adn ambiental (edna) como mÉtodo de evaluaciÓn de
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ADN AMBIENTAL (eDNA) COMO MÉTODO DE EVALUACIÓN DE DIVERSIDAD
EN ECOSISTEMAS ACUÁTICOS
LAURA CATALINA REYES VARGAS
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES
FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
BOGOTÁ D.C.
2018
2
“ADN AMBIENTAL (eDNA) COMO MÉTODO DE EVALUACIÓN DE DIVERSIDAD
EN ECOSISTEMAS ACUÁTICOS”
LAURA CATALINA REYES VARGAS
Monografía de grado
Presentada como requisito para optar al título de
Microbióloga
Dirigida por:
Juan Armando Sánchez, Ph.D.
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES
FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
BOGOTÁ D.C.
2018
3
Índice
Resumen ....................................................................................................................... 4
Introducción ................................................................................................................. 4
Capítulo I: La técnica del eDNA .................................................................................... 6
1.1 Tipos de muestra ....................................................................................................... 7 1.1.1 Sedimentos ..................................................................................................................................... 8 1.1.2 Suelos ............................................................................................................................................. 8 1.1.3 Agua ............................................................................................................................................... 8
1.2 Primers...................................................................................................................... 9
1.3 Mantenimiento de muestras y análisis ..................................................................... 10
Capítulo II: Evaluación de biodiversidad ..................................................................... 13
2.1 Conservación de la biodiversidad ............................................................................ 13
2.2 Determinación y seguimiento de especies invasoras ................................................. 15
2.3 Ventajas .................................................................................................................. 16
2.4 Desventajas ............................................................................................................. 17
Capitulo III: Ecosistemas acuáticos ............................................................................. 19
3.1 Ecosistemas acuáticos marinos ................................................................................ 19
3.2 Ecosistemas acuáticos de agua dulce ....................................................................... 20
Conclusiones ............................................................................................................... 21
Bibliografía ................................................................................................................. 23
4
Resumen
Los profundos cambios en la distribución de las especies a lo largo de los años ha constituido
uno de los campos de estudio más amplios en los últimos tiempos. La biología molecular,
por su parte, ha avanzado al punto en el que su aplicabilidad puede adaptarse a muchos tipos
de análisis. El ADN ambiental, o eDNA, es una técnica que permite analizar muestras de
diferentes tipos de sustrato del ambiente para detectar especies o evaluar su diversidad total.
Los ecosistemas acuáticos son uno de los mayores retos debido a su rango de variabilidad e
inestabilidad con respecto a otros. A lo largo del análisis se exploraron ventajas y desventajas
del método así como diversas aplicaciones que han revolucionado el monitoreo de
biodiversidad.
Introducción
La pérdida de biodiversidad es una de las problemáticas en las que se encuentran múltiples
disciplinas del conocimiento, al abarcar el reto más determinante de la humanidad en los
últimos tiempos. Se estima que un alto porcentaje de la biodiversidad en la Tierra está
decreciendo estrepitosamente 1. En ecosistemas acuáticos el panorama no parece ser más
alentador. Existe una gran presión sobre los ecosistemas dado que el cambio climático
constituye una amenaza latente, que tiene como aliciente la apretura demográfica derivada
de poblaciones en constante crecimiento que se estima alcanzarán los 9.7 billones de
personas en total para la mitad de este siglo 2,3.
El método de muestreo de ADN ambiental es una técnica que ha sido utilizada en los últimos
años como herramienta para evaluar y monitorear la diversidad de especies en diversos
ecosistemas. A pesar de ser novedosa en el contexto de las técnicas utilizadas desde el
acelerado ascenso de la biología molecular, ha ganado un terreno importante en estimaciones
taxonómicas en una gran variedad de ambientes y a través de numerosas fuentes de colecta.
5
El objetivo de este documento es realizar una revisión de los avances de la técnica de
evaluación de ADN ambiental particularmente en ecosistemas acuáticos con el fin de
determinar las ventajas y desventajas de su uso en estudios con perspectiva de conservación
de especies en categorías de amenaza o invasoras. Para llevar a cabo el recuento bibliográfico
se realizó una búsqueda en los principales servidores de literatura científica y se revisaron
revistas de divulgación científica en físico con especial énfasis en los textos que abordaran
el uso de la técnica en ecosistemas acuáticos.
