28/4. galactomanano. dra. iris agorio
TRANSCRIPT
Iris Agorio
Laboratorio de Microbiología
Micología
Hospital Británico de Buenos Aires
SOSPECHA CLÍNICA
ENFERMEDAD DE BASE
ESTADO INMUNE
TRATAMIENTO PREVIO - ATB ó ATF
ANTECEDENTES EPIDEMIOLÓGICOS
COMPLEMENTADO CON:
DIAGNÓSTICO POR IMÁGENES
DIAGNÓSTICO MICOLÓGICO
EXAMEN MICROSCÓPICO DIRECTO
CULTIVO
ESTUDIOS HISTOPATOLÓGICOS
DETECCIÓN de ANTICUERPOS
DIAGNÓSTICO MICOLÓGICO
CLÁSICO
DIAGNÓSTICO MICOLÓGICO NUEVAS METODOLOGÍAS
DIAGNÓSTICO MICOLÓGICO NUEVAS METODOLOGÍAS
Aspergillus especies
¿Donde lo encontramos?
•Aire
•Polvo de habitación y AMBIENTAL
•Productos Alimentarios
•Condimentos: ej. pimienta
•Filtros de aire acondicionado
•Biofilm en conductos de agua
•Plantas ornamentales y hojas secas
•Yerba mate
•Mayor exposición durante obras de demolición y construcción
Aspergillus especies
Factores predisponentes
• Edad avanzada
• Enfermedad de base
• Trasplante (Médula ósea - pulmón- higado etc.)
• Infección por virus respiratorios
• Número de transfusiones
• Neutropenia profunda y prolongada
• Enfermedad de injerto contra hospedero
• Infección por CMV
• Corticoterapia
Aspergillus especies
Fisiopatogenia
Patogenia Diámetro de las esporas
> 10 – 20 µm
5 – 7 µm
3 – 5 µm
< 3 µm
Fosa nasal
Alvéolos
NEUTROPENIA
Aspergillus especies
Fisiopatogenia
Patogenia Diámetro de las esporas
> 10 – 20 µm
5 – 7 µm
3 – 5 µm
< 3 µm
Fosa nasal
Alvéolos
NEUTROPENIA
Habitualmente la inmunidad innata es suficiente para eliminar a los conidios inhalados. Las células epiteliales de la vía aérea y los macrófagos alveolares realizan el aclaramiento de las conidias, tras reconocer determinados antígenos fúngicos de la pared, secretan mediadores inflamatorios que favorecen el reclutamiento de NEUTRÓFILOS y la activación de la inmunidad celular. Paso determinante en la eliminación de hifas y en la constitución de la respuesta inmunológica.
Conidias inhaladas
Germinación
Masa de hifas fase estacionaria
Elongación de la hifa filamento y ramificación
Aspergillus: Ciclo de vida
PRESENTACIÓN CLÍNICA Factores predisponentes
INVASORA
Alteración fagocitosis
Neutropenia (quimioterapia,
enf. oncohematológicas)
Trasplante
Glucocorticoides
Infec. por Citomegalovirus
Enf. Injerto contra huésped
Enf. Granulomatosa Crónica
POR HIPERSENSIBILIDAD
Asma: Individuos atópicos
Pacientes asmáticos y con enfermedad
granulomatosa crónica.
INTRACAVITARIA
Cavidades preformadas:
Tuberculosis, Sarcoidosis,
Bronquiectasias,
Senos paranasales.
Exposición a esporos de
Aspergillus spp.
PREVENCIÓN
¿Cómo?
Dirigida a
Evitar la exposición:
Alimentos crudos
Construcciones
Plantas, flores, polvo
Pacientes de alto
riesgo de AI
Aire filtrado:
•Filtros HEPA
•Flujo Laminar
•Presión Positiva
•Recambio > 12/hora
Agentes
quimiofluorescentes
Esputo
BAL
Biopsias
Líquidos
Etc.
DIAGNÓSTICO MICOLÓGICO
MUESTRAS Examen en fresco
Microscopio Óptico
Luz brillante
Contraste de fase
Examen en fresco
Microscopio Fluorescencia
Coloraciones
Examen en fresco (EF)
Microscopio Óptico
Luz brillante
Contraste de fase
Microscopía directa
MICROSCOÍA DIRECTA BAL Hongo de micelio hialino, ramificado y tabicado
Microscopía directa
Examen en fresco c/ líquido de montaje KOH AL 10%
Agentes quimiofluorescentes
Calcoflúor
Microscopio de fluorescencia
Microscopía directa
Tinción
Coloración Argéntica
Histopatología
Agentes
quimiofluorescentes
Esputo
BAL
Biopsias
Líquidos
Etc.
DIAGNÓSTICO MICOLÓGICO
MUESTRAS
Cultivo
Examen en fresco
Microscopio Óptico
Luz brillante
Contraste de fase
Examen en fresco
Microscopio Fluorescencia
Coloraciones
Sabouraud Aislamiento primario
Czapek Dox
Agar Malta
Estructuras morfológicas de género Aspergillus Cabezas conidiales
Células de Hülle
Radial Columnar
Conidióforo
Célula “pie”
Vesícula
Métula
Fialides
Conidias
Uniseriado Biseriado
ASPERGILOSIS: CULTIVO Aspectos de las colonias y observación microscópica
Agentes: Aspergillus fumigatus (85%)/Aspergillus flavus (5-10%) / Otros: A. niger, A. terreus, A. nidulans, etc.
