Aislamiento de bacterias benficas de raz y su efecto sobre el crecimiento de maz (Zea mays L)1. Resumen 2. Introduccin y antecedentes 3. Material y mtodos 4. Resultados y Discusin 5. Conclusin 6. Bibliografa 7. Anexo ResumenEl aislamiento y la seleccin de bacterias benficas de raz (BBR) para inocular maz a dosis reducidas de fertilizante nitrogenado (FN), es parte de una estrategia que no afecta negativamente su rendimiento. Las BBR causan un efecto similar al observado cuando el maz se fertiliza con la forma de N recomendada para esa variedad y regin. Los objetivos de este trabajo fueron: i) aislar y seleccionar BBR para la var de maz H-417 ii) analizar el efecto de inoculacin de las BBR sobre el crecimiento del maz.Las BBR se aislaron de races de maz var H-417, en agar D y D. posterior a su purificacin se sometieron la prueba de reduccin de acetileno (ARA) para detectar su capacidad de fijar N2. El maz se inoculo y cultiv en arena estril en el sistema hidropnico de jarras de Leonard en invernadero. Las variables respuesta evaluadas para el efecto de las BBR sobre el maz fueron: alturade la planta, peso fresco, seco, contenido de protena y nitrgeno total. Los resultados muestran un efecto positivo de las BBR sobre el crecimiento del maz en trminos del incremento en su peso seco, por ciento de protena y nitrgeno total, en comparacin con el maz sin inocular y fertilizado con nitrato de amonio. Lo anterior indica que una seleccin cuidadosa de las BBR aumenta la probabilidad de una respuesta positiva del maz a la inoculacin con estas rizobacterias y mejoraa el uso del FN, sin dao ambiental.Palabras clave: Rizobacteria, fitohormonas, exudados radicales.Introduccin y antecedentes.El maz es un cereal de consumo bsico en Mxico y el mundo, requiere aplicacin continua de fertilizante nitrgenado (FN) como otras gramneas domesticas (Behling y Boddey, 1987; Baldani et al., 2000). El FN en general no se usa en este cultivo no se aplica racionalmente, ello causa perdida de fertilidad del suelo, eleva el costo de produccin de este grano, adems reduce su rea de cultivo y en consecuencia el pas tiene que importarlo (Prez-Moreno Ferrera-Cerrato, 1996 y Snchez-Yez et al., 1997). Una estrategia para intentar minimizar y optimizar el empleo del FN, es el aislamiento, seleccin e inoculacin del maz a la siembra con bacterias benficas de raz (BBR), las cuales aumentan la absorcin radical del FN por estimulacin fitohormonal (Berge et al.,1991; Garca et al.,1995; Snchez-Yez et al., 1998; Jacoud et al., 1999; James, 2000) a dosis inferiores de la FN recomendada para la regin, con ello se evita la contaminacin ambiental, se ahorra en el costo de produccin y se alarga la vida til del recurso suelo (Valdivia, B., et al., 1997; Valdivia et al., 1999; Sturtz y Nowak, 2000; Reis, et al., 2000). Los objetivos de este trabajo fueron: i) aislar y seleccionar BBR para la variedad de maz H-417 ii) analizar el efecto de esas BBR sobre el crecimiento del maz en invernadero.Material y mtodos.I. Origen de las BBR y semillas. Las BBR se aislaron de races de maz variedad H-417 del Campo Agrcola Experimental de Ro Bravo (CAERIB), estado de Tamaulipas en el noreste de Mxico, segn el mtodo escrito por Llovera et al., (1994) que consiste en la agitacin de races y su desinfeccin con alcohol absoluto/5 min, lavado con agua estril tres veces con hipoclorito de sodio al 5% por 2/min, lavadas con agua destilada estril, trituradas en motero para sembrar luego en agar D y D semislido en tubo y en caja de Petri con agar 18g/L en el D y D con la siguiente composicin qumica g/L: KH2 PO4.. 0.4; K2H PO4..0.6; MgSO4 7H2O.. 0.0.2; NaCl ..0.1; CaCl 0.02; NaMo04 .2 H2O 0.02; trazas de FeCl; 4.0 ml de una solucin alcohlica de azul de bromotimol al 0.5%; 50g de malato de sodio (Merck) esterilizado por filtracin (membrana milipore Gelman 0.2 ). El medio de cultivo se ajusto a un pH de 6.8 con NaOH 0.1M (Chelius y Triplett, 2000). Se inocularon tubos de 16 x 150 mm con 2 ml de D y D y un 0.05% de agar, la cepa de Azospirillum brasilense de Brasil fue proporcionada por el Dr. Ferrera-Cerrato del laboratorio de microbiologa de suelos del Colegio de Postgraduados, Montecillos, Edo, Mxico, Mxico. Las semillas de maz (Zea mays L) var. H-417 fueron donadas por el Instituto Nacional de Investigaciones Agrcolas de Zaragoza, Coahuila, Mxico. Las BBR se mantuvieron por resiembra peridica en agar nutritivo cubierto con aceite mineral estril entre 10-15C.II. Prueba de reduccin de acetileno (ARA), o fijacin de N2.La demostracin de la fijacin de nitrgeno o ARA se realiz con los cultivos bacterianos axnicos puros de acuerdo con Loera et al., (1996). Los aislados de races de maz se crecieron en el agar D-D se incubaron a 30C por 48 h, luego con una manguera de hule de 10.0 mm de dimetro se les agreg una mezcla de argn-oxgeno en relacin 95:5 para cambiar la atmsfera del tubo se cerraron con tapones de hule de ampolleta; con una jeringa para gases Hamilton de 5 mL, se les extrajo el 10% de la fase gaseosa y se les inyect el 10% de acetileno, este gas se gener al reaccionar 5.0g de carburo de calcio y 20 mL de agua en un matraz Kitasato de 500ml cerrado con un tapn de hule, y conectado a una torre de lavado mediante una manguera de hule de 10/mm de dimetro. El acetileno producido en cada tubo se extrajo con jeringa despus de 0, 2, 3, 4 y 6h de incubacin a 30C, se analiz en un cromatgrafo de gases Beckman GC-72-5 con detector de ionizacin de flama, con una columna de Porapak N de dos metros por cuatro mm. de dimetro a 50C y nitrgeno como gas de arrastre (25ml/min) segn el mtodo descrito por Barber et al., (1976), Baldani et al., (1986), Elbeltagy et al., (2000).

