN DE ( 1 3 ) - - D - GLUCANO

ENDOTOXINA (LPS)

LECTURA

Sistema de Detección

1 2 3 4 5 6 7 9 8 10 11 12

9 6 3 12 15 18

18 15 12

11 14 17

17 14 11

10 13 16

16 13 10

DISEÑO DE REALIZACIÓN

(1 3)-β-D-GLUCANO

B = BLANCO

S = CONTROLES

1 = MUESTRAS

= CONTROLES Curva en pg-ml

6 12 25 100 50

Concentración de Glucanos picogramos/mL

DO/min

a 405 nm

DO muestra

CURVA DE CALIBRACIÓN

(1 3)-β-D-GLUCANO

Insuficiencia renal

Hemodiálisis con filtros de celulosa

Inmunoglobulinas ó sus derivados

Exposición de serosas ó superficie

corporal a gasas o algodón

Albúmina

Factores de coagulación

Fracciones de proteínas plasmáticas

Ciertos Streptococcus producen

polímeros simil glucano

Exceso de manipulación de la muestra

(1 3)-β-D-GLUCANO

Falsos positivos

Cutoff S % E %

Sensibilidad y Especificidad

Fungitec

G-Test MK Obayashi y col. 1995 (41 IFI) 20 pg/mL 90 100

(1 3)-β-D-Glucano

Obayashi y col. 2008 (54 IFI) 30 pg/mL 95,1 85,7

60 pg/mL 85,4 95,2

80 pg/mL 78 98,4

Kami 2000 16 aspergilosis

incluyó aspergilomas 20 pg/mL 63

Kami 2000 sólo aspergilosis

diseminada 20 pg/mL 88

Fungitec G-Test MK

Obayashi y col. CID 2008;46 (15 June) 1864-70

Cutoff S % E %

Sensibilidad y Especificidad

Fungitell Odabasi 2004 20 IFI 60 pg/mL 100

(1 3)-β-D-Glucano

Pazos y col. 2005

7 Aspergilosis invasora 120 pg/mL 87,5 89,6

Ostrosky-Zeichner 2005

107 Candidiasis 60 pg/mL 81,3

Ostrosky-Zeichner 2005

10 Aspergilosis 60/80 pg/mL 80

Pickering 2005

Hemo bact Gram + Falsos + 80 pg/mL 93,3 77,2

Fungitell

(1 3)-β-D-GLUCANO

Senn L. y col. CID 2008;46:878-885

Ptes. Neutropénicos. 190 Episodios. 95 pacientes

Punto de corte 2 determinaciones ≥ 7 pg/ml

Sensibilidad: 63%

Especificidad: 96%

VPP: 79%

VPN: 91%

Ensayo Wako: Tachypleus tridentatus

Demostró que el Beta glucan fue capaz de demostrar IFI en estadíos

tempranos, antes que las manifestaciones radiológicas ocurran.

(1 3)-β-D-GLUCANO Ostrosky-Zeichner y col. CID 2005;41:654-59

Estudio Multicéntrico (6 US)

Punto de corte 60 pg/ml

Sensibilidad: 69,9 %

Especificidad: 87,1 %

VPP: 83,8 %

VPN: 75,1 %

Ensayo Fungitell, Limulus polyphemus

EFI n = 163 1 Muestra por paciente

Punto de corte 80 pg/ml

Sensibilidad: 64,4 %

Especificidad: 92,4 %

VPP: 89 %

VPN: 73 %

(1 3)-β-D-GLUCANO

Pneumocystis jiroveci

Clin Microbiol Infect. 2010 Dec 27. doi: 10.1111/j.1469-0691.2010.03452

Held J, Wagner D. Clin Microbiol Infect. 2011 Apr;17(4):595-602. doi: 10.1111/j.1469-0691.2010.03318.x.

Held J, Koch MS, Reischl U, Danner T, Serr A.

Niveles de beta-D-glucano como indicador

temprano en el diagnóstico de neumonía.

Niveles de beta-D-glucano evaluación de la

respuesta al tratamiento como valor pronóstico.

(1 3)-β-D-Glucano

Utilidad diagnóstica

Dosaje de β-D-Glucano, puede servir

como herramienta útil para el diagnóstico

de candidemias asociadas a cateter.

Nett et al. J. Infect Dis 2007. 195:1705-1712

(1 3)-β-D-GLUCANO en pacientes

oncohematológicos

Racil et al. J Medical Microbiology 2010;59:1016-1022

Sensibilidad limitada por la alta frecuencia de falsos +.

Falsos +: Mucositis / colonización con Candida /bacteriemia

/uso de antimicrobianos /productos hemáticos filtrados como

eritrocitos plaquetas /, muestras recolectadas através de

catéteres venosos.