Para esto, se buscó realizar un acercamiento desde los aspectos más generales hasta los más
específicos. El uso de ADN ambiental como aliciente en la profundización del conocimiento
científico demanda conocer a fondo el soporte histórico del que han partido mejoras para
afianzar y potenciar las opotunidades que ofrece. Es por ello que en el documento a
continuación desarrollado se propuso analizar la técnica desde una visión holística que
permitiera encontrar los puntos comunes a lo largo de los diferentes usos, tanto para
ecosistemas como para tipos de muestras y organismos, con la finalidad de validar su
viabilidad aplicada a ecosistemas acuáticos. Así pues, en el desarrollo del texto se encuentra
un sumario de los detalles de la metodología seguido de una ampliación de sus aplicaciones
en el marco de dos de los retos de la ecología aplicada y por último, a los ecosistemas
acuáticos.
6
Capítulo I: La técnica del eDNA
Se ha estimado que alrededor de 8.7 millones de especies habitan el Planeta Tierra 4. Todas
ellas comparten una organización genética común, aunque con particularidades que dan
cuentas de características específicas que las llevan a diferenciarse entre sí. Este código
común es denominado Ácido Desoxirribonucléico, o por sus siglas, ADN. La biología
molecular ha profundizado en el análisis de su estructura e interacciones con el fin de
descifrar el intrincado árbol que relaciona a los organismos vivos en su totalidad. Sin
embargo, dada la variabilidad ecológica que existe entre los seres vivos, muchas técnicas de
análisis genético ampliamente utilizadas pueden no ser lo suficientemente efectivas para
determinar algunas de sus cualidades.
El método de ADN ambiental es una herramienta desarrollada hace relativamente poco
tiempo. El ADN ambiental es “el material genético obtenido directamente de muestras del
ambiente (tales como tierra, sedimento o agua) que no tengan ningún signo evidente de
material biológico” 5. A pesar de ser una técnica reciente, ha venido dando resultados
satisfactorios en diferentes campos de estudio. Su uso ha permitido explorar información
compleja de examinar desde la óptica de la biología de la conservación hasta del análisis de
muestras de importancia en salud pública. El ADN ambiental es capaz de detectar especies,
en muchos casos, sin necesidad de avistarlas o capturarlas 6. A partir del análisis de material
genético extracelular es posible seguir el rastro de especies que persisten o han recorrido el
ecosistema considerado. Esta exploración se sostiene en una de las técnicas que han
revolucionado los estudios genéticos desde que en el año 2003 el grupo de investigación de
Paul Herbert, Ph.D en la Universidad de Guelph propuso un novedoso método que permitiría
la identificación a nivel de especie usando tan solo una pequeña sección de ADN de una
región estandarizada: el DNA Barcoding o código de barras de la vida 7.
7
El uso de ADN ambiental es sumamente efectivo para evaluar diversos grupos de organismos
que abarcan desde anfibios, reptiles, peces, mamíferos e incluso parásitos. Los residuos
celulares utilizados en este método provienen de múltiples tejidos tales como heces, orina,
piel, gametos, mucosas o aquellos derivados de organismos en descomposición 8. La técnica
tiene el potencial de ser apta para identificar especies individualmente o abundancia de
diversas especies en ecosistemas complejos. A través de bases de datos que cuentan con una
vasta reserva de información sobre diversos grupos taxonómicos se pueden apoyar los
resultados de la amplificación de las secuencias disponibles en la muestra ambiental.
En un principio, la metodología tuvo la pretensión de obtener ácidos nucleicos de organismos
microbianos a partir de muestras extraídas de sedimentos directamente del ambiente blanco
9. A medida que los procedimientos se afianzaron, las aplicaciones fueron cada vez mayores
a pesar de la suposición de que el uso de este tipo de muestras podría subrepresentar la
diversidad microbiológica existente en condiciones naturales debido a la incapacidad de
mantener algunos grupos en medios de cultivo. El desarrollo de procedimientos que
enriquecen la investigación a través de muestras colectadas de diferentes ambientes ha
permitido ampliar el rango de organismos y ecosistemas evaluados, abriendo caminos para
la estandarización de metodologías de acuerdo a los requerimientos del estudio.
1.1 Tipos de muestra
El ADN ambiental cuenta con una amplia aplicabilidad tanto para grupos de organismos
como para tipos de muestras. Incluso a través de ciertos métodos de preservación es posible
analizar muestras antiguas y determinar la diversidad de un ecosistema particular. En otras
palabras, tiene potencial para evaluar la micro y macro-fauna tanto existente en el momento
de la toma de datos como extinta. Esta capacidad depende de la naturaleza del sustrato del
cual se colecte el material. A continuación se muestra un marco general sobre los diferentes
tipos de muestras de material genético proveniente del diferentes tipos de ambiente. A partir
de estos, también pueden ser recolectados muestras directas de tejidos y residuos inherentes
a individuos de especies particulares.