A.fumigatus A.flavus
A.niger
CULTIVO
Estudio de vigilancia (Inmonocomprometido) Hisopado nasal
Baja especificidad Inmunocomp. No Neutropénicos
Pacientes tratados con esteroides
Colonización con Aspergillus esta aumentada en Fumadores y
Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica
Tiene un valor
predictivo alto de
Aspergilosis Invasora
Leucemia aguda
Neutropénicos
Trasplante de Pulmón
Muy Buena
especificidad
Nunca se asocia con
Aspergil. pulmonar
Grupos de alto riesgo BAL
No inmunocomprometidos
Tumor sólido no neutropénicos
Cultivo de
Esputo Positivo
Según Tipo de Muestras
MUESTRA Suero Inmunodifusión
Inmunocompetentes
Especie específica
Aspergillus sección Fumigati Aspergillus sección Flavi
Aspergillus sección Terrei
Aspergillus sección Nigri
Aspergilosis invasora
Agentes causales
Aspergillus fumigatus 56%
Aspergillus flavus 9%
Aspergillus niger 7%
Aspergillus terreus 5%
Aspergillus nidulans
Aspergillus ustus
Múltiples especies 23%
* Transplant Associated Infection Surveillance Network (TRANSNET) Study 2001-2006
Epidemiología por Infección fúngica
por hongos filamentosos IC en Argentina.
Enfermedad de base.
Revisión y experiencia.
2007-2011
M. C. Dignani, G. Davel y col. REMIIN / Red Micología
Oncohematológicos
Trasplante órgano sólidos
HIV
Diabetes
Enf. granulomatosa crónica
Cancer órgano sólido
Trat inmunosup no cancer
Otros
Oncohemato 67%
TOS 10%
HIV 6%
Diabetes 4%
Hialohifomicosis
Mucoramicosis
Feohifomicosis
Otros
Epidemiología por Infección fúngica
por hongos filamentosos IC en Argentina.
Agentes etiológicos.
Revisión y experiencia.
2007-2011
M. C. Dignani, G. Davel y col. REMIIN / Red Micología
Hialohifomicosis 60%
Mocoramicosis 28%
Feohifomic.18%
Otros 8% Aspergillus 55
Fusarium 15
Paecilomyces 5
Scedosporium 2
Sarocladium 2
Scopulariopsis 2
Rendimiento de las técnicas
Hospital Británico
Paciente oncohematológico
Microscopía directa (montaje húmedo)
Campo brillante
Calcoflúor 17 / 17
6 / 17 (35 %) Cultivo
8 / 17 (47 %)
CULTIVO
Estudio de vigilancia (Inmonocomprometido) Hisopado nasal
Baja especificidad Inmunocomp. No Neutropénicos
Pacientes tratados con esteroides
Colonización con Aspergillus esta aumentada en Fumadores y
Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica
Tiene un valor
predictivo alto de
Aspergilosis Invasora
Leucemia aguda
Neutropénicos
Trasplante de Pulmón
Muy Buena
especificidad
Nunca se asocia con
Aspergil. pulmonar
Grupos de alto riesgo BAL
No inmunocomprometidos
Tumor sólido no neutropénicos
Cultivo de
Esputo Positivo
Según Tipo de Muestras
PACIENTES NEUTROPÉNICOS ADULTOS DE ALTO RIESGO
Br. J. Haematol. 2000; 110: 273-284
Prentice y col.
< 100 neutrófilos / mm3 > 3 semanas
Trasplante de médula ósea no relacionado
Enfermedad injerto contra huésped
Neutropenia < 500 neutrófilos / mm3 > 5 semanas
Corticosteroides > 2 mg/kg > 2 semanas
Corticosteroides > 1mg/kg con neutropenia
AraC a altas dosis
Fludarabina
Alemtuzumab
UTILIDAD DIAGNÓSTICA DE GALACTOMANANO
Br. J. Haematol. 2000; 110: 273-284
Prentice y col.
Receptores de trasplante de órganos sólidos
SIDA
Enfermedad granulomatosa crónica
Neoplasias de órgano sólido
Grandes quemados
GALACTOMANANO EN SUERO
UTILIDAD DIAGNÓSTICA RELATIVA EN:
Factores predisponentes
de Aspergilosis invasora • Leucocitos polimorfonucleares entre
500/mm3 y 100/mm3 .
• Neutropenia prolongada (12 – 15 dias).
• Infección por Citomegalovirus
(trasplantes de pulmón / TMO).
• Terapia con corticoides.
DIAGNÓSTICO MICOLÓGICO PRECOZ EN EL
PACIENTE NEUTROPÉNICO FEBRIL,
SE ASOCIA CON AUMENTO DE LA
SUPERVIVENCIA.
FACTOR TIEMPO
JUEGA UN ROL MUY IMPORTANTE
BIOMARCADORES
BÚSQUEDA
TÉCNICAS ALTRNATIVAS
Énfasis en vigilancia
Directo y Cultivo Positivo
Diagnóstico IFI en Neutropenia profunda prolongada
Sitios estériles
Diagnóstico de IFI
HEMOCULTIVO Baja sensibilidad < 1%
NO se accede a la BIOPSIA Enf crítico
plaquetopénico sitio no abordable
SI se accede a la BIOPSIA carga fúngica baja ó no
viable
Sitios estériles
Sitios NO estériles
Esputo-Hisopado nasal POSITIVOS
Colonzación del paciente crítico
¿?
Mananos (polímeros de D manosa)
Manoproteínas
Quitina (poliacetilamino hexosa)
Membrana celular
Bicapa de fosfolípidos
Ergosterol
Célula fúngica
P
A R E
D
M
E
M
B.
Beta (1,3)-glucanos
(polímeros de D glucosa)
Beta (1,6)-glucanos
C
I
T
O
P
L
A
S
M
A
Ribosomas 80 S
Mitocondrias
Núcleo
Retículo endoplásmico R y L
Aparato de Golgi
Lisosomas
Lisis de
constituyentes
de la hifa
Vacuolas
Glucógeno
Lípidos
Aminoácidos
Polifosfatos
ATPasa
Glucosa K+
ATP ADP K+
H2O
Bomba de
extrusión de protones
K+
H2O
Glucosa Iones de H/protones
K+
K+
ZONA DE
SENESCENCIA ZONA DE
ALMACENAMIENTO
ZONA DE
ABSORCIÓN ZONA DE CRECIMIENTO APICAL
Adaptado de Jennings & Lysek, 1999 - Piontelli
Pared celular
Específico de Aspergillus spp.