III. Inoculacin del maz en el invernadero.Las semillas de maz variedad H-417 se sembraron en jarras Leonard la gramnea se aliment, con una solucin mineral de White, con la siguiente composicin qumica: K2HPO4 1M-1mL; KH2PO4 1M-1mL; MgSO4 7H2O 1M-1mL; CaCl2; 2H2O 1M-1mL; FeSO4 trazas; solucin de elementos menores: (cido brico-2.68 g; ZnSO4 7H2O 0.22 g KCL-0.09g; Na-Mo04-trazas; agua destilada 100 mL; pH 7.0) se utiliz un 1.0 mL; agua destilada-1000 mL. Se dejaron 2 plantas de maz por jarra de Leonard (Luna y Snchez-Yez, 1991). El control relativo fue el maz fertilizado con NH4NO3, 1M-1mL/L en arena, con repeticiones por tratamiento. Las plantas se mantuvieron durante 14 semanas, al terminar este perodo las variables respuestas evaluadas fueron: altura mxima alcanzada, peso fresco y seco (60C/72 h) nitrgeno total por el mtodo Kjeldhal y protena segn la A.O.AC. (Llovera et al., 1994).IV. Identificacin de las BBR.La identificacin se bas en los criterios de Luna y Snchez-Yez (1991), Llovera etal., (1994), Loera et al.,(1996), que consideran reaccin al Gram, patron de oxidacin/fermentacin de carbohidratos, actividad proteoltica: casena, urea, gelatina y la respiratoria.Resultados y Discusin.I. Aislamiento de las BBR.La BBR fijadoras de N2 recuperadas de la variedad de maz H-417 se obtuvieron una por la tcnica de agitacin y la otra por la de trituracin de races se observo que ambas BBR mostraron una evidente ARA y que provenan de races expuestas en agitacin, lo que sugiere que por lo menos una fue dominante en el rizoplano o en clulas epiteliales de la raz del maz como se reporta para Azospirillum de manera frecuente (Jacoud et al., 1999).Actividad reductora de acetileno (ARA) o fijacin biolgica del N2. En el cuadro 1 se muestra que la ARA fue positiva y gradual para la BBR de maz durante el perodo de incubacin, estos valores fueron relativamente normales en comparacin con lo que se reportan para otras bacterias similares de gramneas (Baber et al., 1976; Baldani et al., 2000) al considerar que el medio de cultivo en el cual crecieron y a condiciones nutricionales que afectan la fijacin de nitrgeno son dependientes del tipo de BBR.Evaluacin de la inoculacin del maz con las BBR.El cuadro 2 presenta el efecto de las BBR sobre el maz H-417, donde se observa que A. lipoferum causo un aumento en el peso seco, en el por ciento de protena y en el N total el cual fue superior al efecto observado en el maz inoculado con A. brasilense y Azotobacter beijerinckii (Az. beijerinckii), los cuales a su vez superaron al maz solo fertilizado con N y obviamente al maz sin inocular y sin N, estos datos concuerdan con los reportados por otros trabajos en los que Burkholderia spp caus un incremento en el peso seco de una variedad de maz y adems mantuvo un rendimiento similar al observado en el maz usado como control relativo (Garca et al.,1995; Reis, et al., 2000; Garca et al.,2005;) en donde la inoculacin de BBR en maz dosis reducidas de FN caus un efecto positivo sobre su crecimiento as como se reporta para otras gramneas (Baldani, et al., 2000; Reis et al., 2000) en este sentido la inoculacin es una alternativa para la produccin de maz (Sturtz y Nowak, 2000). Las BBR aceleran la actividad radical mediante la absorcin eficiente del N a dosis reducidas (Valdivia et al., 1997; Garca et al., 2001, Garca et al.,2005). A. lipoferum fue la BBR que caus el mayor efecto positivo sobre el por ciento de protena como se reporta en otras gramneas que se inoculan con BBR (Elbeltagy et al., 2000; Chelius y Triplett, 2000). El cuadro1 tambin se muestra que el por ciento de protena de N total, del peso seco y fresco del maz inoculado fue