II. ManualdePrcticasdel LaboratoriodeBioqumica

1. Agua

II. Manual de Prcticas del Laboratorio de Bioqumica

La vida en la tierra, desde su origen mismo, se ha desarrollado siempre con la ayuda del agua, que ha provisto a los organismos desde los principios de su evolucin hasta la actualidad, de un ambiente en el que las molculas que los constituyen se han multiplicado en nmero y complejidad. En consecuencia, la fisiologa de los seres vivos est ntimamente ligada desde sus mismos niveles moleculares a las propiedades deeste solvente vital.3A causa de su ubicuidad es considerada, con frecuencia, un lquido inerte, meramente destinado a llenar espacios en los organismos vivos. Pero en realidad, el agua es una sustancia de gran reaccionabilidad, con propiedades poco frecuentes, que la diferencian mucho, tanto fsica como qumicamente, de la mayora de los lquidos corrientes. El agua posee, elevados puntos de fusin, la temperatura de ebullicin mas alta, el calor especfico de vaporizacin ms alto, el calor de fusin y tensin superficial elevados. Estas propiedades indican que en el agua las fuerzas de atraccin entre las molculas y, por tanto, su cohesininterna, son relativamente elevadas.5Los tomos de hidrgeno y oxgeno del agua se acomodan en una orientacin no lineal donde el enlace H-O-H forma un ngulo de 104.5, figura 1.1.La naturaleza polar del agua da lugar a la atraccin electrosttica entre sus molculas. El hidrgeno de una molcula, en virtud de su carga parcialmente positiva, es atrado hacia el oxgeno de otra molcula que a su vez posee una carga parcialmente negativa. De esta manera, cada hidrgeno de una molcula puede ser compartido con los oxgenos de otras molculas, del mismo modo en que se comparten los electrones de dos tomos, cuando estos forman una unin covalente, a este tipo de interaccin o

atraccin entre las molculas del agua se le llama puente de hidrgeno, figura 1.2.

Figura 1.1 Estructura de la molcula de agua.3

El hecho de que los puentes de hidrgeno son en realidad protones que se comparten entre dos tomos de oxgeno, y de que el movimiento de estos es mas lento que el de los electrones en una unin covalente, es lo que hace que estas uniones sean ms dbiles que las covalentes (4.5 kcal/mol vs. 110 kcal/mol, respectivamente). Debido a que en la molcula e agua el oxgeno tiene situados sus orbitales electrnicos de modo tetradrico, cada molcula de agua solo puede formar puentes de hidrgeno estables, con las otras cuatro molculas vecinas que se encuentran en los vrtices del tetraedro que forman los orbitales deloxgeno. 3A su vez, esta propiedad explica la extraordinaria capacidad del agua para actuar como solvente de los compuestos polares.Los iones ya sean positivos o negativos de una red cristalina son atrados por las molculas dipolares del agua y se solubilizan. Una vez en solucin,

tanto los iones con carga positiva como los de carga negativa, son rodeados por capas protectoras de molculas de agua, de modo que disminuye la interaccin entre estos iones con cargas opuestas.

Figura 1.2 Puentes de hidrgeno entre dos molculas de agua.3

Los ejemplos de los compuestos polares que disuelven fcilmente en agua son molculas orgnicas pequeas que contienen uno o ms tomos electronegativos (tales como oxgeno o nitrgeno), incluyendo los alcoholes, las aminas, y los cidos carboxlicos. La atraccin entre los dipolos de estas molculas y del dipolo del agua hace que tiendan a disolver. Las sustancias inicas y polares son referidas como hidroflicas debido a esta tendencia. Los hidrocarburos son no polares. Consecuentemente, las molculas no polares no disuelven en agua y son referidas como hidrofbicas, los hidrocarburos en particular tienden a secuestrarse desde un ambiente acuoso. Un lquido no polar forma un sistema de dos capas con el agua; un ejemplo es una capa de petrleo. Es posible que una sola molcula tenga porciones polares y no polares. Las sustancias de este tipo se llaman amfipticas. Un compuesto tal como estos en la presencia del agua tiende a formar las estructuras llamadas las micelas, en las cuales los grupos principales polares estn en contacto conel ambiente acuoso y las colas no polares se aslan del agua.2