NO Específico
de Aspergillus spp.
Galactomananos
(1 - 3) β-D-glucanos
CITOPLASMÁTICOS: ADN
Hifa
Clearence renal/hepático
Número de epitopes
Experiencia
Cut-off
Pre-tratamiento
Conservación
Factores involucrados en la realización del ELISA diagnóstico de aspergilosis invasora en SUERO
The Lancet Infectious Diseases. Vol 4 June 2004 349-357 Mennink-Kersten y col.
O2
GM 20 kDa
GM/galf-glicoprot 35-94 kDa
Lipopéptido GM >100 kDa
Ac anti-Aspergillus
Factores paciente edad
Cond. subyacentes citoquinas
Antifúngicos/Atb beta lactámicos
Antígenos GM/galf circulantes
Frecuencia de muestreo
Suero
ELISA
Glucosa
Neutrófilos circulantes
Sitio de Infección Sangre circulante Laboratorio
Especie
Cepa
Ramificaciones
Hifa
Experiencia
Cut-off
Pre-tratamiento Conservación
The Lancet Infectious Diseases. Vol 4 June 2004 349-357. Mennink-Kersten y col. Agca H. et al. Mycoses 2014, 57, 169-175
O2
GM 20 kDa
GM/galf-glicoprot 35-94 kDa
Lipopéptido GM >100 kDa
Antifúngicos?
ELISA
Definición de positivo
Glucosa
Sitio de Infección Sangre circulante Laboratorio
Especie Cepa
Ramificaciones Neutropenia?
Factores involucrados en la realización del ELISA diagnóstico de aspergilosis invasora en BAL
Volumen de muestra
recolectado?
FACTORES QUE INFLUENCIAN LA DETECCIÓN DE ANTÍGENO
EN ASPERGILOSIS INVASORA
EQUIPO COMERCIAL
Galactomananos
EQUIPO COMERCIAL
Galactomananos
Kit Nuevo - 2012 Argentina
Nombre Platelia Aspergillus Ag
Código 62794
Uso
Detección de antígeno
galactomanano en suero de adultos,
pediátricos, BAL, otros líquidos
biológicos
Composición
R1 Microplaca sensibilizada 96 pocillos
(12 tiras de 8 pocillos)
R2 Sln. lavado 20x proclin
R3 / R4 / R5 Controles Listo para su uso .
Conservante <1,5% proclin TM 300
R6
Conjugado Ac monocl. Anti GM
marcado peroxidasa. Conservante:
<1,5% proclin TM 300
R7 Solución tratamiento de muestra:
EDTA
R9
Cromógeno TMB listo para usar
3,3´,5,5´-tetramethilbenzidine (<0,1%),
H2O2 < 1%
R10 Ácido sulfúrico (H2SO4) 1 N
Desarrollado US 1 inserto internacional
DESARROLLO EN LA DETECCIÓN DE
GALACTOMANANOS (GM) EN FLUÍDOS
BIOLÓGICOS
Estructura química del antígeno
[- M - M - M - M -]n
M: Manano
G: Galactofurano
n = 10
R > 3
[G]R [G]
G G
Selección de anticuerpos
monoclonales, específicos contra
la cadena lateral de
Galactofuranos (G) ausente en
humanos
Ac monoclonal
EBA-2
Clin Microbiol. Rev 1999; 12:310-350 Latgé
Galactofurano
s
Pasos de la técnica
Precipitación de proteínas con EDTA y calentamiento en bloque térmico o ebullición 3 minutos.
Centrifugación a > 10.000 rpm 10 – 20 minutos
Extracción de sangre en campo estéril igual que hemocultivos
Guardar el suero a 4°C si se usa dentro de 24 horas. Frezar a -18°C de lo contrario.
Utilizar tips y tubos estériles apirógenos. Los tubos con tapa a rosca
M. A. S. H. Mennink-Kersten, J. P. Donnnelly and P. E. Verweij The Lancet Infectious Diseases Vol4 June 2004
EIA en suero para Galactomananos
Galactomananos (GM)
Microplaca
Suero
M. A. S. H. Mennink-Kersten, J. P. Donnnelly and P. E. Verweij The Lancet Infectious Diseases Vol4 June 2004
EIA en suero para Galactomananos
Galactomananos (GM)
Microplaca
Ac EBA-2 GM Peroxidasa
Suero
M. A. S. H. Mennink-Kersten, J. P. Donnnelly and P. E. Verweij The Lancet Infectious Diseases Vol4 June 2004
EIA en suero para Galactomananos
Galactomananos (GM)
Microplaca
Ac EBA-2 GM Peroxidasa
Cromógeno
M. A. S. H. Mennink-Kersten, J. P. Donnnelly and P. E. Verweij The Lancet Infectious Diseases Vol4 June 2004
EIA en suero para Galactomananos
Galactomananos (GM)
Microplaca
Ac EBA-2 GM Peroxidasa
Cromógeno
M. A. S. H. Mennink-Kersten, J. P. Donnnelly and P. E. Verweij The Lancet Infectious Diseases Vol 4 June 2004
EIA en suero para Galactomananos
Galactomananos (GM)
Microplaca
Ac EBA-2 GM Peroxidasa
Cromógeno
PLACA DE LECTURA DE ELISA ASPERGILLUS
Control NEGATIVO
CUT-OFF
Control POSITIVO
CUT-OFF
• RESULTADO
Se expresa como ÍNDICE (I)
I = DO muestra / DO cut-off
Cociente entre:
DO muestra / DO cut-off
SUERO
2 muestras consecutivas
I ≥ 0,5
POSITIVO
Detección de galactomananos por ELISA
Niveles de punto de corte
Fabricante del equipo PlateliaR Bio-Rad, hasta marzo 2007
I ≥ 1,5 (2 muestras consecutivas) Presencia de GM
I entre 1,0 - 1,5 Indeterminado
I < 1,0 Ausencia de GM
Propuesta en adultos Maertens et al.* (2004)
Punto de corte estático I ≥ 0,8 (1muestra)
Punto de corte dinámico I ≥ 0,5 (2 muestras consecutivas)
* Maertens et al. B. J. Haematology 2004; 126: 852-860. ** Mennink-Kersten et al. The Lancet Infectious Diseases. Vol 4 June 2004 349-357.