8
1.1.1 Sedimentos
El análisis de sedimentos se inició con el estudio de plantas, mamíferos y aves presentes en
las eras del Holoceno y el Pleistoceno con muestras de 10.000 a 400.000 años de antigüedad
10, las cuales dieron cuenta de la enorme diversidad de taxones de la época y permite estimar
la diferencia de los mismos con respecto a la diversidad actual en las mismas locaciones.
Siendo así una oportunidad única de hacer seguimiento a las fluctuaciones de los ecosistemas
y sus dinámicas. Posteriormente se dio paso a la indagación de la diversidad de aves y
mamíferos habitantes de cuevas 11, en el cual a pesar de identificar especies incluso extintas
demostró que los métodos se deben pulir para evitar errores de contaminación y confirmación
errada de presencia dados los problemas que se pueden presentar con la herramienta BLAST
y los primers.
1.1.2 Suelos
La persistencia de material genético puede ser mucho más notable en suelos que en ambientes
acuáticos, además de contar con mayor cantidad de ADN extracelular 6. El acercamiento
desde esta perspectiva ha permitido identificar categorías importantes en cuanto a taxonomía
vegetal, comunidades fúngicas en bosques y patrones bioindicadores de poblaciones de
gusanos que regulan algunas propiedades de la tierra. Esto permite aseverar que el uso de la
metodología permite no sólo identificar grupos taxonómicos con precisión sino también
determinar biomasa relativa de especies vertebradas o invertebradas 5. A partir de las
muestras de suelos y tierra es probable encontrar subtipos de muestra de tejidos y compuestos
importantes tales como pelo, garras, heces 12, exosqueletos, escamas, entre otros.
1.1.3 Agua
Es posible escudriñar muestras de agua tanto en estado líquido como sólido. A pesar de que
está demostrado que el material genético en agua suele decaer más rápido que en otros tipos
de muestras, a través de su análisis se han llegado a conclusiones que demuestran una amplia
diversidad pasada y presente. Por medio de la colecta de muestras de bloques de hielo
9
localizados en Groenlandia se pudo demostrar que el ADN eucariota es capaz de persistir en
esta condiciones además de descubrir que la cobertura vegetal de la isla en su costado sur se
presentó unos dos millones de años antes de lo estimado 13. Esto abre las puertas a
descubrimientos que tienen relevancia en conservación y modelamiento ecológico
apostándole a datos que nunca antes se habían considerado.
Así mismo, se pueden encontrar numerosas investigaciones que tienen como sustrato aguas
de diferentes características. Desde su visión, el ADN ambiental puede acompañar procesos
de descontaminación de aguas negras, potabilización, evaluación de estimados poblacionales
de especies invasoras, redescubrimientos locales, entre otros que serán desarrollados más
adelante en el documento. La particularidad de estos ecosistemas radica en que mientras en
otras superficies el material biológico puede permanecer intacto, o al menos ínfimamente
estropeado, por décadas o incluso siglos en el agua tanto salada como dulce la degradación
puede completarse en escala de días o semanas 14.
1.2 Primers
La correcta identificación de las especies o grupos de organismos presentes en una muestra
depende de la calidad de los primers -o cebadores- y de la especificidad de los mismos. Estos
pueden adaptarse a las necesidades particulares del estudio y brindar información de interés
taxonómico. Los primers son fragmentos pioneros en el proceso de iniciación y posterior
elongación en la técnica de PCR, que deben tener como objetivo secuencias cortas de ADN.
Las muestras colectadas provenientes de sustratos utilizados para el análisis de ADN
ambiental constan de fragmentos que oscilan entre las 100 y 150 pares de bases como
máximo en la mayoría de los casos. Para contar con los estándares requeridos, se deben
construir a partir de tres procedimientos conjuntos: In Silico, In Vitro e In Situ.
El primer paso consiste en el diseño bioinformático de la secuencia, el segundo paso requiere
realizar pruebas en el laboratorio con tejidos provenientes del organismo o grupo de
organismos objetivo y especies relacionadas y por último, se debe poner a prueba con
muestras antiguas originarias de localidades con densidades bajas y altas conocidas de los
10
organismos que se requiere analizar, así como de localidades de ausencia comprobada con el
fin de tener una prueba control negativa 6.