equivalente o mejor al similar del maz usado como control relativo. En general A. lipoferum influyo positivamente sobre el desarrollo de los diferentes tejidos del maz, lo que no se observ en el maz inoculado con las otras BBR como A. brasiliense incluso en el maz usado como control relativo (Garca et al., 1995; Reis et al., 2000).Identificacin de las BBREn el cuadro 3, se indican los resultados de las pruebas bioqumicas de identificacin de las BBR. Como se indica BBR denominada S-17 no hidroliz la gelatina, ni la casena. Fue positiva a la produccin: de ureasa, catalasa y oxidasa: utiliz los citratos como nica fuente de carbono y energa. Redujo los nitratos a nitritos: tuvo una reaccin negativa a la prueba de Voges Proskauer, rojo de metilo e indol; no formo cido sulfhdrico en el agar triple azcar-hierro (TSI), ni en cido y/o gas de ribosa, maltosa, sacarosa, rammosa, lactosa y xilosa, de la glucosa fue dbil. Estos datos indican que S-17 corresponde a Azospirillum lipoferum segn Llovera et al., (1994) y Loera et al., (1996) con excepcin de que este aislado oxida la glucosa y reduce los nitratos apoyado en la morfologa de la figura 1 al microscopio electrnico como bacilos tpicos del genero Azospirillum. En lo que respecta al aislado S-12 su patrn bioqumico indica que se trata Azotobacter de la especie: beijerinckii, por la produccin de quistes y por la carencia de movimiento como por la incapacidad para hidrolizar el almidn, como se reporta en la literatura (Baldani et al., 1986; Baldani et al., 2000) para BBR de este tipo.Conclusin.Se concluye que el aislamiento de BBR del tipo de A. lipoferum a variedades de maz representan en alternativa para producir esta gramnea a dosis reducidas de FN bajo un esquema de produccin sustentable de este tipo de gramneas..Dedicatoria.Al Dr Eduardo Aguirre-Pequeo, fundador de la FCB, de la facultad de Agronoma , luchador social, comprometido con la salud en todo nivel, estudioso de la gerantologa, filsofo y maestro sin comparacin de la UANL y el estado de Nuevo Len, Mxico.AgradecimientosA la CIC de la UMSNH proyecto 2.7 (2005-2006) por las facilidades para la publicacin de este trabajo. A la Facultad de Ciencias Biolgicas de la UANL por el apoyo econmico y el microscopio electrnicoBibliografa.Barber, L.E., Tjepkema, J.D., Russell, S.T. and Evans, H.J. 1976. Actylene reduction (nitrogen fixation) associated with corn inoculants with Spirillum spp. Appl. Environ. Microbial. 32:108-113.Baldani, J.I., Baldani, V.L.D.n and Dobereiner., J. 1986. Caracterization of Herbaspirillum seropedicae gen. Nov., sp. Nov., a root-associated nitrogen-fixing bacterium. Int. J. Syst.Bacteriol.36:86-93.Baldani, V.L.D., Baldani, J.I, and Dbereiner, J. 2000. Inoculation of rice plants with the endophytic diazotrophs Herbaspirillum seropedicae and Burkholderia spp. Biol. Frtil. Soils 30:485-491.Behling, M.C. H. and Boddey, R.M. 1987. Estimation of biological nitrogen fixation associated with 11 ecotypes of Panicum maximun grown in nitrogen-15-labeled soil. agronomy J. 79:558-562.Berge, O., Heulin, T. Achouak, W., Richard, C., Bally, R., and Balandreau, J.1991. Rahnella aquatilis a nitrogen-fixing enteric bacterium associated with the rhizosphere of wheat and maize. Can. J. Microbiol. 37:195-203.Chelius, M.K, and Triplett, E.W. 2000. Prokaryotic Nitrogen Fixation; Model system for the analysis of a biological process. Ed Horizon Scientific Press, Hwitts Lane Wymondahm NR18. England. 