*** Kawazu et al. JCM, June 2004, p.2733-41. **** US Food and Drug Administration (FDA Upton A. et al. J.Clin.Microbiol
2005;43:4796-4800. *****Maertens J. A.et al. Optimization of the Cutoff Value for the Aspergillus Double-Sandwich Enzyme
mmunoassay. Clin. Infect. Dis 2007; 44: 1329-1336.
Propuesta Mennink-Kersten et al. ** (2004)
I ≥ 0,7
Propuesta Kawazu et al. *** (2004)
I ≥ 0,6
Propuesta US Food and Drug Administration **** (2005)
I ≥ 0,5
Valores de cut-off
Propuesta Maertens et al ***** (2007)
I ≥ 0,5 (2 muestras consecutivas)
Detección de Galactomananos
Falsos Negativos
Falsos Positivos
Profilaxis antifúngica
Población no seleccionada
Encapsulación de la infección
Formación de inmunocomplejos: Ac. anti-Aspergillus
Antibióticos de Origen fúngico: Pip-Tazo / AMCla.
Reacción cruzada con antígenos de otros géneros: Penicillium, Fusarium spp. Paecilomyces, Alternaria, Geotrichum, Histoplasma y Candida
Rn cruzada por bacteriemias
Contaminación con algodón
Mucositis intensa
Colonización masiva intestinal por Aspergillus
Transfusiones
Es un ensayo inmunoenzimático
Validado para muestras de suero y BAL
Es una prueba que cuando se utiliza junto
con otros procedimientos diagnósticos
puede usarse como ayuda en el diagnóstico de la aspergillosis invasiva
Tortorano et el. 2012. JCM.
• Los resultados son expresados como índice (GM)
• Un índice > a 0.5 en dos muestras consecutivas se
interpreta como RESULTADO POSITIVO
PRIMEROS ESTUDIOS PROSPECTIVOS GM
Maertens
et al. (1)
Maertens
et al. (2)
Sulahian
et al. (3)
Punto de corte
( Nº de muestras positivas )
1
(2)
1
(2)
1,5
(2)
Aspergilosis invasora
(Probada+Probable) (n) 33 39 53
Sensibilidad (%) 93 90 91
Especificidad (%) 95 98 94
VPP (%) 93 87 SD
VPN (%) 95 98 SD
Falsos positivos (%) 8 14 12
Precocidad en días (%) 6 (54) 5 (68) 7 (40)
Eficacia global (%) 94 95 SD
1) J Clin Microbiol 1999; 37:3223-28. Maertens et al.
2) Blood 2001; 97:1604-10. Maertens et al.
3) Cancer 2001; 91: 311-18. Sulahian et al.
VPP: Valor predictivo positivo
VPN: Valor predictivo negativo
SD: Sin datos
CID 2006-42; 1417.1427. Pfeiffer y col.
CID 2006-42; 1428-1429. John H. Rex.
GALACTOMANANOS VERSUS
DIAGNÓSTICO DE ASPERGILOSIS DATOS GLOBALES DE 27 ESTUDIOS DESDE 1966 HASTA FEBRERO 2005
Probada Sensibilidad: 61%
Especificidad: 89%
Probada + Probable Sensibilidad: 71%
Especificidad: 93%
VPN: 98%
VPN: 95%
VPP: 26%
VPP: 53%
ANTIGENEMIA de ASPERGILLUS
Detección de Galactomananos
Investigación comienza: al inicio de la neutropenia
Frecuencia: 2 muestras semanales
CID 2002; 34:7-14. Definición Infección Fúngica Invasora. Consenso EORTC/MSG
Método: ELISA
Consenso EORTC/MSG 2002 Propone su uso
Clasificando Dos Resultados Consecutivos
Positivos en la Categoría de “Infección Probable”
Selección de entidad/es clínica/s en las que se realizará la
prueba
GALACTOMANANOS VERSUS DIAGNÓSTICO DE ASPERGILOSIS
Maertens J. A., et al.
Optimization of the Cut off Value for the Aspergillus Double-Sandwich
Enzyme Immunoassay. Clin. Infect. Dis 2007; 44: 1329-1336.
Punto de corte: I ≥ 0,5 Sensibilidad: de 76,3% a 97,4% Especificidad: de 97,5% a 90,5%
DATOS 2007
Índice de Galactomananos como
Monitoreo de Respuesta al Tratamiento
Antifúngico
Marr K. A. Aspergillus galactomannan index: a surrogate end point to asses outcome of
therapy?. Clin Infec Dis 2008; 46:1423-5.
Disminución de I de GM se asocia con buena
respuesta al tratamiento.
Valores persistentes o aumentados indican
aspergilosis progresiva.
Miceli M. H.,Grazziotti M. L., et al. Strong correlation between serum Aspergillus
galactomannan index and outcome of aspergillosis in patients with hematological
cancer: clinical and research implications. Clin Infec Dis. 2008; 46:1412-1422.
Índice de Galactomananos en suero
Hospital Británico 2004 a 2008
Natalia Enriquez, Gustavo Mendez, Rosana Jordán, Ernesto Efron, Amalia Schiel, Iris Agorio.