Las muestras se pueden analizar bajo la luz de primers específicos o genéricos: su diferencia
radica en el objetivo de la investigación. De manera que en estudios que tienen como objetivo
realizar una estimación general de la biodiversidad presente en un ecosistema deteminado es
recomendable y mayormente utilizado uno o más primers que puedan acoplarse a secuencias
compartidas por varias especies dada su cercanía taxonómica. Por otro lado, si el estudio se
focaliza en la búsqueda o identificación de una especie en particular el primer deberá ejercer
la función de discriminar precisamente los fragmentos que contenga la muestra. Debido a
que algunas muestras datan de muchos años atrás, los fragmentos podrían ser cada vez más
pequeños. El análisis de este tipo de muestras depende de fragmentos de ADN aún más cortos
que las referencias marco de las regiones de barcoding 15. Esto hace necesario que los primers
ajusten sus secuencias para evitar la generación de errores asociados al acoplamiento
incompleto y falsos positivos.
El blanco de las secuencias de los primers puede ser de diferentes tipos. Geerts y
colaboradores16 en su estudio para estandarizar protocolos que permitieran detectar al
cangrejo invasor de río Procambarus clarkii (Girard, 1852) escogieron genes mitocondriales
debido a que tienen más copias por célula, además de ser más propensos a detectarse en
muestras de ADN ambiental. Del mismo modo, de acuerdo con Turner y colaboradores17, las
mitocondrias son más resistentes a la degradación, por lo cual suelen comúnmente ser
utilizados en estudios que utilizan el método. Complementariamente también se utilizan
regiones génicas de cloroplastos y ribosomas dada su capacidad de persistencia.
1.3 Mantenimiento de muestras y análisis
Una de las grandes ventajas de la utilización de componentes ambientales es que a partir de
una muestra estandarizada se pueden analizar comunidades completas simultáneamente. El
análisis consta de técnicas ampliamente utilizadas en biología molecular. La amplificación
del ADN se realiza a través de la Reacción en Cadena de la Polimerasa -PCR por sus siglas
11
en inglés- y sucesiva secuenciación del material genético5. Los procedimientos se ajustan a
los parámetros que delimita la muestra analizada.
Se ha demostrado que el ADN de plantas y animales puede amplificarse a partir de
sedimentos preservados en permafrost de alrededor de 300.000 años y de sedimentos de unos
600 años de antigüedad provenientes de cuevas de ambientes templados, aunque no es claro
si puede encontrarse material genético más antiguo en estas últimas condiciones
mencionadas 11. Sin embargo, es bien conocido que el ADN es más fácilmente preservado
en ambientes fríos. En sintonía con esto, para ambientes húmedos terrestres tales como suelen
ser cuevas o linderas de ambientes plenamente acuáticos, el material orgánico tiende a decaer
rápidamente, contrario a ambientes secos en los cuales los materiales y tejidos suaves pueden
preservarse por un tiempo más prolongado. Para evitar o retrasar el decaimiento del material
biológico son frecuentemente utilizados algunos reactivos tales como acetato de sodio,
bromuro de cetiltrimetilamonio y dimetil sulfóxido-DMSO 6,18,19.
De acuerdo con el objetivo de la investigación es necesario utilizar primers que segmenten
adecuadamente la identidad del material genético presente en las muestras. Si se busca
identificar especies individualmente es recomendable utilizar PCR clásico o qPCR, mientras
que si el énfasis es general, adicionalmente muchos estudios han utilizado la tecnología Next
Generation Sequencer 20,21. Si es necesario evaluar la presencia de más de tres especies es
recomendable usar un acercamiento general a través de cebadores genéricos 6. Cuando se
requiere evaluar muestras con perspectiva multi-especie, los resultados se comparan con
bases de datos genéticas lo cual se denomina eDNA metabarcoding.
Mientras que los dos acercamientos usan fragmentos estandarizados de ADN, se amplifican
secuencian y son el marco de referencia para comparar con datos curados existen ciertas
vicisitudes con respecto a la herramienta DNA metabarcoding dado que es incapaz de
aprovechar ciertos genes codificantes para proteinas como es el caso del citocromo oxidasa
I (COI) a causa de la variabilidad genética interespecífica que imposibilita la utilización de
primers genérico, según Deagle y colaboradores 22. Los barcodes propuestos tienen por lo
general más de 500 pares de bases, para los cuales se acepta ampliamente el uso de los genes
12
COI mitocondrial para animales 23, ribulosa 1,5- bifosfato carboxilasa del plástido y maturasa
K (matK) para plantas 24 y el espaciador transcrito interno (ITS) para hongos 5,25.
13
Capítulo II: Evaluación de biodiversidad
El análisis de ADN ambiental, por cuanto representa un método con mayor adaptabilidad y
facilidad para implementar en ecosistemas heterogéneos, ha venido siendo cada vez más
explorado para ahondar en las interacciones de territorios con importancia científica.
Además, gracias a su enorme versatilidad y destacable disminución en costos de
equipamiento apodera una de la herramientas con mayor proyección en evaluación de la
biodiversidad.
