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Aflatoxina M1 | JAA2015 | Rafaela – Junio 2015

AFLATOXINA M1 Detección y cuantificación en leche y productos lácteos

Métodos manuales y automatizados

Dra. Cristina D‘Aiutolo R-Biopharm Latinoamérica [email protected]

mailto:[email protected]



R-Biopharm Group


Alergenos Grupo R-Biopharm

• proveedores mundiales de soluciones para problemas analíticos

• ofrecemos kits para varias plataformas tecnológicas

Empresa joven, con sede central en Darmstad, Alemania, que cubre todos los mercados

de la Unión Europea, Australia, China y América con una extensa red de más de 80

Distribuidores en 70 países.

R-Biopharm Group


Análisis de Alimentos y Piensos

Micotoxinas

Antibióticos

Alergenos Alimentarios / Adulteración

Hormonas / Anabólicos

PCR

Microbiología / Higiene

BSE / Risk Material /

Identificación de Especies Animales

Vitaminas

Productos para Control de Calidad

R-Biopharm Group


Micotoxinas

Metabolitos secundarios producidos por ciertos hongos durante el crecimiento en

el campo, procesamiento, transporte o almacenamiento

Ocurrencia natural e inevitable

Tóxicas y/o carcinogénicas

Bajo peso molecular

Varían en su estabilidad al procesamiento

Número total de micotoxinas (miles?)

Efecto: micotoxina/s involucrada/s, nivel de contaminación, tpo. de exposición,

huésped

Principales: Aflatoxinas, Tricotecenos (Deoxinivalenol, Nivalenol, Toxina T2),

Zearalenona, Fumonisinas, Ocratoxina A, Citrinina, Patulina. Menos estudiadas:

alcaloides del ergot, Moniliformina,, Diacetoxiscirpenol, Ácido Ciclopiazónico,

Neosolaniol, Esterigmatocistina. Metabolitos intermedios

R-Biopharm Group


Micotoxinas - Aflatoxinas

Difuranocumarinas. Relacionadas

Mas de 18 tipos

Más frecuentes: Aflatoxina B1, B2, G1, G2, M1 y M2

Aflatoxina M1 (AFM1) metabolito hidroxilado de la Aflatoxina B1 (AFB1)

secretada en leche de mamíferos (secreción proporcional a la ingesta).

Tasa de Conversión ~ 1,5% (0.4 – 3%)

Aparecen a las 12 hs, pico máximo a las 24 y desaparece a los 4 días del cese

de la ingesta

Aspergillus

R-Biopharm Group


Necesidad de métodos

Cumplir con la legislación

Para llevar a cabo trabajos de control y monitoreo

Control de las etapas de producción de alimentos y piensos

Investigación: estudios toxicológicos, descontaminación, estudios

epidemiológicos

Valoración del riesgo

Metodologías analíticas deben conducir a respuestas exactas y precisas para

poder implementar medidas de control y hacer que el monitoreo de las micotoxinas sea

cada vez mas efectivo

Los métodos analíticos son instrumentos en la elaboración y ejecución de las

regulaciones internas de cada país y en las relaciones comerciales entre países

protegiendo así la salud de los consumidores

R-Biopharm Group


Desafíos de los análisis de micotoxinas

Diversidad de estructuras química de las micotoxinas

Dificultad en la remoción de impureza

Eleva el costo de análisis

Aumenta el tiempo de análisis

Afecta el grado de recuperación

Distribución irregular de las micotoxinas en el sustrato

Diversidad de sustratos

AFLATOXINA M1:

Molécula pequeña

Matriz homogénea / Distribución homogénea

R-Biopharm Group


Legislación

• Aflatoxina M1

CE < 0.05 ppb (leche y productos lácteos)

< 0.025 ppb (fórmulas infantiles)

USA, Mercosur,

Japón, China, Méjico, etc. < 0.5 ppb

R-Biopharm Group


Métodos de Análisis para Aflatoxina M1

• Elección del método

Muchos métodos desarrollados se requiere de mucho juicio para

seleccionar el óptimo protocolo de análisis.

Además de la precisión y exactitud necesarias, los métodos analíticos están

caracterizados por tres criterios prácticos:

Velocidad de realización del ensayo

Nivel de conocimientos técnicos requerido para su desarrollo

Si el ensayo da un resultado cualitativo ó cuantitativo

El mejor método: RAPIDO, SIMPLE, PRECISO, SENSIBLE, CUANTITATIVO,

AUTOMATIZABLE, BARATO

R-Biopharm Group



• Detección y/ó cuantificación

Tecnología que permite determinar si la micotoxina está presente

Métodos rápidos de rastreo (screening): detectan la presencia de AFM1

ELISA, LFD, Biosensores

Métodos de referencia (confirmatorios): detectan, identifican y cuantifican AFM1

Generalmente basados en técnicas cromatográficas: HPLC, LC-MS y LC-

MS/MS

R-Biopharm Group



• Métodos rápidos de rastreo (screening)