1-20 pp.Elbeltagy, A., Nishioka, K., Suzuki, H., Sato, H., Sato, T., Morisaki, Y.I, Mitsui, H, andMinamisawa, K. 2000. Isolation and characterization of endophytic bacteria from wild and traditionally rice varieties. Soil Sci. Plant Nutr. 46:617-629.Garca, G.M.M., Moreno-Zacaras, P.E., Pea-Cabriales, J.J. y Snchez-Yez, J.M. 1995. Respuesta del maz (Zea mays L) a la inoculacin con bacterias fijadoras de nitrgeno. Terra 13:71-79.Garca, G.M.M., Faras-Rodrguez R. y Snchez-Yez, J.M. 2001. Colonizacin de la rizosfera y efecto sobre el crecimiento de trigo (Triticum aestivum L) var Pavon por Azospirillum spp. Ciencia Nicolaita 29:31-38.Garca, G.M.M., Farias, R, R., Pea-Cabriales, J.J, y Snchez-Yez J.M. 2005. Inoculacin del trigo (Triticum aestivum L) var PAVON con Azosprillum spp Azotobacter beijirinkii. TERRA 23:65-72Herber, K.P., Martel, M.H., and Heulin, T. 1994. Burkholderia cepacia a plant growth promoting rhizobacterial associate of maize. In: "Improving plant productivity with rhizosphere bacteria". Proc. Intern. Workshop on Plant Growth-Promoting Rhizobacteria, adelaide, south Australia, march 7-11, 1994. M.H. Ryder, P.M. Stephens and G.D. Bowen, eds. CSIRO pp:201-203.Jacoud, C., Job, D., Wadoux, P, and Bally, R. 1999. Initiation of root growth stimulation by Azospirillum lipoferum CRTI during maize seed germination. Can J. Microbiol. 45:339-342.James, E.K. 2000. Nitrogen fixation in endophytic and associative symbiosis. Field Crop. Res. 65:197-209.Llovera, L.J., Pea-Cabriales, J.J. y Snchez-Yez, J.M. 1994. Reduccin de acetileno por bacterias asociadas a races de especies de nopal (Opuntia L) Rev. Lat-Amer.Microbiol. 36:183-189.Loera, T.M.L., Pea-Cabriales, J.J. y Snchez-Yez, J.M. 1996. Acetylene reduction activity on the root of cactaceus plants. Rev. Lat-Amer.Microbiol. 38:7-15. Luna, O.H.A. y Snchez-Yez, J.M. 1991. Manual de prcticas de microbiologa del suelo. Facultad de Ciencias Biolgicas. Universidad Autnoma de Nuevo Len. 1era. ed. Monterrey, N.L. Mxico.Prez-Moreno, J, y Ferrera-Cerrato, R. 1996. Avances de Investigacin de la Seccin deMicrobiologa de Suelos. Centro de Edafologa, Colegio de Postgraduados, Montecillos,Estado de Mxico. 10-30 pp. Reis, V.M., Baldani, J.I., Baldani, V.L.D, and Dbereiner, J. 2000. Biological dinitrogen fixation in gramineae and palm trees. Crit. Rev. Plant Sci. 19:227-247. Snchez-Yez, J.M., Galvn, G.D., Gmez, L.B, y Caracheo, V.G. 1997. Efecto de rizobacterias y cidos hmicos sobre el rendimiento de trigo de verano. III Simposio Internacional y IV Reunin Nacional sobre Agricultura Sostenible (Memoria in extenso). Sociedad Mexicana de Agricultura Sostenible. Guadalajara, Jal., Mxico. 410-417 pp. Snchez-Yez, J.M., Tran, V V., and Balandreau, J. 1998. Aislamiento de la microflora fijadora de N2 asociada a teocintle y maz; Mirobiologa ambiental. Instituto de Investigaciones Qumico-Biolgicas. Universidad Michoacana de San Nicols de Hidalgo, CONACYT, Mxico, CNRS. Ecologie microbienne du sol Universit Claude-Bernard, Francia. Reporte tcnico.Sturtz, A.V, and Nowak, L.J. 2000. Endophytic communities of rhizobacteria and the strategies required to create yield enhancing associations with crops. Appl. Soil Ecol. 15:183- 190.Valdivia, U. B., Nava, M.M., Corts, R.M., Caracheo, V.G., Galvn, G.D, and Snchez-Yez, J.M. 1997. Weed as a source of beneficial for Spring wheat. Colloque Rhizosphere Aix 97. Societie Francaise de Phytopatologie Societie Francaise de Microbiologie. Aix en Provance. France. Abstract pp 74.Valdivia-Urdiales, B., Fernndez-Brondo, J.M, y Snchez-Yez, J.M. 1999. Efecto de la inoculacin de Pseudomonas putida y Glomus sp sobre trigo. Rev. Lat-Amer. Microbiol. 41:214-217.AnexoCuadro 1. Actividad de reduccin de acetileno (ARA) o fijacin biolgica del N2 por rizobacterias benficas de races de maz (Zea mays L) var. H-417.Actividad reductora de acetileno (nanomoles de etileno/tubo)

Tiempo (h)

Aislado/Cepa01.523456

Azospirillum lipoferum (S-10)0ND4.26.910.6NDND

Azotobacter beijerinckii (S-17)02.1ND6.3ND7.110.2

Burkholderia vietnamiensis*011.76.38.911ND

Bacillus cereus G4**0004.2000

La prueba se realiz con las bacterias crecidas en D-D semislido a 30 C/12 h. Todos los valores son el promedio de 4 repeticiones. ND=No determinado. *Donada por Dr. T. Van Van, Lab Ecologa microbiana Universidad Claude Bernard, Lyon, Francia, **Coleccin Lab. Microbiologa Ambiental, IIQB-UMSNH.Cuadro 2. Efecto de la inoculacin de rizobacterias benficas de raz sobre crecimiento de maz (Zea mays L) variedad H-417.Aislado/fertilizacinLongitud de la planta (cm)Longitud de hoja (cm)Peso fresco (g)Peso seco (g)% de protenaN total (g)

Azospirillum lipoferum64.562.839.62.412.682.03

A. brasilense36d34.5c33.0b2.47.87b1.26

Azotobacter beijerinckii42c29c37.22.18.05b1.28

Maz*NH4NO3 sin inocular51.5b43b36.42.0a10.851.73a

Maz** sin fertilizar, sin inocular26.7d29.8c20.4c1.5b7.02b0.64b

Realizado en jarra de Leonard, 8 repeticiones. Letras iguales sin diferencia estadstica segn Tukey (P