A través de los años, los esfuerzos de conservación han dependido de extenuantes monitoreos
para describir patrones de distribución y estimados de tamaño tanto de poblaciones como de
especies 5. Dada la enorme diversidad de vida en la Tierra, muchas especies pasan
inadvertidas ante los ojos de los científicos debido a la ausencia de identificación de sus
ciclos de vida, el desconocimiento de su morfología en diferentes estadíos del desarrollo o
sus hábitos crípticos y evasivos.
2.1 Conservación de la biodiversidad
Las técnicas de muestreo de ADN ambiental son cada vez más usadas en el campo de la
biología de la conservación así como en el estudio de la ecología de especies invasoras.
Debido a que muchos estadíos de especies de importancia en esta índole son desconocidas,
la alerta que brinda un resultado positivo de una muestra de estas características pueden
ayudar a detectar tempranamente especies raras, en alguna categoría de peligro o invasoras
16. En algunos casos, poder penetrar espacios en los cuales se supone existe una especie en
peligro facilita las medidas que se pueden proponer para su conservación. Usualmente,
sumado a la imposibilidad de observarlas en sus entornos naturales, existen restricciones
legales que impiden la captura y manipulación de las mismas dificultando la consecución de
información esencial para estudiarlas 26. Algunos estudios sugieren que la mayoría de la
14
diversidad que no es posible cultivar pertenece a parásitos eucariotas 27. Esto es importante
debido a que este tipo de organismos (de los cuales pueden existir organismos patógenos)
desarrolla un rol importante en los ciclos de vida de muchos grupos típicamente analizados
a la luz del ADN ambiental. Las interacciones hospedero-parásito tienen la capacidad de
brindar información relevante para realizar un acercamiento más preciso a la conplejidad de
los ecosistemas analizados. Para ello es recomendable combinar diferentes metodologías
utilizadas en diversas áreas del conocimiento para que integrados logren vislumbrar los
entramados que esconde una red ecológica.
Según Barnes y Turner 26, existen siete aspectos clave en los que se desarrollará la técnica
ADN ambiental en el futuro: descripción de comunidades enteras, estimación de abundancia,
genética poblacional y funcional, genómica, toma de muestras en ecosistemas alternativos,
autonomía en la toma de datos y por último abrir caminos para lograr aislar diferentes
moléculas del ambiente más allá del ADN. Cabe destacar que a pesar de que el ADN
ambiental es considerablemente menos invasivo que otras técnicas, algunos métodos de
filtración como aquellos preservados en seco o en buffer de lisis pueden favorecer la
diversidad en composición biológica de la muestra y tener menos impacto en los
ecosistemas28.
Con miras al reto de mitigar las consecuencias asociadas al cambio climático, el ADN
ambiental puede tener una función importante en la evaluación de diversidad ancestral y
consiguiente aplicabilidad para la modelación de posibles escenarios que sigan patrones
comunes. Lorenzen y colaboradores 29 demostraron que los patrones climáticos han sido un
forjador de los cambios poblacionales en los últimos 50.000 años. En su análisis concluyeron
que la información de ADN antiguo proveniente de humanos es determinante para dilucidar
el papel que como especie ha tenido en los cambios demográficos de especies animales tales
como el rinoceronte lanudo, el mamut, el caballo salvaje el bison, el reno y el buey
almizclero. Al combinar esta información con datos de las fluctuaciones del clima de la época
se puede esclarecer la responsabilidad de la intervención antrópica en la extinción de algunas
de ellas. Esta perspectiva, sin duda alguna, significa una herramienta vital para proyectar a
mediano y largo plazo los panoramas venideros teniendo en cuenta patrones inmanentes a la
15
explosión demográfica humana y los cambios acelerados en las temperaturas del planeta
entorno a la supervivencia de especies de diferentes taxones.
2.2 Determinación y seguimiento de especies invasoras
Según la Convención Internacional de Diversidad Biológica 30, “las especies invasoras son
plantas, animales, patógenos y otros organismos que no son nativos de un ecosistema y
pueden causar daño a nivel económico o ambiental o afectar adversamente la salud humana”.
Algunos autores han afirmado que las especies invasoras son la segunda causa de pérdida de
biodiversidad sólo detrás de la destrucción de hábitat 31,32, mientras algunos investigadores
no les asignan esa posición 33. No obstante, es irrefutable que las especies invasoras
desempeñan un papel importante en la alteración de ecosistemas nativos. De allí radica la
necesidad de conocer sus historias de vida para desarrollar estrategias de control y
prevención.