Limitada utilidad en pacientes con malignidad hematológica.

BD positivo, NO puede ser usado para comenzar un

tratamiento antifúngico anticipado (pre-emptive) en este

grupo de ptes.

VPP:10 a 12 %.

S = 89-44% E = 20-56%

Alto VPN.

(1 3)-β-D-GLUCANO

Meta-análisis Karageorgopoulos et al. CID 2011;52(6):750-770

SENSIBILIDAD: 77%

ESPECIFICIDAD: 85%

Sobre 16 estudios desde 1995 – 2010.

Total pacientes: 2979.

594 con IFI Probada ó Probable

(excluyeron infección por Pneumocystis jiroveci)

A pesar de la heterogeneidad entre los diferentes estudios,

tiene buena precisión para distinguir pacientes de Probada o Probable

IFI, de NO IFI.

Adicional estudios prospectivos necesitan ser realizados.

CID 2012; 54 (5):633-643. Lamoth F. et al.

Cut-off pg/ml Fungitell 80 Fungitec-G 20 Wako 11 Maruha 11

(1 3)-β-D-GLUCANO

Revisión - Meta-análisis (ECIL-3) Pacientes Oncohematológicos

Lamoth et al. CID 2012;54(5):633-643

SENSIBILIDAD: 50%

ESPECIFICIDAD: 99%

VPP: 84%

VPN: 95% Dos pruebas consecutivas positivas tienen alta especificidad y

VPP y VPN.

Sensibilidad es baja la prueba necesita ser combinada con

hallazgos clínicos, radiológicos y microbiológicos.

Total: 1771 adultos. 215 con IFI Probada ó Probable.

Para 2 test consecutivos.

Galactomanano y (1 3)-β-D-glucano Enfermos críticos no-neutropénicos

Acosta et al. Eur J Clin Microbiol Infect Dis (2012) 31:721-731

SENSIBILIDAD: 67%

ESPECIFICIDAD: 98%

VPP: 80% VPN: 95%

Aspergilosis Invasora probada + probable GM comparable con BD

Ambos se hicieron positivos con una media de 6,5 días antes que el cultivo de Aspergillus. Mejora diagnóstico ambas determinaciones juntas

SENSIBILIDAD: 70%

ESPECIFICIDAD: 59%

Candidiasis invasora probada BD

Se hizo positivo con una media de 3,25 días antes que el cultivo de Candida.

VPN: 94,5%

Revisión de Definición de Enfermedad Fúngica Invasora

EORTC/MSG CID 2008; 46:1813-21

IFI Probable

Evidencia micológica la detección Galactomanano suero, BAL

β (1 3)-D-Glucano en suero

Se aplica al paciente inmunocomprometido Cancer, Trasplante de Médula Ósea, Receptores de Trasplantes de Órganos Sólidos, e Inmunodeficiencias Primarias

COMPARACIÓN (1 3)-β-D-GLUCANO / GALACTOMANANO /

PCR Real-Time

JCM, June 2004, p.2733-41. Kawazu et al.

Total de episodios:

AI Probada:

AI Probable:

AI Posible:

NO AI:

Pacientes oncohematlógicos

Frecuencia: 1 muestra semanal

S E VPP VPN

Galactomanano (GM) 100% 93% 55% 100%

β-D-Glucano (BG) 55% 98% 40% 96%

PCR Real-Time 55% 93% 40% 96%

ELISA Cut-off: I = 0,6 β-glucan Wako: 11 ng/mL PCR real-time: 40 cop./mL

JCM, Jan 2005, p.299-305. Pazos et al.

S E VPP VPN Falsos +

β-D-Glucano (BG) 87,5% 89,6% 70% 96,3% 10,3%

Total de episodios:

BG tendió a convertirse en positivo mas temprano que GM

Galactomanano (GM) 87,5% 89,6% 70% 96,3% 10,3%

Pruebas combinadas 87,5% 100% 100% 96,3%

BG y GM fueron positivos en los mismos pacientes

Discrepancias en los valores positivos para c/u de las pruebas ayudó a detectar

falsos +

COMPARACIÓN (1 3)-β-D-GLUCANO vs. GALACTOMANANO

AI Probada:

AI Probable:

AI Posible:

NO AI :

Pacientes oncohematlógicos Glucatell Cut-off >= 120 ng / mL

(1 3)-β-D-GLUCANO

Journal of Inmunological Methods. 365 (2011) 158-165. Yoneda A., y Kurokawa T.

Utiliza: Fragmentos recombinantes de la proteína,

Factor G.

Sensibilidad comparable al mét. Colorimétrico.

Tpos. de reacción más cortos.

Instrumenal común en lab. de análisis clínicos

Lectores de ELISA.

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