El más utilizados ELISA

Adecuados para laboratorios en planta y a campo

Equipamiento simple y poco costoso

No se requiere personal altamente especializado

Poco tiempo para implementar los ensayos

Cuantitativos

Automatizables

R-Biopharm Group


R1121 RIDASCREEN® Aflatoxin M1

ELISA competitivo

96 pocillos

Estándares: 0 / 5 / 10 / 20 / 40 / 80 ng/kg (ppt)

Sensible

• Límite de detección:

• Leche: < 5 ppt

• Leche en polvo: < 50 ppt

• Queso: < 50 ppt

Rápido: 1h 15min

R-Biopharm Group



Cuantitativo

Pocillos sensibilizados con Ab anti-anticuerpo: menor interferencia y mayor

especificidad

Competencia en fase líquida

Formato de microplaca: ahorro de reactivos

12 x 8 Pocillos separables: se utiliza la cantidad de pocillos necesarios

No requieren pocillo de premezcla: menor descarte de reactivos

No requieren pipeta multicanal

Mayor repetitividad

R-Biopharm Group



Ab anti IgG

Medición del producto

sustrato/cromógeno

SN stop

Ab esp. Y

Muestra

+

Conj.

(Ag + Perox.) +

Y Y

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Micropocillos sensibilizados con anticuerpos anti IgG

IgG anti IgG

R-Biopharm Group



IgG anti IgG

IgG anti AFM1

R-Biopharm Group



IgG anti IgG

Std ó Muestras

IgG anti AFM1

R-Biopharm Group



IgG anti IgG

IgG anti AFM1

Std ó Muestras

AFM1 conjugado

R-Biopharm Group



Competencia Mucha toxina


R-Biopharm Group



Competencia Poca toxina

R-Biopharm Group



Competencia Sin toxina

R-Biopharm Group




Sustrato + cromógeno

SC P

Poco color

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Competencia Poca toxina

SC P


Color medio

R-Biopharm Group



Competencia Sin toxina

SC P


Mucho color

R-Biopharm Group



• Lectura de los resultados: fotómetro de lectura vertical

Lector de tiras Lector de placa

R-Biopharm Group



• Evalación de los resultados

RIDASOFT® WIN

Soft desarrollado por R-Biopharm

Se entrega sin cargo con los kits de ELISA

Se realiza entrenamiento

Se actualiza continuamente

Muy fácil utilización

Análisis por distintos métodos (Spline, Logit/log)

LOS RESULTADOS SE ARCHIVAN EN UNA BASE DE DATOS. PERMITE EL

ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS.

R-Biopharm Group



R-Biopharm Group



• Automatización del ensayo: AUTOANALIZADOR

R-Biopharm Group


Automatización CHEMWELL 2910

Empresa Awareness

Compañía Norteamericana de distribución mundial

R-Biopharm Group


Automatización Chemwell 2910

Autoanalizador: Chemwell 2910 - Awareness

Equipo dual que combina ensayos enzimáticos con ELISA mediante el uso de

micropocillos para ambas reacciones:

• Química y ELISA

R-Biopharm Group



Sistema abierto

Windows software

reactivos muestras reacción

Bombas: 2

jeringas

Sistema óptico

de precisión

dH2O

Probe con

sensor

Cabezal de

lavado

R-Biopharm Group



Chemwell selecciona

automáticamente una

de sus dos jeringas,

50uL ó 2.5mL para

pipetear ó diluir

• Punta de la probe detecta la

superficie de los líquidos

• ChemWell estima el volumen

restante

• Probe se lava automáticamente

luego de cada uso

• Se programan los protocolos de

lavado, por lo que no es necesario

el uso de tips descartables para

evitar carryover PROBE:

• Cuerpo corto, aguja larga

• Control de temperatura,

• Retraíble

• Fácil de cambiar

R-Biopharm Group



4 canales ópticos alineados con 4

micropocillos y lee cada pocillo a 8

longitudes de onda (340-750nm)

R-Biopharm Group



Cuando se analizan ensayos de ELISA el Chemwell trabaja cada ensayo en tiras y

programa el tiempo y el proceso

Se pueden colocar distintos ensayos en cada tira mientras ellos compartan un

soporte y temperatura comun. Máximo 12 ensayos por placa. Máximo 2 buffers de

lavado. Los tiempos de incubación de los ensayos pueden ser diferentes

ChemWell organiza el inicio de los ensayos para prevenir conflictos entre ensayos

ELISA’s

R-Biopharm Group



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¡¡¡¡¡ UTILIZAR ENSAYOS VALIDADOS !!!!

• In-house

• Kits comerciales Validados por Organismos Oficiales


Muchas gracias!!!!

[email protected]




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