Otra de las propiedades extraordinarias del agua que la hacen un medio ideal para los organismos vivos es su capacidad calorfica especfica, (el nmero de caloras requeridas para elevar la temperatura de 1 g de agua de 15 a 16 C) que es igual a 1.0 y es notablemente alta entre las de varios disolventes con enlaces de hidrgeno.Cuanto mayor sea el calor especifico de una sustancia, menor ser el cambio de temperatura que resulte cuando dicha sustancia absorba una cantidad dada de calor. De este modo, las propiedades del agua la hacen apropiada para mantener relativamente constante la temperatura de un organismo vivo.El calor de vaporizacin del agua es muy alto. Expresado como el calor especfico de vaporizacin (caloras absorbidas por un gramo de agua vaporizada), el valor para el agua es de540 en su punto de ebullicin e incluso mayor a temperaturas ms bajas. Este alto valor resulta de gran utilidad para que los organismos vivos mantengan constante su temperatura ya que es posible disipar una gran cantidad de calor por vaporizacin del agua.El alto calor de fusin del agua reviste importancia en la estabilizacin del medio biolgico. Aunque en las formas superiores de vida rara vez se congela el agua, el calor desprendido por sta al congelarse es un factor importante para disminuir la cada de temperatura de un cuerpo de agua durante el invierno. As, 1 g de agua al congelarse a 0 C, debe ceder 80 veces tanto calor como el que pierde al disminuir de 1 a 0 C exactamente antes de congelarse.El agua se expande al solidificarse, y por tanto el hielo es menos denso que el agua. Solo otras pocas sustancias se expanden al congelarse. Si el hielo fuera mas pesado que el agua, se hundira. Esto significa que los ocanos, lagos y corrientes de agua se congelaran del

fondo hacia la superficie, y una vez congelados, seran extremadamente difcil que se fundieran. Obviamente, una situacin as no permitira que dichos cuerpos de agua constituyeran el hbitat de muchas formas vivientes, como efectivamente sucede. Lo que sucede en la realidad es que el agua lquida, ms caliente, se va al fondo de los lagos y el hielo se mantiene sobre la superficie, donde el calor proviene del medio externo lo alcanza y lo funde. Otras propiedades del agua tales como su alta tensin superficial y su elevada constante dielctrica son muy importantes desde el punto de vista de la biologa.

Ionizacin del AguaDurante la interaccin con puentes de hidrgeno entre las molculas de agua, existe la tendencia a que algunas cedan totalmente sus protones a las molculas vecinas y que stas a su vez cedan sus protones a otras. Cuando esto sucede, aparecen cargas reales en las molculas, una carga neta negativa en aquellas que cedieron sus protones, y una carga neta positiva en las que ganaron los protones. De acuerdo con la teora de J. N. Brnsted y T. M. Lowry, en la que se concepta a un cido como una molcula que es capaza de donar protones, y una base como una molcula que es capaz de aceptar protones, la ionizacin del agua, tal como se describe arriba, da lugar a dos especiesinicas de la molcula de agua: el in hidronio, H3O+ que funciona cono un cido, pues es capaz de donar un protn y el in hidroxilo OH- que es una base, pues es capaz de aceptar un protn.

2H2O H3O+ + OH-

Experimentalmente se ha determinado que en un litro de agua pura a 25 C se mantiene una concentracin promedio de 1.0X10-7 molar de iones hidroxilo. Aunque no existen realmente protones libres (H+) en el agua, para facilitar la comprensin del proceso de ionizacin del agua, consideraremos la disociacin de sta en:

H2O H+ + OH-Al producto de la concentracin de los iones hidrgeno por la de los iones OH- se le da el nombre de producto inico del agua, kw y tiene entonces el siguiente valor.

Kw = (1.0X10-7) X (1.0X10-7) = 1.0X10-4

La constante Kw, expresa el producto de las concentraciones de iones H+ y OH- que, por definicin, no cambia. En consecuencia, cuando una solucin es cida, la concentracin de protones esrelativamente alta; pero la concentracin de hidroxilos disminuye en una cantidad igual, para que el producto de las concentraciones de H+ y de OH- se mantenga constante. En el caso de una solucin alcalina, la situacin se invierte, disminuyendo la concentracin de protones y aumentando en forma correlativa la concentracin de hidroxilos.3Como las concentraciones que se manejan son tan pequeas, aun expresadas, matemticamente como submltiplos de 10 (potencias negativas de 10), su manejo puede resultar "complicado" por lo que se utiliza el logaritmo negativo de base 10 paraexpresarlo. Esto es lo que se conoce como "p" y referido a la concentracin de H+ se denomina pH. El pH corresponde al logaritmo negativo de la concentracin de hidrogeniones, o sea:

pH = -log [H+]o bien,pH = log 1/ [H+]