Datos no publicados
Sensibilidad: 81,8%
Especificidad: 81,9%
Valor Predictivo Positivo: 28,1%
Valor Predictivo Negativo: 98,1%
Total 138 pacientes 641 GM
Promedio de 5 por paciente
GALACTOMANANOS
en suero
Útil para discernir entre:
•síndrome de reconstitución inmune cuando
se recuperan neutrófilos
y
•Progresión de la enfermedad invasora
GALACTOMANANOS
Muestras distintas a suero
En lavado broncoalveolar
J. Maertens propone el uso de un Cut-off ≥ 1,0.
Se investiga también en muestras obtenidas de
sitios estériles, biopsias, líquidos de punción.
CID 2009; 49:1688-1693. J. Maertens y col.
Utilidad del Galactomanano en BAL
Maertens J. et al. CID 2009; 49: 1688-93. GM en BAL para diagnóstico API en pacientes con enfermedad hematológica
Categorías
Índ
ice
GM
0,01
0,1
1 Más alto Cut-off = 0,7
Más bajo Cut-off = 0,5
10
FN
VP FP
VN
Tiende a disminuir la sensibilidad en pacientes con
profilaxis.
Utilidad del Galactomanano en BAL
GM en BAL diagnóstico API en pacientes enf. Hematológica Maertens J. et al. CID 2009; 49: 1688-93.
SENSIBILIDAD
GM en BAL 91,3 % (I ≥ 1,0)
CULTIVO 50 %
MICROSCOPÍA 53,3%
GM en BAL (I ≥ 1,0)
VPP 76 %
VPN 96 %
Agca H. et al. Mycoses 2014, 57, 169-175
- GM no es afectado por el estado inmune del paciente - GM Cut Off > 1,0 correlacionó mejor con cultivo positivos
MICROSCOPÍA CULTIVO GM SUERO GM BAL Referencia
SENSIBILIDAD 53% 50% 55% 100% Maertens CID 2009
Cut-off 1,0 ESPECIFICIDAD 88%
SENSIBILIDAD 40% 69% 40% 100% Hsu BMC I. Dis 2010
Cut-off 0,5/1,0 ESPECIFICIDAD 100% 100% 73/98%
SENSIBILIDAD 58% 69% 58% 100% Luong Diag Micro Inf
Dis 2010
Cut-off 2,0 ESPECIFICIDAD 93%
SENSIBILIDAD 55% 69% 72% 58% Bergeron Chest 2010
Cut-off 0,5 ESPECIFICIDAD 96%
SENSIBILIDAD 78% 78% Desai Pediat Inf Dis J
2009
Cut-off 0,98 ESPECIFICIDAD 100% 92%
SENSIBILIDAD 29% 57% 79% 64% Paugan Pathol Biol 2010
Cut-off 0,5 ESPECIFICIDAD 100%
Chadi A. et al. Current Opinion in Pulmonary Medicine 2011, 17: 167-171.
COMPARACIÓN DE MÉTODOS PARA DIAGNÓSTICO
ASPERGILOSIS
GM Negativo 5 (30%)
GM Positivo 12 (70%)
Índice de Galactomananos
en suero versus cultivo positivo
para Aspergillus spp. Hospital Británico 2004 a 2009
Pacientes oncohematológicos y trasplante de
células progenitoras hematopoyéticas.
Cultivo Positivo para especies de Aspergillus 17
Mendez G., Jordan R., Martinez J, Enriquez N, Verbanaz S, Giorgio P, Efron E.
Aspergillus
Fusarium
Mucorales
Histología
GM
Histología + GM
Otros
Aspergillus spp. 43%
Fusarium spp. 13% Mucorales 6%
GM 12%
Otros 15%
Histopatología 8%
Histopatología + GM 3%
Diagnóstico en 51 (75%) pacientes
sólo 1 prueba positiva
Cultivo: 38
GM: 9
Histopatología: 4
Diagnóstico de Micosis por Hongos
Filamentosos en inmunocomprometidos en
Argentina. REMIIN 2010 - 2012
Diagnóstico en 17 (25%) pacientes
mas de 1 prueba positiva
Dignani MC, Davel G y col. Grupo REMIIN (registro de micosis invasoras)
3er Simposio de la Sociedad Argentina de Hematología. [Abstract 13]. 2012;16:125
Total 68 pacientes
Aspergillus Lateral-Flow Device
Método: Suero y BAL hemorrágico
Se busca antígeno JF5 es manoproteína Punto corte aprox 30 ng/ml
Aspergillus Lateral-Flow Device
Multicéntrico Cut off BAL ≥ 1,0 VPN 97
El SIGNO HALO es transitorio (dentro de las 24 hs.), aumenta
de tamaño durante la neutropenia
y luego
SIGNO del AIRE CRECIENTE (4 días) al recuperar neutrófilos.
Evolución radiográfica de la neumonía por
Aspergillus spp.
