03 métodos de análisis bioquímicos

Métodos de Análisis Bioquímico y Técnicas en Biología Molecular

Departamento de Biomedicina MolecularCINVESTAV-IPNDepartamento de Biomedicina MolecularCINVESTAV-IPN

Métodos

MÉTODOS PARA INVESTIGACIÓN BIOLÓGICA

• Bioquímicas

• Biología Molecular

CentrifugaciónFraccionamiento Celular

Electroforesis de Proteínas

Sedimetación

• Cultivo Celular

Purificación de Proteínas

• Interacciones ProtéicasFRET

Doble híbrido

Western blot

Coomasie

PCREnzimas de RestricciónSecuenciación

Fluorescesce Activated Cell Sorter

FACS

Laser capture microdissection (LSM)

Cultivo Celular

HISTORIA DEL CULTIVOEl inicio del cultivo de células y tejidos in vitro, tuvo su orígen en el siglo

XIX como una continuación de las técnicas de embriología:

• 1866 Rechlinhausen• 1885 Wilhem Roux• 1907 R.G. Harrison• 1910 Burrows y Carrel• 1913 Carrel• 1916 Rous y Jones• 1920-1940 Surgen los antibióticos

• 1948 Earle y col• 1952 Grey y col• 1954 Rita Levi-Montalcini• 1955 Eagle• 1961 Hayflick y Moorhead• 1965 Ham.• 1969 Augusti-Tocco • 1976 Sato y col

CULTIVO CELULAR ACTUAL

Se entiende por cultivo celular al conjunto de técnicas que permiten el mantenimiento de las células in vitro, conservando al máximo sus propiedades fisiológicas, bioquímicas y genéticas.

Dependiendo del grado de preservación, de la estructura del tejido o del órgano de origen y de su duración, se puede hablar de diferentes tipos de cultivos: de células, de órganos y explantes primarios o secundarios.

TIPOS DE CULTIVO

Adulto Embrión Huevo

Disección

Picado fino Disección posteriorsi es necesario

Digestión enzimática

Cultivo celular Explantes primarios Cultivo de órganos

El uso de algún sustrato (fibronectina, colágeno, etc) que mejore la adhesión

PRODUCCION DE HIBRIDOMAS

1975 Kohler and Milstein

Métodos Bioquímicos

CENTRIFUGACION

SEDIMENTACIÓN

Velocidad de Sedimentación Equilibrio de Sedimentación

Gradientes de Sacarosa: proteínas CsCl ácidos nucléicos

Purificación por Cromatografía

Tipos:Intercambio Ionico

Filtración en Gel (exclusión de tamaño)

AFINIDAD:

Ni-NTA (6x His-Tag)

GST (glutation S-Transferasa)

Anticuerpos

ATP

Oligonucleotidos

PURIFICACION POR CROMATOGRAFIA

PURIFICACION POR CROMATOGRAFIA

ELECTROFORESIS DE PROTEINAS

ELECTROFORESIS DE PROTEINAS

WESTERN BLOT

Biología Molecular

Tecnología del DNA recombinante comprende

una mezcla de técnicas:

1. Amplificación de fragmentos de DNA por PCR,

• restricción del DNA por enzimas de restricción

2. Clonación del DNA ,donde un fragento específico DNA es

integrado a un elemento genético de replicación (plasmido or

virus),

3. Hibridación de ácidos nucleicos, el cual hace posible identificar

genes.

4. Secuenciación del DNA de un fragmento amplificado

5. Ingenieria, donde nucleotidos especificos pueden ser

cambiados y determinarse las consecuencias funcionales de la

mutación determinada

ENZIMAS DE

RESTRICCION

LIGACION

PCR:REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA

TM=Temperature Melting

TERMOCICLADOR PARA PCR

Marcadores Productos de PCR

Marcadores Productos de PCR

Secuenciar Mutar Hibridizar

5’ 3’

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/

Mutagénesis dirigida

Gene Discovery Efforts: Head and Neck-Cancer Genome Anatomy Project

• NCI and NIDCR have recently teamed up to establish the Head and Neck Cancer Genome Anatomy Project (HN-CGAP), a collaborative joint effort aimed to creating a complete information infrastructure of genes expressed in squamous cell carcinomas of the head and neck

Laser capture microdissection

CGAP-Sequencing

-Blast

known genesanonymous ESTs

cDNA Librariesnovel genes!

Gene Evaluation Efforts: Genomic approaches to understand head and neck cancer

Leethanakul et al, Oncogene, 19: 3220-3224, 2000

HNSCC: Laser capture microdissection and membrane arrays

Advances in molecular biology allow one to experimentally move from gene to protein and from protein to gene to gain a better

understanding of the structure and function of a target gene/protein

. Nature 2000; 407, 971 - 977Naoki kunishima et al.

FRET

FRET

ECFP

903 903EYFP

hCaR

Excitación

FRETEmisión

<100Å

Reductoras No-Reductoras

hC

aR

Wt

hC

aR

/EC

FP

hC

aR

/EY

FP

hC

aR

Wt

hC

aR

/EC

FP

hC

aR

/EY

FP

0 5 10 15 20 250

10000

20000

30000

40000

hCaR Wt

hCaR/E C FP

hCaR/E YFP

CM

P

212

121

96

kDa

[Calcio] mM

hCaR ECFP

Contraste fase

hCaR EYFP

ECFP

EYFP

Contraste fase

Contraste fase

GST

293T

LT G

ST-

CaR

cter

GS

T-C

aRct

er

LT G

ST-

Δ89

5-10

75

LT G

ST

Mar

acad

ore

s

GS

T

GS

T-Δ

895-

1075

Pull-down

Doble Híbrido

GRACIAS