Ntese que la "p" es minscula, ya que se trata de una sigla que indica potencial.Si se considera que el valor de la concentracin de protones es de 1x10-7, se tiene que:

pH = log 1/(1X10-7) =log1-Iog 1x10-7 = 0-(-7) = 7

Es a partir del agua que se define la escala de pH , por lo cual se habla de soluciones cidas cuando tiene valores de concentracin de hidrogeniones mayores de 1x10-7 o pH menores de 7 y desoluciones alcalinas con concentraciones de hidrogeniones menores de 1x10-7 y pH mayores a 7.Como la mxima concentracin posible de hidrageniones en solucin acuosa es de 1.0 M, el valor de pH mnimo es 0.0 ya que el log10 1 es 0. En el otro extremo, cuando la concentracin de H+ es la mnima (1x10-14) el pH es de 14. El punto de neutralidad es de pH = 7 o en concentracin de H+ de 1 x 10-7. EI rango de pH para indicar la acidez de unasolucin va del 0 al 7, mientras que el correspondiente a la basicidad o alcalinidad de una solucin va del 7 al 14.

cidos y BasesLa ecuacin para la disociacin o ionizacin de un cido (HA) en disolucin acuosa diluida implica la transferencia de un protn desde el cido al agua, la cual puede actuar como aceptor del protn y forma el cido H3O+:HA + H2O H3O+ + A-

Cada base conjugada posee una afinidad caracterstica para su protn; los que muestran una afinidad elevada por el protn son cidos dbiles y solo se disocian muy ligeramente, los quemuestran una afinidad pequea son cidos fuertes y pierden iones H+ con facilidad.

La tendencia de cualquier cido a disociarse viene dada por su constante de disociacin:Ka = [H+] [A-][HA]

Constituye tambin una convencin, en bioqumica, emplear las constantes de disociacin basadas en la medida analtica de las concentraciones de los reactivos y de los protones, en unas determinadas condiciones experimentales, es decir, para una concentracin total y fuerza inica determinadas y especificando los dems solutos. Esta constante recibe el nombre de constante de disociacin aparente y se designa por K' o constante de disociacin termodinmica empleada por los qumicos- fsicos, la cual esta corregida por la desviacin del sistema de conducta ideal provocada por factores tales como la concentracin y la fuerza inica. Cuanto ms sea grande la Ka mayor es la tendencia del cido a disociarse; es decir ms fuerte es el cido. La fuerza de los cidos generalmente se expresa en funcin del valor de pKa en donde:

pKa = - logKa

Dado que pKa es el logaritmo negativo de Ka un valor numricamente pequeo de pKa corresponde a un cido fuerte y un valor numricamente grande corresponde a un cido dbil.

Indicadores cido-BsicosEl pH de una disolucin puede determinarse mediante el empleo de colorantes indicadores, la mayor parte de las cuales son cidos dbiles (se designan como HInd). Tales indicadores se disocian de acuerdo con el equilibrio:

Hlnd H+ + Ind-

Supongamos que la especie Hlnd es incolora y que la especie Ind- es coloreada. La posicin de equilibrio de

esta disociacin y por tanto, la cantidad de luz absorbida por la especie Ind- a su longitud de onda caracterstica, es determinada por la concentracin dehidrgeno del medio. En una disolucin fuertemente cida, el equilibrio se desplaza hacia la izquierda y se absorber poca luz a la longitud de onda del mximo de absorcin de Ind-. En una disolucin bsica, la especie Ind- se halla favorecida, ya que el exceso de iones OH- reacciona con los iones H+ para formar agua, impulsando el equilibrio hacia Ind-. En este caso se absorber mucha luz.

TamponesLos fluidos intracelulares y extracelulares de los organismos vivos contienen pares conjugados cido- bsicos, los cuales actan como tampones al pH normal de dichos fluidos.

4El tampn intracelular ms importante es el par conjugado cido-

II. Manual de Prcticas del Laboratorio de BioqumicaI

4bsico H2PO -

/ HPO 2-

(pK' = 7,2). Los

fosfatos orgnicos, tales como la glucosa- 6-fosfato y el ATP, contribuyen tambin a la capacidad de tamponamiento en la clula. El principal tampn extracelular en la sangre y en los fluidos intersticiales de los vertebrados es el sistema tampn del bicarbonato.Puesto que por la ley de Henry la solubilidad de un gas en agua es proporcional a su presin parcial, el pH de su sistema tampn constituido por el bicarbonato es funcin de la presin parcial del CO2 en la fase gaseosa situada sobre la disolucin tampn.El rasgo distintivo del sistema tampn del bicarbonato lo constituye que el CO2 sea el producto final de la combustin aerobia de las molculas combustibles en los vertebrados, que se expulsa en ltimo trmino por los pulmones. 3,7,20

UNIVERSIDAD VERACRUZANA LABORATORIO DE BIOQUMICA PRCTICA No. 1

PREPARACIN DE SOLUCIONES AMORTIGUADORAS Y DETERMINACIN DE pKa

NOMBRE:GRUPO:FECHA:

II. Manual de Prcticas del Laboratorio de Bioqumica

TIEMPO DE PRCTICA: 3 Horas.