Con la explosión de la globalización es cada vez más común el tráfico de materiales y
productos entre naciones. Estas fluctuaciones de los escenarios mercantiles han acarreado
transformaciones en diversos hábitats que enfrentan intervenciones antrópicas con más
intensidad. Por tanto, la prominencia de especies invasoras a lo largo del tiempo ha ido en
ascenso. De acuerdo con la organización Standars and Trade Development Facility 34, “el
incremento en viajes, comercio y turismo ha facilitado el movimiento intencional o
impremeditado de especies más allá de sus barreras geográficas”. Una de las prioridades
actuales es el monitoreo y el desarrollo de propuestas que ayuden a disminuir y detener
organismos invasores adscritos a las aguas de lastre en los buques trasnoceánicos 26. Muchas
de las especies invasoras más ampliamente distribuidas y que constituyen un grado de alerta
muy alto están estrechamente relacionadas con formas de vida acuáticas 35.
El uso de ADN ambiental para la detección de especies invasoras ha tenido un camino común
con la conservación de biodiversidad relevante a través de los años. Este campo ha ganado
un espacio importante dadas las amenazas que presupone el aumento y colonización de
especies invasoras para los ecosistemas nativos, la obtención de servicios ecosistémicos o
16
inclusive la economía. De hecho, se estima que las especies invasoras representan una
pérdida de alrededor de doce billones de euros por año solamente para la Unión Europea 36.
La detección temprana y seguimiento continuo aseguran la toma de medidas aptas para
controlar la problemática. El análisis de ADN ambiental asegura una ventaja en comparación
con otros tipos ya que es altamente sensible a pesar de las bajas densidades de material
genético presente en la muestra 6. Además puede ser utilizado sostenidamente para evaluar
la efectividad de planes de manejo propuestos para ecosistemas determinados a lo largo de
un periodo de tiempo.
Sobre esto se han realizado múltiples estudios con resultados beneficiosos tanto al poner a
prueba la efectividad de la técnica como en el seguimiento y manejo de especies invasoras.
Tal es el caso de investigaciones hechas en parásitos acuáticos 37 en las cuales detectaron la
presencia de especies potencialmente dañinas en ciertas localidades en las que nunca habían
sido reportadas o se tenían estimaciones bajas; en el cangrejo de río Procambarus clarkii 16
en los Estados Unidos en el cual evaluaron la confiabilidad de diferentes métodos de
extracción y comprobaron la confiabilidad de la técnica con objetivos de biomonitoreo; o la
cuantificación del evasivo pez béntico Neogobius melanostomus en el Mar Negro 38 el cual
se ha convertido en una amenaza latente para las comunidades nativas de la zona y para el
cual a través de este estudio se obtuvo información aproximada de la biomasa de la especie
permitiendo ampliar el conocimiento acerca de ella y convirtiéndose en un aliado elemental
en la formulación de planes de manejo y control. Así mismo, afirman que la detección
temprana de especies invasoras tiene una alta demanda actualmente debido a que la evidencia
confirma que las experiencias de erradicación más exitosas muestran una estrecha relación
entre estos esfuerzos y su oportuno control poblacional, teniendo en cuanta los estadíos del
ciclo en el que tienen mayor vulnerabilidad.
2.3 Ventajas
Las técnicas moleculares se han convertido en un cimiento fundamental de la identificación
taxonómica y el posicionamiento evolutivo de los grupos de organismos. El ADN ambiental
el cual está basado en métodos ampliamente utilizados en una gran variedad de estudios
17
confiere resultados veraces taxonómicamente y aplicables a diversos ambientes ya sea por
medio de la evaluación específica o genérica. Su evaluación en diferentes localidades que
abarquen un área más amplia, extiende la probabilidad de detectar los organismos esperados.
Paralelamente, los costos y tiempo requerido para obtener resultados en comparación a otras
técnicas como microarreglos o espectroscopía de transmisión láser pueden optimizarse. Por
ejemplo, herramientas desarrolladas para promover la ciencia ciudadana pueden llegar a
costar alrededor de cincuenta mil pesos colombianos por muestra, y veinticinco mil pesos
por cada especie evaluada adicional 39. Para estos aspectos en particular, las especies
objetivos son determinantes en estimado final.
A medida que se perfeccionan los protocolos, la técnica puede abrir cada vez más caminos
para su exploración 40. El ADN ambiental ha permitido investigar ecosistemas recónditos
para conocer la diversidad biológica de espacios de los que se tiene poca información 41.
Muchos de los pasos propuestos para llegar a sitios recónditos implican dispersión de
material biológico que puede conllevar consecuencias negativas, tales como la introcucción
de especies potencialmente invasoras. La correcta utilización de los métodos de colecta puede
llegar a disminuir el riesgo de dispersión e incluso disminuir al máximo la intervención. Estos
aspectos son particularmente importantes para tener en cuenta en estudios que involucren
ecosistemas con un alto riesgo de verse perjudicado por las intervenciones antrópicas y al
mismo tiempo necesite un acercamiento cuantitativo y/o acualitativo de su biodiversidad.
Diversos grupos de investigación conciben que el ADN ambiental es una herramienta que
revolucionó las técnicas que vienen siendo usadas por décadas y nos brinda información
invaluable para conservar ecosistemas de trascendencia global.
2.4 Desventajas
La exploración del ADN ambiental como una herramienta para valorar la diversidad de los
ecosistemas es relativamente nuevo. Debido a esto, muchas de sus características están
sujetas a cambios y mejoras. Algunos investigadores sugieren que la confiabilidad de la
técnica reposa en la validez de los resultados de las diversas investigaciones que la pongan a
prueba. Las susceptibilidades que afronta son mayoritariamente en procesos que deben
18
ceñirse a estándares que limiten al máximo los errores asociados. Tal es el caso de la
contaminación de las muestras, que puede acarrear falsos positivos o negativos y extender
las réplicas de los procedimientos que en un principio son reducidas debido a la simplicidad
de la técnica con respecto a otras metodologías sofisticadas. Además el material genético
puede no tener una calidad ideal que de cuentas de la presencia del organismo en cuestión o
por el contrario, sobrerepresente las poblaciones 42. Sujeto a la confiabilidad de las muestras,
la sensibilidad de los equipos puede ser determinante para obtener resultados adversos.
Tal como se mencionó anteriormente, uno de los grupos de genes más utilizados para analizar
ADN ambiental es el proveniente de las mitocondrias de las células. A pesar de que las
secuencias son conservadas y tienen una alta especificidad, dada la heredabilidad del
organelo, la técnica puede no negar la presencia de híbridos en la naturaleza ofreciendo
sesgos ecológicos que, para propuestas de conservación, son elementales. Sumado a esto, los
errores inherentes al proceso de simulado de replicación pueden estar presentes. Al tratarse
de una técnica que utiliza amplicones para aseverar la presencia de un fragmento especie-
específico de una muestra aleatoria, la cuantificación de material genético puede ser
sacrificada en función del primer resultado.
Se ha demostrado que las tasas de degradación del material genético son menores en
temperaturas bajas, bajos niveles de luz UV-B y condiciones alcalinas 43,44. Por otra parte,
las tasas de degradación altas se dilucidan en presencia de factores que contribuyen al
crecimiento microbiano tales como alta temperatura, pH neutro y luz UV-B moderada,
significando que las consecuencias de estos factores pueden estar mediados biológicamente
43. Por último, el uso de material genético ambiental puede generar expectativas que sin ser
acompañadas de metodologías de monitoreo pueden generar resultados incompletos. Es
recomendable potenciar los beneficios de este procedimiento con estudios ecológicos que
permitan adentrarse en características inherentes a las especies, poblaciones y comunidades
que interactúan en el ambiente para así dimensionar la envergadura del manejo que se debe
dar al ecosistema.
19
Capitulo III: Ecosistemas acuáticos
Tal como se ha ilustrado a lo largo del documento, la implementación del análisis de ADN
ambiental ha revolucionado campos en los que es necesario dinamizar la muestra de datos
para aseverar resultados confiables de una manera más rápida y eficaz. Para el caso particular
de los ecosistemas acuáticos existen algunas variables adicionales a considerar 44. La
eficiencia en la captura de muestras puede verse influenciada por algunas caracteristicas
como lo son la turbidez, la concentración de ADN o la carga inhibitoria 45.
El primer reporte de uso de ADN ambiental aplicado a ecosistemas acuáticos se utilizó para
analizar la presencia de la rana toro americana Lithobates catesbeianus (Shaw, 1802) en
humedales y ambientes controlados 46. Posteriormente se han relizado investigaciones en más
grupos de organismos incluyendo peces, invertebrados, reptiles, parásitos, mamíferos,
plantas, hongos, entre otros 47.
Para realizar el muestreo de aguas, usualmente se sumergen tubos de centrífuga ligeramente
por debajo de la superficie o a la profundidad que se desee evaluar hasta completar alrededor
de 15 mL. Adicionalmente, se mezcla con acetato de sodio y etanol absoluto para
almacenarlo en hielo de 10 a 120 minutos para posteriormente congelarlo en hielo frío por lo
general a -80 ºC 18. Allí puede preservarse por décadas incluso al tomarse repetidas muestras
para la estandarización del material genético.