TAC de alta resolución tomada en forma secuencial
Signo del Halo alrededor de una imagen
nodular
Angioinvasión
de pequeños
vasos
Halo
Recomendaciones Biomarcadores Método Indicado Recomendación
Galactomanano
Temprana
detección
de aspergilosis
Suero seriado + Tomografía de alta resolución,
en adultos neutropénicos bajo quimio. por
leucemia ó TMO alogeneico
Cut-off un solo resultado I > 0,7
ó
Cut-off dos mtras consecutivas I > 0,5
J Antimicrob Chemother 2011;66 Suppl 1: i15-24. Cuenca-Estrella
Recomendaciones Biomarcadores Método Indicado Recomendación
Galactomanano
Temprana
detección
de aspergilosis
Suero seriado + Tomografía de alta resolución,
en adultos neutropénicos bajo quimio. por
leucemia ó TMO alogeneico
Cut-off un solo resultado I > 0,7
ó
Cut-off dos mtras consecutivas I > 0,5
En ptes no-neutropénicos GM en suero NO
tiene el mismo valor diagnóstico y pronóstico
J Antimicrob Chemother 2011;66 Suppl 1: i15-24. Cuenca-Estrella
Recomendaciones Biomarcadores Galactomanano Indicado Recomendación
Galactomanano
Temprana
detección
de aspergilosis
Suero seriado + Tomografía de alta resolución,
en adultos neutropénicos bajo quimio. por
leucemia ó TMO alogeneico
Cut-off un solo resultado I > 0,7
ó
Cut-off dos mtras consecutivas I > 0,5
En ptes no-neutropénicos GM en suero no
tiene el mismo valor diagnóstico y pronóstico
Suero es útil en ptes neutropénicos pediátricos
J Antimicrob Chemother 2011;66 Suppl 1: i15-24. Cuenca-Estrella
Recomendaciones Biomarcadores Método Indicado Recomendación
Galactomanano
Temprana
detección
de aspergilosis
Suero seriado + Tomografía de alta resolución,
en adultos neutropénicos bajo quimio. por
leucemia ó TMO alogeneico
Cut-off un solo resultado I > 0,7
ó
Cut-off dos mtras consecutivas I > 0,5
En ptes no-neutropénicos GM en suero no
tiene el mismo valor diagnóstico y pronóstico
Suero es útil en ptes neutropénicos pediátricos
Valores > 1 en ptes adultos y pediátricos
tratados, se considera un signo de falla
terapéutica
J Antimicrob Chemother 2011;66 Suppl 1: i15-24. Cuenca-Estrella
Recomendaciones Biomarcadores Método Indicado Recomendación
Galactomanano
Temprana
detección
de aspergilosis
Suero seriado + Tomografía de alta resolución,
en adultos neutropénicos bajo quimio. por
leucemia ó TMO alogeneico
Cut-off un solo resultado I > 0,7
ó
Cut-off dos mtras consecutivas I > 0,5
En ptes no-neutropénicos GM en suero no
tiene el mismo valor diagnóstico y pronóstico
Suero es útil en ptes neutropénicos pediátricos
Valores > 1 en ptes adultos y pediátricos
tratados, se considera un signo de falla
terapéutica
Ptes neutropénicos y no-neutropénicos puede
ser útil BAL cut-off > 1 LCR cut-off > 0,5 (BIII)
J Antimicrob Chemother 2011;66 Suppl 1: i15-24. Cuenca-Estrella
Pacientes críticos
Pacientes neutropénicos
CONCLUSIÓN
Aspergilosis
GM suero
Técnica mas reproducible que BG
Tiene alta especificidad
Galactomanano
Integrar signos clínicos, estudios radiológicos (TC) y microbiológicos.
Monitoreo de la respuesta al tratamiento antifúngico
Monitoreo de la respuesta al tratamiento antifúngico, Síndrome de
reconstitución inmune
Pacientes críticos
Pacientes neutropénicos
(1 3)-β-D-glucano
Puede ser usado para excluir AI en un entorno clínico con GM negativo
Para aumentar la certeza de AI en la presencia de un GM
positivo ó un aislamiento positivo de un sitio no estéril
Aspergilosis
GM suero BD suero
CONCLUSIÓN
Pacientes críticos
Pacientes neutropénicos
Aspergilosis
GM suero BD suero
Aspergilosis
Candidiasis Neumocistosis
BD suero
Parece ser mas sensible que GM en la detección de AI, no
obstante carece de especifcidad micológica intrínseca,
requiere integración de datos clínicos, radiológicos y
microbiológicos para una correcta interpretación.
(1 3)-β-D-glucano
Herramienta de screening para vigilancia de AI y otras
infecciones fúngicas diseminadas, en poblaciones con riesgo
Realización mas compleja que GM con un costo mayor
CONCLUSIÓN
Pacientes críticos
Pacientes neutropénicos
Aspergilosis
GM suero BD suero
Aspergilosis
Candidiasis Neumocistosis
BD suero
GM BAL
Datos indican mas Sensibilidad que en suero
Galactomanano en BAL
CONCLUSIÓN
Grados de Evidencia de Recomendación sobre las Técnicas Diagnósticas
en la Infección Fúngica Invasora Categoría de la Evidencia Calidad de la Evidencia
Categoría A Útil y fiable Calidad I ≥1 estudio multicéntrico bien diseñado de casos controles o cohortes
Categoría B Utilidad moderada Calidad II ≥1 estudio de casos controles o cohortes realizados en 1 sólo centro de múltiples series o de series no controladas
Categoría C Sin utilidad Calidad III Opiniones de expertos basadas en experiencias clínicas o estudios descriptivos
(1 3) - β - D - Glucano B III o Usualmente positivo pero no específico.
Diagnóstico Grado de Evidencia
Basados en los resultados obtenidos con criterios EORTC/MSG para definir Inf Fúngica Diseminada,
integrando signos clínicos, radiológicos y microbiológicos.
Galactomanano A II / B II o Cuando es positivo puede ser útil para seguimiento.
Bone Marrow Transplantation (2012) 47,846-854. Recomendaciones ECIL-3
Uso Biomarcadores en Diag Enf. Fúngica Invasora en Leucemia y TMO.
El diagnóstico convencional sigue siendo el método de referencia
CONCLUSIONES Marcadores biológicos
Aún no se tienen evidencias sólidas .
Combinar técnicas sería la mejor opción, tanto para diagnóstico temprano como para seguimiento de
paciente.
El diagnóstico temprano sigue siendo dificultoso y por lo tanto requiere enfoque
multidisciplinario.
MUCHAS GRACIAS…
(1 3)-β-D-GLUCANO
Es un constituyente de la pared celular de
la mayoría de los hongos de importancia
médica
Excepción: Cryptococcus y Zygomycetes
Detecta picogramos
Fungitec G-Test
MK
Β-glucan Test
Wako B-G Star Fungitell
Fabricante Seikagaku
Corporation
Wako Pure
Chemical
Maruha
Corporation
Associates of
Cape Code
País Japón Japón Japón USA
Año aprobado 1995 1996 2001 2004
Método Cinética
cromogénica
Cinética
turbidimétrica
Punto final
cromogénico
Cinética
cromogénica
Muestra Suero o Plasma Suero o Plasma Suero o Plasma Suero
Pretratamiento Álcali Dilución y
calentamiento
Dilución y
calentamiento Álcali
Standard
β-glucan Pachyman
Carboxymethyl-
curdlan Lentinan Pachyman
Origen Tachypleus
tridentatus
Limulus
polyphemus
Tachypleus
tridentatus
Limulus
polyphemus
Cutoff pg/mL 20 11 11 60 o 80
Rango pg/mL 3,9 - 500 6 - 600 1,2 – 120 31,25 - 500
Tpo. minutos 30 90 30 40
CID 2008:46 (15 June). Obayashi y col.
(1 3)-β-D-GLUCANO
Frecuencia: 2 a 3 veces por semana
Diferentes equipos, diferentes géneros de cangrejos
• Fungitell (Glucatell) (Limulus polyhemus)
Distintos puntos de corte ≥ 60 / ≥80 / ≥ 120 pg/mL
• FungiTec-G (Tachypleus tridentatus) Cut-off 20 pg/mL
Muestra: suero o plasma
Muestras no aptas para procesar son sueros:
• Lipémicos
• Hemolizados
• Presencia de bilirrubina
• Turbios
FACTOR C
ENDOTOXINA (LPS)
FACTOR C ACTIVADO
ENZIMA DE COAGULACIÓN
INACTIVA
FACTOR B ACTIVADO FACTOR B
ENZIMA DE COAGULACIÓN
ACTIVA
SUSTRATO CROMOGÉNICO CROMÓFORO Abs 405 nm
FACTOR G ACTIVADO FACTOR G
( 13 ) - - D - GLUCANO
ENSAYO COLORIMÉTRICO
Camino metabólico de coagulación cangrejo de herradura
DETECCIÓN DE ( 1 3 ) - - D - GLUCANO
ENDOTOXINA (LPS)
LECTURA
Sistema de Detección
S1
S2
S3
S4
S5
B
1
1
A
B
C
D
E
F
G
H
1 2 3 4 5 6 7 9 8 10 11 12
0
100
50
25
12
6
4 7
4 7
2 5 8
8 5 2
3 6 9
9 6 3 12 15 18
18 15 12
11 14 17
17 14 11
10 13 16
16 13 10
DISEÑO DE REALIZACIÓN
(1 3)-β-D-GLUCANO
B = BLANCO
S = CONTROLES
1 = MUESTRAS
21
21
20
20
19
19
= CONTROLES Curva en pg-ml
6 12 25 100 50
Concentración de Glucanos picogramos/mL
DO/min
a 405 nm
70
DO muestra
CURVA DE CALIBRACIÓN
(1 3)-β-D-GLUCANO
Insuficiencia renal
Hemodiálisis con filtros de celulosa
Inmunoglobulinas ó sus derivados
Exposición de serosas ó superficie
corporal a gasas o algodón
Albúmina
Factores de coagulación
Fracciones de proteínas plasmáticas
Ciertos Streptococcus producen
polímeros simil glucano
Exceso de manipulación de la muestra
(1 3)-β-D-GLUCANO
Falsos positivos
Cutoff S % E %
Sensibilidad y Especificidad
Fungitec
G-Test MK Obayashi y col. 1995 (41 IFI) 20 pg/mL 90 100
(1 3)-β-D-Glucano
Obayashi y col. 2008 (54 IFI) 30 pg/mL 95,1 85,7
60 pg/mL 85,4 95,2
80 pg/mL 78 98,4
Kami 2000 16 aspergilosis
incluyó aspergilomas 20 pg/mL 63
Kami 2000 sólo aspergilosis
diseminada 20 pg/mL 88
Fungitec G-Test MK
Obayashi y col. CID 2008;46 (15 June) 1864-70
Cutoff S % E %
Sensibilidad y Especificidad
Fungitell Odabasi 2004 20 IFI 60 pg/mL 100
(1 3)-β-D-Glucano
Pazos y col. 2005
7 Aspergilosis invasora 120 pg/mL 87,5 89,6
Ostrosky-Zeichner 2005
107 Candidiasis 60 pg/mL 81,3
Ostrosky-Zeichner 2005
10 Aspergilosis 60/80 pg/mL 80
Pickering 2005
Hemo bact Gram + Falsos + 80 pg/mL 93,3 77,2
Fungitell
(1 3)-β-D-GLUCANO
Senn L. y col. CID 2008;46:878-885
Ptes. Neutropénicos. 190 Episodios. 95 pacientes
Punto de corte 2 determinaciones ≥ 7 pg/ml
Sensibilidad: 63%
Especificidad: 96%
VPP: 79%
VPN: 91%
Ensayo Wako: Tachypleus tridentatus
Demostró que el Beta glucan fue capaz de demostrar IFI en estadíos
tempranos, antes que las manifestaciones radiológicas ocurran.
(1 3)-β-D-GLUCANO Ostrosky-Zeichner y col. CID 2005;41:654-59
Estudio Multicéntrico (6 US)
Punto de corte 60 pg/ml
Sensibilidad: 69,9 %
Especificidad: 87,1 %
VPP: 83,8 %
VPN: 75,1 %
Ensayo Fungitell, Limulus polyphemus
EFI n = 163 1 Muestra por paciente
Punto de corte 80 pg/ml
Sensibilidad: 64,4 %
Especificidad: 92,4 %
VPP: 89 %
VPN: 73 %
(1 3)-β-D-GLUCANO
Pneumocystis jiroveci
Clin Microbiol Infect. 2010 Dec 27. doi: 10.1111/j.1469-0691.2010.03452
Held J, Wagner D. Clin Microbiol Infect. 2011 Apr;17(4):595-602. doi: 10.1111/j.1469-0691.2010.03318.x.