OBJETIVOS: Aprender el uso de la ecuacin de Henderson-Hassebalch. Experimentar y entender como se comporta un sistema amortiguador de pH. Aprender a calcular el pKa de un par cido-base. Realizar la determinacin del pKa para diferentes tipos de cidos mediante la ejecucin de una curva de titulacin.

PREGUNTAS PRELABORATORIO

1.-Qu es el pKa?

2.-A partir de que parmetro podemos calcular el pKa?

3.-Qu es una solucin buffer?

4.-Paraqueseutilizaunasolucin buffer?

5.-En los organismos podemos encontrar sistemas amortiguadores?

FUNDAMENTO

Resulta muy til poder relacionar el pH de la solucin de un cido dbil con la constante de disociacin de este.

K = [H+][A-]

[HA]

A fin de lograr esta relacin se puede reordenar la ecuacin para la constante de disociacin del cido HA,

[H+] = Ka[HA][ A ]

sisetomanlogaritmosnegativosde ambos trminos, encontraremos:

- log10[H+] = - log10Ka - log10 [HA][ A ]

De manera semejante a la forma en que se define pH (pH = log10 1 / [H+] =- log10) por definicin pKa es:

pKa = log101= -log10 Ka Ka

Si se sustituyen pH y pKa por sus equivalentes en la ecuacin reordenada de la disociacin del cido HA, tendremos:

pH = pKa log10 [HA][ A ]

Finalmente, se puede cambiar el signo al logaritmo en la ecuacin invirtiendo la relacin [HA] / [A], porque log10[HA] / [A] = + log10 [A-] / [HA] yentonces tenemos:

pH = pK + log10 [ A-][HA]

Esta es la ecuacin de Henderson- Hasselbach, que establece la relacin entre el pH de la solucin acuosa de un cido dbil, su pK y las cantidades de las formas disociada y no disociada.18Las soluciones buffer por otra parte contienen un cido dbil y su base conjugada o una base dbil y su cido conjugado en donde el pH es igual o cercano a su valor de pKa, la ecuacin de Henderson-Hasselbach puede ser usada para realizar los clculos necesarios parasu preparacin.20

MATERIAL Y PROCEDIMIENO EXPERIMENTAL

MATERIAL DE LABORATORIO: 2 Vasos de precipitados de 100 ml 2 Vasos de precipitados de 150 ml 1 Pipeta graduada de 10 ml 1 Pipeta graduada de 5 ml 1 Pipeta graduada de 1 ml 1 Matraz volumtrico de 100 ml 1 Bureta 1 Agitador magntico Piceta

REACTIVOS:(Para su preparacin vase la preparacin de soluciones). Glicina 0.025 M pH 2.0 Lisina 0.025 M pH 2.0 cido asprtico 0.025 M pH 2.0 NaOH 1 M

EQUIPO: Potencimetro

a) PreparacindeSoluciones Amortiguadoras:La seleccin de una solucin reguladora adecuada para un determinado proceso bioqumico, debe ajustarse a los siguientes criterios:

- Escoja el buffer de tal modo que su pKa est muy prximo al pH al cual se va a trabajar (generalmente, entre 6 y 8). Si se espera que el pH va a descender durante el proceso bioqumico, escjase el buffer cuyo pKa sea algo menor que el pH inicial de trabajo; si el pH va a aumentar, el pKa debe ser algo mayor que el pH inicial.-Las sustancias que se van a emplear deben ser hidrosolubles y con un alto grado de pureza, a fin de evitar efectos o reacciones espurias.-No deben usarse en la elaboracin del buffer, sustancias citotxicas o que tengan accin inhibidora de enzimas.-Deben ser sustancias qumica y enzimticamente estables.-Si las sustancias empleadas interactan con cationes o aniones o tienen efectos salinos, estos efectos deben ser mnimos y bien conocidos. Si forman complejos con iones, estos deben ser hidrosolubles.-No deben absorber luz en las regiones visibles y ultravioleta.-Deben tener adecuada "capacidad buffer" en el rango de pH requerido. Para cubrir estos y otros requerimientos especiales, existe una gran diversidad de reguladores para uso en bioqumica, algunos no contienen cationes minerales.En esta prctica, cada grupo o alumno recibir un problema especial consistente en la preparacin de una solucin buffer, de pH y concentracin determinados y que llene ciertos requisitos que se indicaran en cada caso. Deber: a) efectuar los clculos correspondientes para saber que sustancias debe emplear y que cantidad de cada una de ellas. b) determinar la capacidad buffer de la solucin que prepara.