3.1 Ecosistemas acuáticos marinos
Los ecosistemas marinos son los ambientes más complejos en los cuales es posible aplicar el
método de ADN ambiental. La detección de especies a través de él muestra un reto destacado
dada la abundante disolución y la cantidad de salinidad comparado con los ecosistemas de
agua dulce, su acción sobre la eficacia de la preservación de las muestras, las corrientes
oceánicas, la vasta dispersión de los tejidos potencialmente útiles, entre otros 6,19,48. La
20
mayoría de estudios han sido realizados en microorganismos dada su facilidad de dispersión,
sus densidades estimadas y su diversidad.
Uno de los acercamientos más innovadores en este subtipo de ecosistema se realizó utilizando
la metodología aplicada a poblaciones de octocorales en las profundidades del océano en la
costa oeste de los Estados Unidos 49. Allí fueron capaces de combinar los datos arrojados por
la secuenciación de material genético de los octocorales (e.g. Paragorgia s.p., Isidella
tentaculum, Eugorgia rubens) con imágenes obtenidas por la expedición Nautilus-2016
convirtiéndose en un estudio pionero en el desarrollo de estandarización de protocolos que
permitan potencializar las dos metodologías para evaluar la diversidad de estas importantes
poblaciones submarinas.
3.2 Ecosistemas acuáticos de agua dulce
A lo largo de los años el número de investigaciones que involucra en análisis de ADN
proveniente de muestras ambientales en ecosistemas como ríos, lagos, lagunas y humedales
ha ido en ascenso. Gracias al creciente interés en estimar poblaciones inherentes a estos
ambientes se ha logrado mantener un registro continuo de la diversidad biológica de sitios
con diversas características. El ADN es propenso a solubilizarse en agua además de estar a
la orden de organismos descomponedores y continuo flujo de corrientes. Sin embargo, la
obtención de resultados positivos para una o más especies genera confiabilidad precisamente
dada esta razón. El decaimiento de los restos de tejidos y células es apresurado en
comparación a otros sustratos, siendo el coplamiento específico de los primers objetivos una
conclusión diciente sobre la presencia reciente del organismo en cuestión.
Tal es el caso de estudios como el realizado por Laramie y colaboradores 50 quienes lograron
caracterizar la distribución del salmón Oncorhynchus tshawytscha, una especie en peligro de
extinción para Norteamérica. Allí concluyeron que a través del muestreo continuo en
diferentes localidades tanto en el cauce principal como en las cuencas es posible inferir las
densidades poblacionales locales de la especie, aún más incluyendo información de
distribución espacial y métodos complementarios de monitoreo.
21
Conclusiones
El desarrollo del método de detección por ADN ambiental ha supuesto una herramienta muy
importante para el monitoreo de especies determinantes en ecosistemas de difícil acceso y
seguimiento. Los protocolos que sigue son ampliamente compartidos con diversas técnicas
de biología molecular, por tanto, la estandarización de muestras y procedimientos pueden
limitarse al máximo para evitar el mosaico de posibles errores que se pueden presentar al
utilizarlo. Es necesaria la interferencia de esta novedosa metodología en ambientes
inexplorados para continuar poniéndola a prueba y aprovechar las virtudes que ha
demostrado desde sus tímidos inicios.
Muchos depósitos sedimentarios pueden contener registros únicos que revolucionan la
comprensión contemporánea de paleoambientes. El entendimiento de las fluctuaciones
climáticas y evolutivas en periodos ancestrales pueden dar cuenta de patrones biológicos que
deben ser tenidos en cuenta para afrontar la investigación sobre organismos existentes
actualmente y sus posibles desenlaces de caras al cambio climático. El entendimiento de los
sucesos pasados pueden ser un incentivo para evitar repetir patrones que zanjaron la
supervivencia de especies icónicas en el planeta. Por otra parte, adentrarse en ecosistemas
que no son conocidos por el grueso de la población puede favorecer el estímulo del sentido
de pertenencia de las comunidades respecto a su diversidad biológica. Esta técnica puede
colonizar espacios de ciencia ciudadana que permitan ensanchar la información requerida
para realizar modelos con perspectiva de conservación 51.
La técnica debe ser complementada con estudios de campo minuciosos que arrojen datos
específicos sobre la ecología de las especies, necesarios para diseñar programas de
conservación eficaces. Distintos investigadores han propuesto al ADN ambiental como un
soporte para enriquecer los análisis multidisciplinarios que se requieren para comprender a
fondo la historia de vida de las especies y sus interacciones inter-específicas.
Adicionalmente, es de suma importancia descentralizar la focalización del uso de la técnica
22
hacia un mosaico más amplio de organismos (e.g. macroorganismos marinos), permitiendo
conocer a fondo interacciones ecológicas en detalle.
23
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