Held J, Koch MS, Reischl U, Danner T, Serr A.
Niveles de beta-D-glucano como indicador
temprano en el diagnóstico de neumonía.
Niveles de beta-D-glucano evaluación de la
respuesta al tratamiento como valor pronóstico.
(1 3)-β-D-Glucano
Utilidad diagnóstica
Dosaje de β-D-Glucano, puede servir
como herramienta útil para el diagnóstico
de candidemias asociadas a cateter.
Nett et al. J. Infect Dis 2007. 195:1705-1712
(1 3)-β-D-GLUCANO en pacientes
oncohematológicos
Racil et al. J Medical Microbiology 2010;59:1016-1022
Sensibilidad limitada por la alta frecuencia de falsos +.
Falsos +: Mucositis / colonización con Candida /bacteriemia
/uso de antimicrobianos /productos hemáticos filtrados como
eritrocitos plaquetas /, muestras recolectadas através de
catéteres venosos.
Limitada utilidad en pacientes con malignidad hematológica.
BD positivo, NO puede ser usado para comenzar un
tratamiento antifúngico anticipado (pre-emptive) en este
grupo de ptes.
VPP:10 a 12 %.
S = 89-44% E = 20-56%
Alto VPN.
(1 3)-β-D-GLUCANO
Meta-análisis Karageorgopoulos et al. CID 2011;52(6):750-770
SENSIBILIDAD: 77%
ESPECIFICIDAD: 85%
Sobre 16 estudios desde 1995 – 2010.
Total pacientes: 2979.
594 con IFI Probada ó Probable
(excluyeron infección por Pneumocystis jiroveci)
A pesar de la heterogeneidad entre los diferentes estudios,
tiene buena precisión para distinguir pacientes de Probada o Probable
IFI, de NO IFI.
Adicional estudios prospectivos necesitan ser realizados.
CID 2012; 54 (5):633-643. Lamoth F. et al.
Cut-off pg/ml Fungitell 80 Fungitec-G 20 Wako 11 Maruha 11
(1 3)-β-D-GLUCANO
(1 3)-β-D-GLUCANO
Revisión - Meta-análisis (ECIL-3) Pacientes Oncohematológicos
Lamoth et al. CID 2012;54(5):633-643
SENSIBILIDAD: 50%
ESPECIFICIDAD: 99%
VPP: 84%
VPN: 95% Dos pruebas consecutivas positivas tienen alta especificidad y
VPP y VPN.
Sensibilidad es baja la prueba necesita ser combinada con
hallazgos clínicos, radiológicos y microbiológicos.
Total: 1771 adultos. 215 con IFI Probada ó Probable.
Para 2 test consecutivos.
Galactomanano y (1 3)-β-D-glucano Enfermos críticos no-neutropénicos
Acosta et al. Eur J Clin Microbiol Infect Dis (2012) 31:721-731
SENSIBILIDAD: 67%
ESPECIFICIDAD: 98%
VPP: 80% VPN: 95%
Aspergilosis Invasora probada + probable GM comparable con BD
Ambos se hicieron positivos con una media de 6,5 días antes que el cultivo de Aspergillus. Mejora diagnóstico ambas determinaciones juntas
SENSIBILIDAD: 70%
ESPECIFICIDAD: 59%
Candidiasis invasora probada BD
Se hizo positivo con una media de 3,25 días antes que el cultivo de Candida.
VPN: 94,5%
Revisión de Definición de Enfermedad Fúngica Invasora
EORTC/MSG CID 2008; 46:1813-21
IFI Probable
Evidencia micológica la detección Galactomanano suero, BAL
β (1 3)-D-Glucano en suero
Se aplica al paciente inmunocomprometido Cancer, Trasplante de Médula Ósea, Receptores de Trasplantes de Órganos Sólidos, e Inmunodeficiencias Primarias
COMPARACIÓN (1 3)-β-D-GLUCANO / GALACTOMANANO /
PCR Real-Time
JCM, June 2004, p.2733-41. Kawazu et al.
Total de episodios:
149
AI Probada:
9
AI Probable:
2
AI Posible:
13
NO AI:
125
Pacientes oncohematlógicos
Frecuencia: 1 muestra semanal
S E VPP VPN
Galactomanano (GM) 100% 93% 55% 100%
β-D-Glucano (BG) 55% 98% 40% 96%
PCR Real-Time 55% 93% 40% 96%
ELISA Cut-off: I = 0,6 β-glucan Wako: 11 ng/mL PCR real-time: 40 cop./mL
JCM, Jan 2005, p.299-305. Pazos et al.
S E VPP VPN Falsos +
β-D-Glucano (BG) 87,5% 89,6% 70% 96,3% 10,3%
Total de episodios:
40
BG tendió a convertirse en positivo mas temprano que GM
Galactomanano (GM) 87,5% 89,6% 70% 96,3% 10,3%
Pruebas combinadas 87,5% 100% 100% 96,3%
BG y GM fueron positivos en los mismos pacientes
Discrepancias en los valores positivos para c/u de las pruebas ayudó a detectar
falsos +
COMPARACIÓN (1 3)-β-D-GLUCANO vs. GALACTOMANANO
AI Probada:
5
AI Probable:
3
AI Posible:
3
NO AI :
29
Pacientes oncohematlógicos Glucatell Cut-off >= 120 ng / mL
(1 3)-β-D-GLUCANO
ELISA
Journal of Inmunological Methods. 365 (2011) 158-165. Yoneda A., y Kurokawa T.
Utiliza: Fragmentos recombinantes de la proteína,
Factor G.
Sensibilidad comparable al mét. Colorimétrico.
Tpos. de reacción más cortos.
Instrumenal común en lab. de análisis clínicos
Lectores de ELISA.