MTODO:1. Al recibir su problema, estudie las condiciones que se piden y busque un buffer cuyo pKa sea adecuado y aplicando

la ecuacin de Henderson-Hasselbach, calcule las cantidades que debe pesar de cido y base conjugada, para preparar 100 ml de disolucin.2. Pese las cantidades que calcul o mida los volmenes adecuados y disuelva. Afore aproximadamente a 75 ml.3. Transfiera esta disolucin a un vaso de precipitados de 150 ml y verifique el pH en un potencimetro previamente calibrado y ajustar a la temperatura a las condiciones de trabajo. Si el pH no es exactamente el pedido, ajstelo agregando el componente (cido o base), que sea necesario para subir o bajar el pH hasta el valor requerido.4. Afore a 100 ml con agua destilada y verifique nuevamente el pH.5. Determinacin de la capacidad buffer. La capacidad buffer es la cantidad de base fuerte requerida para alterar el pH de la disolucin reguladora, en una unidad de pH:C.B.=dbdpH

Siendo dpH el incremento de pH resultante de la adicin de un volumen db de base.6. Ponga su disolucin en un vaso, introduzca los electrodos del potencimetro y disponga una bureta con disolucin de NaOH 1 N y un agitador

magntico, dentro del vaso. Determine el pH inicial.7. Ponga el agitador en marcha sin que este golpee los electrodos, y agregue un volumen de NaOH 1 N medido exactamente en la bureta (1 ml). Anote el pH resultante. Repita las adiciones de base, en volmenes iguales (1 ml) y anote los valores de pH correspondientes, hasta obtener por lo menos cinco lecturas.16

b) Determinacin de pKa:MTODO:1. Ponga 20 ml de la solucin de glicina en un vaso de precipitados de 100 ml.2. Proceda a la medicin del pH.3. Aada 0.1 ml de NaOH 1.0 M. Agitar el vaso y volver a medir el pH anotando los resultados.4. Repita el paso 3 hasta llegar a un pH de 12 aproximadamente.5. Haga lo mismo (pasos 1 a 4) para los otros dos aminocidos.6. Haga una grfica de pH contra volumen en ml de NaOH gastados luego de tomar en cuenta que cada 0.1 ml de NaOH diluido en 20 ml aumenta la concentracin de OH- en 50 mmoles.7. Localiza en la grfica los diferentes pK de los aminocidos.8. Identifica a que pH tienen poder amortiguador.10

HOJA DE RESULTADOS

NOMBRE:GRUPO:FECHA:

a) Preparacindesoluciones amortiguadoras:1.- Problema NpH requerido Concentracin molar Volumen finalml.2.- Clculos efectuados.3.- Cantidades por pesar o medir de A- y HA.4.-Cul es el pH de la solucin inicial? 5.-Cul es el pH final de la solucin?b) Determinacin de pKa:

ml de NaOH agregadospH obtenido0.01.02.03.04.05.06.- Cul es la capacidad buffer?

DISCUSIN DE RESULTADOS

CONCLUSIONES

CUESTIONARIO

1.- Indica el pKa de los siguientes cidos:a) cido pirvico.b) cido lctico.c) cido benzoico.d) cido oxlico.e) cido succnico.f) cido carbnico.g) cido ctrico.h) cido fosfrico.2.- Indique el nombre completo, pKa y peso molecular (o frmula) de los siguientes compuestos usados como reguladores de pH en bioqumica: TRIS; CAPS; MES; TES Y Tricina.3.-Para qu valores de concentracin de los componente de un buffer, tiene este la mxima capacidad buffer?

4.-Por qu los aminocidos actan como reguladores del pH?5.- Define que es la capacidad buffer?6.-Identifica los cidos y bases conjugadas de los siguientes pares de sustanciasa) (CH3)3NH+ / (CH3)3Nb) +H3N-CH2COOH / +H3N-CH2COO-c) +H3N-CH2COO- / H2N-CH2-COO-d) -OOC-CH2-COOH / -OOC-CH2-COO-e) -OOC-CH2-COOH / HOOC-CH2-COOH 7.- Como podras preparar 1 litro de un buffer de fosfato 0.05 M. a pH 7.5 usando K2HPO4 cristalino y una solucin de HCl 1M?

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS